Verhalten von Muttermilch bei unterschiedlich langer Vorinkubation in An-

3. Ergebnisse

3.1 Untersuchung des Einflusses von Muttermilch und seiner Komponenten auf

3.1.5 Verhalten von Muttermilch bei unterschiedlich langer Vorinkubation in An-

Bisher konnte in den in dieser Arbeit durchgeführten Experimenten bei einer 24-stündigen Inkubation keine Infektion mehr nachgewiesen werden. In einem nächsten Schritt sollte daher untersucht werden, bis zu welchem Zeitpunkt HCV in Gegenwart von Muttermilch eventuell noch stabil bleibt. Zudem galt es heraus zu finden, ob es einen Unterschied in der Titerreduktion gibt, je nachdem ob die Muttermilch zunächst ohne oder zusammen mit HCVcc inkubiert wurde. Anhand eines solchen Versuches könnte man die Unterscheidung treffen, ob einerseits die beobachteten Effekte allein auf das Verhalten der Muttermilch gegenüber dem Virus zurückzuführen sind. Das würde bedeuten, dass diese eine effektive Infektion der Zielzellen unterbinden kann. Andererseits wäre es auch denkbar, dass sich die Muttermilch oder ein in ihr enthaltener Faktor schon bei kurzer Inkubation in der Abwesenheit des Virus‘ so sehr verändert, dass ein hoher Virustiter nach Zugabe von HCVcc nicht mehr erreicht werden kann. Es würde sich dabei hinsichtlich der Infektiositätsminderung vielmehr um die passive Auswirkung der Zusammensetzung der Muttermilch auf das Virus, als um eine aktive antivirale Aktivität von Muttermilch gegenüber HCV, handeln.

Um diese Unterscheidung vornehmen zu können, wurden parallel zum einen HCVcc (Jc1 wt) und Muttermilch für eine definierte Zeitperiode im Verhältnis 1:10 bei RT inkubiert (vgl.

Abb. 9A), zum anderen wurde Muttermilch zuerst allein bei RT für eine bestimmte Zeit stehen gelassen und danach für entweder 1 min oder 1 h mit HCVcc (Jc1 wt) inokuliert und bei RT inkubiert (vgl. Abb. 9B). Bei der verwendeten Muttermilch handelte es sich um die Probe nur einer Spenderin (Muttermilch.3). Als Kontrolle diente jeweils ein Inokulat mit Medium (DMEM cplt). So wurde z.B. je ein Inokulat, bestehend aus Muttermilch und HCVcc, für 31 min oder 1,5 h inkubiert (vgl. Abb.10: „Muttermilch+Virus“). Parallel dazu wurde je eine Muttermilchprobe für 30 min in Abwesenheit des Virus‘ und danach für 1 min oder 1 h in Anwesenheit des Virus‘ inkubiert (vgl. Abb. 10: „Muttermilch+1min/1hVirus“), so dass auch hier eine Gesamtinkubationszeit von 31 min und 1,5 h vorlag. Das gleiche Vorgehen gilt für die jeweiligen Mediumkontrollen (vgl. Abb. 10: „Medium+Virus“

beziehungsweise „Medium+1min/1h Virus“). Alle Proben wurden nach der definierten Inkubationsperiode bei -80°C eingefroren. Erst nach Ablauf aller Inkubationszeiten wurden die Proben zusammen aufgetaut (vgl. Abb. 9C) und gemäß des TCID50/ml-Protokoll titriert.

Die Bewertung des Virustiters erfolgte 72 h nach der Infektion (vgl. Abb. 9D). Abbildung 9 gibt den Versuchsaufbau modellhaft wieder.

A

B

Abbildung 10: Verhalten von Muttermilch bei Vorinkubation in An- und Abwesenheit von HCVcc. A:

Muttermilch ohne Virus vorinkubiert bei RT für angegebene Zeitperioden. Hinzufügen des Virus‘ für 1 min. B:

Muttermilch ohne Virus vorinkubiert bei RT für angegebene Zeitperioden. Hinzufügen des Virus‘ für 1 h.

Parallel erfolgte jeweils die gemeinsame Inkubation von Muttermilch und Virus für die gleichen Zeitperioden (A, B). Als Kontrolle dienten jeweils nach dem oben beschriebenen Schema behandelte Mediumproben. Die bei allen Muttermilchproben beobachtete Zytotoxizität ist in den Abbildungen angegeben.

Nach 30-minütiger Inkubation von Muttermilch ohne HCVcc und anschließender Inkubation mit HCVcc für 1 min, kann eine Infektiositätsminderung von ca. 3 Zehnerpotenzen gegenüber der Mediumkontrolle beobachtet werden. Diese Minderung bleibt nahezu konstant für alle weiteren gemessenen Zeitwerte. Weiterhin besteht kein Unterschied in der anschließenden Zeit der Inkubation von entweder 1 h oder 1 min der Muttermilch mit HCVcc. Ähnliche Resultate ergibt die gleichzeitige Inkubation von Muttermilch+HCVcc, allerdings liegen die Titer der Messwerte von Anbeginn um ca. eine halbe Zehnerpotenz niedriger als die der zuvor in Abwesenheit inkubierten Muttermilch. Keine Infektion oberhalb der Zytotoxizitätsgrenze ließ sich nach ca. 8 h der Inkubation bei diesen Proben ermitteln.

Auf der x-Achse ist die Inkubationszeit in Stunden und auf der y-Achse die Infektiosität, gemessen in TCID₅₀/ml, aufgetragen.

Experiment beobachten (vgl. rote gestrichelte Linie). (Die Muttermilchprobe einer Spenderin (Muttermilch.3) wurde aufgrund von Materialmangel nur bis auf 65°C erhitzt).

Abbildung 12: Einfluss von verschiedenen Temperaturen auf Muttermilch und ihre Wirkung auf die HCV-Infektiosität. Die Muttermilchproben wurden auf Temperaturen zwischen 37 und 99°C erhitzt. Bei allen drei Muttermilchproben ist die Infektiosität bereits bei 37°C um ca. 2 Zehnerpotenzen gegenüber der Mediumkontrolle reduziert. Eine abnehmende Reduktion kann bei steigender Temperatur nicht beobachtet werden. Die beobachtete Zytotoxizität ist in Form einer roten gestrichelten Linie angegeben.

(Die Muttermilchprobe einer Spenderin (Muttermilch.3) wurde aufgrund von Materialmangel nur bis auf 65°C erhitzt). Auf der x-Achse ist die Temperatur in °C und auf der y-Achse die Infektiosität, gemessen in TCID₅₀/ml, aufgetragen.

Alleiniges vorheriges Erhitzen der Muttermilch auf 37°C führt bei allen Muttermilchproben zu einer Reduktion der Infektiosität von 2 Zehnerpotenzen (Muttermilch.1/.2; Abb. 13A und B) bzw. 3 Zehnerpotenzen (Muttermilch.3; Abb. 13C). Außerdem lässt sich bei einer Erhitzung der Muttermilch auf 37°C und gleichzeitigem Schütteln bei 600 rpm ebenfalls eine Infektiositätsminderung von ca. 2 Zehnerpotenzen (Muttermilch.1/.3; Abb. 13A und C) und von einer Zehnerpotenz (Muttermilch.2; Abb. 13B) beobachten. Damit besteht bei Muttermilch.1 kein Unterschied in den beiden angewendeten Methoden. Bei Muttermilch.2 und Muttermilch.3 führt das Schütteln bei 600 rpm zu einer jeweils um eine Zehnerpotenz weniger ausgeprägten Infektiositätsreduktion. Zusammenfassend ließ sich jedoch keine signifikante verminderte Reduktion der Infektiosität durch das vorherige Erhitzen und/oder Schütteln der Muttermilch beobachten.

A

B

C

Abbildung 13: Einfluss von Schütteln und 37°C auf Muttermilch sowie ihre Wirkung auf die HCV-Infektiosität.

A: Muttermilch.1 auf 37°C +/- Schütteln bei 600 rpm erhitzt. Infektiositätsreduktion von ca. 2 Zehnerpotenzen sowohl mit als auch ohne Schütteln. B: Muttermilch.2 auf 37°C +/- Schütteln bei 600 rpm erhitzt.

Infektiositätsreduktion von ca. 2 Zehnerpotenzen ohne Schütteln und um eine Zehnerpotenz mit Schütteln. C:

Muttermilch.3 auf 37°C +/- Schütteln bei 600 rpm erhitzt. Infektiositätsreduktion von fast 3 Zehnerpotenzen ohne Schütteln und von ca. 2 Zehnerpotenzen mit Schütteln.

Es konnte jeweils eine Zytotoxizität von 1 x 10² festgestellt werden. Die y-Achse gibt die Infektiosität in TCID₅₀/ml an.

3.1.7 Lactoferrin

Da bisher eine Reduktion der Infektiosität von HCV in Gegenwart von Muttermilch beobachtet werden konnte, sollte der dafür verantwortliche Effektor erforscht werden. Ein natürlicher und großer Bestandteil der Muttermilch ist das Lactoferrin. Deshalb weckt er wissenschaftliches Interesse, vor allem aber hinsichtlich seinen bereits nachgewiesenen unter anderem antiviralen Eigenschaften [92, 95-96]. Daher zielen die Versuche in diesem Abschnitt darauf ab, ein tieferes Verständnis der Wirksamkeit von Lactoferrin auf HCVcc zu erlangen und Lactoferrin als potentiellen Effektor in Muttermilch zu identifizieren.

Da man in der Literatur bereits Aussagen darüber findet, dass bLf an HCV bindet und somit den Viruseintritt verhindert [98-99], sollte diese Hypothese im folgenden Teil meiner Arbeit weiterführend und im Rahmen eines authentischen Zellkultursystems überprüft werden.

Außerdem galt es, das humane Lactoferrin auf seine eventuelle anti-HCV-Wirkung zu testen.

Um eine vergleichende Aussage treffen zu können, wurden äquimolare Mengen von hLf und bLf verwendet. Es wurden in Zellkultur gewonnene, filtrierte und konzentrierte HCVcc (Jc1wt) zusammen mit entweder hLf oder bLf, gelöst in sterilem und destilliertem Wasser, in einem Verhältnis von 1:10 für 24 h bei RT inkubiert. Es wurden Konzentrationen von 0,1 bis 4000 µg/ml (hLf) sowie 1000 bis 4000 µg/ml (bLf) getestet. Als Kontrolle diente die Inkubation von HCVcc mit Medium (DMEM cplt) (vgl. rote Linie in Abb. 14B). Nach der angegebenen Inkubationszeit wurde das Inokulat zur Infektion naiver Zielzellen verwendet.

Der Virustiter wurde 72 h später beurteilt. Abbildung 14A zeigt modellhaft den Versuchsaufbau.

Wie man in Abbildung 14B erkennen kann, ist der Kontrolltiter mit ca. 10⁷ TCID50/ml erwartungsgemäß hoch. Der Vergleichstiter des hLf-Inokulats liegt bei den Konzentrationen 0,1 bis 10 µg/ml mit etwas mehr als 10⁶ TCID₅₀/ml nicht ganz eine Zehnerpotenz niedriger.

Bei den höheren Konzentrationen von 100 bis 4000 µg/ml besteht zum Kontrolltiter ein Unterschied von im Mittel einer Zehnerpotenz. Ähnliches trifft für das bLf-Inokulat zu. Bei einer Konzentration von 1000 µg/ml beträgt der Unterschied zum Mediuminokulat eine Zehnerpotenz. Der Titer nähert sich dem Kontrollwert bei den Konzentrationen von 2000 bis 4000 µg/ml immer weiter an. Weiterhin konnte kein signifikanter Unterschied bei den Ergebnissen des humanen und des bovinen Lactoferrins festgestellt werden.

3.1.7.1 Einfluss von Lactoferrin auf die HCVpp-Infektiosität

Anlass zur Überprüfung des Effektes, den Lactoferrin möglicherweise auf die HCV Pseudopartikel und das VSV-Glykoprotein-G hat, gaben wissenschaftliche Publikationen. So sollen bLf und hLf vornehmlich an das HCV-Hüllprotein E2 binden [101] und eine Dosis abhängige Verringerung der HCVpp- und VSVpp-Infektiosität bewirken [83, 103-104].

Dieser Abschnitt der Arbeit ist daher der erstmaligen Überprüfung des Einflusses von Lactoferrin auf authentische, pseudotypisierte HCV-Partikel in einem etablierten in-vitro-System gewidmet.

Als Negativkontrolle dienten in diesem Versuch der pcDNA Leervektor, als Vergleichsprobe die pseudotypisierten VSV-G-Partikel. Diese werden häufig als Standard verwendet, um die Infektiosität anderer Pseudopartikel zu vergleichen [131]. VSV sind Viren, die sehr viele verschiedene Wirtszellen infizieren können. Um die Infektion quantifizieren zu können, handelt es sich bei den eingesetzten Pseudopartikeln um solche, die das Gen für die

„Firefly“-Luziferase enthalten. Für den Versuch wurden daher jeweils pseudotypisierte VSV-G- sowie HCV-Partikel (HCVpp; E1E2J6, Genotyp 2a-Isolat) mit humanem Lactoferrin in den Konzentrationen von 0, 2 und 4 mg/ml versetzt und für eine Infektion von naiven Huh-7.5-Zellen in einer 12-Napf-Platte verwendet. Nach sechsstündiger Inkubation bei 37°C und 5% CO₂ wurde ein Mediumwechsel (DMEM cplt) vorgenommen. Nach 72 h wurde schließlich die „Firefly“-Luziferase-Aktivität in einem Luminometer gemessen. Es kann dadurch eine Aussage über das Ausmaß der Infektion getroffen werden. Das Ergebnis des Versuches ist in Abbildung 15 dargestellt.

Die Intensität des Luziferase-Signals ist bei den nicht mit Lactoferrin versehenen Proben am stärksten. Es kann ein sehr schwach ausgeprägter Abfall der Signalstärke bei VSV-G mit zunehmender Konzentration von Lactoferrin beobachtet werden. Im Vergleich zu der unbehandelten Probe sieht man in der mit 2 mg/ml hLf versetzten Probe eine dezente, jedoch insignifikante Signalabnahme bei den HCVpp (E1E2J6). Eine weitere Signalreduktion mit steigender hLf-Konzentration kann hier hingegen nicht verzeichnet werden.

Abbildung 15:Einfluss von Lactoferrin auf HCVpp-Infektiosität. Sehr schwache Signalreduktion bei VSV-G mit steigender hLf-Konzentration. Bei den HCVpp (E1E2J6) hingegen nicht signifikante Dosis abhängige Signalabnahme.

Auf der y-Achse ist die Intensität des „Firefly“-Luziferase Signals pro Napf angeben.

3.1.8 LL37 und CRAMP

In einem weiteren Schritt sollte der mögliche Effekt von LL37, beziehungsweise seines murinen Homologes CRAMP, auf die Infektiosität von HCVcc überprüft werden. Dieses Cathelicidin hat zahlreiche antimikrobielle Eigenschaften und ist wie das Lactoferrin ein natürlicher Bestandteil der Muttermilch. Es sollte somit im folgenden Teil überprüft werden, ob dieses Peptid möglicherweise antivirale Eigenschaften besitzt und daher als eventueller Effektor in der Muttermilch in Frage kommt.

Es wurden hierfür unterschiedliche Endkonzentrationen von LL37 (0 bis 50 µg/ml; Abb. 16A) beziehungsweise von CRAMP (0 bis 5 µg/ml; Abb. 16B) in in vitro generierten HCVcc angesetzt. Das Inokulat wurde für die sofortige Infektion naiver Huh-7.5-Zellen im 12-Napf-Format verwendet. Nach 4 h erfolgte ein Mediumwechsel (DMEM cplt). Die Luziferase-Aktivität konnte schließlich 72 h später im Luminometer erfasst werden, da die zuvor verwendeten infektiösen HCV-Partikel das Reportergen für die „Firefly“-Luziferase enthalten. Mit „mock“ wird in diesem Versuch der im Gerät gemessene Hintergrund angeben, das bedeutet das Signal der nicht infizierten Zelllysate. Das Ergebnis der Experimente ist in Abbildung 16 dargestellt.

Aus Abbildung 16A geht hervor, dass die Intensität des Luziferase-Signals mit steigender Konzentration von LL37 zunächst um ca. eine halbe Zehnerpotenz zunimmt (2 µg/ml), um dann um weniger als eine Zehnerpotenz im Vergleich zum Kontrollwert (0 µg/ml LL37) abzufallen (10 und 50 µg/ml). Bei demselben Versuchsaufbau mit CRAMP konnte ebenfalls keine signifikante Veränderung in der Luziferase-Signalstärke gegenüber dem Kontrollwert festgestellt werden (vgl. Abb. 16B).

A

B

Abbildung 16: LL37 und CRAMP. A: LL37. Die Luziferase-Signalstärke bleibt für alle eingesetzten Konzentrationen von LL37 nahezu konstant. Bei einer Konzentration von 2 µg/ml LL37 nimmt die Signalintensität um ca. ein halbe Zehnerpotenz zu. In den Konzentrationen von 10 und 50 µg/ml LL37 nimmt das Signal um weniger als eine Zehnerpotenz gegenüber dem Kontrollsignal ab. B: CRAMP. Die Intensität des Luziferase-Signals verändert sich bei unterschiedlichen Konzentrationen von CRAMP sehr geringfügig gegenüber dem Kontrollsignal.

Mit „mock“ ist das Signal der nicht infizierten Zelllysate angegeben. Auf der x-Achse ist die jeweils eingesetzte Konzentration von LL37 (A), beziehungsweise CRAMP (B), und auf der y-Achse die Intensität des Luziferase-Signals aufgetragen.

3.2 Erforschung des Einflusses von Samenflüssigkeit, seiner Komponenten und EGCG auf die Stabilität und Infektiosität von HCV

Im folgenden Teil der Arbeit sollte die Stabilität von HCV in Gegenwart von menschlicher Samenflüssigkeit und des Antioxidans EGCG analysiert werden. Denn bis dato sind hinsichtlich dieser Fragestellungen keine oder nur sehr wenige wissenschaftliche Publikationen gemacht worden. Zurzeit ist einer der wenigen Anhaltspunkte die Entdeckung von Amyloidfibrillen (SEVI) im Sperma, die die Infektiosität des HI-Virus‘ steigern [121].

Darüber hinaus konnten Hauber et al. zeigen, dass EGCG in die Fibrillogenese eingreift und somit die infektionssteigernde Wirkung hemmen kann [123]. Aber auch im Allgemeinen werden EGCG unter anderem antiviral wirksame Eigenschaften zugesprochen [124-125]. Es gilt daher herauszufinden, ob sich diese Erkenntnisse auch auf das Hepatitis-C-Virus anwenden lassen.

3.2.1 Einfluss von Sperma auf HCV

3.2.1.1 Stabilität von HCVcc in Anwesenheit von Sperma

Um zu überprüfen, welchen Einfluss menschliche Samenflüssigkeit auf die HCVcc-Infektiosität hat, wurden in vitro generierte infektiöse HCV-Partikel zusammen mit einer der Spermaproben (Sperma.1-.10; Sperma pool (bestehend aus 30 unterschiedlichen Spenderproben)) in einem Mischverhältnis von 1:10 für 24 h bei RT inkubiert. Anschließend erfolgte mit Hilfe des Inokulats die Infektion von naiven Huh-7.5-Zellen für 72 h. Als Kontrolle diente ein Inokulat, das anstelle von Sperma mit Medium (DMEM cplt) versetzt worden war (vgl. rote Linie in Abb. 17B). Das Ausmaß der Infektion wurde mittels Färbung des NS5A-Proteins sichtbar gemacht. Abbildung 17A gibt modellhaft den Versuchsaufbau wieder und das Ergebnis des Versuches ist in Abbildung 17B dargestellt.

Der Unterschied zwischen dem Titer der verschiedenen Spermaproben und dem Kontrolltiter beträgt ungefähr 1 x 10 bzw. 0 x 10 TCID50/ml und scheint daher nicht signifikant zu sein.

Auch zwischen den diversen Proben können, abgesehen von geringfügigen Schwankungen, keine signifikanten Unterschiede verzeichnet werden. Eine Zytotoxizität von ca. 10² konnte bei den mit Sperma inkubierten Proben verzeichnet werden.

3.2.1.2 Langzeitstabilität von HCV in Anwesenheit von Sperma

Bis zu diesem Zeitpunkt ließ sich keine Veränderung der Infektiosität von HCV in Gegenwart von Samenflüssigkeit bei 24-stündiger Inkubation feststellen. Zur Testung der Langzeitstabilität von HCV in Gegenwart von Sperma wurde dieses in einem nächsten Experiment für verschiedene definierte Zeiträume zusammen mit HCVcc inkubiert. In einem Mischverhältnis von 1:10 wurden die infektiösen Partikel zusammen mit dem Spermapool für 7/14/21/28 Tage bei RT inkubiert. Ein Mediuminokulat wurde jeweils als Kontrolle eingesetzt. Die Proben wurden nach der jeweiligen Inkubationszeit von 7/14/21/28 Tagen bei -80°C eingefroren, später zusammen aufgetaut und mittels TCID50 titriert. Die Bewertung des Infektionsausmaßes gelang 72 h später mit Hilfe des Anfärbens des NS5A-Proteins. In Abbildung 17A ist der Versuchsaufbau modellhaft angegeben (das Einfrieren der Proben ist nicht aufgeführt) und in Abbildung 18 ist das Ergebnis des Versuchs dargestellt.

Nach sieben Tagen Inkubationszeit kann keine Infektion mehr gemessen werden. Nur eine Zytotoxizität ist bei allen Zeitwerten messbar („Zytotoxizität Sperma (pool)“). Auch der Titer des Kontrollinokulats nimmt über die Zeit ab. So erreicht dieser nach 21 Tagen die untere Messschwelle für die Infektiosität.

Abbildung 18: Langzeitstabilität von HCV in Anwesenheit von Sperma. Inkubation von 7/14/21/28 Tagen. Nach 7 Tagen kann nur Zytotoxizität („Zytotoxizität Sperma (pool)“) in Höhe von 10³ und keine Infektion mehr gemessen werden. Dieser Wert bleibt bis zum Tag 28 konstant. Der Titer des Kontrollinokulats nimmt kontinuierlich ab. Dieser hat an Tag 21 die untere Messschwelle für die Infektiosität erreicht. Die x-Achse gibt die Inkubationsdauer in Tagen und die y-Achse die Infektiosität, gemessen in TCID50/ml, an.

3.2.2 Auswirkung von SEVI auf die HCVcc-Infektiosität

In diesem Teil der Arbeit sollte die Hypothese, dass SEVI einen Einfluss auf die HCVcc-Infektiosität nehmen kann, geprüft werden. Es sollte erforscht werden, ob SEVI, ähnlich wie bei dem HI-Virus, in der Lage ist, die Infektiosität von HCV zu steigern.

Es wurden hierfür HCVcc (Jc1-luc) zusammen mit SEVI in verschiedenen Endkonzentrationen (0,4 bis 250 µg/ml) jeweils für 4 h bei RT inkubiert. Erst danach erfolgte mit dem Inokulat die Infektion naiver Huh-7.5-Zellen im 96-Napf-Format für 72 h. Als Kontrolle diente ein Mediuminokulat (DMEM cplt) (angezeigt in Form einer roten Linie in Abb. 19). Es wurden jeweils Dreifachansätze pipettiert. Bei den verwendeten HCV-Partikeln handelte es sich in diesem Fall um solche, die das Gen für die „Firefly“-Luziferase enthalten.

Das Ausmaß der Infektion konnte somit über die Signalintensität der Luziferase im Mikroplattenluminometer detektiert werden. Dabei wird mit „mock“ (vgl. Abb.19) der im Gerät gemessene Hintergrund angeben, das bedeutet das Signal der nicht infizierten Zelllysate.

In Abbildung 19A wurde unverdünntes Viruskonzentrat verwendet. Mit zunehmender SEVI-Konzentration lässt sich ein minimaler Anstieg der Infektiosität gegenüber dem Kontrollwert feststellen. Es handelt sich dabei allerdings nur um eine maximale Zunahme einer halben Zehnerpotenz. Zytotoxizität ließ sich in diesem Versuch nicht feststellen.

In Abbildung 19B wurde das Viruskonzentrat 1:10 in Medium (DMEM cplt) vorverdünnt. Es sollte dadurch getestet werden, ob nicht bei einem zu hohen Virustiter bereits so viele HCV-Partikel existieren, dass eine weitere Anreicherung und damit Steigerung der Infektiosität durch SEVI nicht möglich ist. So fanden auch Münch et al. heraus, dass die größte HIV- Infektiositätssteigerung durch SEVI bei niedriger Viruslast erfolgte [121]. Allerdings sieht man in Abbildung 19B, dass kein verändertes Verhalten in der Beeinflussung der HCV-Infektiosität eintritt. So kann festgestellt werden, dass sich die maximale Signalstärkezunahme auf weniger als ca. eine halbe Zehnerpotenz im Vergleich zum Kontrollwert beläuft und zudem Schwankungen unterliegt. Erneut konnte in dem Experiment keine Zytotoxizität verzeichnet werden.

A

B

Abbildung 19: Einfluss von SEVI auf HCVcc-Infektiosität. A: Unverdünntes Virus. Minimale Signalstärkezunahme mit steigender SEVI-Konzentration von max. einer halben Zehnerpotenz. .B: Verdünntes Virus (1:10). Insignifikante Signalstärkezunahme gegenüber dem Kontrollwert, die zudem Schwankungen unterliegt.

Auf der y-Achse ist die Luziferase-Signalstärke pro Napf und auf der x-Achse sind die verwendeten Konzentrationen von SEVI in µg/ml aufgetragen. Die rote Linie zeigt jeweils den Mediumkontrollwert an. Das von den nicht infizierten Zelllysaten ausgehende und gemessene Signal wird mit „mock“ bezeichnet.

Da bisher nur eine geringe Zunahme des Luziferase-Signals beobachtet werden konnte, galt es in einem weiteren Schritt herauszufinden, ob SEVI eine stimulierende Wirkung nur auf eine bestimmte Fraktion des Hepatitis-C-Virus‘ hat. Denn es ist bereits bekannt, dass HCV aus Partikeln unterschiedlicher Dichte besteht [132].

Es wurde daher zunächst das Virus (Jc1-luc) mittels eines Dichtegradienten (vgl. 2.2.15) in neun unterschiedlich dichte Fraktionen aufgeteilt. Diese Fraktionen wurden jeweils in einem Doppeltansatz entweder mit SEVI in einer Endkonzentration von 40 µg/ml oder ohne SEVI für 4 h bei RT inkubiert. Nach den 4 h Inkubationszeit wurde das Inokulat für die 72-stündige Infektion von naiven Huh-7.5-Zellen im 96-Napf-Format benutzt. Die Luziferase-Aktivität wurde schließlich im Mikroplattenluminometer gemessen. Das Ergebnis des Versuches ist in Abbildung 20 dargestellt.

Die Stärke des Luziferase-Signals weicht bei den zu vergleichenden Proben nur minimal ab.

Es scheint daher kein signifikanter Unterschied in der Infektiosität der Viren unterschiedlicher Dichte bei der Inkubation mit oder ohne SEVI zu bestehen.

Abbildung 20: HCV-Dichtegradient. Neun verschiedene Fraktionen wurden +/- SEVI inkubiert. Ein Unterschied in der Inkubation +SEVI zu der -SEVI kann nicht verzeichnet werden.

Auf der x-Achse ist die im Refraktometer gemessene Dichte der Fraktionen in g/ml und auf der y-Achse ist die gemessene Luziferaseaktivität pro Napf aufgetragen.

3.2.3 Hepatitis-C-Virus und EGCG

3.2.3.1 Einfluss von EGCG auf die HCV-Replikation

Die Hypothese, dass EGCG einen inhibitorischen Effekt auf die HCV-Replikation und die Freisetzung infektiöser Partikel ausüben kann, sollte in diesem Versuch getestet werden.

Es wurden naive Huh-7.5-Zellen mit für das Reportergen „Firefly“- Luziferase kodierender HCV-RNA transfiziert, um vier Stunden später mit verschiedenen Konzentrationen von EGCG versetzt zu werden (0 bis 100 µg/ml). Nach 48 h der Inkubation bei 37°C und 5% CO2

wurde zum einen der Überstand geerntet, filtriert und für die Infektion von naiven Zielzellen verwendet, zum anderen wurde direkt die „Firefly“-Luziferase-Aktivität der Zellen des 48 h-Wertes gemessen. Die „Firefly“-Luziferase-Aktivität wurde dann auch wiederum nach 48 h von den mit Überstand infizierten Zielzellen gemessen. Somit lässt sich eine Aussage darüber

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