Erforschung des Einflusses von Samenflüssigkeit, seiner Komponenten und

Mit dem Zweck zum ersten Mal im Rahmen eines authentischen HCV-in-vitro-Systems erste Erkenntnisse über die Stabilität von HCV in Gegenwart von Sperma oder dessen Einfluss auf die HCV-Infektiosität zu erlangen, wurde zunächst, analog zu den Versuchen mit Muttermilch, der Effekt einer 24-stündigen Inkubation der mit jeweils unterschiedlichen Spermaproben versetzten Inokulate untersucht. Dabei konnte bei keiner der zehn Spermaproben oder bei dem Spermapool ein signifikanter infektiositätsmindernder oder eventuell sogar –steigernder Einfluss festgestellt werden. Das Virus ist somit in der Gegenwart von Sperma vergleichsweise stabil wie in der Anwesenheit von DMEM cplt- Medium geblieben. Dieses trifft gleichermaßen für alle getesteten Spermaproben zu, womit von einer inhaltlichen Kohärenz ausgegangen werden kann. Allerdings konnte ähnlich wie bei den Versuchen mit Muttermilch eine geringe Zytotoxizität detektiert werden, die mit einem direkten schädlichen Einfluss der Samenflüssigkeit auf die Huh-7.5-Zellen zu erklären ist.

Diese Ergebnisse gehen konform mit wissenschaftlichen Erkenntnissen über die anscheinend häufige Zytotoxizität von Samenflüssigkeit auf Zellen [134-135].

Im weiteren Verlauf wurde versucht, den Zeitraum der Stabilität von HCV in Anwesenheit von Sperma genauer einzugrenzen. So gelang in dieser Arbeit der Nachweis, dass die HCVcc nur über einen bestimmten Zeitraum von weniger als zumindest 7 Tage bei einer Inkubation mit Sperma stabil bleiben. Dies deutet auf einen Effekt der Samenflüssigkeit auf die HCVcc hin, da die Mediumvergleichsprobe zu jenem Zeitpunkt noch immer einen relativ hohen Virustiter aufweist. Jedoch verliert auch das Virus in Abwesenheit von Sperma an Stabilität, denn es kann nach 28-tägiger Inkubation keine Infektion mehr nachgewiesen werden. Dies läuft konform mit aktuellen wissenschaftlichen Erkenntnissen [8]. Allerdings wurde dieses Experiment nur einmal durchgeführt und sollte zur Bestätigung der Beobachtungen wiederholt werden.

Zusammenfassend kann damit festgehalten werden, dass HCV in Gegenwart von Sperma für mindestens 24 Stunden stabil bleibt und somit zumindest potentiell die Transmission des Virus‘ auf dem Weg des Geschlechtsverkehrs denkbar wäre. Jedoch wird in weiteren Studien einerseits herauszufinden sein, warum HCV nur mindestens 24 Stunden in Gegenwart von Samenflüssigkeit stabil bleibt und andererseits, wie die in-vivo-Situation mit Sperma Infizierter zu bewerten ist. Allerdings weisen die Ergebnisse darauf hin, dass die

HCV-Transmission bei Kontakt von Samenflüssigkeit mit bestehenden Läsionen des Partners während des Geschlechtsverkehrs möglich ist.

4.2.1 Einfluss von SEVI und EGCG

In einer Studie konnten die sich in humanem Sperma bildenden Amyloidfibrillen (SEVI) identifiziert werden, die ferner einen infektiositätssteigernden Einfluss auf das HI-Virus nehmen. Die Steigerung war dabei von der eingesetzten SEVI-Dosis von 1 bis maximal 200 µg/ml abhängig [121]. In der vorliegenden Arbeit wurde daraufhin versucht, diese Erkenntnisse auf das Hepatitis-C-Virus anzuwenden. Jedoch gelang es nicht, einen solchen Effekt von SEVI auf HCV nachzuweisen. Zwar war es möglich, eine geringfügige von der SEVI-Dosis abhängige Zunahme der „Firefly“-Luziferase-Signalstärke bei Verwendung eines unverdünnten Viruskonzentrates zu verzeichnen. Jedoch kann diese Veränderung nicht als signifikant gewertet werden. Es hätte dennoch der Fall seien können, dass HCV durch den hohen Virustiter übersättigt ist und SEVI daher keinen weiteren Einfluss auf dessen Infektiosität nehmen kann. Der Versuch wurde deshalb mit verdünntem Viruskonzentrat wiederholt. So konstatierten auch Münch und Kollegen, dass die HIV-infektionssteigernde-Potenz von SEVI bei geringer Viruslast am Größten sei [121]. Aber auch diese auf HCV übertragene Hypothese konnte in dieser Arbeit nicht bestätigt werden.

Da ein minimaler Anstieg des „Firefly“-Luziferase-Signals und somit der Infektiosität beobachtet werden konnte, wurde schließlich überprüft, ob SEVI HCV-Partikel bestimmter Dichte beeinflusst. Schließlich konnte bereits bewiesen werden, dass HCV aus Serum unterschiedlicher Dichte besteht [132]. Allerdings konnte im Rahmen dieser Dissertation keine signifikante Einflussnahme von SEVI auf eine der Fraktionen nachgewiesen werden.

Die fehlende Übertragbarkeit der bei HIV gefundenen Effekte von SEVI auf HCV könnte damit erklärt werden, dass HCV-Partikel im Gegensatz zu HIV-Partikeln jeweils sehr dicht mit Glykoproteinen ausgestattet sind. Die genaue Dichte der Hüllproteine eines HCV-Partikels ist noch nicht bekannt, jedoch konnten Münch et al. kürzlich bestätigen, dass solche Viren mit weniger Hüllglykoproteinen wie HIV-1, HIV-2, verschiedene simiane Immundefizienz Viren, das feline Immundefizienz Virus, Koala Retrovirus, schweineähnliches endogenes Retrovirus, felines Leukämie Virus, murines Leukämie Virus, xenotropes-Mäuse-Leukämievirus-verwandtes Virus sowie Marburg Virus auf die infektiositätssteigernde Wirkung von SEVI ausgezeichnet ansprechen. Hingegen erwiesen sich Viren mit vermutlich sehr dicht ausgestatteten Glykoproteinen wie das Herpes simplex

Virus-1/-2, Cytomegalie Virus, Hepatitis-B-Virus, Dengue, Respiratory-Syncytial-Virus, VSV sowie das Masern Virus als nicht oder nur geringfügig zugänglich für die durch SEVI verursachten Effekte. Darüber hinaus ergaben Versuche mit unterschiedlichen Quantitäten von VSV-G in HIV-Pseudopartikeln eine inverse Korrelation hinsichtlich der infektiositätssteigernden Wirkung von SEVI. Dabei war der größte Effekt bei der niedrigsten Menge von VSV-G zu beobachten [Prof. Münch, mündliche Mitteilung]. Daher liegt es nahe, dass der Unterschied in dem Wirkungsspektrum von SEVI gegenüber HIV in der Dichte der Hüllglykoproteine der HCV-Partikel und folglich in der Zugänglichkeit der Virusmembran begründet ist. Ferner zählen die HCV-Partikel diesen Ergebnissen zu Folge vermutlich zu solchen mit sehr vielen Hüllglykoproteinen.

Hauber und Kollegen veröffentlichten eine Studie, die einen inhibitorischen Effekt des EGCG auf SEVI während einer HIV-Infektion suggerieren [123]. Allerdings ist diese Interpretation ihrer Ergebnisse in Frage zu stellen. So soll EGCG, in den Konzentrationen zwischen 0,625 und 2,5 mM, dosisabhängig in der Lage sein, SEVI, in seiner Eigenschaft die HIV-Infektiosität zu steigern, mit großer Effizienz zu antagonisieren. Jedoch handelt es sich dabei lediglich um Effekte die um den Faktor 2 gesteigert sind. Diese können im Allgemeinen nicht als signifikant gewertet werden. Ferner gelang in jener Studie kein Nachweis eines direkten antiviralen Effekts von EGCG gegenüber der HIV-Infektion.

Dennoch gaben diese und andere Studien, in denen antivirale Eigenschaften gegenüber anderen Viren des EGCG konstatiert wurden [124-125], Anlass dazu, den potenziellen Einfluss dieses Catechins auf HCV in der vorliegenden Arbeit zu überprüfen.

Zunächst wurde der Einfluss von EGCG auf die HCV-Replikation und die Freisetzung infektiöser Partikel getestet. Es konnte mittels des Luziferase-Assay nachgewiesen werden, dass die Replikation der HCV-RNA durch EGCG nicht beeinträchtigt wird. Allerdings konnte bei der anschließenden Überprüfung der Anzahl von den Zellen freigesetzter HCV-Partikel ein geringfügiger Rückgang dieser messbaren Partikel mit zunehmender EGCG-Konzentration verzeichnet werden. Scheinbar wird also die Replikation der RNA nicht durch EGCG inhibiert, aber dennoch ist durch die Anwesenheit von EGCG die Sezernierung der neu gebildeten Partikel etwas gestört. Es ist wahrscheinlich, dass dieser Sachverhalt in einer leichten zytotoxischen Wirkung des EGCGs begründet liegt.

Bei der Betrachtung des Einflusses von EGCG sowohl auf den Zelleintritt als auch auf die Replikation von HCV, konnte festgestellt werden, dass EGCG die Infektiosität des Virus‘

inhibiert. So nahm die Intensität des Luziferase-Signals bei steigenden Konzentrationen von EGCG soweit ab bis es unterhalb der Messschwelle lag. Auffällig ist, dass diese Wirkung auf

HCV nur EGCG hat, nicht aber seine Derivate EGC, ECG oder EC. Lediglich seinem Derivat ECG konnte in dieser Arbeit ein ähnlicher, aber weniger potenter Einfluss auf die Minderung der HCV-Infektiosität nachgewiesen werden. Daher ist es offensichtlich, dass den Derivaten von EGCG eine bestimmte chemische Gruppe vergleichsweise fehlt, um die HCV-Infektiosität zu inhibieren. Auch Song et al. gelang es analog dazu, einen inhibitorischen Effekt des EGCGs und des ECGs, nicht aber der weiteren Derivate, auf die Replikation des Influenzavirus‘ und der Neuraminidaseaktivität nachzuweisen. Dabei war auch in jener Studie der Effekt des EGCGs stärker ausgeprägt, als der seines Derivates ECG [136].

Da zwar ein inhibitorischer Effekt des EGCG auf die Infektiosität von HCV, nicht aber auf dessen RNA-Replikation bewiesen werden konnte, lag es nahe, den Einfluss auf den Zelleintritt von HCV genauer zu analysieren. Schließlich könnte durch den Nachweis der Verhinderung des Zelleintritts von HCV durch EGCG die bis dato in dieser Arbeit generierte Datenlage erklärt werden. Es wäre möglich, dass EGCG genau an dieser Stelle in den Mechanismus der Zellinfektion eingreift. Modellhaft wurde zur Überprüfung der aufgestellten Hypothese das HCV-Pseudopartikelsystem benutzt. Da hier nur die HCV-Hüllproteine E1 und E2 vorhanden sind lässt sich eine differenzierte Aussage über den Einfluss von EGCG auf die Effizienz des HCV-Zelleintritts treffen. Tatsächlich bestätigte sich in dieser Arbeit die Vermutung, dass EGCG den HCV-Zelleintritt des Genotyp 2a-Isolates inhibiert. Außerdem wurde ein vergleichbarer Effekt auf pseudotypisierte VSV-G-Partikel festgestellt. Es konnte eine positive Korrelation zwischen der eingesetzten EGCG-Dosis und der Abnahme der Infektiosität nachgewiesen werden.

Ein antiviraler Einfluss des EGCG auf das Hepatitis-C-Virus konnte somit erstmals im Rahmen dieser Arbeit mit einem etablierten Zellkultursystem nachgewiesen werden. Dabei war die Inhibition von HCV durch EGCG auf den Viruseintritt in die Zelle beschränkt und allein durch EGCG, nicht aber durch seine Derivate, effektiv möglich.

Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass sich die Daten aus der HIV-Forschung bezüglich der die Infektiosität steigernden Amyloidfibrillen nicht auf HCV übertragen lassen. Es gelang in dieser Arbeit nicht, einen solchen Effekt von SEVI auf HCV nachzuweisen. Hingegen konnte erstmals ein antiviraler Einfluss von EGCG auf das Hepatitis-C-Virus bewiesen werden. Durch diese Erkenntnisse wird der eventuell positive sowie unterstützende Einfluss des Konsums von grünem Tee, dessen Hauptbestandteil EGCG ist, auf die HCV-Therapie suggeriert. Darüber hinaus wäre es denkbar ein EGCG-Therapeutikum zu entwickeln,

insbesondere zum Beispiel für die Reinfektionsprophylaxe nach einer Lebertransplantation bei HCV-Positiven. Dieses wird allerdings noch in weiteren Studien zu erforschen sein.