Tierärztliche Hochschule Hannover
Ausbreitung der klassischen BSE-Prion-Erreger vom Darm über das periphere Nervensystem zum Gehirn
INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.)
Vorgelegt von Martin Kaatz Schwedt/Oder
Hannover 2014
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Martin Groschup
Friedrich-Loeffler-Institut, Institut für neue und neuartige Tierseuchenerreger, Insel Riems-Greifswald
1. Gutachter: Prof. Dr. Martin Groschup
Friedrich-Loeffler-Institut, Institut für neue und neuartige Tierseuchenerreger, Insel Riems-Greifswald 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Wolfgang Baumgärtner
Institut für Pathologie, Tierärztliche Hochschule Hannover
Tag der mündlichen Prüfung: 17.7.2014
Wer den Blick hebt, sieht keine Grenzen.
aus Japan
Für meine Familie
1 Einleitung ... 15
2 Literaturübersicht ... 16
2.1 Anatomische Grundlagen ... 16
2.1.1 Bauelemente des Nervensystems ... 17
2.1.2 Zentrales Nervensystem (ZNS) ... 17
2.1.2.1 Rückenmark ... 17
2.1.2.2 Gehirn/Stammhirn ... 18
2.1.3 Peripheres Nervensystem (PNS) ... 20
2.1.3.1 Vegetatives Nervensystem (VNS) ... 20
2.1.4 Enterisches Nervensystem (ENS) ... 22
2.2 Transmissible Spongiforme Enzephalopathien ... 23
2.2.1 Das Prion-Protein ... 24
2.2.1.1 Struktur des zellulären Prion-Proteins (PrPC) ... 24
2.2.1.2 Eigenschaften und Funktion des PrPC ... 24
2.2.1.3 Das pathologische Prion-Protein (PrPSc) ... 25
2.2.2 Erregerhypothese ... 25
2.2.3 Transmissible Spongiforme Enzephalopathien der Tiere ... 27
2.2.3.1 Pathologie der Transmissiblen Spongiformen Enzephalopathien ... 29
2.2.3.2 Diagnostik ... 31
2.2.3.3 Scrapie ... 32
2.3.3.4 Bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE) ... 34
2.3 Pathogenese der TSE-Erkrankungen ... 36
2.3.1 Dosis und Inkubationszeiten ... 37
2.3.2 Das lymphatische System ... 38
2.3.3 Das Periphere Nervensystem (PNS) ... 41
2.3.3.1 Neuroinvasion ... 41
2.3.3.2 Ausbreitung von PrPSc im PNS ... 42
2.3.3.3 Ausbreitungsmechanismen im Nervensystem ... 43
2.3.4 Alternative Ausbreitungswege von PrPSc im Körper ... 44
2.3.5 Akkumulation von PrPSc in extraneuronalen Geweben und Ausscheidung ... 45
2.3.6 Entzündungen und TSE ... 46
3 Tiere, Material und Methoden ... 48
3.1 Tiere ... 48
3.1.1 Rinder ... 48
3.1.2 Durchführung der Rinder-Pathogenesestudie ... 48
3.1.2.1 Tierhaltung ... 48
3.1.2.2 Inokulat und Inokulation ... 48
3.1.2.3 Verhaltensstudie ... 49
3.1.2.4 Probenentnahme ... 49
3.1.2.5 Bestandsbetreuung ... 50
3.1.3 Mäuse ... 51
3.1.3.1 Mauslinien ... 51
3.1.3.2 Inokulate ... 51
3.1.3.3 Durchführung des Tierversuchs ... 52
3.1.3.4 Probenentnahme ... 53
3.1.3.5 Inkubationszeiten ... 53
3.2 Probenmaterial ... 54
3.3 Histologische Methoden ... 57
3.3.1 Herstellung der histologische Präparate ... 57
3.3.2 Hämatoxylin-Eosin-Färbung ... 58
3.3.3 Bewertung der Hämatoxylin-Eosin-Färbung ... 58
3.3.4 Immunhistologische Untersuchungen ... 59
3.3.5 Immunhistologische Kontrollen ... 60
3.3.6 Bewertung der immunhistologischen Untersuchungen ... 60
3.4 Proteinbiochemische Methoden ... 61
3.4.1 Homogenatherstellung ... 61
3.4.2 Fällung mit Phosphorwolframsäure (PTA-Fällung) ... 62
3.4.3 Proteinauftrennung mittels SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese ... 62
3.4.4 Western Blot ... 63
3.4.5 Bewertung der Ergebnisse und Kontrollen ... 64
4 Ergebnisse ... 65
4.1 Allgemeine Ergebnisse ... 65
4.1.1 Klinische Symptomatik ... 65
4.1.2 Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung ... 66
4.1.3 Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchung ... 67
4.1.3.1 Quantifizierung der Ergebnisse ... 67
4.1.3.2 Lokalisation und Reaktionsmuster von PrPSc ... 68
4.1.4 Ergebnisse des Maus-Bioassay (Tgbov XV-Mäuse) ... 73
4.2 Zusammenfassende Betrachtung ... 74
4.2.1 Assoziation von Teilergebnissen ... 74
4.2.2 Strukturierung der Ergebnisse ... 76
4.3 Einzeltierergebnisse ... 77
4.3.1 Ergebnisse der Tiere ohne Beteiligung der Medulla oblongata ... 77
4.3.1.1 IT 28 (16 mpi) ... 78
4.3.1.2 IT 46 (16 mpi) ... 79
4.3.1.3 IT 50 (20 mpi) ... 79
4.3.1.4 IT 60 (20 mpi) ... 80
4.3.1.5 IT 58 (24 mpi) ... 81
4.3.1.6 IT 52 (28 mpi) ... 82
4.3.2 Ergebnisse der Tiere mit geringgradiger Beteiligung der Medulla oblongata ... 84
4.3.2.1 IT 24 (24 mpi) ... 84
4.3.2.2 IT 61 (32 mpi) ... 85
4.3.2.3 IT 25 (40 mpi) ... 86
4.3.3 Ergebnisse der Tiere mit mittel- bis hochgradiger Beteiligung der Medulla oblongata ... 89
4.3.3.1 IT 21 (28 mpi) ... 89
4.3.3.2 Zusammenfassung der weiteren Ergebnisse ... 91
4.4 Natürlich infiziertes Rind (R09/06)... 97
5 Diskussion ... 98
5.1 Ziel der Arbeit ... 98
5.2 Kritische Betrachtung des Untersuchungsmaterials ... 98
5.3 Allgemeine Betrachtungen ... 100
5.3.1 Ergebnisüberblick ... 100
5.3.2 Dosis, Inkubationszeiten und klinische Symptomatik ... 101
5.3.3 Zusammenhänge von erhobenen Befunden ... 102
5.3.4 Vergleich von Feldinfektion vs. experimenteller Studie ... 103
5.4 Pathogenese der BSE ... 104
5.4.1 Rolle des lymphatischen Systems ... 104
5.4.2 Rolle des ENS und Neuroinvasion ... 106
5.4.3 Ausbreitung im peripheren Nervensystem ... 107
5.4.3.1 Ausbreitungsrichtung ... 108
5.4.3.2 Gehirn ... 108
5.4.3.3 Rückenmark ... 109
5.4.3.4 Gemischtfaserige Ganglien ... 110
5.4.3.5 Sympathikus ... 112
5.4.3.6 Parasympathikus ... 112
5.4.4 Hypothese zur Ausbreitung im PNS ... 113
5.4.5 Transport des PrPSc ... 116
5.5 Pathogenese und Pathologie ... 118
6 Zusammenfassung ... 120
7 Summary ... 122
8 Literaturverzeichnis ... 124
9 Anhang ... 167
9.1 Histologische Methoden ... 167
9.1.1 Entparaffinierungs- und Differenzierungsprotokoll ... 167
9.2 Legende zur Verhaltensbeobachtung der Rinder ... 167
9.3 Puffer und Lösungen ... 171
9.3.1 Immunhistochemie ... 171
9.3.2 Hämatoxylin-Eosin-Färbung ... 172
9.3.3 Westernblot ... 173
Abkürzungsverzeichnis
µm Mikrometer
A Alanin
A. bidest. bidestilliertes Wasser Abb. Abbildung
AG Antigen
AK Antikörper
APS Ammoniumpersulfat
AS Aminosäure
BA Bioassay
BBP12/92 Boviner Brain Pool 12/1992 BHV1 Bovine Herpesvirus-1
bov bovine
BRSV Bovines Respiratorisches Synzytialvirus BSE Bovine Spongiforme Enzephalopathie bzw beziehungsweise
CJK, CJD Creutzfeldt-Jakob-Krankheit CO2 Kohlendioxid
C-terminal Carboxy-terminal
CWD Chronic Wasting Disease d.h. das heißt
DAB Diaminobenzidintetrahydrochloride DC Dendritische Zellen
DMNV Dorsaler motorischer Kern des Nervus vagus DNA Desoxyribonukleinsäure
Dpi days post infection
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure ENS Enterisches Nervensystem ER Endoplasmatisches Retikulum EU Europäische Union
exp experimentell
FA Firma
FAE Follikel-assoziiertes Epithel
fCJD familiäre Creutzfeldt-Jakob-Krankheit
FDC Follikulär Dendritische Zellen FFI Fatale Familiäre Insomnie FLI Friedrich-Loeffler-Institut
FSE Feline Spongiforme Enzephalopathie
g Gramm
GALT Darm-assoziiertes lymphatisches Gewebe GG gemischtfaserige Ganglien
Ggl Ganglion
GMGC Ganglion coeliacum-Komplex GPI-Anker Glykosylphosphatidylinositol-Anker GSS Gerstmann-Sträussler-Scheinker-Syndrom GT Ganglion trigeminale
HE Hämatoxylin-Eosin
hu human
i.c. intrazerebral i.p. intraperitoneal ID infektiöse Dosis IgG Immunglobulin G IHC Immunhistochemie
INNT Institut für neue und neuartige Tierseuchenerreger IT Infektionstier
Kap Kapitel kDa Kilo-Dalton
l Liter
Lnn. Lymphonodi
LRS Lymphoretikuläres System M Molar; Mol/Liter
mab monoklonaler Antikörper max maximal
min Minute ml Milliliter mm Millimeter mM Millimolar
MO Medulla oblongata
mpi Monate post infectionem
n Anzahl
N Nervus
n.a. nicht auswertbar n.d. nicht durchgeführt
neg negativ
Nn Nervi
NP 40 Nonidet P 40 N-terminal Amino-terminal o.g. oben genannt
O.I.E. Office International des Epizooties - Weltorganisation für Tiergesundheit OHV2 Ovines Herpesvirus Typ 2
ov ovin
PAGE Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese
PBS Phosphat-gepufferte Natriumchloridlösung PCR Polymerasekettenreaktion
PET-Blot Paraffin Embedded Tissue Blot p.i. post infection
PK Proteinase K
PMCA Protein Misfolding Cyclic Amplification PNS Peripheres Nervensystem
PP Peyer´sche Platten
Prion Proteinaceous infectious particle Prnp Prion-Protein-Gen
PrP Prion-Protein
PrP27-30 Proteinase K resistenter Teil des PrPSc PrPC zelluläres Prion-Protein
PrPSc Scrapie-Isoform des Prion-Proteins
PS Parasympathikus
PTA Phosphorwolframsäure PVDF Polyvinylpyrrolidon
Q Glutamin
R Arginin
rER rauhes Endoplasmatisches Retikulum
RM Rückenmark RNA Ribonukleinsäure
RT Raumtemperatur
S Sympathikus
s. siehe
S.E.M. Standardabweichung des Mittelwertes SAF Scrapie-assoziierte Fibrillen
sCJD sporadische Creutzfeldt-Jakob-Krankheit SDS Natriumdodecylsulfat
sog. sogenannt Tab. Tabelle
TBM Tingible body macrophages
TBS Tris-gepufferte Natriumchloridlösung TEMED N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin TME Transmissible Enzephalopathie der Nerze TNT tunneling nano tubes
Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan
TSE Transmissible Spongiforme Enzephalopathie Tween 20 Polyoxyethylen(20)sorbitanmonolaureat
U Unit
u.a. unter anderem ud undefiniert
UK United Kingdom
UV Ultraviolett
V Valin
vCJD Variante der CJD
VLA Veterinary Laboratories Agency VNS Vegetatives Nervensystem WB Western blot
z.B. zum Beispiel z.T. zum Teil
ZNS Zentrales Nervensystem ZVO Zirkumventrikuläre Organe
μg Mikrogramm
μl Mikroliter
15 Einleitung
1. EINLEITUNG
Transmissible spongiforme Enzephalopathien (TSE) treten bei unterschiedlichen Spezies auf.
Am bekanntesten sind dabei Scrapie bei Schafen, die chronisch zehrende Krankheit der Hirsche (CWD) und die Bovine Spongiforme Enzephalopathie (BSE) der Rinder. Bei all diesen Infektionskrankheiten wird ein pathogenes Prion-Protein als ursächlicher Erreger vermutet.
Im Jahre 1987 erstmals detailliert beschrieben, geriet BSE durch die sogenannte BSE-Krise in den Fokus der Öffentlichkeit. Am stärksten waren Rinder im Vereinigten Königreich betroffen und neben einer Vielzahl von europäischen Ländern wurden Fälle auch in den USA, Kanada und Japan nachgewiesen. Die Brisanz der Epidemie ergibt sich aus der Übertragbarkeit der BSE-Erreger auf den Menschen. Die als Variante der Creutzfeldt-Jakob- Krankheit (vCJD) bekannte Erkrankung wurde vermutlich durch den Verzehr von infiziertem Rindfleisch ausgelöst.
Als natürlicher Infektionsweg von BSE im Rind wird die orale Aufnahme von verseuchten, d.h. ungenügend vorbehandelten, Futtermitteln vermutet. Dies führte in den Jahren 1988 bzw.
1996 im Vereinigten Königreich sowie 2001 in der gesamten EU zu einem vollständigen Fütterungsverbot von Tiermehlen, weshalb es nach ca. 5 Jahren, der durchschnittlichen BSE- Inkubationszeit bei Rindern, zu rückläufigen Fallzahlen kam. Eine eindeutige Diagnostik kann bis zum heutigen Zeitpunkt lediglich post mortem durchgeführt werden, da ein zugelassener Lebendtest trotz interessanter Ansätze nicht zur Verfügung steht. Vor allem aus Versuchen mit Labortieren (Hamster, Maus) stammen die bisherigen Erkenntnisse über die Ausbreitung der BSE-Erreger im Tierkörper. Die lange Inkubationszeit und das zoonotische Potential ließen nur wenige Studien am natürlichen Wirt mit begrenzten Tierzahlen zu. So ist die Frage nach der Pathogenese von BSE nach oraler Infektion nach wie vor nur unvollständig beantwortet.
Der am Friedrich-Loeffler-Institut (FLI) durchgeführte Tierversuch zur Pathogenese der BSE umfasste insgesamt 74 Tiere, von denen 56 Kühe infektiöses Gehirn-Inokulat erhielten. Die umfassende Probenentnahme an präklinisch und klinisch erkrankten Rindern führte zu einem einzigartigen Pool von Geweben. Die hier vorgelegte Arbeit basiert auf der Untersuchung von Gewebeproben aus dem zentralen und peripheren Nervensystem sowie des Darms ausgewählter Tiere, um die neuronale Ausbreitung des BSE-Agens zum Gehirn darzustellen.
Literaturübersicht 16 2. LITERATURÜBERSICHT
2.1 Anatomische Grundlagen
Für das Verständnis der in dieser Dissertation verwendeten Termini erfolgt zunächst die Beschreibung der Bestandteile des Nervensystems unter Berücksichtigung der für die Pathogenese der Transmissiblen Spongiformen Enzephalopathien (TSE) relevanten Strukturen.
Wenn nicht anders gekennzeichnet, sind die folgenden Angaben dem Lehrbuch der Anatomie der Haustiere (NICKEL, SCHUMMER, SEIFERLE, 3. Auflage, 1991) entnommen.
Das Nervensystem wird in das Zentrale Nervensystem (ZNS), durch Gehirn und Rückenmark repräsentiert, und das Periphere Nervensystem (PNS) mit Nerven und Ganglien eingeteilt.
Morphologisch und funktionell ist die Grenze weniger deutlich, da die zum Großteil im zentralen Anteil liegenden Nervenzellen ihre Axone als periphere Nerven abgeben.
Das Enterische Nervensystem (ENS) ist im Schema der Abbildung 2.1 als eigenständiger Anteil dargestellt. Anderen Lehrmeinungen zufolge wird es dem vegetativen Anteil zugeordnet, da seine Steuerung den parasympathischen und sympathischen Nervenbahnen obliegt.
Abb. 2.1 Hierarchie des Nervensystems
Literaturübersicht 17 2.1.1 Bauelemente des Nervensystems
Das Nervengewebe baut sich aus den funktionell unterschiedlichen Zellelementen, Neuroglia und den Nervenzellen auf:
Die Neuroglia lassen sich in Astrozyten, Oligodendrozyten, Mikroglia und die Schwann´schen Zellen unterscheiden, die verschiedene Aufgaben wahrnehmen. Sie gewährleisten die Funktion des Nervengewebes, indem die unterschiedlichen Gliazellen den Liquor cerebrospinalis produzieren, den Stoffwechsel ermöglichen, Axone mit Mark- oder Myelinscheide umhüllen und phagozytierende Eigenschaften besitzen.
Die Nervenzellen bestehen aus dem kernhaltigen Zellkörper, dem Perikaryon, und den Fortsätzen, das bei jeder Nervenzelle nur einmal vorkommende Axon und die vielfach auftretenden Dendriten. Die Axone leiten Erregungen vom Zell-Leib weg und können damit Ausgangspunkt eines peripheren Nervens sein.
Die Gesamtheit der die Perikaryen einbettenden Nerven- und Gliazellfortsätze wird unter dem Begriff Neuropil zusammengefasst.
Im ZNS lässt sich immer die mehr oder weniger deutlich abgrenzbare graue Substanz (Substantia grisea) und die weiße Substanz (Substantia alba) unterscheiden. Die graue Substanz enthält Gliazellen (vor allem Astrozyten) und Neurone, während in der weißen Substanz die umhüllten Axone verlaufen.
2.1.2 Zentrales Nervensystem (ZNS)
2.1.2.1 Rückenmark
Die Ausdehnung des Rückenmarks erstreckt sich vom ersten Halswirbel bis zum Kreuzbein.
Es wird aufgrund seiner Lage im Wirbelkanal und durch die segmental abgehenden Rückenmarksnerven (Nn. spinales) in das Halsmark (Pars cervicalis), das Brustmark (Pars thoracica), das Lendenmark (Pars lumbalis) und das Kreuzmark (Pars sacralis) sowie das Schwanzmark (Pars caudalis) unterteilt.
Der innere Aufbau des Rückenmarks ist mit der H- oder der Schmetterlingsform der grauen Substanz und der sie umgebenen weißen Substanz makroskopisch sichtbar (s. Abb. 2.2, S.18).
Im Feinbau weist die graue Substanz bilateral symmetrisch das Dorsalhorn (Cornu dorsale) und das Ventralhorn (Cornu ventrale) auf. Die jeweiligen Seiten korrespondieren über die
18 Literaturübersicht Commissura grisea, die ihrerseits in die Substantia intermedia lateralis und die den Canalis centralis umschließende Substantia intermedia centralis unterteilt werden kann.
Die sensiblen Neurone des Dorsalhorns empfangen Reize über afferente Nervenfasern der Radix dorsalis und ihrem Spinalganglion (Ganglion spinale). Im Ventralhorn finden sich große motorische Neuronen, deren efferenten Axone als Radix ventralis gemeinsam mit der Radix dorsalis als gemischtfaseriger Spinalnerv, Truncus nervi spinalis, den Wirbelkanal verlassen. Motorische sympathische Wurzelzellen sind in der Substantia intermedia lateralis lokalisiert.
Die weiße Substanz lässt sich in einen Dorsalstrang (Funiculus dorsalis), einen Lateral- und Ventralstrang (Funiculus lateralis/ventralis) einteilen. Weiterhin werden Commisura alba, Fissura mediana ventralis und der Sulcus medianus dorsalis beschrieben. Funktionell besteht die weiße Substanz aus markhaltigen Nervenfasern, die als Bündel (Tractus) funktionell unterschiedlich in aufsteigenden und absteigenden Bahnen verlaufen.
Abb. 2.2 Schematische Darstellung des Rückenmarks
Strukturen der grauen Substanz: 1. Cornu ventrale, 2. Cornu dorsale, 3. Commisura grisea;
Strukturen der weißen Substanz: 4. Funiculus anterior, 5. Funiculus lateralis, 6. Funiculus posterior, 7. Commisura alba, 8. Fissura mediana ventralis; 9. Sulcus medianus dorsalis; 10.
Canalis centralis, 11. Radix ventralis, 12. Radix dorsalis, 13. Ganglion spinale
2.1.2.2 Gehirn/Stammhirn
Als zentrales, übergeordnetes Steuerungsorgan entspringen dem Gehirn 12 paarige Nerven (Nervi craniales), die ihren Ursprung in den verschiedenen Abschnitten des Gehirns finden.
Je nach Funktion weisen die einzelnen Nerven einen sensiblen, sensorischen oder motorischen Fasergehalt auf. Neben diesen reinen treten auch gemischte Nerven auf, die
Literaturübersicht 19 durch den Faseraustausch mit Ganglien zusätzlich sympathische und parasympathische Qualitäten besitzen können.
Ein spezielles Endothel mit tight junctions schützt als Blut-Hirn-Schranke und Blut-Liquor- Schranke das Gehirn und gewährleistet über aktive und passive Transportvorgänge die Versorgung. Eine eingeschränkte Blut-Hirn-Schrankenfunktion weisen die zirkumventrikulären Organe (ZVO) auf, die über ein fenestriertes Endothel Hormone sezernieren und sensorische Funktionen besitzen.
Abb. 2.3 Schematischer Querschnitt der Medulla oblongata mit den für die TSE Diagnostik relevanten Kerngebieten, Abb. aus CASALONE et al. 2005
Für die BSE-Routine-Diagnostik wird die Region des Obex im Bereich des verlängerten Marks (Medulla oblongata) untersucht. Die Medulla oblongata als Teil des Stammhirns (Myelencephalon) bildet den am weitesten kaudal gelegenen Teil des Gehirns und stellt die Verbindung zum Rückenmark her. Der Obex selbst bildet mit anderen Strukturen den kaudalen Abschluss des Daches des IV. Ventrikels.
Die graue Substanz dieses Anteils der Medulla oblongata wird durch mikroskopisch isolierbarer Nervenzellnester als Kerngebiete (Nuclei) bestimmter Gehirnnerven repräsentiert (s. Abb. 2.3), die von der weißen Substanz umschlossen und teilweise durchzogen wird.
Funktionell ist die Medulla oblongata damit ein wichtiges Zentrum peripherer Nerven und kann als Koordinations- und Reflexzentrum charakterisiert werden.
20 Literaturübersicht 2.1.3 Peripheres Nervensystem (PNS)
Das PNS umfasst alle für die Erregungsleitung verantwortlichen Nerven und Ganglien, die direkt oder indirekt Kontakt zum ZNS haben.
Die Skelettmuskulatur und Sinnesorgane werden durch das somatische System innerviert, während vegetative oder autonome Nerven und Ganglien für die adäquate Steuerung der Organe und Organsysteme sorgen.
Im Folgenden werden lediglich die für diese Arbeit relevanten Strukturen beschrieben.
2.1.3.1 Vegetatives Nervensystem (VNS)
Im VNS wird das sympathische vom parasympathischen System differenziert, die sich durch ihre antagonistische Wirkungsweise und durch die chemische Natur ihrer Transmittersubstanzen (Sympathikus: Adrenalin, Noradrenalin; Parasympathikus:
Acetylcholin) unterscheiden. Eine schematische Übersicht der für diese Arbeit relevanten Anteile des vegetativen Nervensystems zeigt die Abb. 2.4 (S.21).
Sympathisches Nervensystem
Der Ursprung des Sympathikus liegt in den Wurzelzellen der Substantia intermedia des Rückenmarks. Die entsprechenden Axone verlassen den Wirbelkanal über die Ventralwurzel und finden größtenteils Anschluss an die Ganglienkette des Grenzstranges (Truncus sympathicus), wo zum Teil die Umschaltung auf das sekundäre Neuron erfolgt. Manche Fortsätze durchziehen jedoch diese sogenannten Paravertebralganglien und werden erst in den sogenannten Prävertebralganglien auf das zweite Neuron verschaltet.
Der Halsteil des sympathischen Grenzstranges enthält das Ggl. stellatum und im Kopfbereich das Ggl. cervicale craniale. Dieses Paravertebralganglion stellt nach erfolgter Umschaltung größtenteils den sympathischen Anteil der Gehirnnerven. Der Brustteil besteht aus einer Kette symmetrisch und segmental angeordneter Paravertebralganglien (Ganglia trunci sympathici), welche die Nervi splanchnici majores abgeben, die als Eingeweidenerven zum Plexus bzw.
Ggl. coeliacum ziehen.
Das Ggl. coeliacum wird zusammen mit dem anatomisch nicht separierbaren Ggl.
mesenteriale craniale als Ganglionkomplex (englisch: Coeliac Mesenteric Ganglion Complex, CMGC) angesprochen und ist dem Bauchteil des Sympathikus zugeordnet. In enger Verbindung mit dem Ggl. mesentericum caudale ist es für die sympathische Innervation des
Literaturübersicht 21 Darmsystems verantwortlich. In diesem als Prävertebralganglion fungierende Nervenzellknoten werden die Fasern des N. splanchnicus auf die sekundären postganglionären Neurone umgeschaltet und führt durch den Anschluss von Zweigen des N.
vagus der Ganglienkomplex auch parasympathische Fasern.
Parasympathisches System
Der kraniale Teil des Parasympathikus hat seine Ursprung im Mittelhirn und der Medulla oblongata, während die Wurzelzellen des kaudalen Anteils in der Substantia intermedia des Kreuzmarks (Pars sacralis) lokalisiert sind. Erstgenannter Teil versorgt die Organe des Kopfes und der Bauch- und Beckenhöhle, die parasympathische Innervation der Beckenorgane und des Geschlechtsapparates erfolgt durch den Pars sacralis.
Abb. 2.4 Schematische Darstellung von Anteilen des zentralen und peripheren Nerven- systems
ZNS: 1-Gehirn, 1a-Ebene des Obex in der Medulla oblongata, 2a-Halsmark, 2b-Brustmark, 2c-Lendenmark, 2d-Kreuzmark des Rückenmarks; sympathisches System: 3-sympathischer Grenzstrang, 4-Ggl. cervicale craniale, 5-Ggl. stellatum, 6-Nn. splanchnici majores, 7-Nn.
splanchnici lumbales; parasympathisches System: 8-N.vagus, 9-Ggl. nodosum; somatisches System: 10 Ggl. trigeminale; gemischte Anteile: 11-Ggl. coeliacum, 12-Ggl. mesenteriale caudale, 13- Plexus aorticus abdominalis (Abb. modifiziert nach (NICKEL, SCHUMMER, SEIFERLE, 3. Auflage, 1991)
22 Literaturübersicht Der N. vagus ist der bedeutsamste Nerv des parasympathischen Systems, führt aber auch somatomotorische, sensible und sympathische Fasern. Im Bereich des Nucleus tractus solitarii und Nucleus tractus nervi trigemini der Medulla oblongata enden die afferenten Wurzelfasern, während die parasympathischen Wurzelzellen im Kern des N. vagus (s. Abb.
2.4, S.21) des verlängerten Marks liegen.
Der N. vagus enthält im Nervenstrang selbst z.T. zahlreiche Neuronennester und durchläuft das Ggl. distale oder nodosum, welches die sekundären Neurone der afferenten Nervenfasern enthält. Über eine Vielzahl von Ästen ist der N. vagus unter anderem an der Steuerung der Kehlkopffunktion und des Herzens beteiligt, besitzt aber auch viszerosensible und - motorische Fasern für die Funktion der meisten Organe im Brust- und Bauchraum. Im Bauchraum erhält er dabei eine anatomische Verbindung mit den Ggl. coeliacum.
Des Weiteren führt der N. vagus auch einige sympathischen Fasern, die ihm durch das Ggl.
cervicale craniale zugeführt werden.
2.1.4 Enterisches Nervensystem (ENS)
Die folgenden Angaben sind dem Buch „The enteric nervous system“ (FURNESS, 2006) entnommen und durch weitere Literaturangaben ergänzt.
Das ENS setzt sich aus Neuronen, ihren Axonen und Gliazellen in Form kleiner, aber sehr zahlreicher Ganglien zusammen. So wird der Darm einerseits autark über Reflexbögen gesteuert, über ein weitreichend verschaltetes Netzwerk erfolgt aber auch eine intensive Kommunikation mit dem ZNS.
Die extrinsische Steuerung wird vor allem durch Nerven sympathischer Qualität gewährleistet (OHMORI et al. 2008), die auch für die direkte Innervation der Peyer`schen Platten bestimmt werden konnten (DEFAWEUX et al. 2007; CHIOCCHETTI et al. 2008) und somit eine funktionelle Verbindung zwischen dem Nerven- und dem Immunsystem darstellen.
Nach der Lokalisation werden zwei Plexus unterschieden. Zu Veranschaulichung der anatomischen Verhältnisse dient Abb. 2.5 (S.23).
Der Plexus myentericus (Auerbach`scher Plexus) befindet sich zwischen der longitudinalen und der zirkulären Schicht der äußeren Muskulatur des Verdauungstraktes. Der myenterische Plexus, dessen Ganglien über sogenannte interganglionäre Stränge vernetzt sind, ist in allen Abschnitten das Gastrointestinaltraktes zu finden. Dabei wird primär unabhängig vom ZNS
Literaturübersicht 23 die Motilität und Peristaltik des Verdauungssystems gesteuert. Allerdings greifen Parasympathikus und Sympathikus in die Aktivität des Plexus ein und beeinflussen somit die Darmmotilität.
Das Auftreten des Plexus submucosus (Meißner`scher Plexus) ist auf die Bereiche des Dünn- und Dickdarms beschränkt. Die variable Lokalisation der Ganglien und funktionell verschiedenen Neuronen-Typen konzentrieren sich auf die Submukosa und können dort die Follikel der Peyer`schen Platten umspannen, während einzelne Neurone aber auch in der Mukosa zu finden sind. Funktionell ist dieser Plexus für die Innervation der Mukosa, für den transepithelialen Ionentransport, die Regulation der mukösen Blutversorgung und für Immunreaktionen verantwortlich (SURPRENANT, 1994).
Abb. 2.5 Schematische Darstellung der Anteile des enterischen Nervensystems
A: Mukosa; B: Muscularis mucosae; C: Submukosa; D: zirkuläre Muskulatur; E:
longitudinale Muskulatur; 1: Peyer´sche Platten; 2: Follikel-assoziiertes Epithel (FAE);
Neurone des 3: internen mukösen Plexus; 4: des externen mukösen Plexus; 5: des myenterischen Plexus; 6: interganglionäre Stränge
2.2 Transmissible Spongiforme Enzephalopathien
Bei den Transmissiblen Spongiformen Enzephalopathien (TSE) handelt es sich um übertragbare, progressiv verlaufende neurodegenerative Erkrankungen, die bei verschiedenen Säugetierspezies auftreten. Als ursächlicher Erreger wird für diese Krankheiten nach heutigem Wissenstand eine abnormale Form des eigentlich zellulären, d.h. körpereigenen, Prion-Proteins (PrPC, C von cellular) (PRUSINER 1982; PRUSINER et al. 1990)
24 Literaturübersicht angenommen. Diese abnormale, fehlgefaltete Isoform akkumuliert bei den bekannten TSE und wird als PrPSc (Sc von Scrapie) bezeichnet.
2.2.1 Das Prion-Protein
2.2.1.1 Struktur des zellulären Prion-Proteins (PrPC)
Prion-Protein PrPC ist ein körpereigenes, extrazelluläres und hochkonserviertes Glykoprotein (RIEK et al. 1996; HORNEMANN et al. 2004; GOSSERT et al. 2005; LYSEK et al. 2005), welches durch das Prion-Protein-Gen (Prnp) kodiert wird und sich im Genom einer Vielzahl von Säugetierspezies, Reptilien, Vögeln und Amphibien findet (WOPFNER et al. 1999;
CALZOLAI et al. 2005).
Die posttranslationalen Modifikationen des Proteins im Endoplasmatischen Reticulum und dem Golgi-Apparat umfassen die Bildung einer Disulfid-Brücke und die Glykosylierung (PRUSINER 1998; HARRIS 2003), die zur Bildung dreier Isoformen führt: unglykosyliert, einfach oder zweifach glykosyliert (RUSSELAKIS-CARNEIRO et al. 2002).
Am reifen Protein lässt sich ein N-Terminus mit einer hochkonservierten Oktarepeatregion und ein globulärer C-terminaler Bereich unterscheiden (RIEK et al. 1996).
2.2.1.2 Eigenschaften und Funktion des PrPC
PrPC ist gut löslich, wird durch Proteinasen vollständig abgebaut und weist zudem im Gegensatz zu seiner pathologischen Isoform eine höhere Empfindlichkeit gegenüber Hitze, pH-Wert-Schwankungen und UV-Strahlung auf. Die PrPC-Expression findet bei Säugern vor allem im ZNS und in geringeren Mengen in nahezu allen Körpergeweben statt (BENDHEIM et al. 1992; FORD et al. 2002), darunter auch Zellen des Immunsystems (DODELET u.
CASHMAN 1998). Die physiologische Funktion des Proteins wurde von WESTERGARD et al. (2007) zusammenfassend diskutiert: Neben zytoprotektiven Effekten scheint das Protein indirekte Auswirkungen auf die neuronale Differenzierung, Reifung und Regeneration zu haben. Als interaktives Transmembranprotein ist die Beteiligung an Signalkaskaden und bei der synaptischen Übertragung wahrscheinlich. Darüber hinaus ist PrPC offensichtlich an der Zelladhäsion beteiligt und bedingt die zelluläre Aufnahme und Bindung von Kupferionen.
Eine aufgrund des hohen Konservierungsgrades vermutete essentielle Rolle des Prion- ProteinPrion-Proteins wird durch Lebensfähigkeit von PrP- knock-out-Mauslinien (PrP0/0) in
Literaturübersicht 25 Frage gestellt. Die Herstellung dieser transgenen Mäuse führte zu phenotypisch unveränderten Tiere (BÜELER et al. 1992).Allerdings berichten andere Studien eine gestörte neuronale Erregung (COLLINGE et al. 1994; COLLING et al. 1995), eine höhere Anfälligkeit gegenüber oxidativem Stress (BROWN et al. 1999) und anormale Schlafrhythmen bei PrP0/0-Mäusen (TOBLER et al. 1996).
2.2.1.3 Das pathologische Prion-Protein (PrPSc)
PrPC und das pathologische Prion-Protein (PrPSc) besitzen die gleiche Aminosäuresequenz. Es bestehen jedoch deutliche Unterschiede hinsichtlich ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften und ihrer Struktur.
So zeigt die pathologische Form des Prion-Proteins eine ausgesprochen hohe Widerstandsfähigkeit gegenüber chemischen und physikalischen Einflüssen (HUNTER et al.
1964; ALPER et al. 1966, 1967). Neben der Unlöslichkeit in wässrigen Lösungen sind herkömmliche Desinfektionsmittel gegen PrPSc kaum oder gar nicht wirksam.
Als wichtigstes Unterscheidungskriterium gilt die partielle Resistenz der pathologischen Isoform gegen Proteinasen, beispielsweise Proteinase K (PK) (OESCH et al. 1985). Durch die Inkubation mit PK werden wird ein 27-30 kDa (PrP 27-30) großes Proteinfragment gebildet, das das Kernstück des PrPSc darstellt (PRUSINER et al. 1987). Untersuchungen mit transgenen, PrP27-30 exprimierenden Mäusen zeigten, dass dieses Fragment des Proteins für die Infektion der Tiere ausreicht (FISCHER et al. 1996). Es aggregiert und bildet regelmäßige, amyloide Strukturen, die man nach Aufreinigung als Prion-Rods bzw. Scrapie- assoziierte Fibrillen (SAF) anspricht (PRUSINER et al. 1983). Anhand der charakteristischen Verschiebung (shift) der molekularen Masse von PrPSc im Western Blot kann anhand der Glykosylierungsformen (un-, mono-, di-glykosyliert) der Erreger charakterisiert werden (KUCZIUS et al. 1998). So dominiert bei BSE anders als bei Scrapie die diglykosylierte Form (STACK et al. 2002), obwohl eine Diskriminierung von BSE und Scrapie nicht immer eindeutig möglich ist (BARON et al. 1999).
2.2.2 Erregerhypothese
Aufgrund der Tatsache, dass sich die Infektiosität des Scrapie-Erregers nicht durch herkömmliche Verfahren und Substanzen zum Abbau von Nukleinsäuren verringern lässt,
26 Literaturübersicht wurde erstmals durch ALPER et al. (1966) der Verdacht eines infektiösen Proteins geäußert.
Die Anreicherung eines Proteins der Größe von 27-30 kDa aus TSE-infiziertem Gehirnmaterial (PRUSINER et al. 1980) führte im Folgenden zur Formulierung der protein- only-hypothesis (OESCH et al. 1985). Diese Theorie postuliert PrPSc als infektiöses Agens, welches für die Erkrankung verantwortlich ist und seine Fehlfaltung auf das vorhandene, körpereigene PrPC überträgt. Die Replikation erfolgt durch die autokatalytische Konversion von Alpha-helix-reichem PrPC in die pathologische, Beta-faltblatt-reiche Isoform (PRUSINER 1998). Diese Konformationsänderung wird als entscheidendes Ereignis in der Pathogenese der Prion-Erkrankungen diskutiert. Für diesen neuartigen Erreger prägte PRUSINER aus der Bezeichnung „proteinaceous infectious particle“ den Begriff „Prion“, dem eine eigenständige Nukleinsäure fehlt (PRUSINER 1998).
Vielfältige Hinweise stützen diese Hypothese So konnte PrPC in vitro durch die Zugabe von PrPSc in die fehlgefaltete Form konvertiert werden (GASSET et al. 1992; KOCISKO et al.
1994). Weiterhin gelang mit hoch aufgereinigtem PrPSc die Infektion von Wildtypmäusen (PRUSINER 1982). Zudem war in vitro hergestelltes rekombinantes PrPC nach anschließender Überführung in eine Beta-Faltblatt-reiche Struktur für transgene Mäuse infektiös (LEGNAME et al. 2004). In einem entgegengesetzten Ansatz erwiesen sich PrPC- defiziente Mäuse gegen eine Infektion als resistent (BUELER et al. 1993).
Der Nachweis bei Wildtyptieren wäre ein finaler Hinweis für die Gültigkeit der 'protein-only- hypothesis'. Mittels zyklischer Amplifikation der Protein-Fehlfaltung (engl., protein misfolding cyclic amplification, PMCA) war in vitro generiertes PrPSc in der Lage, Wildtyp- Hamster zu infizieren (CASTILLA et al. 2005). Ein weiteres Experiment generierte ein Prion aus bakteriell exprimierten PrP, welches nicht nur die typischen Eigenschaften von PrPSc aufwies, sondern auch ohne Co-Faktoren für Wildtypmäuse infektiös war (WANG et al.
2010). Diese Ergebnisse wurden als Durchbruch für die Gültigkeit der 'protein-only- hypothesis' gewertet.
Dennoch war die mögliche Beteiligung anderer Faktoren am Infektionsprozess bis dato einer der Kritikpunkte (ABID u. SOTO 2006). Des Weiteren bestanden Zweifel, dass durch die unterschiedliche Faltung des Prion-Proteins die Information für verschiedene TSE Stämme kodiert werden kann. Außerdem konnte in einer Studie mit BSE-infizierten und klinisch erkrankten Mäusen bei 55% der Tiere kein PrPSc nachgewiesen werden. Erst nach mehreren Subpassagen gelang die Detektion von pathologischem Prion-Protein. Aus diesem Grund wurde ein bisher unbekannter Faktor für die eigentliche, klinische Infektion diskutiert (LASMEZAS et al. 1997).
Literaturübersicht 27 Eine andere Theorie beschäftigt sich mit der Beteiligung von Viren am Krankheitsgeschehen.
In dieser Virus-Hypothese von DIRINGER et al. (1994) und MANUELIDIS (1994) dient das Prion-Protein lediglich als Rezeptor für ein bisher nicht bekanntes Virus. Eine Prion-Infektion hat in vivo wie auch in der Zellkultur einen steigernden Einfluss auf die Expression bestimmter Retroviren (CARP et al. 1999; STENGEL et al. 2006). Deren Expression förderte die Freisetzung von Prionen/Infektiosität in den Überstand und die Verbreitung innerhalb der Kultur (LEBLANC et al. 2006).
Als mögliche Co-Faktoren erleichterten in vitro insbesondere kleine, hoch-strukturierte RNAs oder unspezifische DNAs die Konversion von Hamster-PrPC (CORDEIRO et al. 2001;
DELEAULT et al. 2003, 2005). Ergänzend zu vorherigen Studien zur Interaktion von PrPSc mit RNA (WEISS et al. 1997; DERRINGTON et al. 2002; ADLER et al. 2003;
SUPATTAPONE 2004), wird die Beteiligung eines RNA-haltigen Nukleoprotein-Komplexes diskutiert (SIMONEAU et al. 2009).
2.2.3 Transmissible Spongiforme Enzephalopathien bei Tieren
Die das ZNS betreffenden Erkrankungen (s. Tab. 2.1, S.28) treten nach einer verhältnismäßig langen Inkubationszeit von mehreren Monaten bis Jahren auf und enden stets letal (BUDKA et al. 1995). Sie führen zu neurodegenerativen Schädigungen, die durch spongiforme Läsionen im Neuropil, Degeneration von Nervenzellen und Astrozytose gekennzeichnet sind (FIELD u. PEAT 1969). Der progressive Krankheitsverlauf beginnt mit dem Einsetzen von Symptomen wie Verhaltensänderungen, Bewegungs- und Sensibilitätsstörungen und ist beim Menschen mit einer fortschreitenden Demenz verbunden.
Ähnlich wie bei anderen neurodegenerativen Erkrankungen wie der Alzheimer´schen oder der Parkinson´schen Krankheit können auch bei TSEs amyloide Plaques auftreten (SOTO 2003).
Prion-Krankheiten treten nicht nur sporadisch oder hereditär auf, sondern können auch auf natürliche, akzidentielle oder experimentelle Infektionen zurückgehen (CHANDLER 1961;
CHANDLER u. TURFREY 1972; WELLS et al. 2003). Bedeutsam ist das zoonotische Potentials der BSE-Erreger (BRUCE et al. 1997) – humane Infektionen sind seit Mitte der neunziger Jahre als Variante der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (vCJD) bekannt (WILL et al. 1996;
BUDKA 2001).
28 Literaturübersicht Allen Prion-Erkrankungen gemein ist das Ausbleiben einer detektierbaren humoralen und zellulären Immunantwort. Wirkungsvolle Therapie-Ansätze gegen TSEs bei Mensch und Tier gibt es derzeit noch nicht (VANA et al. 2007).
Am lebenden Tier kann anhand der klinischen Symptome lediglich eine Verdachtsdiagnose gestellt werden. Die Diagnose einer TSE-Erkrankung kann bis dato ausschließlich post mortem durch biochemische und immunhistochemische Tests gestellt werden.
Tab. 2.1 Liste natürlich auftretender Transmissibler Spongiformer Enzephalopathien
Natürliches
Vorkommen TSE Literatur
Mensch
Kuru ZIGAS u. GAJDUSEK (1957)
Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJK) (iatrogen, sporadisch, familiär-
genetisch, Variante)
CREUTZFELDT (1920), JAKOB (1921a; 1921b; 1921c) vCJK: WILL et al. (1996) Gerstmann-Sträussler-Scheinker-
Syndrom (GSS) GERSTMANN et al. (1936)
Fatale familiäre Insomnie (FFI) LUGARESI et al. (1986)
Schaf
Scrapie MCGOWAN (1922)
atypische Scrapie BENESTAD et al. 2003
Rind
Bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE)
WELLS et al. (1987) JEFFREY u. WELLS (1988)
atypische BSE CASALONE et al. 2004
BIACABE et al. 2004 Cerviden chronisch zehrende Krankheit der
Hirsche (CWD) WILLIAMS u. YOUNG (1980)
Katzen schwammartige Hirndegeneration der Katzen (FSE)
WYATT et al. (1990) PEARSON et al. (1992)
Nerz übertragbare Hirndegeneration der Nerze (TME)
BURGER et al. (1965) HARTSOUGH et al. (1965)
Literaturübersicht 29 2.2.3.1 Pathologie der Transmissiblen Spongiformen Enzephalopathien
Pathologische Veränderungen konnten bisher ausschließlich im ZNS lokalisiert werden. Es handelt sich dabei um neurodegenerative Prozesse, die nicht mit einem spezifischen inflammatorischen Geschehen einhergehen.
Histopathologische Veränderungen des Gehirns kommen bei allen TSE´s vor, sie unterscheiden sich aber hinsichtlich ihrer Ausprägung und Lokalisation. Die im Vordergrund stehenden spongiformen Veränderungen entstehen bilateral durch das Anschwellen von Perikarien (neuronale Vakuolen) und der Nervenfortsätze (Auflockerung des Neuropils) bei gleichzeitigem Verlust intrazellulärer Organellen.
Die histopathologischen Vakuolen bei klassischer BSE sind unabhängig von Rasse, Dosis und Art der Inokulation (WELLS u. SIMMONS, 1996). Die Läsionen in den Kerngebieten des Tractus solitarii, Tractus spinalis, N. trigeminus, N. vestibulares und der Substantia grisea periaquaeductalis der Medulla oblongata (Obex) können für eine BSE-Diagnose herangezogen werden, die Läsionen erstrecken sich aber auch auf das Cerebellum, Diencephalon, Mesencephalon und die Pons (WELLS u. WILESMITH, 1995).
Für Scrapie wird das Auftreten von Vakuolen im Mesencephalon, Diencephalon, Telencephalon, Corpus striatum beschrieben, die aber nicht in den Olivkernen, dem zerebralen Cortex und dem Hippocampus vorkommen (JEFFREY u. GONZÁLEZ, 2004).
Weiterhin weisen die Ergebnisse verschiedener Studien eine Vielzahl von Variationen abhängig vom Scrapie-Stamm, Genotyp und anderen individuellen Faktoren auf (ZLOTNIK 1958; WOOD et al. 1997; BEGARA-MCGORUM et al. 2002; LIGIOS et al. 2002).
Die Unterschiede in der neuroanatomischen Verbreitung der Vakuolen nach Adaptation an definierte Nagetiere können in Form von Läsionsprofilen dargestellt werden, durch die verschiedene Scrapie-Stämme differenzierbar sind (BEGARA-MCGORUM et al. 2002;
LIGIOS et al. 2002). Auch BSE-Infektionen zeichnen sich durch ein charakteristisches Läsionsprofil aus, identische Läsionsmuster von BSE und vCJD in Mäusen ließen zudem den Schluss eines direkten Zusammenhangs zwischen beiden TSE´s zu (BRUCE et al. 1997).
Wie auch die Vakuolisierung sind das Vorkommen einer Gliose und der Verlust von Nervenzellen keineswegs einheitlich. Bei einer Gliose handelt es sich um eine über das physiologische Maß hinausgehende erhöhte Anzahl von Gliazellen in einem geschädigten Bereich des Zentralnervensystems. Der Nachweis eines apoptotischen Neuronenuntergangs in signifikanten Tierzahlen konnte weder für Scrapie (LYAHYAI et al. 2006) noch für BSE (THEIL et al. 1999) erbracht werden, obwohl die Steigerung pro-apoptotischer Faktoren bei
30 Literaturübersicht Scrapie (SERRANO et al. 2009) und der Verlust von Nervenzellen bei BSE-Rindern (JEFFREY u. HALLIDAY 1994) beschrieben wurden. Für beide Erkrankungen können allerdings die Veränderungen auch unter einem lichtmikroskopisch detektierbaren Level liegen (FRASER 1976; WELLS et al. 1989, 1994; SOMERVILLE et al. 1997; CHAPLIN et al. 1998).
Als weiterer pathologischer Aspekt gilt der Nachweis von PrPSc-Akkumulationen mittels Immunhistochemie. Diese treten an den gleichen neuroanatomischen Lokalisationen wie die spongiformen Veränderungen auf (WELLS u. WILESMITH, 1995).
Tab. 2.2 Pathologische Befunde bei BSE und Scrapie
BSE Scrapie
Immunhistochemie - PrPSc- Akkumulation (4)
korreliert mit Vakuolisierung Lokalisation korreliert mit Vakuolisierung Akkumulationen:
perineuronal, linear, extrazellulär Neuropil-assoziiert
fein-punktiert, (linear, fein-punktiert und grobkörnig-partikulär , koaleszieren und perineuronal),
grobkörnig-partikulär Astrozyten-assoziiert
(sternförmig, subpial, subependymal und perivaskulär),
Ependymalzellen-assoziiert
(supraependymal)
Endothelzellen-assoziiert
(vaskuläre Plaques)
intraneuronal, intraglial intrazellulär intraneuronal, intraglial (1) WELLS u. WILESMITH, 1995; (2) JEFFREY et al. 2011; (3) HADLOW et al. 1982, (4) JEFFREY u. GONZÁLEZ, 2004
Bei der Bewertung der morphologischen und topographischen Muster, dem sogenannten PrPSc-profiling, lassen sich für klassische BSE relativ gleichmäßige und einheitliche PrPSc- Akkumulationen nachweisen. Dagegen weisen die Gehirne klinischer Scrapie-Fälle eine hohe Variabilität im PrPSc-Profil auf (s. Tab. 2.2). Dadurch lassen sich nicht nur Informationen zum Stamm und Ursprung des Scrapie-Erregers ableiten, es konnte ebenfalls die Abhängigkeit von der Inokulationsroute und dem Genotyp bei klinisch erkrankten Schafen gezeigt werden (JEFFREY u. GONZÁLEZ, 2007). Das sogenannte PrPSc-mapping bedient sich dagegen
Literaturübersicht 31 unterschiedlicher Antikörper, die spezifische Epitope des pathologischen Prion-Proteins erkennen und erlaubt so die immunhistologische Unterscheidung von BSE und Scrapie.
Die Korrelation zwischen Pathologie, Erregernachweis und Symptomen gestaltet sich ebenfalls uneinheitlich. So besteht bei einzelnen Individuen die Möglichkeit einer klinischen TSE-Erkrankung gänzlich ohne nachweisbare pathologische Veränderungen (KONOLD et al.
2008). Während Gliose und Neuronenverlust mit Depositionen des pathologischen Prion- Proteins assoziiert sind, trifft diese Korrelation nicht auf die spongiformen Veränderungen und apoptotische Prozesse zu. Als eigentliche Krankheitsursache wird daher der Verlust der protektiven PrPC-Funktion anstatt einer direkt schädigen Wirkung des PrPSc diskutiert (JEFFREY et al. 2011).
2.2.3.2 Diagnostik
Die Routine-Diagnostik bedient sich zunächst kommerzieller Schnelltests, die im Falle eines Reagenten weitergehende Untersuchungen in den nationalen Referenzlaboren zur Diagnosestellung nach sich ziehen. Hier kommen OIE-zertifizierte Testmethoden zur Anwendung, zu denen die Histopathologie, Immunhistochemie (IHC) und der Scrapie- assoziierte-Fibrillen (SAF)- Immunoblot gehören.
Abb. 2.6: Vergleich der elektrophoretischen Profile und der Antikörperbindung nach Proteinase K Verdau, PTA-Präzipitation und Immunoblot bei Verwendung der monoklonalen Antikörper P4 und L42 (modifiziert nach Gretzschel 2007).
32 Literaturübersicht Da sich die neuropathologischen Veränderungen aller TSE’s vorrangig in der Obexregion der Medulla oblongata befinden, wird als Probenmaterial für die Diagnostik das Stammhirn eingesetzt. Bei Scrapie sollte zur Abklärung möglicher atypischer Fälle auch das Kleinhirn untersucht werden.
In der histopathologischen Untersuchung auftretenden Vakuolen allein sind jedoch nicht beweisend. Der direkte Nachweis von PrPSc-Ablagerungen im Rahmen der Immunhistochemie unter Verwendung spezifischer Antikörper stellt hingegen einen wesentlichen Bestandteil der Diagnostik dar.
Als biochemische Methode kommt der Immunoblot zur Anwendung, der nach elektrophoretischer Auftrennung des mit Proteinase K degradierten Proteins unter Verwendung spezifischer Antikörper die drei Glykosylierungsformen des pathologischen Prion-Proteins als einzelne Banden visualisiert. Darüber hinaus kann unter Berücksichtigung des Antikörperbindungsverhältnisses, des Glykosylierungsverhältnisses und der molekularen Masse des unglykosylierten PrPSc eine Charakterisierung des PrPSc zur Unterscheidung von BSE und Scrapie vorgenommen werden (s. Abb.2.6, S.31).
2.2.3.3 Scrapie
Scrapie (von engl. scrape „kratzen“, „schaben“) oder Traberkrankheit ist eine übertragbare, langsam tödlich verlaufende Erkrankung des Gehirns bei Schafen und in geringerem Ausmaß auch bei Ziegen, deren Erstbeschreibung auf das Jahr 1750 zurückgeht (LEOPOLDT 1750).
Allerdings erwähnt ein 1772 erschienener Aufsatz in England Scrapie-Fälle, die sogar auf das Jahr 1732 zurückgehen (COMBER 1772). Sie gilt damit als Prototyp der TSE und tritt in zahlreichen Ländern endemisch bei kleinen Wiederkäuern auf.
Für Scrapie gilt nur die Zusammenfassung der histopathologischen Befunde in Kombination mit den typischen PrPSc-Ablagerungen als pathognomisch, da auch bei gesunden Tieren spongiforme Veränderungen in geringerer Zahl gefunden wurden (ZLOTNIC u. RENNIE 1958, ZIOTNIK 1962).
Das Auftreten klinisch erkrankter und unauffälliger Tiere innerhalb einer Schafherde beruht auf einer Resistenz, die durch Polymorphismen im Prnp-Genotyp kodiert sind, die vor allem am Codon 136, 154 und 171 auftreten (GOLDMANN et al. 1990; HUNTER et al. 1994a;
BELT et al. 1995; BOSSERS et al. 1996) (s. Tab. 2.3, S.33). Vor diesem Hintergrund sind seit 2003 alle EU-Mitgliedsstaaten aufgefordert, Programme zur Resistenzzucht bezüglich Scrapie aufzustellen.
Literaturübersicht 33 Scrapie- Erreger werden horizontal über die infektiöse Plazenta übertragen (TOUZEAU et al.
2006; BROTHERSTON et al. 1968; PATTISON et al. 1972; DICKINSON et al. 1974).
Allerdings gelingt der Nachweis des PrPSc nur in der Plazenta von Föten des empfänglichen Genotyps (ANDREOLETTI et al. 2002; LACROUX et al. 2007) und die Übertragung auf den Embryo ist nicht obligatorisch (FOSTER et al. 2006).
Schafe infizieren sich direkt an der infektiösen Nachgeburt und indirekt an mit dieser kontaminiertem Weideland (HOINVILLE, 1996; FOSTER et al. 1996, 2006; VAN KEULEN et al. 2008). Möglicherweise spielen auch Kot (GONZÁLES et al. 2006) und Urin (SISÓ et al. 2006) eine Rolle bei der horizontaler Übertragung.
Tab. 2.3 Übersicht Scrapie
Scrapie klassisch atypisch
Symptome Unruhe, Schreckhaftigkeit, Ataxie,
Abmagerung, Juckreiz, Festliegen v.a. Ataxie (1)
Einfluss des Genotyps PrPARR - unempfänglich, PrPVRQ - hoch empfänglich (2) (3)
PrPVRQ - unempfänglich, PrPARR - hoch empfänglich (4)
Infektionsquelle Kontamination der Umwelt, direkter
Tierkontakt spontanes Auftreten (4)
intra-spezies
Übertragung horizontal Übertragbarkeit auf Schafe
experimentell nachgewiesen (5)
Erregeraufnahme oral (6), konjunktival (7), dermal (8),
gingival (9) unklar
(1) BENESTAD et al. 2003; (2) VAN KEULEN et al. 2000; (3) ANDREOLETTI et al. 2000;
(4) BENESTAD et al. 2008; (5) SIMMONS et al. 2007; (6) HADLOW et al. 1982; (7) SCOTT et al. 1993; (8) MOHAN et al. 2004; (9) CARP, 1982
Des Weiteren sprechen PrPSc-Akkumulationen im Euter (LIGIOS et al. 2005), den Speicheldrüsen (VACELLARI et al. 2007), der Zunge (CASALONE et al. 2005) und Infektiosität im Kolostrum und der Milch (LACROUX et al. 2008) für die Möglichkeit einer Übertragung durch direkten Tierkontakt. Als Erregerreservoir werden zudem Rötelmäuse aufgrund ihrer hohen Empfänglichkeit gegenüber Scrapie diskutiert (PIENING et al. 2006).
In Norwegen wurde 1998 erstmals eine atypische Variante von Scrapie festgestellt (BENESTAD 2003, BUSCHMANN et al. 2004). Retrospektive Analysen ergaben aber, dass atypische Fälle bereits Ende der 80ziger Jahre in Großbritannien auftraten und weltweit mit
34 Literaturübersicht einer vergleichbaren Prävalenz wie klassischen Scrapie vorkommen (FEDIAEVSKY et al.
2008). Im Gegensatz zur klassischen Form weist sie eine vermehrte Akkumulation des pathologischen Prion-Proteins vor allem im Kleinhirn und weniger im Stammhirn auf.
Weitere Unterscheidungskriterien sind das fehlende Vorkommen von PrPSc in lymphoretikulären Geweben und deutlich unterschiedliche biochemische Eigenschaften (BENESTAD et al. 2003; BUSCHMANN et al. 2004; GAVIER-WIDEN et al. 2005; LE DUR et al. 2005).
2.2.3.4 Bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE)
Die spongiforme Enzephalopathie der Rinder wurde 1985 in Vereinten Königreich Großbritannien entdeckt und erstmals 1987 beschrieben (WELLS et al.).
Die Frage nach dem Ursprung konnte noch nicht eindeutig geklärt werden. Diskutiert wurde zunächst die Übertragung von Scrapie-Erregern aus infizierten Schafen (WILESMITH et al.
1988, WILESMITH et al. 1991). Trotz der erfolgreichen Übertragung von Scrapie auf Rinder wies die Infektion nach intra-zerebraler Inokulation andere proteinbiochemische und histopathologische Merkmale auf und scheint daher als Ursache wenig wahrscheinlich (KONOLD et al. 2006).
Die Hypothese, dass spontan an BSE erkrankte Rinder den Ausgangspunkt für die Epidemie darstellten (EDDY 1995), fand mit Entdeckung der sporadisch auftretenden, sogenannten atypischen BSE-Fälle, Unterstützung (BUSCHMANN et al. 2006; CAPOBIANCO et al.
2007).
Die klinischen Symptome (s. Tab. 2.4, S.35) treten erst nach einer sehr langen Inkubationszeit deutlich in Erscheinung, auf die eine relativ kurze progressive Krankheitsperiode folgt.
Für die Verbreitung unter den Rindern wird die Verfütterung von infektiösem Tiermehl oder Milchaustauschern angenommen (WILESMITH et al. 1988; PAISLEY u. HOSTRUP- PEDERSEN 2004). Die Persistenz und Inzidenz des BSE-Erregers bei der Tiermehlherstellung entstand durch die im Vereinigten Königreich der siebziger Jahre beschlossenen Reduzierung der Behandlungstemperaturen und -zeiten und durch die Steigerung der Tiermehlfütterung an Rinder (HÖRNLIMANN 2001). Ein Verfütterungsverbot von Tiermehl an Wiederkäuer erfolgte Großbritannien bereits 1988, dem sich die EU 2001 anschloss. So ist die Zahl der aufgetretenen BSE-Fälle in Großbritannien seit 1993 und in Deutschland seit 2001 rückläufig. Hierzulande wurden bisher insgesamt 413 Fälle registriert (Stand: 10.08.2012).
Literaturübersicht 35 Als natürliche Übertragung gilt die orale Aufnahme infektiösen Materials als sicher, da bisher weder eine vertikale noch eine horizontale Übertragung durch die Ausscheidung von Sekreten oder Exkreten beschrieben wurde (CURNOW u. HAU, 1996) und auch im Blut keine Infektiosität nachgewiesen werden konnte (WELLS et al. 1998; ESPINOSA et al. 2007).
In den letzten Jahren ließ sich das Auftreten zweier atypische BSE-Varianten nachweisen. Es wird der sogenannte H- Typ (BIACABE et al. 2004) von dem im gleichen Jahr erstmals detektierten L-Typ (oder Bovine Amyloidotic Spongiform Encephalopathy - BASE) unterschieden (CASALONE et al. 2004; BARON u. BIACABE, 2006). Beide Formen der atypischen BSE wurden auch in Deutschland dokumentiert (BUSCHMANN et al. 2006).
Dabei weist der L-Typ durch das etwas geringere Molekulargewicht ein deutlich anderes Glykosylierungsprofil auf. Die IHC weist PrPSc-Akkumulationen in Form von amyloiden Plaques vor allem in Thalamus und Cortex (CASALONE et al. 2004) anstelle der typischen granulären und linearen Ablagerungen im Hirnstamm auf. Eine an Primaten durchgeführte Studie zeigte markante klinische und neuropathologische Unterschiede (COMOY et al. 2008).
Die Inokulation humanes PrP exprimierender Mäuse mit dem L-Typ war effizienter als bei der Verwendung der klassischen Variante (KONG et al. 2008) und Mäuse mit bovinem PrP wiesen deutlich verkürzte Inkubationszeiten auf (BUSCHMANN et al. 2006).
Tab. 2.4 Übersicht BSE
BSE Klassisch atypisch
Symptome Abmagerung, Verhaltensänderungen, erhöhte Sensibilität, Ataxie
Abmagerung, Verhaltensänderungen, erhöhte Sensibilität, Ataxie (3)
Einfluss des Genotyps
ggf. Polymorphismen oder Depletion der Promotorregion des Prion-Protein-
Gens (Prnp) und im Intron 1 (1) (2)
keine bekannt
Infektionsquelle infektiöses Tiermehl spontanes Auftreten
intra-spezies Übertragung
nur experimentell oral oder intra-zerebral
intrazerebrale Übertragbarkeit auf Rinder experimentell nachgewiesen (3)
Erregeraufnahme oral -
(1) HAASE et al. 2007; (2) JULING et al. 2006; (3) BALKEMA-BUSCHMANN et al. 2011 Neben der BSE-Erkrankung beim Hausrind traten auch TSE-Erkrankungen bei exotischen Wiederkäuern in zoologischen Gärten auf (JEFFREY u. WELLS 1988, KIRKWOOD et al.
1990). Desweiteren wurden in Frankreich und im Vereinten Königreich zwei BSE- Infektionen bei Ziegen identifiziert (ELOIT et al. 2005; VACCARI et al. 2009).
36 Literaturübersicht Im Gegensatz dazu lässt sich der H-Typ vor allem durch sein signifikant höheres Molekulargewicht von klassischer BSE unterscheiden (CASALONE et al. 2004). Die Infektion von bovines PrP exprimierenden Mäusen ging mit einer Verlängerung der Inkubationszeit gegenüber der klassischen Form einher (BUSCHMANN et al. 2006).
Grundsätzlich wird angenommen, dass diese atypischen TSE-Formen spontan entstehen können und angesichts der in der Vergangenheit stattgefundenen Verfütterung von infektiösem Tiermehl an Wiederkäuer eine mögliche Ursache für die klassische BSE- Infektion gewesen sein könnten (BIACABE et al. 2004, CASALONE et al. 2004, BUSCHMANN et al. 2006, CAPOBIANCO et al. 2007). Der im Western-Blot durch einen Scrapie-spezifischen Antikörper detektierbare H-Typ wirft die Frage auf, ob es sich tatsächlich um eine neuartigen BSE-Typ handelt oder eher eine natürliche Scrapie-Infektion beim Rind darstellt (BIACABE et al. 2004).
2.3 Pathogenese der TSE-Erkrankungen
Zur Klärung der TSE-Pathogenese (griechisch, páthos, Leiden und génesis, Entstehung) wurden verschiedene In vivo-Infektionsstudien mit unterschiedlichen Tierarten durchgeführt.
Die kann die ausgewählte Infektionsroute (oral, intrazerebral oder intraperitoneal) kann dabei eine wesentlichen Einfluss haben und ergaben mitunter unterschiedliche Ergebnisse.
Experimentelle Studien zu BSE an oral inokulierten Rindern wurden lediglich am damaligen Veterinary Laboratory Agency, Weybridge, Vereinigtes Königreich Großbritannien und am Friedrich-Loeffler-Institut, Insel Riems, Deutschland durchgeführt.
Im Folgenden soll die Pathogenese nach Prion-Infektionen bei verschiedenen Tieren erörtert werden, wobei der Schwerpunkt auf Ergebnissen aus Studien mit dem Scrapie- und BSE- Erregern liegen soll. In die Verbreitung des PrPSc ist nach derzeitigem Kenntnisstand neben lymphoiden Strukturen das PNS über parasympathische und sympathische Bahnen involviert.
Im Zuge einer Scrapie-Infektion weisen Studien auch auf eine mögliche hämatogene Verbreitung hin. Dagegen wird insbesondere für BSE beim Rind aufgrund strenger Indizien die neuronale Route favorisiert. Detaillierten Ergebnisse zur anterograden Ausbreitung des pathologischen Prion-Proteins beim Rind liegen bisher jedoch noch nicht vor (s. Abb. 2.7, S.37).
Literaturübersicht 37
Abb. 2.7 Möglicher Ausbreitungsweg des PrPSc bei klassischer Scrapie (modifiziert nach VAN KEULEN et al. 2002), grau hinterlegt: vermutete Beteiligung bei BSE; 1: Infektion des GALT; 2: Ausbreitung im lymphatischen System; 3: Neuroinvasion, GC: Ganglion coeliacum; GN: Ganglion nodosum
2.3.1 Dosis und Inkubationszeiten
Die durch epidemiologische Studien geschätzte Inkubationsperiode einer natürlichen BSE- Erkrankung liegt bei 5-5,5 Jahren (ARNOLD u. WILESMITH, 2004; WILESMITH et al.
1988). Dies würde im Tierexperiment einer einmaligen Dosis von 0,1g bis 1g eines Hirnhomogenat-Pools entsprechen (ARNOLD et al. 2007; WELLS et al. 2007).
Unberücksichtigt bleibt bei dieser Betrachtung eine im Feld mögliche mehrfache Aufnahme infektiösen Materials, die im Nagetiermodell eine erhöhte Infektionswahrscheinlichkeit und verkürzte Inkubationszeiten zur Folge hatte (DIRINGER et al. 1998; GRAVENOR et al.
2003). Statistischen Schätzungen zufolge liegt das höchste Infektionsrisiko bei Kälbern in den ersten sechs Lebensmonaten (ARNOLD u. WILESMITH, 2004).
38 Literaturübersicht Tab. 2.5 Korrelation zwischen Dosis und PrPSc-Nachweis/Symptomatik
Dosis initialer PrPSc- Nachweis im Obex
definierte klinische Symptome frühestens nach
1 g 44 mpi (1); 42-47 mpi (2) 0,001 g 68 mpi (5) 0,1 g
1 g
53 mpi (5) 45 mpi (5)
100 g 24 mpi (3); 27 mpi (4); 10 g 44 mpi (1) 41 mpi (5) 30 mpi (1) (2) 100g 31 mpi (5); 35 mpi (1) (1) MASUJIN et al, 2007 (2) ARNOLD et al. 2007 (3) HOFFMANN et al. 2007 (4) ESPINOSA et al. 2007 (5) WELLS et al. 2007; mpi: Monate post infectionem
Im Maus- und Rindermodell (MCLEAN u. BOSTOCK, 2000; WELLS et al. 2007) ließ sich zwar keine Schwellendosis für eine Infektion ermitteln, dennoch beeinflusst die Menge des infektiösen Materials die Zeit bis zum Auftreten definierter klinischer Symptomatik ebenso wie die erstmalige Detektion von PrPSc im Hirnstamm (s. Tab. 2.5). Nach der Gabe von hohen Dosen lässt sich nicht nur PrPSc im Hirnstamm deutlich früher detektieren, es kommt zudem zu einer Verringerung der Inkubationszeit und deren Variabilität (WELLS et al. 2007).
Weiterhin konnte nach oraler Verabreichung von 100g Homogenat PrPSc im ZNS signifikant früher vor dem Auftreten klinischer Symptome nachgewiesen werden als bei niedriger dosierten Tieren (ARNOLD et al. 2007).
2.3.2 Das lymphatische System
Der initiale Nachweis nach oraler Scrapie-Inokulation erfolgt in Form von PrPSc- Akkumulationen im Darm-assoziierten-lymphatischen Geweben (engl., gut associated lymphoid tissue, GALT), speziell in den Peyer´schen Platten (MAIGNIEN et al. 1999; VAN KEULEN et al. 1999; BEEKES u. MCBRIDE, 2000) und der Tonsille (ANDREOLETTI et al. 2000; VAN KEULEN et al. 2002). Im weiteren Verlauf erfolgt bei Scrapie der Befall des Retropharyngeal- und der Mesenteriallymphknoten durch die das GALT drainierenden Lymphgänge (ANDREOLETTI et al. 2000; VAN KEULEN et al. 2002).
Die Mechanismen für die Überwindung der Darmwand können für PrPSc bisher lediglich vermutet werden. Sogenannte M-Zellen, die im Follikel-assoziierten Epithel (FAE) der Peyer´schen Platten lokalisiert sind, können verschieden Pathogene (Viren, Bakterien, Prionen) transportieren (NEUTRA et al. 1996; HEPPNER et al. 2001). Auch ein
