Nationalbibliografie;
Detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.ddb.de abrufbar.
1. Auflage 2011
© 2011 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen
Printed in Germany
ISBN 978-3-86345-0
Verlag: DVG Service GmbH Friedrichstraße 17
35392 Gießen 0641/24466 geschaeftsstelle@dvg.net
www.dvg.net 16-8
Die Rolle entzündlicher Prozesse für die Entwicklung von spontanen Anfällen, Neurodegeneration und Verhaltensänderungen
in Epilepsie-Modellen
THESE
zur Erlangung des Grades eines DOCTOR OF PHILOSOPHY
– Ph.D. –
im Fachgebiet Pharmakologie
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover und das Zentrum für Systemische Neurowissenschaften (ZSN) Hannover
vorgelegt von Nadine F. Polascheck
Bielefeld
Hannover 2011
Wissenschaftliche Betreuung:
Univ.-Prof. Dr. W. Löscher Univ.-Prof. Dr. S. Petri Univ.-Prof. Dr. P. Claus
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. W. Löscher (Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover)
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. S. Petri (Neurobiologische Abteilung der Medizinischen Hochschule Hannover)
3. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. P. Claus (Institut für Neuroanatomie der Medizinischen Hochschule Hannover)
4. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. I. Blümcke (Lehrstuhl für Neuropathologie der Friedrich- Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg)
Tag der mündlichen Prüfung: 08.04.2011
Gefördert durch ein Georg-Christoph-Lichtenberg Stipendium des Ministeriums für Wissenschaft und Kultur des Landes Niedersachsen. Dies Arbeit ist ein Teilprojekt der DFG-Forschergruppe Neurodegeneration und -regeneration bei ZSN-
Erkrankungen des Hundes (Forschergruppe 1103).
Für meine Eltern
1 Einleitung _____________________________________________________________ 1 2 Kenntnisstand__________________________________________________________ 3 2.1 Epilepsien __________________________________________________________ 3 2.1.1 Definition und Bedeutung ___________________________________________ 3 2.1.2 Temporallappenepilepsie ___________________________________________ 5 2.1.3 Epilepsie-assoziierte Komorbiditäten __________________________________ 6 2.1.4 Tierexperimentelle Tests für psychisch-kognitive Verhaltensänderungen ______ 7 2.1.5 Tiermodelle für Temporallappenepilepsie_______________________________ 9 2.2 Epilepsie-Prävention _________________________________________________ 13 2.2.1 Neue Ansätze der Epilepsie-Prävention _______________________________ 17 2.2.2 Bedeutung der Neuroinflammation in der Epilepsieentstehung _____________ 19 2.2.3 Substanzen_____________________________________________________ 27 3 Arbeitshypothesen und Zielsetzung_______________________________________ 31 4 Material und Methoden _________________________________________________ 33 4.1 Versuchstiere und Tierhaltung__________________________________________ 33 4.2 Studie 1: Beeinflussung der Konsequenzen eines SE durch Inhibition der COX-2__ 35 4.2.1 Versuchsablauf __________________________________________________ 35 4.2.2 Induktion eines SE mittels fraktionierter Gabe von Pilocarpin ______________ 35 4.2.3 Behandlung mit Parecoxib _________________________________________ 36 4.2.4 Bestimmung von Valdecoxib und Parecoxib im Plasma___________________ 37 4.2.5 Implantation von Gyrus-Dentatus-Elekroden ___________________________ 39 4.2.6 Überwachung spontan wiederkehrender Anfälle ________________________ 42 4.2.7 Beurteilung der spontan wiederkehrenden Anfälle _______________________ 44 4.2.8 Verhaltensmodelle der Verhaltensbatterie _____________________________ 45 4.2.9 Tötung und Gewebegewinnung für die Histologie _______________________ 52 4.2.10 Histologie _____________________________________________________ 52 4.2.11 Auswirkungen eines SE auf die COX-2 ______________________________ 55 4.3 Studie 2: Beeinflussung der Konsequenzen eines SE durch die Inhibition von IL-1! 58 4.3.1 Implantation von Cortex-Elektroden __________________________________ 58 4.3.2 Induktion eines SE _______________________________________________ 59 4.3.3 Behandlung mit VX-765 und Anakinra ________________________________ 59 4.3.4 Überwachung spontan wiederkehrender Anfälle ________________________ 61 4.3.5 Beurteilung der spontan wiederkehrenden Anfälle _______________________ 62 4.3.6 Tötung und Gewebegewinnung für die Histologie _______________________ 62 4.3.7 Histologie ______________________________________________________ 63 4.3.8 Bestimmung von Anakinra und IL-1! im Plasma und CSF_________________ 64 4.4 Statistik ___________________________________________________________ 64 5 Ergebnisse ___________________________________________________________ 67 5.1 Studie 1: Beeinflussung der Konsequenzen eines SE durch Inhibition der COX-2__ 67 5.1.1 COX-2-Expression nach SE ________________________________________ 67 5.1.2 Effekte der Parecoxib-Behandlung auf den SE-induzierten PGE2-Anstieg ____ 68 5.1.3 Gewichtsverlauf und Mortalität nach SE_______________________________ 69 5.1.4 Plasmakonzentrationen von Valdecoxib und Parecoxib___________________ 71 5.1.5 Spontan wiederkehrende Anfälle ____________________________________ 72 5.1.6 Verhaltensänderungen ____________________________________________ 74 5.1.7 Auswertung neurodegenerativer Veränderungen________________________ 84 5.2 Studie 2: Beeinflussung der Konsequenzen eines SE durch Inhibition von IL-1!___ 89 5.2.1 Gewichtsverlauf und Mortalität nach SE_______________________________ 89 5.2.2 Konzentration von Anakinra und IL-1! im Plasma und CSF _______________ 90
5.2.3 Auswertung neurodegenerativer Veränderungen________________________ 93 5.2.4 Spontan wiederkehrende Anfälle ____________________________________ 95 6 Diskussion ___________________________________________________________ 99 6.1 Beeinflussung der unmittelbaren Folgen eines SE durch die Parecoxib-Behandlung100 6.2 Beeinflussung der Entwicklung spontaner Anfälle durch die Parecoxib-Behandlung 101 6.3 Beeinflussung der Epilepsie-assoziierten Verhaltensänderungen durch die Parecoxib- Behandlung __________________________________________________________ 105 6.4 Neuroprotektiver Effekt der Parecoxib-Behandlung ________________________ 109 6.5 IL-1!-Hemmung als Strategie der Epilepsie-Prävention _____________________ 112 6.6 Auswirkungen der IL-1!-Hemmung auf die SE-induzierte Neurodegeneration____ 116 6.7 Auswirkungen der IL-1!-Hemmung auf die Entwicklung spontaner Anfälle ______ 117 6.8 Schlussbetrachtung _________________________________________________ 118 7 Zusammenfassung____________________________________________________ 121 8 Summary ____________________________________________________________ 125 9 Literaturverzeichnis ___________________________________________________ 127 10 Anhang ____________________________________________________________ 159 10.1 Geräte und Verbrauchsmaterialien ____________________________________ 159 10.1.1 Tierhaltung und -versorgung______________________________________ 159 10.1.2 Stereotaktische Operation _______________________________________ 159 10.1.3 SE-Induktion und anti-inflammatorische Behandlung___________________ 160 10.1.4 Parecoxib- und Valdecoxib-Analytik ________________________________ 160 10.1.5 EEG- und Videoüberwachung ____________________________________ 161 10.1.6 Gewebe-Präparation und Aufarbeitung für den PGE2-ELISA_____________ 162 10.1.7 ELISA _______________________________________________________ 162 10.1.8 Histologie ____________________________________________________ 163 10.2 Puffer und Lösungen _______________________________________________ 164 10.2.1 Perfusion_____________________________________________________ 164 10.2.2 Histologische Färbungen ________________________________________ 165 10.2.3 Blutentnahme und HPLC-Analytik _________________________________ 167 10.3 Färbeprotokolle ___________________________________________________ 169 Publikationen _________________________________________________________ 172 Erklärung ____________________________________________________________ 174 Danksagung _________________________________________________________ 175
!
Abkürzungen
AG Arbeitsgruppe Aqua dest. destilliertes Wasser
Aqua bidest. zweifach destilliertes Wasser bzw. beziehungsweise
CA1 Cornu Ammonis Region 1 CA3 Cornu Ammonis Region 3 CA4 Cornu Ammonis Region 4
cm Zentimeter
CSF Liquor cerebrospinalis (cerebrospinal fluid) COX Cyclooxygenase
d.h. das heißt
EDTA Ethylendiamintetraacetat EEG Elektroenzephalogramm
ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay EP Prostaglandin-E2-Rezeptor
g Gramm
Hz Hertz
HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (high performance liquid chromatography) ILEA Internationale Liga gegen Epilepsie
(International League against Epilepsy) IL-1! Interleukin-1!
IL-1RA Interleukin-1-Rezeptorantagonist IL-1RAen Interleukin-1-Rezeptorantagonisten i.m. intramuskulär
i.p. intraperitoneal i.v. intravenös
kg Kilogramm
Kontr Kontrolle
M molar
mEq Milliäquivalent
mg Milligramm
min Minute ml Milliliter mm Millimeter
mRNA Boten-Ribonukleinsäure (messenger ribonucleic acid) mV Millivolt
NaCl Natriumchlorid
NeuN neuronenspezifisches Kernprotein (neuronal specific nuclear protein) NMDA N-Methyl-D-Aspartat
p.a. pro analysi
PBS Phosphat-gepufferte Natriumchloridlösung Pcb Parecoxib
pg Picogramm
PGD2 Prostaglandin-D2
PGE2 Prostaglandin-E2 PGF2" Prostaglandin-F2"
p.o. per os
s Sekunde
s.c. subkutan SE Status epilepticus
SEM Standard error of the mean (Mittelwertfehler)
Std Stunde
TNF-" Tumornekrosefaktor-"
Vcb Valdecoxib
VX VX-765
#m Mikrometer
1 Einleitung
Mit der Bezeichnung Epilepsie wird eine Vielzahl von Krankheiten und Symptomen zusammengefasst, die durch das wiederholte Auftreten epileptischer Anfälle charakterisiert sind (Fröscher u. Vasella 1994). Gemäß der Weltgesundheitsorganisation sind weltweit 50 Millionen Menschen an Epilepsie erkrankt (WHO 2009). Epilepsien gehören sowohl beim Menschen als auch bei Hund und Katze zu den häufigsten chronischen Erkrankungen des zentralen Nervensystems (Schwartz-Porsche 1984; Hauser et al. 1993; Löscher 2003). Die gegenwärtige pharmakologische Therapie ist auf die symptomatische Unterdrückung der Anfälle mittels Antikonvulsiva limitiert (Pitkänen 2010). Es ist derzeitig keine Therapie bekannt, welche die Entwicklung einer Epilepsie bei Patienten mit erhöhtem Risiko (z.B. aufgrund einer genetischen Prädisposition oder eines Schädel-Hirn- Traumas) verhindern kann (Pitkänen u. Kubova 2004; Temkin 2009). Somit sind Epilepsien die einzigen bekannten Erkrankungen, bei denen Patienten mit erhöhtem Erkrankungsrisiko einfach zu identifizieren sind, aber bei denen keine therapeutische Möglichkeit zur Verfügung steht, welche die Krankheitsentwicklung verhindert (Dichter 2009). Daher wurde in Europa und in den USA die Entwicklung epilepsievorbeugender Therapien zum Hauptziel der Epilepsieforschung erklärt (Baulac u. Pitkänen 2009; Kelley et al. 2009).
Um dieses Ziel zu erreichen, werden zwei unterschiedliche Herangehensweisen verwendet: Einerseits werden bereits in der Klinik etablierte Antikonvulsiva auf einen antiepileptogenen und einen den Krankheitsverlauf modifizierenden Effekt hin untersucht; andererseits wird versucht gezielt die Prozesse zu beeinflussen, welche an der Epilepsieentstehung beteiligt sind (Löscher u. Brandt 2010). Einige der bisher getesteten Antikonvulsiva führten zu einer Reduktion der Epilepsieinzidenz im Tiermodell, konnten jedoch in Patienten mit traumatischem Gehirninsult keinen antiepileptogenen Effekt erzielen (Löscher et al. 1996; Yan et al. 2005; Suchomelova et al. 2006; André et al. 2007; Nehlig 2007; Temkin 2009; Russo et al. 2010). Als potenzielle Angriffspunkte im Entwicklungsprozess der Epilepsie werden die Neuroinflammation sowie die gesteigerte Aktivierung des Immunsystems, neuronale
Hyperexzitabilität und Neurodegeneration angesehen (Löscher u. Brandt 2010). Die Ergebnisse zahlreicher experimenteller und klinischer Studien deuten darauf hin, dass entzündlichen Prozessen eine bedeutende Rolle in der Epilepsieentstehung zukommt (Vezzani u. Granata 2005). Es wird angenommen, dass die Entzündungsmediatoren Cyclooxygenase(COX)-2 und Interleukin(IL)-1! hierbei eine Schlüsselrolle einnehmen (Cole-Edwards u. Bazan 2005; Takemiya et al. 2007;
Vezzani u. Baram 2007).
Ziel dieser Arbeit war es, die pharmakologische Inhibition der COX-2 und des IL-1!
auf eine antiepileptogene Wirkung hin zu untersuchen. Hierzu wurde in einem chronischen Nager-Epilepsie-Modell untersucht, wie sich die Applikation eines selektiven COX-2-Inhibitors auf die Ausprägung spontaner Anfälle und die Verhaltens- sowie neuroanatomischen Veränderungen nach einem Gehirninsult auswirkt. Die Untersuchung der Effekte einer IL-1!-Inhibition wurden vergleichend anhand zweier Nager-Epilepsie-Modelle in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Frau Prof. Vezzani (Mario Negri Institute for Pharmacological Research, Mailand) durchgeführt.
2 Kenntnisstand 2.1 Epilepsien
2.1.1 Definition und Bedeutung
Der Begriff „Epilepsie“ leitet sich von dem altgriechischen Wort epilepsis = „der Anfall, der Überfall“ ab. Eine Epilepsie wird nach der Internationalen Liga gegen Epilepsie (International League against Epilepsy; ILAE) und dem internationalen Büro für Epilepsie (International Bureau for Epilepsy; IBE) als „eine Störung des Gehirns, die durch eine dauerhafte Neigung zur Entwicklung epileptischer Anfälle, sowie durch die neurobiologischen, kognitiven, psychologischen und sozialen Konsequenzen dieses Zustandes charakterisiert ist“ definiert (Fisher et al. 2005).
Unter einem epileptischen Anfall wird das „vorübergehende Auftreten von krankhaften Befunden und/oder Symptomen einer pathologisch exzessiven oder synchronen neuronalen Aktivität“ verstanden (Fisher et al. 2005). Aus dieser Definition geht hervor, dass der Begriff Epilepsie verschiedene Erkrankungen und Symptome mit zerebraler Funktionsstörung subsumiert. Deshalb wird häufig die Bezeichnung „Epilepsien“ verwendet.
Schätzungen zufolge leiden weltweit etwa 50 Millionen Menschen, was fast 1% der Weltbevölkerung entspricht, an Epilepsien (WHO 2009). In den Industriestaaten beträgt die Inzidenz der Epilepsien etwa 50 Neuerkrankungen pro 100.000 Menschen in einem Jahr, in Entwicklungsländern wird von einer höheren Inzidenz ausgegangen (Sander 2003). Damit sind Epilepsien nach Schlaganfällen die häufigsten neurologischen Erkrankungen des Menschen (Browne u. Holmes 2001).
In der Veterinärmedizin zählen Epilepsien bei Hund und Katze ebenfalls zu den häufigsten chronischen neurologischen Erkrankungen (Löscher 2003). Darüber hinaus stellen sie die einzige chronische Hirnerkrankung dar, die veterinärpharmakotherapeutisch behandelt wird (Löscher 2003).
Eine richtige Diagnose ist die essentielle Voraussetzung für eine erfolgreiche Behandlung von Epilepsien, denn die Art des epileptischen Syndroms und der
epileptischen Anfälle ist entscheidend für die zu wählende Therapie (Browne u.
Holmes 2001). Die Kommission für Klassifikation und Terminologie der ILAE klassifiziert epileptische Syndrome und Anfälle unter Zuhilfenahme folgender Kriterien: Anfallsmuster, Ursache, Alter bei Krankheitsbeginn, auslösende Faktoren und elektroenzephalographische Befunde.
Beim Anfallsmuster werden fokale Anfälle, auch als partielle Anfälle bezeichnet, von generalisierten Anfällen unterschieden. Fokale Anfälle gehen von einer eng umschriebenen Gehirnregion (dem epileptischen Fokus) aus und manifestieren sich klinisch als unwillkürliche Bewegungen einzelner Muskelgruppen. Sie können einfach-fokal (ohne Bewusstseinstörungen) oder komplex-fokal (mit Bewusstseinstörungen) und sekundär-generalisiert ausgeprägt sein. Unter Letzterem versteht man die Ausbreitung einer epileptogenen Entladung vom initialen Fokus auf beide Großhirnhemisphären.
Klinisch werden primär und sekundär generalisierte Anfälle in tonische (Streckkrämpfe), klonische (Ruderkrämpfe), tonisch-klonische, myoklonische (Muskelzuckungen ohne Bewegungseffekt) und atonische Krämpfe (Relaxation der Muskulatur) sowie Absencen (kurze Bewusstseinspausen mit anschließender Amnesie) eingeteilt (Westbrook 2000). Neben fokalen und generalisierten Epilepsien unterscheidet man ferner unklassifizierbare Epilepsien und weitere spezielle Syndrome wie den Status epilepticus (SE). Dieser wird definiert als eine längere Zeit andauernde tonisch-klonische Krampfaktivität oder eine Serie von Anfällen ohne Wiedererlangung des Bewusstseins (Lowenstein et al. 1999).
Gemäß ihrer Ätiologie werden Epilepsien in symptomatische, idiopathische und kryptogene Epilepsien untergliedert. Etwa 30% der Epilepsien werden den symptomatischen Epilepsien zugeordnet; diese Epilepsien treten als Folge einer bekannten oder vermuteten Erkrankung des zentralen Nervensystems auf (Pitkänen u. Lukasiuk 2009). Den idiopathischen Epilepsien geht keine andere Grunderkrankung voraus, sie sind oftmals altersabhängig und vermutlich genetisch bedingt (Engel 2001). Als kryptogen werden Epilepsien bezeichnet, deren Ursache verborgen oder nicht zu ergründen ist (Schmidt 1992). In der Veterinärmedizin ist
der ILAE vorzunehmen. Demnach werden auch bei Hunden und Katzen symptomatische, idiopathische und kryptogene Epilepsien beschrieben. Man grenzt fokale von primär oder sekundär generalisierten Anfällen ab. Die Diagnosestellung ist oftmals abhängig von den Beobachtungen des Tierhalters. Erschwerend kommt hinzu, dass eine elektroenzephalographische Untersuchung nicht routinemäßig durchgeführt wird (Berendt u. Gram 1999; Chandler 2006; Smith Bailey u. Dewey 2009).
2.1.2 Temporallappenepilepsie
Entsprechend der Klassifikation der ILEA werden die symptomatischen fokalen Epilepsien aufgrund der anatomischen Lage des epileptischen Fokus in Temporal-, Frontal-, Parietal- und Okzipitallappenepilepsien eingeteilt (Dreifuss 1994). Die Mehrheit aller komplex-fokalen Anfälle hat ihren Ursprung im Temporallappen, insbesondere im Hippocampus, in der Amygdala und im parahippocampalen Cortex (Chang u. Lowenstein 2003). Demnach stellt die Temporallappenepilepsie die häufigste Epilepsieform beim Menschen dar (Hauser et al. 1993).
Es wird davon ausgegangen, dass einer Temporallappenepilepsie in den meisten Fällen eine initiale Schädigung mit struktureller Veränderung des Gehirns vorausgeht, die nach einer Latenzzeit von etwa zwei Jahren zum Auftreten des ersten spontanen Anfalls führt (Englander et al. 2003). Als eine solche initiale Schädigung wurden SE, Schädel-Hirn-Traumata, vaskuläre Schädigungen, Umfangsvermehrungen und Infektionen des Gehirns sowie Fieberkrämpfe im frühen Kindesalter beschrieben (Löscher 1999). Ein bis heute ungelöstes Problem in der Therapie der Temporallappenepilepsie besteht darin, dass bis zu 75% der Patienten pharmakoresistent sind (Spencer 2002). Im Kontext der Epilepsien war der Begriff
„Pharmakoresistenz“ lange nicht einheitlich definiert. Die ILEA stellte 2009 folgende Definition vor: Eine pharmakoresistene Epilepsie besteht, wenn die Therapie mit zwei tolerierten, angemessen ausgewählten und verwendeten Antiepileptika (als Monotherapie oder in Kombination) nicht zu einer anhaltenden Anfallsfreiheit führt (Kwan et al. 2010). Unter dem Begriff Antiepileptika (Synonym: Antikonvulsiva) werden antikonvulsiv wirkende Pharmaka, welche zur symptomatischen Therapie der
Epilepsien, d.h. der Anfallsunterdückung, eingesetzt werden verstanden; sie verhindern weder die Entstehung der Epilepsien noch führen sie zu ihrer Heilung. Für pharmakoresistente Patienten stellt oftmals eine neurochirurgische Resektion des epileptischen Fokus die letzte alternative Behandlung dar (Foldvary et al. 2001). Eine vollständige Rekonvaleszenz ist mit einem derartigen Eingriff oft nicht zu erzielen, die meisten Patienten müssen anschließend zur Anfallskontrolle mit Antiepileptika behandelt werden (Löscher u. Schmidt 2006). Die einer Pharmakoresistenz zugrundeliegenden Ursachen sind noch nicht vollständig bekannt, es wird vermutet, dass es sich um eine multifaktorielle Ätiologie handelt (Regesta u. Tanganelli 1999;
Kwan u. Brodie 2000; Löscher u. Potschka 2002). Gegenwärtig werden drei Hypothesen diskutiert (Regesta u. Tanganelli 1999; Schmidt u. Löscher 2005; Remy u. Beck 2006): Erstens die Transporter-Hypothese, welche annimmt, dass eine Überexpression von Multidrug-(Efflux-)Transportern an der Blut-Hirn-Schranke eine ausreichende Konzentration der Antiepileptika im Gehirngewebe verhindert. Der Multidrug-Transporter P-Glykoprotein spielt dabei vermutlich eine bedeutende Rolle (Löscher u. Potschka 2005). Zweitens postuliert die Target-Hypothese, dass genetisch bedingte oder erworbene Veränderungen der molekularen Angriffspunkte („Targets“) der Antiepileptika ursächlich für verminderte pharmakodynamische Effekte sind. Drittens besagt die Netzwerk-Hypothese, dass sich genetisch oder krankheitsbedingt epileptische Netzwerke entwickeln, welche sich strukturell und/oder funktional bei pharmakosensitiven- und pharmakoresistenten Patienten unterscheiden.
2.1.3 Epilepsie-assoziierte Komorbiditäten
Mehr als 50% aller erwachsenen Epilepsiepatienten leiden unter psychischen Komorbiditäten (Machleidt 2004). Vor allem treten Epilepsie-assoziierte Depressionen, Angst- und kognitive Störungen auf; des Weiteren werden Psychosen, Persönlichkeitsstörungen, aggressives Verhalten sowie Alkohol- und Drogenmissbrauch beobachtet (Devinsky 2003). Epilepsien sind mit einem höheren Risiko der Manifestation kognitiver Defizite trotz normal entwickelter Intelligenz verbunden; diese können sich als Gedächtnisdefizite, Wortfindungs- und
Sprachschwierigkeiten, motorische Unkoordiniertheit, Unaufmerksamkeit, gestörtes räumliches Orientierungsvermögen sowie Schwierigkeiten bei Problemlösungsansätzen äußern (Motamedi u. Meador 2003).
Angesichts des korrelierten Auftretens diverser psychischer Veränderungen mit Epilepsien wird eine bidirektionale Verbindung zwischen diesen angenommen, wonach Epilepsien die Entstehung von psychischen Störungen begünstigen könnten und vice versa (Hesdorffer et al. 2000; Alper et al. 2002; Kanner 2003, 2003a;
Thapar et al. 2005). Fundierte Erkenntnisse über die genauen Zusammenhänge und pathogenen Mechanismen der Assoziation zwischen Epilepsien und psychisch- kognitiven Begleiterkrankungen bestehen derzeit noch nicht. Etwaige gemeinsame Pathomechanismen, wie strukturelle Gehirnveränderungen, Veränderungen innerhalb der Neurotransmittersysteme sowie funktionelle Abnormalitäten, werden beispielsweise bei Epilepsie-assoziierten depressiven Störungen vermutet (Kanner 2005). Die Komplexität dieser Krankheitsbilder sowie die Tatsache, dass wichtige Variablen des Krankheitsverlaufes, wie der fokale Ursprung eines Anfalls oder die unterschiedliche Krankheitsgeschichte eines Patienten (z.B. medikamentöse Vorbehandlung) nicht beeinflusst werden können, erschweren die Untersuchung gemeinsamer Pathomechanismen direkt am Patienten. Aus diesem Grund kann der Einsatz geeigneter Tiermodelle hilfreich sein, um den Ursprung der Epilepsie- assoziierten Verhaltensstörungen zu identifizieren (Hannesson et al. 2005). Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Tests zur Untersuchung psychisch-kognitiver Verhaltensänderungen werden nachfolgend vorgestellt.
2.1.4 Tierexperimentelle Tests für psychisch-kognitive Verhaltensänderungen
2.1.4.1 Open-Field-Test
Der Open-Field-Test wurde 1932 von Hall und Ballechey entwickelt, um zu untersuchen, ob die Defäkation von Ratten mit Ängstlichkeit korreliert. Seitdem hat er sich zu einem der am häufigsten verwendeten Verhaltenstests etabliert (Walsh u.
Cummins 1976). Er wird genutzt, um das Explorations- und Lokomotionsverhalten, sowie Angst-assoziiertes Verhalten zu beurteilen (Prut u. Belzung 2003). Die
Versuchsapparatur besteht aus einer quadratischen oder runden Arena, die von hohen Wänden umrandet wird, welche das Entfliehen der Tiere verhindern (Walsh u.
Cummins 1976). Bei diesem Test befinden sich die Tiere in einem Konflikt zwischen dem Bedürfnis, eine neue Umwelt zu erkunden und der Aversion gegenüber offenen Räumen. Tiere, welche Angst-assoziiertes Verhalten zeigen, meiden das aversive Zentrum der Arena und halten sich statt dessen in geschützten wandnahen Bereichen auf. Neben dem präferierten Aufenthaltsbereich werden weitere Parameter wie beispielsweise die zurückgelegte Wegstrecke, die Geschwindigkeit, sowie das Aufricht- und Putzverhalten gemessen (Walsh u. Cummins 1976; Prut u.
Belzung 2003).
2.1.4.2 Elevated-Plus-Maze-Test
Der Elevated-Plus-Maze-Test wurde erstmals von Handley und Mithani (1984) beschrieben und gilt seit vielen Jahren als etablierter Test für die Untersuchung von Angst-assoziiertem Verhalten (File 1993). Er basiert auf dem natürlichen Konflikt von Nagern, zum einen neue Umgebungen zu explorieren (Suche nach Futter, neuen Lebensräumen sowie nach Sexualpartnern), zum anderen offene, exponierte Flächen aus Angst vor Beutegreifern zu meiden (Lamberty u. Gower 1996). Die Versuchsapparatur stellt ein erhöhtes Plus mit je zwei gegenüberliegenden offenen und zwei von Wänden umrahmten, geschlossenen Armen dar. Wie beim Open-Field- Test können zahlreiche verhaltenbiologische Parameter erhoben werden. Einer der wichtigsten Parameter für die Risikobereitschaft der Tiere ist die Aufenthaltszeit auf den aversiven offenen Armen, welcher durch anxiolytische oder anxiogene Substanzen pharmakologisch beeinflusst werden kann (Handley u. Mithani 1984).
2.1.4.3 Morris-Water-Maze-Test
Anfang der achtziger Jahre wurde der Morris-Water-Maze-Test von Morris (1984) konzipiert, um die räumliche Lern- und Gedächtnisleistung von Ratten zu überprüfen.
Der Test ist zur Beurteilung des Arbeits- und des Referenzgedächtnisses geeignet (Stafstrom 2006). Bei diesem Test suchen die Tiere von wechselnden Startpunkten aus schwimmend nach einer unter die Wasseroberfläche abgesenkten Plattform.
welche die Tiere bis zum Auffinden der Plattform benötigen, nimmt mit zunehmender Trainingsdauer ab und wird als Indikator für erfolgreiches Lernen verwendet. Hierfür ist die Integrität eines funktionsfähigen Hippocampus unerlässlich (Stafstrom 2002).
Morris et al. (1982) stellten fest, dass Tiere mit hippocampalen Läsionen den Test schlechter absolvierten als Tiere mit intaktem Hippocampus. Diese Beobachtung wurde von anderen Autoren bestätigt (Eichenbaum et al. 1990; Nunn et al. 1994;
Hodges 1996; Duva et al. 1997; Logue et al. 1997). Neben der Generierung einer
„kognitiven Landkarte“ (Pearce et al. 1998) ist der Hippocampus wichtig für das Lernen neuer Inhalte, das Wiederabrufen bereits gelernter Inhalte sowie für deren Konsolidierung und Speicherung (D'Hooge u. De Deyn 2001).
2.1.4.4 Test auf hyperexzitables Verhalten
Im Pilocarpin-Modell der Temporallappenepilepsie (2.1.5.1) weisen epileptische Ratten Unterschiede im exzitablen und sensorischen Verhalten gegenüber nicht epileptischen Tieren auf. Um diese Verhaltensunterschiede zu erfassen, modifizierten Rice et al. (1998) vier Tests aus der von Moser et al. (1988) beschriebenen Verhaltenstestbatterie. Anhand eines Score-Systems bewerten verschiedene Experimentatoren unabhängig voneinander die Reaktionen der Tiere auf optische, taktile und akustische Reize. Bei dem Touch-Response- und dem Pick- Up-Test wird die Reaktion der Ratte auf Berührung durch einen Stift beziehungsweise durch die greifende Hand des Experimentators beurteilt. Mittels des Approach-Response-Tests wird die Reaktion der Ratte auf einen neu präsentierten Gegenstand bewertet. Der Finger-Snap-Test untersucht die Reaktion des Tieres auf einen akustischen Reiz in unmittelbarer Nähe.
2.1.5 Tiermodelle für Temporallappenepilepsie
Aus ethischen Gründen, aus Mangel an geeigneten Kontrollgruppen oder aufgrund einer zu großen Varianz innerhalb der Testgruppe sind viele Untersuchungen zu humanen Erkrankungen nicht am Menschen möglich. Dieses macht die Verwendung geeigneter Tiermodelle unabdingbar. An ein Tiermodell humaner Erkrankungen werden drei grundlegende Ansprüche gestellt: Zum einen sollte es die Symptomatik widerspiegeln, zum anderen sollten Modell und Erkrankung in ihrer Ätiologie
koinzidieren; des Weiteren sollte das Modell eine Prädiktivität für die klinische Wirksamkeit von Arzneimitteln aufweisen. Häufig kann ein Tiermodell nicht allen Ansprüchen gleichzeitig gerecht werden, was in der ergänzenden Verwendung verschiedener Modelle resultiert.
Zur Untersuchung verschiedenster Aspekte der Epilepsien werden zwei Modelltypen eingesetzt: Anfallsmodelle und Epilepsie-Modelle. Bei ersteren wird durch elektrische oder chemische Induktion ein epileptischer Anfall ausgelöst. Bei letzteren entwickeln die Tiere als Folge eines primären Insults (bei post-SE-Modellen ein chemisch- oder elektrisch-induzierter SE) nach einer Latenzzeit spontan auftretende epileptische Anfälle. Die Tiere in einem Epilepsie-Modell sind demzufolge chronisch epileptisch.
Epilepsie-Modelle simulieren somit die klinische Situation symptomatischer Epilepsien, bei denen Patienten infolge eines initialen Insults, wie einem Schädel- Hirn-Trauma oder einem SE, an Epilepsie erkranken. Diese Modelle bieten demnach die Möglichkeit, den Entstehungsprozess einer Epilepsie, die sogenannte Epileptogenese, zu untersuchen. Die Untersuchungen im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden ausschließlich in Epilepsie-Modellen (post-SE-Modellen) durchgeführt.
Die verwendeten Modelle werden im Folgenden vorgestellt.
2.1.5.1 Das Lithium-Pilocarpin-Modell
Pilocarpin ist ein Agonist des M1(Muscarin)-Acetylcholinrezeptors (Hamilton et al.
1997). Die Beteiligung cholinerger Bahnen im zentralen Nervensystem an der Ausbreitung der Krampfaktivität, wurde von Olney et al. (1983) sowie von Wasterlain und Jonec (1983) gezeigt. Daraufhin etablierten Turski et al. (1983) das Pilocarpin- Modell bei der Ratte. Hamilton et al. (1997) konnten in einer Studie an M1-Rezeptor- knock-out-Mäusen zeigen, dass dieser Rezeptorsubtyp maßgeblich an der Anfallsentstehung beteiligt ist. Die Entstehung eines SE nach Pilocarpin-Applikation wird durch die Gabe von Atropin, einem Muscarinantagonisten, gehemmt, während ein einmal ausgelöster SE nicht mehr durch Atropin beeinflusst werden kann (Clifford et al. 1987). Die Aufrechterhaltung einer Pilocarpin-induzierten Krampfaktivität unterliegt demnach anderen Mechanismen. Nagao et al. (1996) und Smolders et al.
(1997) postulieren, dass nach der M1-Rezeptorvermittelten Initiierung die
Krampfaktivität über NMDA(N-Methyl-D-Aspartat)-Rezeptorvermittelte Vorgänge aufrechterhalten wird.
Das Pilocarpin-Modell simuliert viele Charakteristika der humanen Temporallappenepilepsie. Curia et al. (2008) fassen die wesentlichen Eigenschaften dieses Modells wie folgt zusammen: Mittels intraperitonealer oder subkutaner Applikation von Pilocarpin wird innerhalb kurzer Zeit ein akuter SE induziert. Dieser SE wird nach einer Versuchs-individuellen Dauer pharmakologisch (oftmals mittels Diazepam) abgebrochen. Nach einer Latenzzeit (von mehreren Tagen bis mehreren Wochen) treten spontan wiederkehrende Anfälle auf, welche die chronische Phase der Epilepsie kennzeichnen (Leite et al. 1990; Cavalheiro et al. 1991). Es treten weitläufige Läsionen im Gehirn auf, teils in Gehirnregionen, welche auch bei humanen Epilepsie-Patienten geschädigt sind. Diese Läsionen sind verbunden mit einer Reorganisation des neuronalen Netzwerks in hippocampalen und parahippocampalen Regionen, wie beispielsweise Mossy-Fiber-Sprouting, Verlust an Interneuronen und ektopische Zellproliferation des Gyrus dentatus; diese Veränderungen sind beim Temporallappenepilepsie-Patienten ebenfalls ausgeprägt (Wieser 2004). Des Weiteren entwickeln die Tiere nach Pilocarpin-induziertem SE Verhaltensänderungen wie beispielsweise Veränderungen des exzitablen und sensorischen Verhalten, des Angst-assoziierten Verhaltens sowie Gedächtnisdefizite (Rice et al. 1998; Detour et al. 2005; Cardoso et al. 2009).
Hohe Dosen an Pilocarpin erhöhen die Wahrscheinlichkeit das vollständige Syndrom (Entwicklung motorischer- und elektroenzephalographischer spontaner Anfälle, neuopathologische sowie verhaltensbiologische Veränderungen) zu erzeugen und verkürzen die Zeit bis zum Eintritt des SE, jedoch führen sie zu einer erhöhten akuten Mortalität (Exitus während des SE bzw. innerhalb von 48 Stunden nach SE) (Clifford et al. 1987; Curia et al. 2008). Jope et al. (1986) zeigten an Sprague- Dawley-Ratten, dass die Applikation von 400 mg/kg Pilocarpin bei 83% der Tiere einen SE induzierte, die akute Mortalität aber 100% betrug. Die Applikation von Lithiumchlorid (3 mEq/kg) bis 24 Stunden vor der Pilocarpin-Injektion, ermöglicht eine Verringerung der erforderlichen Pilocarpin-Dosis; dieses senkt die akute Mortalität und bedingt eine zuverlässigere Induktion des vollständigen Syndroms (Honchar et
al. 1983; Clifford et al. 1987). Das Lithium-Pilocarpin-Modell unterscheidet sich in metabolischer, elektroenzephalographischer, neuropathologischer und verhaltensbiologischer Sicht nicht von dem hochdosierten Pilocarpin-Modell (Clifford et al. 1987).
Glien et al. (2001) etablierten in der Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Löscher (im Folgenden als AG Löscher bezeichnet) das fraktionierte Lithium-Pilocarpin-Modell.
Bei diesem erfolgt die Applikation von Pilocarpin (10 mg/kg) in 30-minütigen Intervallen bis zum Eintritt eines SE. Der Vorteil des fraktionierten Modells gegenüber dem Bolus-Modell (einmalige Applikation von Pilocarpin) ist eine deutliche Verringerung der akuten Mortalität bis auf 10%. Nach der Bolus-Applikation wurden im Lithium-Pilocarpin-Modell eine akute Mortalitätsrate bis über 95% beschrieben (Jope et al. 1986; Morrisett et al. 1987). Die SE-Induktionsrate, die Zeit bis zum Auftreten des ersten spontanen Anfalls und die Frequenz der spontanen Anfälle unterscheiden sich im fraktionierten Lithium-Pilocarpin-Modell nicht vom Bolus- Modell (Glien et al. 2001).
Marchi et al. (2009) zeigten, dass es nach Lithium-Gabe im Bolus-Modell vor der Applikation von Pilocarpin und somit vor dem SE zu akuten entzündlichen peripheren Veränderungen und zu einer Schädigung der Blut-Hirn-Schranke kommt.
Entzündliche Veränderungen des zentralen Nervensystems oder systemische Entzündungen sowie die Schädigung der Blut-Hirn-Schranke werden als Initiatoren einer humanen Epilepsie vermutet. Das Lithium-Pilocarpin-Modell simuliert somit die prodromalen inflammatorischen Veränderungen und ermöglicht die Untersuchung von Anfallsgeschehen, die mit entzündlichen Prozessen assoziiert sind (Vezzani 2009).
In den meisten Epilepsie-Modellen wird ein SE in gesunden Tieren induziert (Löscher u. Brandt 2010). Im Gegensatz dazu tritt in der Humanmedizin ein SE oftmals bei nicht-epileptischen Patienten mit einer Vorerkrankung wie Anoxie, zerebraler Hämorrhagie, Schlaganfall, Tumoren oder Infektionen auf (Neligan u. Shorvon 2008).
Das Lithium-Pilocarpin-Modell simuliert mit der Lithiumchlorid-bedingten Aktivierung des erworbenen Immunsystems vor SE (Marchi et al. 2009) die humanmedizinische
Situation einer Vorerkrankung. Ob eine periphere Entzündung in anderen Epilepsie- Modellen die SE-Induktion triggert, ist noch nicht bekannt (Pitkänen 2010).
2.1.5.2 Elektrische Modelle
Neben chemischen Modellen der Temporallappenepilepsie werden auch elektrische Modelle verwendet, welche ebenfalls zu einem SE mit nachfolgender Entwicklung spontaner Anfälle führen (Löscher 2002). Im Unterschied zu den chemischen Modellen erfordern elektrische Modelle die Implantation von intrazerebralen Elektroden, dafür ist die Verwendung von Toxinen nicht notwendig (Stables et al.
2003). Vielmals wird die elektrische Stimulation limbischer Strukturen wie der Amygdala oder des Hippocampus genutzt. Die elektrische Stimulation erfolgt über einen längeren Zeitraum (oftmals 60-90 Minuten), womit ein sich selbsterhaltender SE erzeugt wird, und sich nach einer Latenzzeit spontane Anfälle entwickeln (Handforth u. Ackermann 1988; Lothman et al. 1989; Nissinen et al. 2000). Der mittels elektrischer Stimulation erzeugte SE ist weniger schwer ausgeprägt als ein Pilocarpin-induzierter SE und leichter zu unterbrechen (Bankstahl u. Löscher 2008).
Oftmals wird auf eine Termination des elektrisch-induzierten SE verzichtet; was zu einer SE-Dauer von vielen Stunden führt (Löscher 2002).
2.2 Epilepsie-Prävention
In annähernd 40% der Krankheitsfälle ist die den Epilepsien zugrundeliegende Ätiologie bekannt, hierzu gehören Schädel-Hirn-Traumata, Schlaganfall, Infektionen, Tumoren, neurodegenerative Erkrankungen, anhaltende Fieberkrämpfe und SE (Banerjee et al. 2009) (Abbildung 1). Jedoch existiert derzeitig keine Therapie, welche die Entstehung einer Epilepsie verhindert. Die Entwicklung epilepsievorbeugender Therapien steht daher im Fokus der gegenwärtigen Epilepsieforschung.
Umfassendes Wissen über die Prozesse, welche nach verschiedenartigen Gehirninsulten die Epileptogenese fördern, ist noch nicht vorhanden (Pitkänen 2010).
Die verfügbaren Daten demonstrieren, dass die meisten Patienten innerhalb von zwei Jahren nach einem SE, einem traumatischen Gehirninsult oder einem
Schlaganfall eine Epilepsie entwickeln, was auf vergleichbare Ätiologien hindeutet (Hesdorffer et al. 1998; Bladin et al. 2000; Englander et al. 2003).
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Entwicklung einer Epilepsie und möglichen pharmakologischen Interventionen, modifiziert nach Löscher et al. (2008).
Der Prozess der Epilepsieentstehung kann diverse Phasen beinhalten: Eine Reduktion der Krampfschwelle, Auftreten von Anfällen, eine Progression der
(Sillanpää et al. 1998; Kwan u. Sander 2004; Shorvon u. Luciano 2007); zusätzlich zu den epileptischen Anfällen können Komorbiditäten auftreten und sich verstärken (Hermann et al. 2008).
Die vorherrschende Annahme besagt, dass während der Latenzzeit eine Kaskade von biochemischen, anatomischen und physiologischen Veränderungen in der verletzten Gehirnregion und angrenzenden Gehirnbereichen dazu führt, dass sich ein nicht epileptisches Gehirn zu einem anfallsgenerierenden Gehirn entwickelt (Walker et al. 2002). Möglicherweise bietet die Latenzzeit ein Zeitfenster, in dem eine geeignete Therapie die Entstehung einer Epilepsie verhindern oder positiv beeinflussen kann (Pitkänen et al. 2004; Dichter 2009; Jensen 2009). Aufgrund dieser Annahme wurden zahlreiche Antiepileptika in klinischen Studien an Humanpatienten darauf hin untersucht, ob ihre prophylaktische Verabreichung nach einem Schädel-Hirn-Trauma die Epileptogenese verhindern kann. Jedoch vermochte keines der verabreichten Antiepileptika (Phenytoin, Phenobarbital, Carbamazepin, Valproat) die Epilepsieentwicklung zu verhindern (Temkin 2001, 2009). Antiepileptika vermitteln ihre antikonvulsive Wirkung durch die Hemmung der Erregbarkeit von Neuronen bzw. durch die Hemmung der Erregungsweiterleitung im Gehirn.
Medikamente, welche die Epileptogenese verhindern (falls diese existieren), unterscheiden sich vermutlich in ihren Wirkmechanismen von den herkömmlichen Antiepileptika, weil sich wahrscheinlich die molekularen Mechanismen der Epileptogenese von denen der Iktogenese (Anfallsentstehung) unterscheiden (Weaver 2003). In annähernd 30 tierexperimentellen Studien wurden sowohl Antiepileptika der alten Generation als auch der neuen Generation in Ratten- Modellen auf ihr antiepileptogenes Potenzial getestet, drei Antiepileptika (Carisbamat, Topiramat und Valproat) reduzierten die Epilepsieinzidenz, was auf einen antiepileptischen Effekt hindeutet (Löscher u. Brandt 2010).
In dem jungen Forschungsgebiet der Epilepsie-Prävention sind noch keine einheitlichen Definitionen für die Begriffe „Antiepileptogenese“ und „Krankheits- Modifizierung“ vorhanden (Pitkänen 2010). In dieser Arbeit wird unter einem antiepileptogenen Effekt die Prävention von spontanen Anfällen verstanden. Ein den Krankheitsverlauf modifizierender Effekt liegt vor, wenn die Entwicklung einer
Epilepsie nicht verhindert, jedoch ihre Ausprägung abgeschwächt wird, was eine Verbesserung der Lebensqualität für den Patienten bedeutet. Ein solcher Effekt kann sich beispielsweise in einer geringeren Anfallsfrequenz, einer geringeren Anfallsdauer, einem geringeren Schweregrad der Anfälle oder in einer verringerten Pharmakoresistenz sowie in einer verminderten Ausprägung der Komorbiditäten äußern (Löscher u. Brandt 2010; Pitkänen 2010).
Die Epilepsieentstehung kann in verschiedenen Nager-Modellen für symptomatische Epilepsien, wie dem Kindling-Modell, den post-SE-Modellen der Temporallappenepilepsie, Modellen für traumatische-Gehirninsulte, Schlaganfall- Modellen sowie Modellen für Fieberkrämpfe untersucht werden (Walker et al. 2002;
Stables et al. 2003; Pitkänen et al. 2007). Des Weiteren können genetische Nager- Modelle der generalisierten Epilepsie, bei denen die Tiere spontane Absencen zeigen, oder die GEPR-Ratten (genetically epilepsy prone rat) genutzt werden (Hosford 1995; Löscher 1999). Nicht alle Tiermodelle für Epilepsie sind geeignet, antiepileptogene oder den Krankheitsverlauf modifizierende Therapien zu verifizieren (Stables et al. 2003). Modelle mit einer sehr langen Latenzzeit und einer geringen Frequenz an spontanen Anfällen, was beispielsweise auf einige Modelle für traumatische-Gehirninsulte zutrifft, sind langwierig und mit einem großen Laboraufwand verbunden (Pitkänen et al. 2009; Pitkänen 2010). Auf einem Modell- Seminar der National Institutes of Health/National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NIH/NINDS) 2002 wurden daher nur das Kindling-Modell und die post- SE-Modelle für die Forschung an antiepileptogenen Therapien empfohlen (Stables et al. 2003).
Es bleibt zu berücksichtigen, dass bestimmte Variablen im Studiendesign zu falsch positiven oder falsch negativen Rückschlüssen auf die antiepileptogenen Eigenschaften einer Substanz führen können. Beispielsweise können die Dauer und die Schwere des SE, der Behandlungszeitpunkt, die Behandlungsdauer sowie die Dosierung, der Zeitpunkt und die Länge der Überwachung spontaner Anfälle sowie der genetische Hintergrund der Versuchstiere die Ergebnisse beeinflussen (Löscher u. Brandt 2010; Pitkänen 2010).
2.2.1 Neue Ansätze der Epilepsie-Prävention
Eine systematische Vorgehensweise, antiepileptogene Pharmaka zu identifizieren, ist die Untersuchung von Substanzen, die einen oder mehrere Mechanismen der Epileptogenese beeinflussen (Abbildung 1). Jedoch sind diese Mechanismen nicht ausschließlich an der Epilepsieentstehung beteiligt, sondern womöglich auch an physiologischen Kompensationsprozessen, neuronalen Reparaturvorgängen sowie endogenen antikonvulsiven oder sogar antiepileptogenen Prozessen (Walker et al.
2002). Um die molekularen Prozesse der Epileptogenese näher zu bestimmen, führten Lukasiuk et al. (2006) eine Meta-Analyse zahlreicher Genexpressions- Studien in SE- und traumatischen-Gehirninsult-Modellen durch. Zu allen Zeitpunkten der Epileptogenese wurde eine vermehrte Expression immunregulatorischer Gene festgestellt. Dieses deutet darauf hin, dass die Entzündungshemmung (in Kapitel 2.2.2 beschrieben) oder die Immunsuppression potenzielle antiepileptogene Therapien darstellen könnten. Weiterhin werden neuroprotektive und neuromodulatorische Ansätze als mögliche antiepileptogene Strategien diskutiert (Löscher u. Brandt 2010) (Abbildung 1).
Immunsuppressive Substanzen, welche auf der Ebene der Proteinkinasen oder auf T-Zell-Ebene wirken, wurden hinsichtlich ihres antiepileptogenen Potenzials untersucht. Rapamycin, welches die Serin/Threonin-Proteinkinase mTOR (mammalian target of rapamycin) hemmt, bewirkte nach einem Kainat-induzierten SE eine Reduktion des Mossy-Fiber-Sproutings und der spontanen Anfälle, während es die Neurogenese und den Neuronenverlust nicht beeinflusste (Zeng et al. 2009).
Buckmaster et al. (2009) erzielten im Pilocarpin-Modell mit Rapamycin ebenfalls eine Reduktion des Mossy-Fiber-Sproutings. Dennoch kann nach aktuellem Kenntnisstand keine Aussage darüber getroffen werden, ob Rapamycin zu einem antiepileptogenen Effekt führt. Zum einen ist die Bedeutung des Mossy-Fiber- Sproutings für die Anfallsentstehung noch nicht vollständig bekannt und zum anderen wurden in der Studie von Zeng et al. (2009) die spontanen Anfälle nicht außerhalb der Behandlungsphase beurteilt bzw. in der Studie von Buckmaster et al.
(2009) nicht mit in die Untersuchung einbezogen.
FK506 (Tacrolimus) greift in den Stoffwechsel der T-Zellen ein und hemmt deren Aktivität. Lukasiuk und Sliwa (2009) behandelten Ratten nach elektrisch-induziertem SE mit FK506 und beobachteten anstelle einer antiepileptogenen Wirkung eine Verschlimmerung der Anfallsschwere und Anfallsentwicklung. Im Pilocarpin-Modell erzielte die Behandlung mit FK506 neuroprotektive Effekte (Chwiej et al. 2010).
Welche Rolle die Neurodegeneration in der Epilepsieentstehung spielt, ist noch nicht vollends bekannt. Untersuchungen in der AG Löscher gaben erste Hinweise darauf, dass eine Neurodegeneration des Hippocampus möglicherweise kein obligates Ereignis für die Epilepsieentstehung ist (Ebert et al. 2002; Brandt et al. 2003). Eine weitere Studie von Brandt et al. (2006) untermauert diese Annahme, denn auch hier konnte der Neuronenverlust im Hippocampus medikamentös verhindert werden. Die Behandlung mit Valproat erbrachte keinen antiepileptogenen Effekt, konnte allerdings die Epilepsie-assoziierten Verhaltensänderungen verhindern (Brandt et al.
2006). Daher ist anzunehmen, dass eine Neuroprotektion alleine nicht zur Epilepsie- Prävention führt, jedoch eine Möglichkeit darstellt, die Epilepsie-assoziierten Lern- und Gedächtnisdefizite sowie Verhaltensänderungen zu verhindern (Löscher u.
Brandt 2010).
Eine weitere Strategie der Epilepsie-Prävention könnte die Unterbindung der sich entwickelnden neuronalen Hyperexzitabilität nach einem Gehirninsult mittels neuromodulatorischer Substanzen darstellen (Löscher u. Brandt 2010).
Verschiedene Studien in Epilepsie-Modellen belegten einen neuromodulatorischen und/oder antiepileptogenen sowie neuroprotektiven Effekt von Substanzen, die bei naiven Tieren prokonvulsiv wirken (Rigoulot et al. 2003; Pitkänen 2004; Chen et al.
2007; Echegoyen et al. 2009). Diese gegensätzliche Wirkung prokonvulsiver Substanzen kann vermutlich mit einer insultbedingten molekularen Reorganisation des Gehirns erklärt werden. Ferner wird angenommen, dass ein Gehirninsult die Verschiebung von adulten Rezeptor- und Ionenkanal-Funktionen zu neonatalen Funktionsweisen bewirke, wodurch sich während der Epileptogenese die Ontogenese wiederhole (Köhling 2002; Ben-Ari u. Holmes 2005).
2.2.2 Bedeutung der Neuroinflammation in der Epilepsieentstehung
Einerseits ist die Neuroinflammation ein wichtiges Mittel des Gehirns in der Abwehr von pathologischen Einflüssen, traumatischen Verletzungen und Umwelttoxinen, andererseits trägt sie zu der Pathophysiologie vieler neurologischer und neurodegenerativer Erkrankungen wie Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson, Multipler Sklerose und Amyotropher Lateralsklerose bei (Skaper 2007).
Die Ergebnisse zahlreicher klinischer und experimenteller Studien deuten darauf hin, dass entzündlichen Prozessen eine Schlüsselrolle in der Epileptogenese zukommt (Vezzani u. Granata 2005; Takemiya et al. 2007; Vezzani u. Baram 2007; Choi u.
Koh 2008; Vezzani et al. 2008; Rijkers et al. 2009): I) Etliche Risikofaktoren, welche die Entstehung einer symptomatischen Epilepsie bedingen können, gehen mit entzündlichen zerebralen Veränderungen einher. Systemische als auch zerebrale Infektionen gelten als Auslöser für Anfälle. II) Entzündungsreaktionen wurden nicht nur bei Enzephalitis-assoziierten Epilepsien beobachtet, sondern auch in anderen Epilepsien wie der Temporallappenepilepsie. III) SE und Anfälle induzieren die Synthese pro-inflammatorischer Zytokine und nachgeschalteter Entzündungsmediatoren. IV) Entzündungen des zentralen Nervensystems sowie systemische Entzündungen können die Blut-Hirn-Schranke schädigen, die neuronale Erregbarkeit erhöhen, die Krampfschwelle senken und womöglich die Anfalls- induzierten Gehirnschäden verschlimmern. Es wird vermutet, dass eine entzündungsvermittelte Beeinträchtigung der Blut-Hirn-Schranke die Homöostase des Gehirns stört und auf diese Weise die Epilepsieentstehung fördert. V) Diverse anti-inflammatorische Medikamente zeigten potenzielle antiepileptogene Effekte. Im Folgenden werden die vorgestellten Aspekte näher erläutert.
Das zentrale Nervensystem hat eine immunologische Sonderstellung durch das Vorhandensein der Blut-Hirn-Schranke, das Fehlen einer typischen Lymphdrainage und einer geringen Patrouille von Monozyten und Lymphozyten. Eine Entzündungsantwort des Gehirns wird bestimmt durch den Anstieg von Zytokinen und weiteren pro-inflammatorischen Mediatoren, welche unter physiologischen Bedingungen kaum messbar sind. Diese Mediatoren werden von Mikrogliazellen, Astrozyten, Neuronen sowie Endothelzellen der Blut-Hirn-Schranke und des Plexus
choroideus synthetisiert (Vezzani u. Granata 2005). Die Zusammensetzung der Entzündungsmediatoren nach einem experimentell erzeugten Anfall gleicht der durch Endotoxämie hervorgerufenen Entzündungsantwort. Allerdings sind nach einem Anfall vor allem Mikrogliazellen, Astrozyten und Neuronen an der Entzündungsmediatorensynthese beteiligt, während bei einer endotoxämiebedingten Entzündungsantwort Astrozyten und Neuronen nur geringfügig beteiligt sind (Vezzani u. Granata 2005). Eine transiente Entzündung ist eine physiologische Reaktion des Gehirns, um es vor Schädigung durch Noxen zu schützen. Falls eine Entzündung des Gehirns chronisch und unkontrolliert verläuft, kann dies zu einer Schädigung der Blut-Hirn-Schranke sowie neurodegenerativen und exzitatorischen Veränderungen führen (Vezzani u. Granata 2005). Demnach sind das Ausmaß der produzierten Zytokine sowie das Gleichgewicht zwischen neurotrophischen und entzündlichen Faktoren neben der Dauer der Entzündung wichtige Faktoren, die ihren positiven oder negativen Ausgang beeinflussen.
Die Ergebnisse zahlreicher klinischer und experimenteller Studien legen nahe, dass diverse Gehirninsulte, einschließlich SE, entzündliche Prozesse induzieren, welche zu der Epilepsieentstehung beitragen könnten (Vezzani u. Granata 2005). Ein SE ruft im Tiermodell eine immense Entzündungsreaktion in Gehirnbereichen hervor, welche an der Entstehung und Ausbreitung der epileptischen Aktivität beteiligt sind (Vezzani u. Granata 2005; Vezzani u. Baram 2007). An dieser Entzündungsreaktion sind sowohl das angeborene als auch das erworbene Immunsystem beteiligt (Vezzani u.
Granata 2005). Nach einem SE werden innerhalb kürzester Zeit viele pro- inflammatorische Mediatoren freigesetzt, darunter Zytokine wie IL-1!, IL-6 und Tumornekrosefaktor-" (TNF-"), Komplementfaktoren und das Enzym COX-2 (De Simoni et al. 2000; Vezzani u. Granata 2005). Unter den zahlreichen Entzündungsmediatoren, die an der Epileptogenese beteiligt sein könnten, wurde die Rolle der COX-2 und des IL-1! in vielen Studien charakterisiert; sie wird nachfolgend vorgestellt.
Die Cyclooxygenasen katalysieren den ersten Schritt der Arachidonsäurekaskade:
Die Synthese von Prostaglandin-H2, einem kurzlebigen Vorläufer der weiteren
existieren zwei Isoformen der COX: Die COX-1, welche konstitutiv in den meisten Geweben und Organen exprimiert wird, und die induzierbare COX-2, welche die vorherrschende Isoform im Gehirn darstellt und hier ebenfalls konstitutiv exprimiert wird (Vane et al. 1998). Neben der Entzündungsantwort wird der COX-2 eine Beteiligung an der Neurodegeneration (Kawaguchi et al. 2005) und neuronaler Hyperexzitabilität (Willingale et al. 1997) zugeschrieben.
Abbildung 2: Schematische Darstellung der COX-2-Aktivierung und der Prostaglandin-E2
(PGE2)-vermittelten Folgen in der Epileptogenese. Arachidonsäure (AS) wird durch die Phospholipase A2 aus Phospholipiden freigesetzt. Die Cyclooxygenasen (hier nur COX-2 dargestellt) katalysieren den ersten Schritt der Prostaglandinsynthese, die Metabolisierung der AS zu PGH2. Spezifische Prostaglandin-Synthasen vermitteln anschließend die Synthese der verschiedenen Prostaglandine (hier nur PGE2, PGD und PGF2! abgebildet). Die Hemmung der COX-2 kann durch nicht-steroidale Antiphlogistika und selektive COX-2-Inhibitoren erfolgen.
Hier ist die Hemmung mittels des selektiven COX-2-Inhibitors Parecoxib (Pcb) dargestellt. In der Epileptogenese werden für PGD antikonvulsive Eigenschaften vermutet, während PGE2
und PGF2! prokonvulsiv wirken. PGE2 vermittelt neben der Aktivierung der Transkription inflammatorischer Gene neurotoxische und neuroprotektive Wirkungen. Dem EP1-Rezeptor wird eine neurotoxische Wirkung zugesprochen. Die Aktivierung von EP2 und EP4 führt zur Neuroprotektion. Für den EP3 wurde eine Beteiligung an neurotoxischen und neuroprotektiven Effekten beschrieben.
2002 wurde eine weitere Cyclooxygenase, die COX-3, identifiziert (Chandrasekharan et al. 2002). Sie wird von dem COX-1-Gen exprimiert, unterscheidet sich jedoch in ihrer mRNA von den bekannten COX-Isoformen. Die COX-3 ist gewebespezifisch, mit der höchsten Expression im Gehirn (hier im zerebralen Cortex), gefolgt vom Herzen (Chandrasekharan et al. 2002). Über die Funktionen der COX-3 und ihre Beteiligung an der Prostaglandin-Synthese im Gehirn ist noch wenig bekannt (Minghetti 2004).
In hippocampalen Biopsien von Patienten mit therapieresistenter Temporallappenepilepsie und hippocampaler Sklerose wurde eine gesteigerte COX- 2-Expression nachgewiesen (Desjardins et al. 2003). Erhöhte Prostaglandin-Spiegel wurden im Liquor von Epilepsiepatienten gemessen (Wolfe u. Mamer 1975). Ferner führte die Verabreichung von PGE2 bei epileptischen Patientinnen, die das Antiepileptikum Valproat einnahmen, zu der Entstehung von Krämpfen (Brandenburg et al. 1990). Eine gesteigerte COX-2-Expression im Hippocampus wurde durch Kindling, durch Kainat-, Pilocarpin- und elektrisch-induzierte Anfälle sowie durch epileptische Anfälle in EL(epileptischen)-Mäusen (genetisches Maus-Modell für idiopathische komplexe Anfälle in Humanpatienten) hervorgerufen (Chen et al. 1995;
Sandhya et al. 1998; Okada et al. 2001; Voutsinos-Porche et al. 2004; Kawaguchi et al. 2005; Jung et al. 2006; Zibell et al. 2009). Zudem förderte die Induktion der COX- 2 in Tiermodellen der Temporallappenepilepsie sowohl die Neuodegeneration als auch die Epilepsieentstehung (Cole-Edwards u. Bazan 2005; Takemiya et al. 2007;
Kulkarni u. Dhir 2009). Die Bedeutung der COX-2 in der Epileptogenese wird ebenfalls durch Untersuchungen an knock-out- und transgenen Mäusen verdeutlicht:
Mäusen, denen das COX-2-Gen fehlt (COX-2(-/-)) wiesen im Kindling-Modell eine geringere Inzidenz an Anfällen auf (Takemiya et al. 2003). Hingegen entwickelten Mäuse, welche die neuronale COX-2 überexprimieren, im Kainat-Modell schwerer ausgeprägte Anfälle, die mit hoher Mortalität verbunden waren (Kelley et al. 1999).
Es ist bekannt, dass die Konsequenzen der COX-2-Aktivierung von den synthetisierten Prostaglandinen (PG) und den Prostaglandin-Rezeptoren abhängen (Abbildung 2). PGE2 und PGF2" sind in der akuten Phase nach SE im Gehirn erhöht,
erhöht (Naffah-Mazzacoratti et al. 1995). Aus diesem Grund schreiben Naffah- Mazzacoratti et al. (1995) und Liang et al. (2005) dem PGD2 antikonvulsive und neuroprotektive Eigenschaften zu. Takemiya et al. (2006) postulieren, dass PGE2, welches von Astrozyten und Endothelzellen synthetisiert wird, die Neurodegeneration nach SE verstärkt. Die Applikation eines COX-2-Inhibitors erzielte eine Neuroprotektion, wenn der PGE2-Anstieg vollständig gehemmt wurde (Takemiya et al. 2006). Ob PGE2 den Zelltod fördert oder verhindert, ist vermutlich davon abhängig, über welchen Rezeptor seine Wirkung vermittelt wird (Gendron et al.
2005). Es sind vier PGE2-Rezeptoren (EP1 - EP4) bekannt. Der EP2- und EP4- Rezeptor aktivieren die Adenylatzyklase, der EP3-Rezeptor hemmt diese; die Aktivierung des EP1-Rezptors führt zu einer Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration (Negishi et al. 1995). Die Prostanoid-Rezeptoren EP2 - EP4
sind mit Neuroprotektion assoziiert, hingegen wird der EP1-Rezeptor (und/oder der EP3-Rezeptor (Gendron et al. 2005)) mit Neurotoxizität in Verbindung gebracht (Bilak et al. 2004; McCullough et al. 2004; Ahmad et al. 2005) (Abbildung 2). Pekcec et al.
(2009) zeigten, dass die Antagonisierung des EP1-Rezeptors den Anfalls-induzierten P-Glykoprotein-Anstieg aufhebt.
Eine Hemmung der COX-2 und damit verbundene Abnahme der Prostaglandinspiegel könnte eine Strategie der Epilepsie-Prävention darstellen. Die ersten Ergebnisse, welche diese Hypothese bestätigen, präsentierten Jung et al.
(2006). Sie zeigten, dass die Applikation des COX-2-Inhibitors Celecoxib nach Pilocarpin-induziertem SE zu einer Reduktion der Inzidenz, Dauer und Frequenz von spontanen Anfällen führte. In anderen Studien wurde gezeigt, dass die Wirkungen von Celecoxib nicht ausschließlich auf eine COX-2-Hemmung zurückzuführen sind (Kang et al. 2005; Grösch et al. 2006; Miyamoto et al. 2006). Um die oben genannte Hypothese zu überprüfen, wurde in dieser Arbeit der hoch selektive COX-2-Inhibitor Parecoxib verwendet (Abbildung 2).
Die IL-1-Familie besteht aus IL-1" und IL-1!, zwei pro-inflammatorischen Zytokinen und dem IL-1-Rezeptorantagonist (IL-1RA). IL-1!, oftmals als der Prototyp der Zytokine bezeichnet, wird zur Abwehr nach lokalen und systemischen Verletzungen sowie zur Krankheitsabwehr freigesetzt (Luheshi et al. 2009). Als ein wichtiger
Mediator des angeborenen Immunsystems hat es pyrogene Eigenschaften, stimuliert neutrophile Granulozyten und fördert die Einwanderung von Leukozyten in entzündetes Gewebe (Pettipher et al. 1986; Ulich et al. 1987; Murakami et al. 1990).
Im erworbenen Immunsystem kommt IL-1! eine wichtige Rolle als Stimulator der Entwicklung von aktivierten Lymphozyten zu (Gery et al. 1972). In der Peripherie ist eine der Hauptaufgaben von IL-1! die Bekämpfung bakterieller Infektionen (Miller et al. 2007). Im gesunden Gehirn ist IL-1! nur in äußerst geringen Konzentrationen vorhanden (Vitkovic et al. 2000). Im Zusammenhang mit Neuroinflammation, SE und Anfällen kommt es zu einer gesteigerten Synthese von IL-1!, vorwiegend durch Mikroglia (Pearson et al. 1999; Vezzani et al. 1999; De Simoni et al. 2000; Mabuchi et al. 2000). IL-1! wird als Pro-IL-1! synthetisiert und durch die Caspase-1 zu seiner reifen Form gespalten (Thornberry et al. 1992). Diese aktive Form des IL-1!- vermittelt seine Wirkung durch Bindung an die transmembrane Domäne des IL-1- Rezeptors (Vigers et al. 1997) (Schematisch Darstellung der IL-1!-Synthese und Wirkung siehe Kapitel 2.2.3).
Klinische Hinweise deuten darauf hin, dass IL-1! eine bedeutende Rolle in der Epilepsieentstehung zukommt: Im Gehirngewebe von Patienten mit fokaler kortikaler Dysplasie und glioneuralen Tumoren (beide Erkrankungen sind ursächlich für chronische unbehandelbare Epilepsien) wurde eine erhöhte Expression von IL-1!
gefunden (Ravizza et al. 2006). In resektiertem kortikalen Gewebe epileptischer Patienten wurden erhöhte Zytokin-Spiegel, darunter IL-1! gemessen (Choi u. Koh 2008). NFkappaB, ein Transkriptionsfaktor, der die Wirkung von IL-1!-vermittelt, wird im Hippocampus von Temporallappenepilepsie-Patienten vermehrt exprimiert (Crespel et al. 2002). Häufig ist ein Genpolymorphismus, in der Promotorregion von IL-1!, welcher vermutlich zu einer gesteigerten Produktion von IL-1! führt, in Temporallappenepilepsie-Patienten mit hippocampaler Sklerose und lang anhaltenden Fieberkrämpfen zu verzeichnen (Kanemoto et al. 2003). Die Auswertung von Zytokin-Genpolymorphismen einschließlich IL-1!, deutet auf eine Assoziation dieser Polymorphismen mit der Entstehung einer Epilepsie hin;
allerdings divergieren die Ergebnisse (Heils et al. 2000; Buono et al. 2001; Peltola et
resektiertem Temporallappengewebe von Patienten mit unbehandelbarer Epilepsie wurde eine gesteigerte Aktivität der Caspase-1 beobachtet (Henshall et al. 2000).
Tierexperimentell indizieren zahlreiche Studien eine Konnektivität von IL-1! und der Epilepsieentstehung: Anfälle erzeugt durch die Applikation von Kainat (Vezzani et al.
1999, 2002; Lehtimäki et al. 2003), Pilocarpin (Voutsinos-Porche et al. 2004; Ravizza et al. 2008), Bicucullin (Vezzani et al. 2000) sowie mittels Kindling (Plata-Salamán et al. 2000) oder elektrischer Stimulation (De Simoni et al. 2000; Okada et al. 2002;
Ravizza et al. 2008) induzieren eine gesteigerte Produktion von IL-1! auf mRNA- und Protein-Ebene. Darüber hinaus belegen experimentelle Studien die Beteiligung von IL-1! an neuronaler Hyperexzitabilität, Exzitotoxizität und Neurodegeneration, diese werden als Bestandteile des Epileptogenese-Prozesses angesehen. Die intrazerebrale Applikation von IL-1! vor einem durch Kainat oder Bicucullin induzierten Anfall verkürzt die Zeit bis zum Anfallsbeginn und verstärkt die Anfallsaktivität (Vezzani et al. 1999, 2000). Im Gegensatz dazu wirkt die intrazerebrale Applikation von rekombinaten IL-1RAen antikonvulsiv (Vezzani et al.
2000, 2002). Die pharmakologische Verhinderung der IL-1!-Spaltung in seine aktive Form durch Caspase-1-Inhibition resultiert ebenfalls in einem verzögerten Anfallsbeginn und kürzeren Anfällen (Ravizza et al. 2006a). Neben der pharmakologischen Intervention, verdeutlichen Studien an genetisch veränderten Mäusen ebenfalls eine IL-1!-Beteiligung an der Iktogenese. Mäuse, denen das Caspase-1-Gen fehlt, zeigen eine verringerte Anfallsanfälligkeit (Ravizza et al.
2006a). Konform hiermit weisen transgene Mäuse, die den endogenen IL-1RA überexprimieren, gleichfalls eine verringerte Anfallsanfälligkeit auf (Vezzani et al.
2002).
Da die Hyperexzitabilität einige Minuten nach der Verabreichung von IL-1! auftritt, kann diese Wirkung nicht durch die klassische Signalkasade der genetischen Transkription vermittelt sein (Dinarello 1996). Vielmehr wird die Hyperexzitabilität durch die Wechselwirkung von IL-1! mit Ionenkanälen und Neurotransmittern verursacht (Vezzani u. Baram 2007). Dieser nicht-transkriptionale enzymatische Signalübertragungsweg wird durch die vom IL-1RA hervorgerufene Aktivierung der neuronalen Sphingomyelinase und Scr(sarcoma)-Kinase-bedingter Phosphorylierung
der NR(NMDA-Rezeptor)2B-Rezeptoruntereinheit des NMDA-Rezeptors, welche die Kalzium-Permeabilität reguliert (Viviani et al. 2003; Balosso et al. 2008), vermittelt (schematische Darstellung in Kapitel 2.2.3.3). Des Weiteren wird IL-1! als bedeutender Regulator des Glutamattransportes angesehen (Tilleux u. Hermans 2007). Es hemmt die astrozytäre Glutamatwiederaufnahme und verstärkt mittels TNF-" die astrozytäre Glutamatfreisetzung (Ye u. Sontheimer 1996; Bezzi et al.
2001). Die astrozytäre Glutamatfreisetzung ist an der Entstehung epileptischer Entladungen beteiligt (Tian et al. 2005).
IL-1! ist, neben anderen Zytokinen, an der neuronalen Schädigung infolge traumatischer, ischämischer oder exzitotoxischer Umstände beteiligt (Allan et al.
2005). Degenerierende Neuronen setzen möglicherweise vermehrt Zytokine frei, was zu einem Teufelskreis aus neuronaler Schädigung und Entzündung führen könnte.
Vezzani und Baram (2007) geben zu bedenken, dass die Anfalls-induzierte Freisetzung von IL-1! immer vor dem neuronalen Zelltod auftritt. Durch die Beeinträchtigung der Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke und durch die Rekrutierung von Immunzellen in das Gehirn trägt IL-1! zur Hyperexzitabilität und Exzitotoxizität bei (Nguyen et al. 2002; Seiffert et al. 2004; Allan et al. 2005; Tian et al. 2005; Vezzani u. Granata 2005; Marchi et al. 2009). Ferner wird angenommen, dass die langfristigen Effekte von IL-1!, die über eine Aktivierung der Transkription von NFkappaB und MAPK(mitogen-activated protein kinase)-abhängigen Genen hervorgerufen werden, zu strukturellen und funktionalen Veränderungen in glialen und neuronalen Netzwerken führen, welche wiederum die Entstehung einer Epilepsie begünstigen (Vezzani u. Baram 2007).
Um die Bedeutung von IL-1! in der Epileptogenese besser zu charakterisieren, sind pharmakologische Untersuchungen in Epilepsie-Modellen, die sich der IL-1!- Hemmung durch Blockierung seiner Synthese und/oder Aufhebung der zellulären Signalübertragung bedienen, notwendig (Vezzani et al. 1999, 2000; Ravizza et al.
2006a). Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit durchgeführten Experimente tragen dazu bei diese Facette der vielfältigen IL-1!-vermittelten Wirkungen besser zu verstehen.
