Methoden

Alle Zentrifugationen ohne Angaben eines Rotors wurden in Eppendorf Tischzentrifugen durchgeführt. Es wurden die Modelle 5417C und 5417R verwendet.

2.2.1 Transformation von Bakterien

Es wurden 100 µl kompetente Bakterien mit 1 µl Plasmid-DNA für ca. 20 Minuten auf Eis lagernd inkubiert. Nach einem Hitzeschock von 1,5 Minuten bei 42°C wurden zu jedem Ansatz 500 µl LB-Medium pipettiert. Es folgte eine aerobe Inkubation für 45 Minuten bei 37°C. Danach wurden die Bakterien abzentrifugiert und das entstandene Pellet in 100 µl

LB-Medium resuspendiert. Anschließend erfolgte die Ausplattierung der Bakterien auf Selektivnährböden und deren Kultivierung bei 37°C über Nacht.

2.2.2 Präparation von Plasmid-DNA aus Bakterienkulturen

Zur Präparation von 100 ml E.coli-Kulturen (Midi) wurde das NucleoSpin Plasmid Kit (Machery-Nagel, Düren) nach Angaben des Herstellers verwendet.

Es wurde die Übernachtkultur in 50 ml Falcons für zehn Minuten bei 4°C abzentrifugiert (6000UpM; Sorvall RCGPlus, Thermo; Rotor F13S-14x50cy (FiberLite PTI)). Das entstandene Pellet wurde zur Lyse der Zellen in 4 ml A1-Puffer resuspendiert. Anschließend wurden 4 ml des A2-Lysepuffers, und nach maximal fünf Minuten 4,8 ml des A3-Neutralisationspuffers hinzugegeben. Die darauffolgende Zentrifugation wurde für 20 Minuten bei 4°C (12000UpM; Sorvall RCGPlus,Thermo; Rotor F13S-14x50cy (FiberLite PTI)) durchgeführt. Der Überstand wurde abgenommen und auf vier NucleoSpin Plasmid Säulen aufgetragen. Das Lysat wurde zweimal mit je 500 µl des erhitzten (ca. 50°C) AW-Waschpuffers und einmal mit 700 µl des A4-Waschpuffers gewaschen. Die Elution der Plasmid-DNA erfolgte mit je 50 µl AE-Puffer (5mM Tris/HCL, pH 8,5).

2.2.3 In-vitro-Transkription

Zunächst mussten die für die in-vitro-Transkription benötigten Transkripte hergestellt werden. Hierzu wurden 10 µg der Plasmide (Jc1 Genom; Jc1 Genom mit „Firefly“Luziferase) für eine Stunde mit MluI (NEB) linearisiert. Es folgte eine DNA Aufreinigung mittels Phenol/Chloroform-Extraktion. Dafür wurde die DNA mit 0,1 Volumen 3 M Natriumazetat (pH 6,0) vermischt und zweimal mit 1 Volumen Phenol, gesättigt mit Tris-Ethylendiamintetraessigsäure, und einmal mit 1 Volumen Chloroform extrahiert. Die DNA Fällung erfolgte durch Zugabe von 2,5 Volumen 100% Ethanol und einer Inkubationszeit von 20 Minuten bei -20°C. Die DNA wurde anschließend für 20 Minuten bei 20.000 x g und 4°C zentrifugiert. Daraufhin wurde die gefällte DNA mit 80% Ethanol gewaschen, an der Luft getrocknet und in 65 µl RNAase-freiem Wasser in Lösung gebracht.

Das Gesamtvolumen von 100 µl des Transkriptionsansatzes für die in-vitro-Transkription setzte sich zusammen aus 20 µl 5x RRL-Transkriptionspuffer, 12,5 µl einer 25 mM rNTP Lösung, 100 U RNasin (Promega), 65 µl aufgereinigter und linearisierter DNA-Lösung und 60 U T7-RNA-Polymerase (Promega). Der Ansatz wurde für zwei Stunden bei 37°C inkubiert, anschließend wurden 30 U der T7-Polymerase hinzupipettiert, gefolgt von einer

weiteren zweistündigen Inkubation bei 37°C. Schließlich wurde die Transkriptionsreaktion durch die Zugabe von 7,5 U RNase-freier DNase (Promega) und einer erneuten Inkubation von 30 Minuten bei 37°C beendet. Daraufhin wurden 60 µl 2M Natriumazetat (pH 4,5), 440 µl RNase-freies Wasser und 400 µl wassergesättigtes Phenol zugegeben. Der Ansatz wurde für zehn Minuten auf Eis inkubiert. Die Lösung wurde anschließend für zehn Minuten bei 20.000 x g und 4°C zentrifugiert. Die wässrige Phase wurde dann in ein neues Reaktionsgefäß überführt und die RNA nach Zugabe von einem Volumen Chloroform extrahiert. Die Fällung der RNA wurde schließlich durch die Zugabe von 0,7 Volumen Isopropanol erzielt und diese durch Zentrifugation von zehn Minuten bei 20.000 x g bei Raumtemperatur abzentrifugiert.

Das entstandene Pellet wurde mit 70% Ethanol gewaschen, an der Luft getrocknet und in 50 µl RNase-freiem Wasser aufgenommen. Die Konzentration der RNA wurde, wie unter 2.2.4 beschrieben, bestimmt und die Intaktheit der in-vitro-Transkripte durch Agarose-Gelelektrophorese überprüft.

2.2.4 Auftrennung von DNA und RNA mittels Agarose-Gelelektrophorese

Das Prinzip der Agarose-Gelelektrophorese zum Nachweis von DNA bzw. RNA besteht in der Größenauftrennung ihrer Fragmente im elektrischen Feld. Es wurden hierzu Agarosekonzentrationen von 1% benutzt. Die Agarose (Invitrogen, Karlsruhe) wurde in 1 x TAE-Puffer kurz aufgekocht und anschließend auf ca. 50°C abgekühlt. Die Gele wurden vor dem Gießen mit je 0,01 ml Ethidiumbromid (Stocklösung 10 µg/ml; Roth) auf 100 ml Agaroselösung versetzt. Zu den Proben wurde 1/6 Volumen 6 x Ladepuffer (Orange G;

Sigma-Aldrich, Taufkirchen) hinzugefügt. Zur vergleichenden Bestimmung der Anzahl und der Größe der Fragmente wurde ein entsprechender Marker mit bekannten Bandengrößen mit aufgetragen (Lambda-DNA/Eco130/, Fermentas GmbH, St.Leon-Rot). Die Elektrophorese wurde in 1 x TAE-Puffer bei 120 Volt durchgeführt. Die Visualisierung der DNA-Fragmente bzw. der RNA erfolgte unter UV-Licht mit einer Wellenlänge von 320 nm und deren Dokumentation mit dem Gel iX Imager (UV-Systeme, Intas, Göttingen).

2.2.5 Konzentrationsmessung von Nukleinsäuren

Die Bestimmung der Konzentration von DNA und RNA erfolgte photometrisch mittels eines Photometers bei 260 nm in einer Quarzküvette. Dabei entspricht 1 OD260 50 µg/ml doppelsträngiger DNA und 1 OD260 40 µg/ml RNA. Als Referenz für die Messung diente das entsprechende Lösungsmittel.

2.2.6 Kultivierung von Säugerzelllinien

Alle in dieser Arbeit benutzten Zelllinien wurden in DMEM cplt Medium bei 37°C in einer H2O-gesättigten 5%-igen CO2 Atmosphäre kultiviert. Die Subkultivierung der Zellen erfolgte entsprechend ihres Wachstumes alle zwei bis vier Tage. Dazu wurde bei konfluenten Zellen das Kulturmedium abgenommen, die Zellen mit sterilem 1 x PBS gewaschen und mit 0,05%

Trypsin/0,02% EDTA-Lösung (Gibco; verdünnt mit sterilem PBS) trypsiniert. Nach einer kurzen Inkubationszeit von ca. fünf Minuten konnten die Zellen durch Abklopfen vom Kulturgefäßboden gelöst und in frischem Kulturmedium aufgenommen werden. Die Zellen wurden daraufhin in geringerer Dichte in ein anderes Kulturgefäß ausgesät.

2.2.7 Kryokonservierung von Zellen

Ungefähr 10⁶ Zellen wurden in Suspension für fünf Minuten bei 100 x g (Heraeus Multifuge 1SR; Thermo) pelletiert. Die sedimentierten Zellen wurden in Kryolösung (45ml FKS + 5ml DMSO) aufgenommen und auf -80°C abgekühlt. Nach ein bis zwei Wochen wurden sie für die dauerhafte Lagerung zu -150°C überführt.

Um die zuvor kryokonservierten Zellen wieder in Kultur zu bringen, wurden diese zunächst in einem Wasserbad bei 37°C aufgetaut, dann in Medium überführt und bei 100 x g (Hereaus Multifuge 1SR; Thermo) für fünf Minuten sedimentiert. Schließlich konnten die Zellen in Medium aufgenommen und in Zellkulturgefäße überführt werden.

2.2.8 Bestimmung der Zelldichte

Um die Dichte der Zellen in einer Suspension zu bestimmen, wurde eine Neubauer Zählkammer (LO-Laboroptik, Friedrichsdorf) benutzt. Eine Probe der Zellsuspension wurde in die Zählkammer gegeben und die Anzahl der Zellen in 16 Zählquadraten bestimmt. Das Volumen zwischen Zählkammer und Deckglas beträgt über 16 Quadrate 0,1 µl. Der gezählte Wert multipliziert mit 1 x 10⁴ ergibt somit die Anzahl der Zellen pro ml.

2.2.9 RNA-Transfektion

Mittels der Elektroporation wurden die in-vitro-Transkripte in Huh-7.5-Zellen transfiziert.

Dafür wurden die Zellen mit 1 x PBS gewaschen, mit 0,05% Trypsin/0,02% EDTA abgelöst und in DMEM cplt Medium aufgenommen. Die Zellzahlbestimmung erfolgte mit Hilfe einer Neubauer-Zählkammer. Das benötigte Zellvolumen wurde für fünf Minuten bei 1000 UpM

zentrifugiert, dann mit 1 x PBS gewaschen und erneut für fünf Minuten bei 1000 UpM zentrifugiert. Das Pellet wurde in einer Konzentration von 1,5 x 10⁷ Zellen/ml in 400 µl Zytomix resuspendiert. Die Zellsuspension wurde mit 5 oder 10 µg RNA in eine Elektroporationsküvette (0,4 cm Spaltbreite, BioRad, München) überführt und mit einem Gene-Pulser (BioRad) bei 975 µF und 270 Volt elektroporiert. Die Zellsuspension wurde schließlich je nach Experiment in 10 bis 16 ml Medium aufgenommen und ausgesät. Der Zellkulturüberstand wurde nach 48 und 72 Stunden abgenommen und filtriert (Porengröße:

0,45 µm) und je nach Experiment, z.B. zur Herstellung eines Virusstocks, aufkonzentriert (Amicon (Jc1-luc) bzw. Zentricon (Jc1 wt); Millipore).

2.2.10 DNA-Transfektion mit Lipofectamin

Die Durchführung der Transfektion mit Lipofectamine 2000 (Invitrogen) erfolgte gemäß Herstellerangaben.

2.2.11 Generierung von HCV-Pseudopartikeln

293T-Zellen wurden mit den Plasmiden pHit60, pRVF-luc und VSV-Gwt im Verhältnis 1:1:1 mit Hilfe von Lipofectamin nach Angaben des Herstellers für die Generierung von MLV-basierten VSV Pseudopartikeln transfiziert. Für die Erstellung MLV-basierter HCV Pseudopartikel wurden die Plasmide pHit60, pRVF-luc und ein Plasmid mit den HCV Hüllproteinen des Isolates J6, ebenfalls im Verhältnis 1:1:1 eingesetzt. Die Inkubation der Zellen erfolgte bei 37°C und 5% CO₂. Nach 48 Stunden Inkubationszeit wurden die Zellkulturüberstände abgenommen, filtriert (Porengröße 0,45 µm) und zur Infektion von Huh-7.5 Zielzellen benutzt.

2.2.12 Immunfluoreszenz (IF)-Analyse

In eine 24-Napf-Platte wurden Huh-7.5-Zellen in einer Dichte von 4 x 10⁴ Zellen/Napf auf Deckgläschen ausgesät. Die Zellen wuchsen für ein bis zwei Tage, bevor sie mit 400 µl 3%

Paraformaldehyd für zehn Minuten bei Raumtemperatur fixiert wurden. Vor der Fixierung wurden die Zellen einmal mit 1 x PBS, nach der Fixierung dreimal mit 1 x PBS gewaschen.

Es erfolgte die Permeabilisierung der Zellen mit 0,5% TritonX-100/PBS. Die diversen Primärantikörper wurden gemäß den Verdünnungen in Tabelle 2 verdünnt. Eine unspezifische Antikörperbindung wird durch die Zugabe von 5% Ziegennormalserum verhindert. Nach

einer Stunde Inkubation bei Raumtemperatur erfolgten drei Waschungen mit 1 x PBS und die Zugabe des an Fluoreszenzfarbstoffe gekoppelten Sekundärantikörpers (vgl. Tabelle 3), verdünnt in 1 x PBS mit 5% Ziegennormalserum. Es folgte eine Inkubationszeit im Dunkeln von 30 Minuten, dann eine einmalige Waschung mit 1 x PBS und die Färbung der Zellkerne mit DAPI (4,6-diamino-2-phenylindol-Dihydrochlorid, Molecular Probes). Dazu wurde die DAPI-Lösung 1:3000 (1:300 in H₂O, dann 1:10 Verdünnung in PBS) verdünnt und die Zellen mit der Lösung für eine Minute im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die auf Deckgläschen fixierten Zellen dreimal mit PBS und einmal mit Wasser gewaschen, um dann, in Fluoromount-G (Southern Biotechnology Associates) eingebettet, auf Objektträgern fixiert zu werden. Die Immunfluoreszenz-Aufnahmen wurden schließlich an einem Fluoreszenzmikroskop (Olympus IX 81) durchgeführt.

2.2.13 „Firefly“-Luziferase-Aktivitätsbestimmung

Zellen, die mit HCVcc oder HCVpp infiziert worden waren, wurden mit 1 x PBS gewaschen, in unterschiedlichen Volumina von Lyse-Puffer aufgenommen (für 6-Napf -Platte: 1ml; für 12-Napf-Platte: 350 µl; für 96-Napf-Platte: 35 µl) und bei -20°C eingefroren. Die Zelllysate wurden auf Eis aufgetaut. Bei der 6-bzw. 12-Napf-Platte wurden 100 µl des Lysats mit 360 µl des Probenpuffers versetzt. Mittels eines Luminometers (Lumar LB9507, Berthold) erfolgte die Aktivitätsbestimmung. Nach Injektion von 200 µl 200 mM Luziferinlösung wurde das Substrat von der „Firefly“-Luziferase umgesetzt und die Freisetzung der Photonen für 20 Sekunden gemessen. Bei der 96-Napf-Platte wurden 20 µl des Lysates für die Aktivitätsbestimmung im Mikroplattenluminometer (Berthold Microplate Reader LB 960 Centro XS³; Berthold Technologies DLReady) verwendet. Die Injektion von Probenpuffer und Luziferinlösung erfolgten innerhalb des Gerätes.

2.2.14 Histochemie und Virustitration (TCID50)

Dem Verfahren liegt das Protokoll von Lindenbach et al. [128] zur Virustiterbestimmung zu Grunde. Pro Napf einer 96-Napf-Platte wurden 200 µl einer Huh-7.5-Zellsuspension mit 5 x 10⁴ Zellen/ml ausgesät und für 24 Stunden bei 37°C und 5% CO2 kultiviert. Die filtrierten und konzentrierten Überstände der zuvor transfizierten Huh-7.5-Zellen wurden in einer Verdünnungsreihe titriert, wobei sechs Näpfe der naiven Huh-7.5-Zellen pro Verdünnung (1:10) infiziert wurden. Nach 72 Stunden wurden die Zellen mit eisgekühltem Methanol fixiert und für mindestens 20 Minuten bei -20°C gelagert. Das Methanol wurde anschließend

entfernt, die Zellen kurzzeitig an der Luft bei Raumtemperatur getrocknet und dann einmal mit 1 x PBS gewaschen. Es folgte die fünfminütige Permeabilisierung der Zellen mit 50 µl 0,5 % TritonX-100/PBS pro Napf. Daraufhin wurden die Zellen einmal mit 1 x PBS gewaschen, um dann für 45 Minuten mit dem Primärantikörper gegen NS5A (vgl. Tabelle 2) bei Raumtemperatur zu inkubieren. Die Zellen wurden anschließend dreimal mit 1 x PBS gewaschen, um dann für eine Stunde bei Raumtemperatur mit dem HRP-gekoppelten Sekundärantikörper α-Maus IgG (vgl. Tabelle 3) zu inkubieren. Es schlossen sich erneut drei Waschgänge mit 1 x PBS an. Zur Detektion wurde das HRP-Substrat aus 5 ml Acetatos, 1,5 Carbazol-Gemisch und 20 µl Wasserstoffperoxid angesetzt und mit einer Porengröße von 0,45 µm gefiltert. Es wurden 30 µl des Substrates pro Napf für die ca. 15-minütige Inkubation bei Raumtemperatur verwendet. Die Reaktion wurde mit Wasser gestoppt. Da NS5A-exprimierende Zellen rot gefärbt werden, konnten diese unter dem Lichtmikroskop identifiziert werden. Die Auswertung der Ergebnisse erfolgte statistisch nach der Methode von Kärber und Spearman [129-130].

2.2.15 Dichtegradient

Zwei Tage nach der Elektroporation von HCV-RNA in Huh-7.5-Zellen, wurden die daraufhin produzierten infektiösen Partikel (HCVcc) geerntet, gefiltert (Porengröße: 0,45 µm) und konzentriert (Amicon). Ein Milliliter des Ansatzes wurde so unter einen 0, 10, 20 und 30%

Iodixanol Schritt-Gradienten (Optiprep; Axis-Shield, Oslo, Norwegen) geschichtet, dass sich ein Endvolumen von 40% ergab. Dieser wurde hergestellt aus CSM („cell suspension medium“), bestehend aus 0,85% (wt/vol) NaCl und 10 mM Tricine-NaOH (pH 7,4). Die Gradienten wurde für 16 Stunden bei 30.000 x g und 4°C zentrifugiert (Sorvall Ultra WX80;

Rotor TH-641). Die Fraktionen (neun à 1 ml) wurden vom Grund der Röhrchen (12 ml PET Röhrchen; Thermo) geerntet und zur weiteren Infektion von Huh-7.5-Zellen in An- oder Abwesenheit von SEVI verwendet. Die Dichte der Fraktionen wurde mit einem Refraktometer bestimmt. Die Lagerung der Fraktionen erfolgte bei -80°C.