Einfluss von „Vaginal seeding“ auf die frühe Kälbergesundheit

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Einfluss von „Vaginal seeding“ auf die frühe Kälbergesundheit

INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von Teresa Harborth

Braunschweig

Hannover 2021

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Wissenschaftliche Betreuung: PD Dr. med. vet. Maike Heppelmann Klinik für Rinder

1. Gutachterin: PD Dr. med. vet. Maike Heppelmann

2. Gutachter: Apl. Prof. Dr. med. vet. H.-J. Schuberth

Tag der mündlichen Prüfung: 06.05.2021

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Meiner Familie

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1 Einleitung ... 1

2 Literatur ... 3

2.1 Die Mikrobiota ... 3

2.1.1 Definition der Mikrobiota ... 3

2.1.2 Bedeutung der Mikrobiota... 4

2.2 Humane enterische Mikrobiota... 5

2.2.1 Entwicklung der humanen enterischen Mikrobiota ... 6

2.2.2 Einflussfaktoren auf die humane enterische Mikrobiota ... 7

2.2.2.1 Pränataler Zeitraum ... 7

2.2.2.2 Peripartaler Zeitraum ... 8

2.2.2.3 Postnataler Zeitraum ... 9

2.2.3 Einfluss der humanen Mikrobiota auf die Reifung des Immunsystems ...10

2.3 Enterische Mikrobiota beim Rind ... 12

2.3.1 Einflussfaktoren auf die intestinale Mikrobiota beim Kalb ...14

2.3.2 Entwicklung des Immunsystem beim Kalb ...16

2.4 Periphere Leukozyten ... 18

2.4.1 Polymorphkernige neutrophile Granulozyten (PMN) ...18

2.4.2 Mononukleäre Zellen (MNC) ...18

2.4.2.1 Monozyten ...18

2.4.2.2 Lymphozyten ...20

2.4.2.2.1 CD4⁺ αβ-T-Zellen ...20

2.4.2.2.2 CD8⁺ αβ-T-Zellen ...21

2.5 Vaginal seeding ... 21

3 Material und Methoden ... 23

3.1 Tiere ... 23

3.2 Haltung und Fütterung ... 23

3.3 Einteilung der Versuchsgruppen ... 23

3.4 Versuchsaufbau und Versuchsablauf ... 24

3.5 „Vaginal seeding“ ... 25

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3.6 Probenentnahme für Bestimmung des Mikrobioms ... 27

3.6.1 Vaginaltupfer Kuh ...27

3.6.2 Kolostrum Kuh ...27

3.6.3 Rachenabstrich Kalb ...27

3.6.4 Kotproben Kuh und Kalb ...28

3.6.5 Aerosol Proben ...28

3.7 Blutproben ... 29

3.7.1 Blutprobenentnahme ...29

3.7.2 Analysen ...29

3.7.2.1 Bestimmung des Gesamteiweiß und der Leukozytenzahl ...29

3.7.2.2 Nachweis von Kryptosporidien ...30

3.7.2.3 Bestimmung leukozytärer Subpopulationen ...30

3.7.2.3.1 Gesamtleukozytenzahl ...30

3.7.2.3.2 Vollblutlyse ...30

3.7.2.3.3 Separation leukozytärer Subpopulationen ...31

3.7.2.3.4 Membranimmunfluoreszenz (MIF) ...31

3.7.2.3.5 Durchflusszytometrie...34

3.7.2.4 Bestimmung von IgG1- und IgG2-Gehalten ...34

3.8 Klinische Untersuchungen und Behandlungen ... 36

3.8.1 Allgemeinuntersuchung ...36

3.8.2 APGAR-Beurteilung ...36

3.8.3 Maßnahmen bei Erkrankungen ...37

3.9 Statistische Auswertung ... 38

3.9.1 Prüfung auf Normalverteilung ...38

3.9.2 Mixed model ...40

4 Ergebnisse ... 41

4.1 Versuchstiere ... 41

4.1.1 Allgemeine Parameter Kuh ...41

4.1.2 Allgemeine Parameter Kalb ...41

4.2 Parameter der Kälbergesundheit ... 42

4.2.1 Körpergewicht ...42

4.2.2 Tränkeaufnahme ...44

4.2.3 Allgemeine Untersuchung...44

4.2.3.1 Körpertemperatur ...44

4.2.3.2 Atemfrequenz und Atemqualität ...49

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4.3 Laborwerte ... 56

4.3.1 Kotproben ...56

4.3.2 Venöse Blutproben ...56

4.3.3 Arterielle Blutproben ...58

4.3.3.1 pH-Wert ...58

4.3.3.2 Sauerstoffpartialdruck (pO₂) ...59

4.3.3.3 Kohlenstoffdioxidpartialdruck (pCO₂)...63

4.3.3.4 Sauerstoffsättigung (sO₂) ...64

4.3.3.5 L-Laktat ...65

4.3.3.6 Base Excess (BE) ...68

4.4 Zelluläre Subpopulationen im venösen Blut ... 69

4.4.1 Einfluss von „Vaginal seeding“ ...70

4.4.1.1 Leukozytäre Hauptpopulation ...70

4.4.1.2 Lymphozytäre Subpopulationen ...75

4.4.1.3 Monozytäre Subpopulationen ...79

4.4.2 Einfluss der Position der Klauen bei Beginn der Sectio caesarea ...83

4.4.3 Einfluss des Öffnungsgrades der Cervix bei Beginn der Sectio caesarea ...90

4.4.4 Einfluss des Zustandes der Eihäute bei Beginn der Sectio caesarea ...95

4.4.5 Einfluss der Herkunft des Kolostrums ...98

4.4.5.2 Lymphozytäre Subpopulationen ... 102

4.4.5.3 Monozytäre Subpopulationen ... 103

4.4.6 Einfluss der Qualität des Kolostrums ... 106

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4.4.6.1 Leukozytäre Hauptpopulation ... 106

4.4.7 Einfluss des Auftretens von neonataler Diarrhoe ... 111

4.4.7.1 Leukozytäre Hauptpopulation ... 111

4.5 IgG1- und IgG2-Gehalte im Serum ... 116

4.5.1 Einfluss von „Vaginal seeding“ ... 116

4.5.2 Einfluss der Position der Klauen bei Beginn der Sectio caesarea ... 119

4.5.3 Einfluss des Öffnungsgrades der Cervix bei Beginn der Sectio caesarea ... 122

4.5.4 Einfluss des Zustandes der Eihäute bei Beginn der Sectio caesarea ... 126

4.5.5 Einfluss der Herkunft des Kolostrums ... 127

4.5.6 Einfluss der Qualität des Kolostrums ... 130

4.5.7 Einfluss des Auftretens von neonataler Diarrhoe ... 131

5 Diskussion ... 134

5.1 Studiendesign ... 134

5.2 Parameter der Kälbergesundheit ... 135

5.2.1 Körpergewicht und Gewichtszunahme... 136

5.2.2 Tränkeaufnahme ... 137

5.2.3 Allgemeine Untersuchung... 138

5.2.3.1 Körpertemperatur ... 138

5.2.3.2 Atemfrequenz und -qualität ... 139

5.2.3.3 Kotbeschaffenheit ... 141

5.2.4 Erkrankungen und Behandlung ... 141

5.3 Laborwerte ... 143

5.3.1 Kotproben ... 143

5.3.2 Venöse Blutproben ... 143

5.3.3 Arterielle Blutproben ... 145

5.3.3.1 pH-Wert und Base Excess (BE) ... 145

5.3.3.2 Sauerstoffpartialdruck (pO₂) ... 146

5.3.3.3 Kohlenstoffdioxidpartialdruck (pCO₂)... 147

5.3.3.4 Sauerstoffsättigung (sO₂) ... 147

5.3.3.5 L-Laktat ... 148

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5.4.2 Der Fortschritt der Geburt bei Beginn der Sectio caesarea beeinflusst die

Zellzusammensetzung des venösen Blutes und die IgG-Konzentrationen ... 152

5.4.3 Die Herkunft und Qualität des Kolostrums beeinflusst die Zellzusammensetzung, in Kombination mit „Vaginal seeding“ die IgG2- Konzentrationen des venösen Blutes ... 154

5.4.4 Das Auftreten von neonataler Diarrhoe beeinflusst monozytäre und lymphozytäre Subpopulationen und geht einher mit Unterschieden in der IgG2-Konzentration ... 156

5.4.5 „Vaginal seeding“ und Kälber der Kontrollgruppe zeigen nur gegen Ende des Versuchszeitraumes Unterschiede in der Zusammensetzung lymphozytärer Subpopulationen ... 157

5.4.6 „Vaginal seeding“ beeinflusst die Serumkonzentration an IgG2-Antikörpern .. 159

5.4.7 „Vaginal seeding“ beeinflusst die Zusammensetzung lymphoyztärer und monozytärer Subpopulationen und das IgG1 zu IgG2-Verhältnis nach Gabe von Zylexis^® ... 160

5.5 Schlussfolgerung ... 161

6 Zusammenfassung ... 164

7 Summary ... 167

8 Literaturverzeichnis ... 170

9 Anhang ... 192

9.1 Allgemeinuntersuchung ... 192

9.2 Vergleich von Dichtegradientenseparation und Vollblutlyse ... 193

9.3 Kulturmedien, Puffer und Lösungen ... 195

9.3.1 Lösungen für die Zellseparation und MIF ... 195

9.3.2 Lösungen und Puffer für die ELISA ... 196

9.4 Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen ... 197

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1 1 Einleitung

Die Zusammensetzung der frühen intestinalen Mikrobiota spielt eine große Rolle für die Entwicklung eines gesunden Immunsystems und die metabolische Programmie- rung des Wirtes¹. Aus der Humanmedizin ist bekannt, dass natürlich geborene Kin- der einen höheren Gehalt an Lactobacillus spp. und Bacteroides spp. sowie weniger Streptococcus spp. und Staphylococcus spp. in der Darmflora im Vergleich zu per Sectio caesarea entwickelten Kindern aufweisen². Dies wird darauf zurückgeführt, dass der Fetus bei einer Sectio keinen direkten Kontakt mit der vaginalen bzw. fä- kalen Mikrobiota der Mutter hat³. Die Sectio caesarea gilt grundsätzlich als Risikofak- tor für die Entwicklung von immunologischen und metabolischen Erkrankungen wie Allergien, Diabetes mellitus Typ I, Zöliakie, Neurodermitis und Übergewicht^3-5. Durch sogenanntes „Vaginal seeding“, einer Exposition mit der Vaginalflüssigkeit der Mutter nach einer Sectio caesarea, konnte eine Annäherung an die intestinale Mikrobiota vaginal geborener Kinder erzielt werden¹. Hierbei wurde eine Gaze, die zuvor in der maternalen Vagina inkubiert wurde, über Gesicht und Körper der per Sectio caesarea entwickelten Babys gewischt.

In verschiedenen Studien wurde die Zusammensetzung der intestinalen Mikrobiota von Kälbern in den ersten Lebenswochen beschrieben^{6, 7}. Bisher wurden insbesondere der Einfluss von Kolostrum, Probiotika und Antibiotikagabe auf das intestinale Mikrobiom untersucht^8-11. Dabei konnte sowohl das Auftreten einzelner, bestimmter Organismen als auch eine diverse, stabile Mikrobiota mit einem verringerten Auftre- ten von neonataler Diarrhoe, einer der Hauptursachen für Kälberverluste, in Zusam- menhang gebracht werden^12-14.

Das angeborene Immunsystem beeinflusst die intestinale Mikrobiota, gleichzeitig muss das neonatale Immunsystem eine Toleranz gegenüber der physiologischen Mikrobiota entwickeln. So können z.B. Bacteroides (Bact.) fragilis intraepitheliale T- Zellen beeinflussen und so eine proinflammatorische Immunantwort hemmen¹⁵. Durch die relative Unreife des Immunsystems bei der Geburt sind aber gerade Käl- ber in der Entwicklung ihres Immunsystems wesentlich durch Umgebungseinflüsse wie Haltungsbedingungen und Kolostrumversorgung beeinflusst^{16, 17}. Über den Ein- fluss des Geburtsweges auf die Mikrobiota und den Einfluss von Änderungen auf

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Einleitung

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mittelfristige und langfristige Entwicklung des Immunsystems von Kälbern ist bisher wenig bekannt.

Daher war das Ziel dieser Studie, den Einfluss des „Vaginal seeding“ nach Entwick- lung mittels Sectio caesarea auf die weitere Gesundheit und die Entwicklung des Immunsystem beim Kalb zu untersuchen.

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3 2 Literatur

2.1 Die Mikrobiota

2.1.1 Definition der Mikrobiota

Als Mikrobiota wird die Zusammensetzung der mikrobiellen Population eines Men- schen bzw. Tieres bezeichnet. Das Mikrobiom hingegen ist die Gesamtheit der gene- tischen Information der mikrobiellen Gemeinschaft und wird durch Gesamt-Genom- Sequenzierung bestimmt¹².

Im menschlichen Körper befinden sich mit 3,8 x 10¹³ Bakterien etwa ebenso viele Bakterien wie eukaryotische Zellen¹⁸. Sie besiedeln Haut, Schleimhäute, Lunge und Darm. Die verschiedenen Lokalisationen des Körpers haben dabei eine deutlich un- terscheidbare Mikrobiota¹⁹. Darm- und Mundflora zeigen die größte, die Vaginalflora hingegen die geringste Diversität. Hochpathogene Keime (z. B. Pseudomonas (P.) aeruginosa) sind nicht in der physiologischen Mikrobiota des Menschen vertreten, weniger pathogene Bakterien (z. B. Staphylococcus (S.) aureus) sind dagegen häufig Teil einer stabilen Flora. Bei gesunden Menschen gibt es starke interindividuelle Un- terschiede in der Zusammensetzung der Mikrobiota, intraindividuell dagegen treten über Wochen bis Monate nur geringe Schwankungen auf. Die Ernährung spielt eine wesentliche Rolle bei der Entstehung der individuellen Unterschiede, bspw. überwie- gen Bacteroidaceae bei einer Ernährung, die reich an tierischen Fetten und Protei- nen ist, Prevotellaceae dagegen bei kohlenhydratreicher Ernährung. Regionale Un- terschiede werden hauptsächlich durch Unterschiede in der Ernährung, Umwelt, Ge- netik und im mikrobiellen Erstkontakt erklärt^{20, 21}.

Die Zusammensetzung der mikrobiellen Flora eines Körperbereichs ist abhängig von physikalischen Faktoren (Sauerstoffgehalt, Feuchtigkeit, pH-Wert), der Wirtsimmuni- tät und mikrobiellen Interaktionen wie Mutualismus und Konkurrenz²⁰. Wichtig für die Symbiose zwischen Wirt und Bakterien ist zum einen eine Minimierung von Kontakt zwischen Bakterien und Epithel, im Darm bspw. durch die Mukusschicht, zum anderen eine Toleranz des Immunsystems gegenüber den Bakterien²².

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Literatur

4 2.1.2 Bedeutung der Mikrobiota

Durch Koevolution hat sich eine mikrobielle Flora gebildet, die an vielen essentiellen Prozessen, wie der Verdauung, der Immunabwehr und der Entwicklung des Immun- systems beteiligt ist^{23, 24}. Im Darm beeinflusst die Mikrobiota die Entwicklung von se- kundären lymphatischen Strukturen (Peyer‘sche-Plaques, mesenterische Lymphkno- ten) und der Mukosa^{3, 25, 26} sowie die Differenzierung von Immunzellen¹⁵.

Zunehmend wird ein Zusammenhang zwischen Dysbiosen und verschiedenen metabolischen und immunologischen Erkrankungen gesehen. So wird eine Störung der Mikrobiota als eine Ursache für immunmediierte Erkrankungen wie Inflammatory bowel disease (IBD), Diabetes mellitus Typ I und Allergien vermutet²⁷. Eine geringe Diversität der intestinalen Mikrobiota von Babys wird mit der Entwicklung von Aller- gien assoziiert²⁸. Bei Kindern mit hochgradiger Neurodermitis wurde ein geringer prozentualer Anteil von Bifidobacterium spp. und Bacteroides spp. beobachtet⁵. Eine andere Studie zeigte, dass bei Kindern mit Neurodermitis und Nahrungsmittelaller- gien vermehrt Escherichia (E.) coli, Bifidobacterium (B.) pseudocatenulatum, aber weniger B. breve, B. adolescentis, Faecalibacterium (F.) prausnitzii und Akkerman- sia muciniphila nachgewiesen wurde im Vergleich zu Kindern mit Neurodermitis ohne Nahrungsmittelallergie²⁹. Bei übergewichtigen Kindern wurden retrospektiv im Klein- kindalter geringere Mengen Bifidobacterium spp. und eine höhere Anzahl S. aureus festgestellt als bei normalgewichtigen Kindern. Vermutlich führt dabei die Verände- rung der Mikrobiota zur vermehrten Anlage von Energiereserven und damit zu Über- gewicht⁵. Epidemiologische Studien legen nahe, dass das vermehrte Auftreten von immunologischen und metabolischen Störungen wie Allergien, Asthma, Übergewicht, Neurodermitis, Diabetes mellitus Typ I und Zöliakie bei Kindern nach Sectio caesarea auf eine Veränderung in der Zusammensetzung der intestinalen Mikrobiota zu- rückzuführen ist³. Der exakte kausale Zusammenhang konnte jedoch bisher nicht nachgewiesen werden, da viele Störfaktoren, wie sozioökonomische Unterschiede, Antibiotikagabe post partum und Ernährung des Säuglings Einfluss haben⁴.

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5 2.2 Humane enterische Mikrobiota

Die humane enterische Mikrobiota besteht aus über 500 Spezies^{18, 30} und ist über- wiegend zusammengesetzt aus Bacteroides spp., Prevotella spp. und Ruminococcus spp.²³. Sie kann in zwei Gruppen unterteilt werden, die autochthonen (Epithel- assoziiert) und die allochthonen (Lumen-assoziiert) Arten²³.

Die enterische Mikrobiota ist an verschiedenen Prozessen im Körper, wie dem Auf- schluss von Nährstoffen und der Immunabwehr beteiligt und kann sogar Gehirnfunk- tionen beeinflussen. Sie produziert essentielle Vitamine und verbessert die Nah- rungsausnutzung. Durch den Verbrauch von Nährstoffen limitiert sie gleichzeitig vor- handene Nährstoffe und Nischen für pathogene Mikroorganismen²⁷.

Im Darm ist die Mikrobiota an verschiedenen Aspekten der Abwehr von pathogenen Erregern beteiligt. Dies geschieht zum einen durch Nischenkonkurrenz und Unter- stützung der Immunantwort, zum anderen kommt es durch Verbesserung von Me- chanismen der Immunclearance und Änderung der Dicke der intestinalen Mukus- Schicht bzw. der Dichte an Epithelzellen im Darm zu einer Stärkung der Barrierefunk- tion der Mukosa^{10, 24}. Der Mukus besteht aus zwei Schichten, einer inneren, dichten, fest am Epithel anhaftenden Schicht und einer äußeren, nicht anhaftenden, kom- mensalenreichen Schicht^{22, 31}. Die Zusammensetzung des Mukus und Ausprägung der Krypten und Villi des Darmepithels wird stark durch die Ernährung und Mikrobiota beeinflusst²⁵. Auch die Erneuerung des Darmepithels wird durch Interaktionen von Mikrobiota und Epithel beeinflusst, bestimmte Mikroorganismen werden diesbezüg- lich mit Neoplasien in Verbindung gebracht³².

Für eine funktionierende Abwehr im Darm ist besonders wichtig, dass das Immun- system Kommensalen von pathogenen Mikroorganismen unterscheiden und ange- passt reagieren kann. Die intestinale Mikrobiota moduliert die Immunantwort über Microbial associated meloculear patterns (MAMP), die überwiegend von Toll-like- Rezeptoren (TLR) auf Immun- und Darmepithelzellen erkannt werden¹⁵. Dies führt an der Mukosa vor allem zu einer Verstärkung der Muzinproduktion, Sekretion von Im- munglobulin (Ig) A und Expression antimikrobieller Peptide (AMP)²⁴. Initiiert wird dieser Schutzmechanismus über zwei teilweise parallel ablaufende Wege: Der kontinu- ierlich ablaufende Mechanismus, bei dem die TLR Kommensalen erkennen und die

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Literatur

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stetige Produktion protektiver Faktoren induzieren. Und auf der anderen Seite eine verstärkte Ausschüttung protektiver Faktoren nach einer akut aufgetretenen Epithelläsion, die durch das Erreichen der TLR von Zellen unterhalb der Basalmemb- ran (z.B. Fibroblasten und Makrophagen) durch von Kommensalen produzierte Lig- anden festgestellt wird. Im Gegensatz zu pathogenen Erregern wird bei Erkennung von Kommensalen besonders die Produktion von Interleukin (IL-) 6 und Tumornekro- sefaktor (TNF-) α verstärkt und so das Darmepithel geschützt³³.

2.2.1 Entwicklung der humanen enterischen Mikrobiota

Bisher wurde davon ausgegangen, dass sich ein Fetus intrauterin in einer sterilen Umgebung entwickelt und während der Geburt der erste Kontakt mit Mikroorganis- men stattfindet^{3, 27}. Jimenez et al.³⁴ und Neu⁴ konnten jedoch bereits im Amnion, Na- belschnurblut, fetalen Membranen, Mekonium und Plazenta wenig, aber diverse mikrobielle DNA identifizieren. Bei nicht schwangeren Frauen konnte im Uterus ein bio- massearmes, überwiegend aus Lactobacillus spp., aber auch Gardnerella sp., Strep- tococcus spp., Staphylococcus spp., Bifidobacterium spp, Prevotella spp., Atopobium spp. und Sneathia spp. bestehendes Mikrobiom nachgewiesen werden³⁵. Mikroorga- nismen im Mekonium von Babys ähneln den Mikroorganismen der Amnionflüssigkeit und unterscheiden sich von dem späteren fetalen Kot³⁶.

Gerade die ersten zwei Lebenstage sind ein wichtiger Zeitraum für die Etablierung der enterischen Mikrobiota³⁰. Nach einer normalen Geburt besteht die Darmflora des Kindes überwiegend aus der maternalen vaginalen und fäkalen Flora³. Zunächst wird der Darm durch fakultativ anaerobe Bakterien, besonders Enterococcus spp., Staphylococcus spp., Streptococcus spp. und Enterobacteriaceae besiedelt. Diese verbrauchen den vorhandenen Sauerstoff und bilden ein anaerobes Milieu, verän- dern den pH-Wert, senken das Redox-Potenzial und produzieren Kohlenstoffdioxid und Nährstoffe^{3, 37}. Zum Ende der ersten Lebenswoche ist die intestinale Mikrobiota vor allem durch Bifidobacterium spp., aber auch Bacteroides spp., Clostridium spp.

und Lactobacillales geprägt³. Jakobsson et al.³⁸ stellten zusätzlich ein initiales Vor- handensein von Proteobacteria fest, deren Anzahl bis zum zweiten Lebensjahr ab- nimmt. Firmicutes traten erst ab dem dritten Lebensmonat auf, Actinobacteria dage-

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gen erreichten im dritten Lebensmonat ihr Maximum. In den ersten Lebenswochen zeigen die Babys starke individuelle Unterschiede in der genauen Zusammensetzung und dem Besiedlungsmuster der intestinalen Mikrobiota, die auf Unterschiede in der Umgebungsflora und der Ernährung zurückgeführt werden¹⁸. Typisch für die Zu- sammensetzung der Mikrobiota im ersten Lebensjahr ist eine geringe Diversität, gro- ße Instabilität und starke interindividuelle Variation³⁹. Die Diversität der Mikrobiota in oralen und analen Körperstellen ist nach der Geburt besonders hoch und nimmt in den ersten drei Lebenstagen ab, die Diversität der Hautflora nimmt dagegen im ersten Lebensmonat stetig zu¹. Mit Ende des ersten Lebensmonats unterscheidet sich die anale Mikrobiota noch immer deutlich von der adulter Menschen, Haut und orale Mikrobiota ähneln hingegen bereits nach einer Woche der Flora adulter Menschen¹. Die Umstellung auf feste Nahrung fördert die Diversität der intestinalen Mikrobiota³. Eine Mikrobiota, die der eines adulten Menschen ähnelt, wird mit ca. drei Lebensjah- ren erreicht^{3, 18, 40}.

2.2.2 Einflussfaktoren auf die humane enterische Mikrobiota 2.2.2.1 Pränataler Zeitraum

Einflussfaktoren auf die enterische Mikrobiota des Babys sind während der Schwan- gerschaft unter anderem die Genetik, maternale Ernährung und Körpergewicht, Ein- satz von Antibiotika, Stress, Rauchen und Zahnstatus der Mutter^{4, 39, 41}. Eine fettrei- che Ernährung der Mutter führt unter anderem zu einer Reduktion von Bacteroi- des spp. und einer Zunahme von Enterococcus spp. im Mekonium³⁷. Chu et al.⁴² konnten zeigen, dass diese Veränderungen bis zur vierten bis sechsten Lebenswo- che bestehen bleiben. Das enterische Mikrobiom von übergewichtigen Schwangeren ist im Vergleich zu normalgewichtigen deutlich verändert, insbesondere die Zunahme von E. coli und Abnahme von Bifidobacterium spp. ist auffällig³⁷. Kinder übergewich- tiger Mütter zeigen eine veränderte intestinale Mikrobiota mit einer Verschiebung zu Bacteroides spp. und Staphylococcus spp. im ersten und sechsten Lebensmonat, erniedrigte Gammaproteobacteria in der zweiten Lebenswoche bzw. Proteobacteria am zweiten Lebenstag, was u. a. auf einen Mangel an Mikronährstoffen (z.B. Eisen)

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Literatur

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zurückgeführt wird³⁷. Die veränderte Mikrobiota dieser Babys bleibt bis zum Klein- kindalter bestehen³⁷.

Bei Mäusen konnte gezeigt werden, dass Stress während der Trächtigkeit die Menge an Lactobacillus spp. in der maternalen Vaginalflora verändert und damit durch verti- kale Übertragung auch die Darmflora der Nachkommen⁴³.

2.2.2.2 Peripartaler Zeitraum

Unabhängig von der Art der Entbindung kommt es peripartal durch hormonelle Ver- änderungen, besonders Abnahme von Östrogen, zu einer Änderung der Mikrobiota der Mutter⁴⁴. Die Artenvielfalt der intestinalen Mikrobiota der Mutter nimmt insgesamt ab und das Vorkommen von Proteobacteria und Actinobacteria nimmt zu⁴⁵. Auch das vaginale Mikrobiom der Mutter wird weniger divers⁴⁶. Andere Studien zeigten, dass sich lediglich die Vaginalflora im peripartalen Zeitraum verändert⁴⁷.

Der Geburtszeitpunkt beeinflusst die Mikrobiota. Bei prämatur geborenen Babys ist die Besiedlung des Darms mit Bacteroides spp. und Bifidobacterium spp. stark ver- zögert bzw. Staphylococcus spp. und Clostridium spp. treten verstärkt auf. Bedingt wird dies vor allem dadurch, dass diese Kinder meist per Kaiserschnitt geboren, kurz nach der Geburt in sehr keimarme Umgebung gebracht werden und häufig Antibioti- ka erhalten^{18, 48}

Die Art der Entbindung hat einen entscheidenden Einfluss auf die Mikrobiota des Kindes^{3, 30}. Der deutlichste Unterschied im Mikrobiom wurde zwischen vaginaler Ge- burt und elektivem Kaiserschnitt ohne vorhergehende Wehen festgestellt¹⁹. Während einer natürlichen Geburt hat das Kind Kontakt zur vaginalen und intestinalen Mikro- biota der Mutter, was zu einer Kolonisierung des Darms insbesondere mit Lactobacil- lus spp., Prevotella spp. und Bifidobacterium spp. führt³⁰. Diese Übertragung der Mik- robiota fehlt während eines Kaiserschnitts. Hier wird der Darm der Babys durch Um- weltkeime, besonders durch Vertreter der Mikrobiota der Haut, wie Staphylococcus spp., Streptococcus spp. und Propionibacterium spp., besiedelt. Die Besiedlung durch Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp. und Bacteroides spp. ist verzögert und der Reichtum bzw. die Diversität der Mikrobiota stark eingeschränkt. Weiterhin kom-

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men weniger gesundheitsfördernde und vermehrt pathogene Keime in der Mikrobiota bei Babys nach Sectio caesarea vor^{1-4, 30}. In einigen Studien konnte initial im Meko- nium kein Unterschied festgestellt werden, zeitlich verzögert traten jedoch Unter- schiede zwischen vaginal und per Sectio caesarea entwickelten Kindern auf. Bei Wampach et al.⁴⁹ war dies ab dem dritten Lebenstag erkennbar. Häufig nehmen diese Unterschiede mit zunehmendem Alter der Kinder ab. Nach sechs Wochen¹⁹, vier Monaten⁵⁰ bzw. sechs Monaten⁵¹ gleichen sich die intestinalen Mikrobiota von vaginal und per Sectio caesarea entwickelten Kindern. Bei Stokholm et al.⁵² waren nach einem Monat Unterschiede weniger ausgeprägt und nach einem Jahr keine mehr nachweisbar. Andere Studien haben jedoch bis zum siebten Lebensjahr eine Dysbi- ose bei Kindern nach Sectio caesarea feststellen können^{53, 54}.

Bestimmte Faktoren erschweren jedoch den Vergleich des Mikrobioms zwischen vaginal und per Kaiserschnitt entwickelten Kindern. Der Zeitpunkt der Sectio caesarea spielt eine wichtige Rolle, da Wehen z. B. über einen Anstieg proinflammatorischer Zytokine, aber auch das Eröffnen der Eihäute das Mikrobiom beeinflussen können^48,

55. Weiterhin werden im Zuge von Kaiserschnitten der Mutter gewöhnlich Antibiotika verabreicht, dies geschieht häufig intrapartum, meist erst nachdem die Nabelschnur durchtrennt wurde, teilweise aber auch schon vor Operationsbeginn⁴⁸. Ebenso kann die Art der Nahrung einen Einfluss haben, da nach Sectio caesarea die Kinder häufig vorübergehend oder auch langfristig mit Säuglingsnahrung gefüttert werden⁴⁸.

2.2.2.3 Postnataler Zeitraum

In der späteren Entwicklung hat die Umwelt einen großen Einfluss auf die intestinale Mikrobiota. Konya et al.⁵⁶ konnten zeigen, dass die intestinalen Mikrobiota der Kinder und bakterielle Aerosole ihrer Umgebung sich ähneln und vermuteten eine Übertra- gung der Bakterien des Staubs auf die Kinder. Auf Neugeborenenintensivstationen konnte nachgewiesen werden, dass die Umgebungsflora und die intestinale Mikrobi- ota der stationären Babys einander gleichen, hier wurde hingegen daraus geschlos- sen, dass die Kinder und das Pflegepersonal ein Reservoir für die Umgebungskon- tamination darstellen⁵⁷. Weiterhin hat die Zusammensetzung des Haushalts starken

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Literatur

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Einfluss auf die intestinale Mikrobiota von Kindern. Azad et al.⁵⁸ konnten zeigen, dass bei Kindern in Haushalten mit Haustieren Diversität und Reichtum der intestinalen Mikrobiota höher waren, als in Haushalten ohne Tiere, dabei traten Bifidobacteri- aceae verringert und Peptostreptococcaceae vermehrt auf. Die Anzahl der Kinder in einem Haushalt korreliert positiv mit dem Reichtum und Diversität der intestinalen Mikrobiota, insbesondere in Bezug auf Firmicutes und Bacteroidetes⁵⁹. Dagegen führt das Vorhandensein von älteren Geschwistern zu einer verminderten Diversität und Reichtum der intestinalen Mikrobiota und einem verringerten Auftreten von Pep- tostreptococcaceae⁵⁸. Bei Erstgeborenen Kindern wurde eine vermehrte Besiedlung durch Clostridium spp. und Enterobacteriaceae (ausschließlich E. coli) und vermin- dertes Vorkommen von Bifidobacterium spp. nachgewiesen^{60, 61}.

Ein weiterer großer Einflussfaktor in der Entwicklung der enterischen Mikrobiota ist die Ernährung der Kinder nach der Geburt⁴. Muttermilch enthält 10⁹ Mikroorganis- men/ l³⁰, vor allem Bifidobacterium spp., Lactobacillus (L.) rhamnosus, L. gasseri, L.

plantarum, L. fermentum und Enterococcus faecium⁵⁵. Mit Milchaustauscher gefütter- te Babys zeigen eine reduzierte Zahl Bifidobacterium spp. und Lactobacillus spp., aber erhöhte Menge Bacteroides spp. und Enterobacteriaceae⁵⁵. Muttermilch enthält zudem Oligosaccharide, die präbiotisch wirken und deren Zusammensetzung auch die Zusammensetzung der Bakterien beeinflussen^{3, 30}. Oligosaccharide und andere bifidogene Substanzen der Muttermilch fördern die Besiedlung durch Bifidobacterium spp.^{3, 18}. Auch Lysozyme, Lactoferrin und sekretorisches IgA aus der Muttermilch beeinflussen die Mikrobiota der Kinder³⁰. Insbesondere der Zeitpunkt des Absetzens beeinflusst die Mikrobiota, so nimmt beispielsweise die Anzahl an Clostridium (C.) leptum ab, je länger ein Kind gestillt wird⁶¹. Das Vorhandensein bestimmter Nährstof- fe bestimmt auch später im Leben die Zusammensetzung der intestinalen Mikrobiota („restaurant hypothesis“) und damit auch die Entwicklung von Signalwegen, die durch die Mikrobiota beeinflusst werden⁶².

2.2.3 Einfluss der humanen Mikrobiota auf die Reifung des Immunsystems

Die Dichte und Diversität der intestinalen Mikrobiota hat einen wesentlichen Einfluss auf verschiedene Aspekte der Entwicklung des Immunsystems⁶³.

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Kontakt von Enterozyten mit der Mikrobiota (z.B. Bact. fragilis) führt zu einer ver- mehrten Bildung von Th1-Zellen¹⁵.

Intraepitheliale T-Zellen (überwiegend CD8⁺ Intraepitheliale Lymphozyten (IEL)) und T-Zellen der Lamina propria (CD4⁺ T-Zellen) benötigen den Einfluss von Mikroorga- nismen zur Differenzierung und Erlangen ihrer vollen Funktionsfähigkeit. Auch auf die Entwicklung regulatorischer T- (Treg-) Zellen hat die intestinale Mikrobiota einen wesentlichen Einfluss¹⁵. Für viele Vertreter der intestinalen Mikrobiota wurde eine immunmodulierende Wirkung auf CD4⁺ T-Zellen der Lamina propria nachgewiesen, häufig dienen Enterozyten und dendritische Zellen als Vermittler.

Segmentierte filamentöse Bakterien (SFB) fördern die Entwicklung von Lamina propria T-Helfer (Th) 17 Zellen über verschiedene Wege (Abb1). Binden SFB an Entero- zyten, wird vermehrt Serum Amyloid A (SAA) gebildet, das in CD11c⁺ Zellen der La- mina propria zu einer vermehrten Ausschüttung von IL-6 und IL-23 führt. Diese stimulieren wiederum die Entwicklung naiver T-Zellen zu Th17-Zellen. SAA stimuliert zudem dendritische Zellen zur Freisetzung von IL-1β, was auch zu einer Th17-Zell Differenzierung führt. Eine Bindung der SFB an Enterozyten bewirkt außerdem die Polarisierung von Th17-Zellen durch Reaktive Sauerstoffspezies (ROS). Ungebun- dene SFB können an dendritischen Zellen zu einer Ausschüttung von IL-23 führen, das über Intestinale Epithelzellen (IEC) die SAA Ausschüttung stimuliert^{15, 63-66}.

Bact. fragilis wirkt durch Polysaccharid A (PSA) direkt auf CD4⁺ T-Zellen. Diese produzieren daraufhin vermehrt Transforming Growth Factor (TGF-) β2, was zu einer vermehrten Foxp3⁺ Treg-Zell Differenzierung mit Ausschüttung von entzündungs- hemmenden Zytokinen wie z.B. IL-10 führt und damit eine proinflammatorische Th17 Antwort unterdrückt^{3, 15}.

Clostridium spp. dagegen produzieren kurzkettige Fettsäuren, was zu einer Aus- schüttung von TGF-β1 aus Epithelzellen und von Retinsäure aus dendritischen Zel- len führt. Beides stimuliert die Foxp3⁺Treg-Zell Differenzierung. Außerdem hemmen sie proinflammatorische Zytokine^{15, 27, 64}.

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Literatur

12

Abb1 Mikrobiota stimulieren unterschiedliche Abschnitte der T-Zell-Antwort im Darm⁶⁶

Auf der anderen Seite beeinflusst das Immunsystem auch die Mikrobiota, so kann z.B. besonders im Dünndarm durch Freisetzung von sekretorischen IgA, aber auch Komponenten der adaptiven Immunantwort, wie Lysozym und antimikrobielle Pepti- de, das Wachstum der Mikrobiota gesteuert werden²².

2.3 Enterische Mikrobiota beim Rind

Nach der Geburt ist die intestinale Flora des Kalbes einfach und wenig divers, wird aber mit zunehmendem Alter und Futterumstellung komplexer^{6, 67-69}. Die Mikrobiota der Kälber innerhalb eines Betriebes ähnelt sich im Vergleich zu anderen Beständen, was auf Managementfaktoren zurückgeführt wird⁷⁰. Unterschiede zwischen den verschiedenen Studien beruhen wahrscheinlich vor allem auf unterschiedlichen Hal- tungsformen, Rassen, Fütterung und Probenentnahme⁷¹.

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Die ersten Mikroorganismen im Kälberdarm können bereits 20 Minuten nach der Ge- burt nachgewiesen werden, was für eine intrauterine Besiedlung bzw. eine Besied- lung während der Geburt spricht⁷². Innerhalb der ersten acht Lebensstunden wird der Darm durch fakultativ anaerobe Mikroorganismen wie E. coli und Streptococcus spp.

kolonisiert, die ein anaerobes Milieu schaffen^{10, 68}. Mayer et al.⁶⁹ nennen als first co- lonizer Citrobacter spp., Lactococcus spp., Leuconostoc spp. und Lactobacillus spp., nach 24 h waren aber bisher überwiegende Gattungen wie Lactococcus spp. und Leuconostoc spp. nicht mehr nachweisbar, dafür traten E. coli, aber auch Clostridium spp. und Bacteroides spp., insbesondere Bact. fragilis und Bact. vulgatus, auf. Mayer et al.⁶⁹ führten zwei Studien in Bayern bezüglich der Veränderungen in der intestinalen Mikrobiota neonataler Kälber durch. In der ersten Studie wurden 14 Kälber eines Betriebes verglichen, dabei wurden direkt nach der Geburt und nach 6 h, 12 h, 24 h, 48 h, 3 d, 7 d, 14 d und 42 d Kotproben entnommen. In der zweiten Studie wurden sechs Zwillingpaare und jeweils ein Kalb der gleichen Altersgruppe des gleichen Be- triebes verglichen und einmalig zwischen Tag vier und zwanzig Kotproben entnommen. Bei einer japanischen Studie von Uyeno et al.⁷³ waren Bacteroides spp., Prevo- tella spp., Faecalibacterium sp., Clostridium spp., Eubacterium spp. und Atopobium spp. in der ersten Lebenswoche bei Holstein Kälbern dominant. Kotproben wurden hier von insgesamt vier Kälbern eines Versuchsguts jeweils am ersten Tag von Wo- che eins, drei, fünf, sieben, neun und zwölf entnommen. Laut Oikonomou et al.⁶⁷ setzt sich die Darmflora der Kälber in den ersten sieben Lebenswochen in abstei- gender Menge aus Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria, Fusobacteria und Ac- tinobacteria zusammen. Die Zahl der Firmicutes, wie z.B. Lactobacillus spp., aber auch Bifidobacterium spp. nimmt bis zur vierten Lebenswoche zu und danach ab, bei Bacteroidetes verhält es sich umgekehrt. In dieser amerikanischen Arbeit wurden wöchentlich bis zum Absetzen etwa an Tag 45 bei insgesamt 61 Holstein Kälbern eines Betriebes Kottupferproben entnommen. Bei einer Studie von Klein-Jobstl et al.⁶ war das Fehlen von Bifidobacterium spp. auffällig, was dort unter anderem auf eine frühe Gabe von Heu zurückgeführt wurde. In dieser Studie wurden bei sechs Simmentaler Kälbern auf einem österreichischen Versuchshof Kotproben innerhalb der ersten zwölf Stunden nach der Geburt, in der zweiten, dritten und fünften bzw.

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Literatur

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sechsten Lebenswoche, sowie in der Woche vor und nach dem Absetzen (ca. elfte Lebenswoche) entnommen. Fibrolytische Bakterien wie Ruminococcus flavefaciens und Fibrobacter spp. treten erst fünf Wochen postpartum auf, Streptococcus spp.

und Lactococcus spp. können dann nicht mehr nachgewiesen werden⁷³. Laut Dill- McFarland et al.⁶⁸ etablieren sich nach zwei bis vier Wochen methanbildende Bakte- rien. In dieser amerikanischen Studie wurden 15 Holstein Kälber eines Versuchsguts beprobt. Kotproben wurden in der zweiten, vierten und achten Lebenswoche, sowie nach ein und zwei Jahren entnommen.

Am 35. Lebenstag ist, wie beim adulten Tier, im Kot besonders Bacteroides spp., Ruminococcus spp., Clostridium spp. und Blautia spp. zu finden⁷⁴. In dieser amerikanischen Studie wurde von 81 Kälbern eines Betriebes Kotproben am 3., 14. und 35.

Lebenstag entnommen. Im Pansen und Kot adulter Tiere dominieren unter den Pil- zen cellulolytische und fibrolytische Gattungen der Neocallimastigaceae und unter den Archaea besonders Methanobrevibacter spp.. Bakteriell besteht diese Mikrobiota besonders aus Paraprevotellaceae, Bacteroidales, Bifidobacterium spp.,und Trepo- nema spp.⁶⁸.

Die Diversität nimmt in den ersten fünf Lebenswochen zu, besonders hoch ist sie vor und nach dem Absetzen^{6, 74}. Individuelle Unterschiede der Mikrobiota nehmen mit zunehmendem Alter ab^{6, 68}.

Innerhalb des Verdauungstraktes treten starke regionale Unterschiede auf¹⁰. Die Vielfalt der Bakterien ist im Pansen und Dickdarm größer als im Dünndarm. Im Dünndarm findet man bei nicht abgesetzten Kälbern überwiegend Firmicutes und im Dickdarm Bacteroides und Firmicutes⁷. Die Unterschiede zwischen Mukosa- assoziierter und Lumen-assoziierter Mikrobiota sind im Dickdarm gering, im Dünn- darm dagegen ausgeprägter¹⁰. Ab der dritten Lebenswoche hat sich eine klar abge- grenzte Mukosa-assoziierte Keimflora ausgebildet, die im Ileum besonders divers ist^{10, 70}.

2.3.1 Einflussfaktoren auf die intestinale Mikrobiota beim Kalb

Die intestinale Mikrobiota der Kälber wird nach der Geburt durch verschiedene Fak- toren beeinflusst, dabei spielen Kolostrummanagement und auftretende Krankheiten

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15 eine besonders große Rolle.

Die Gabe von Kolostrum trägt zu einer schnellen Besiedlung mit fakultativ anaeroben Bakterien wie Escherichia spp., Streptococcus spp. und Enterococcus spp. bei⁸. Eine verzögerte Fütterung von Kolostrum führt zu Unterschieden in der Mikrobiota im Ile- um. So traten bei Kälbern, die erst nach zwölf Stunden gefüttert wurden, Enterococ- cus spp. und Streptococcus spp. verstärkt auf. Bei einer Fütterung nach 6 h waren Brevibacterium spp. vermehrt vorhanden. Im Colon führte eine späte Fütterung zu einer verminderten Zahl Lactobacillus spp., dagegen waren Faecalibacterium sp. und Ruminococcus gnavus vermehrt vorhanden. Zudem wurde festgestellt, dass es in den ersten zwei Lebenstagen im Ileum eine negative Korrelation zwischen der Kon- zentration kurzkettiger Fettsäuren und Mukosa-assoziierter opportunistischer patho- gener Bakterien gibt und im Colon eine positive Korrelation mit Mukosa-assoziierten Kommensalen⁷⁵. Eine spätere Fütterung von Kolostrum führt zudem zu einer verminderten Aufnahme von IgG und dadurch zu einer vermehrten transepithelialen Migra- tion von Pathogenen⁷⁶.

Klein-Jobstl et al.⁹ dagegen stellten fest, dass sich die Mikrobiota des Kolostrums wesentlich von der frühen enterischen Mikrobiota unterscheidet, wobei hier die mittel- bzw. langfristigen Effekte und auch die Auswirkung auf Lumen-assoziierte Mikrobiota nicht untersucht wurden. Im Kolostrum dominierten hier Enhydrobacter sp. und im Gegensatz dazu Enterobacteriaceae im Kot der Kälber.

Es gibt deutliche Unterschiede in der Mikrobiota gesunder und an Diarrhoe erkrank- ter Kälber, z. B. erhöhte Proteobacteria und geringeres Auftreten von Actinobacteria bei Diarrhoe⁷⁰. An neonataler Diarrhoe erkrankte Kälber zeigen zudem einen verringerten Anteil von Bifidobacterium spp.. Bifidobacterium spp. konkurrieren mit patho- genen Bakterien um Bindungsstellen am Epithel und produzieren Butyrat, was wiederum trophische und immunmodulierende Effekte besitzt⁷⁰. Jang et al.⁷⁷ stellten bei an Rotavirus bedingter Diarrhoe erkrankten Kälbern eine reduzierte Vielfalt und Reichtum der intestinalen Mikrobiota fest. Lactobacillus spp., Subdoligranulum sp., Blautia spp. und Bacteroides spp. waren reduziert, Escherichia spp. und Clostridium spp. dagegen vermehrt vorhanden. Das Auftreten von F. prausnitzii korreliert negativ mit der Inzidenz neonataler Diarrhoe und positiv mit einer Gewichtszunahme^{14, 67}, die

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Literatur

16

probiotische Gabe von Bifidobacterium spp. und Lactobacillus spp. in der ersten Le- benswoche ruft ähnliche Effekte hervor¹⁰. Weiterhin führte das Auftreten von Diar- rhoe zu einer Abnahme der Diversität des Mikrobioms^{67, 78}.

Die Gabe von Antibiotika verändert die Zusammensetzung der intestinalen Mikrobio- ta von Kälbern. So nehmen nach Gabe von Oxytetracyclin besonders Lactobacillus spp., Clostridium spp. und Streptococcus spp. ab11, 67, 79, 80. Bei Bacitracin wurde eine Abnahme von Roseburia spp., Faecalibacterium sp. bzw. Eubacterium spp. und eine Zunahme von Escherichia spp., Enterococcus spp. bzw. Shigella spp. beobachtet⁷⁸.

2.3.2 Entwicklung des Immunsystem beim Kalb

Das erste lymphatische Organ, dass sich im fetalen Kalb entwickelt, ist der Thymus, der ab Tag 40 sichtbar ist. Es folgen Knochenmark und Milz ab Tag 55 und Lymph- knoten ab Tag 60 und Peyer‘sche Platten erst ab Tag 175 der Trächtigkeit. Lympho- zyten zirkulieren ab Tag 45 im Blut, B-Lymphozyten ab Tag 59 (IgM⁺) bzw. 135 (IgG⁺). Bereits ab Tag 75 - 80 können diese Lymphozyten auf Mitogene reagieren, durch hohe Cortisol-Spiegel um den Zeitpunkt der Geburt geht diese Fähigkeit in diesem Zeitraum jedoch wieder verloren^{81, 82}. Bereits fetal können Antikörper im ge- ringen Maß produziert werden und so kann beispielsweise auf Coronavirus- (ab Tag 73 der Trächtigkeit), Parvovirus- (ab Tag 93 der Trächtigkeit) und Parainfluenza 3- (ab Tag 120 der Trächtigkeit) Infektionen reagiert werden⁸¹. Als Reaktion auf eine intrauterine Infektion kann das Schleimhaut-assoziierte lymphatische Gewebe bereits IgA freisetzen, bei ausbleibender Infektion bilden sich IgG⁺ und IgA⁺ Zellen erst post partum¹⁰. Phagozyten nehmen während der Trächtigkeit in der Peripherie zu und können bereits ab Tag 60 auf Stimuli mit Interferon (INF) Produktion reagieren⁷¹. Im letzten Trächtigkeitsmonat sinkt die Zahl der T-Zellen im Blut von ca. 60% auf 30%, da diese in lymphatische Gewebe einwandern⁸³.

Kolostrum beinhaltet nicht nur Immunglobuline, sondern auch Leukozyten, Zytokine, antimikrobielle Proteine und Hormone. In den ersten 24 h post natum kommt es durch Aufnahme dieser Substanzen zu einem passiven Schutz, danach bilden sich tight junctions^{81, 84-88}. Durch das Kolostrum übertragene Leukozyten gelangen in den Blutkreislauf des Kalbes^89-91 und können antigenspezifisch in der Pathogenabwehr

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17

aushelfen. Zudem können sie in lymphatischem Gewebe überdauern und haben Ge- dächtniszellcharakteristika⁹². Sie sind überwiegend aus Makrophagen (40 - 50%), aber auch aus Lymphozyten (22 - 25%) und neutrophilen Granulozyten (25 - 37%) zusammengesetzt⁹³. Kälber, die mit frischem, zellreichen Kolostrum gefüttert wurden, zeigen höhere CD4⁺ T-Zell-Zahlen als Kälber, die mit zuvor gefrorenem Kolostrum gefüttert wurden¹⁶. Die Kolostrumaufnahme führt 12 - 36 h postpartum zu einer Ver- änderung der monozytären Subpopulationen und einem Abfall der aktiven und ru- henden natürlichen Killerzellen (NK-Zellen). Vermutlich führt die vermehrte Permea- bilität der Darmschranke zu einem Übergang kolostraler Zellen und Inhaltsstoffe wie Zytokine, Oligosaccharide oder Wachstumshormone in die Zirkulation des Kalbes und führt so entweder direkt zu Verschiebungen der Zellzusammensetzungen im peripheren Blut oder regt im Knochenmark die Ausbildung von Zellen an⁹⁴. Kolostrale Zytokine fördern weiterhin die Rekrutierung und Reifung neonataler Lymphozyten im Darm⁸⁶. Oligosaccharide sind ein weiterer Bestandteil des Kolostrum, die die Expres- sion von Zytokinen beeinflussen und so die Th1/ Th2 Balance ändern können⁹⁵. In der frühen postnatalen Phase stellt die intestinale Mikrobiota ein wichtiges Signal für den Erhalt der Produktion präimmuner B-Zellen dar¹⁰. In den ersten Lebenswo- chen waren Änderungen in der Expression verschiedenster microRNA mit der bakte- riellen Dichte und Genus (Lactobacillus spp. und Bifidobacterium spp.) im Dünndarm korreliert. Dies betrifft microRNA u. a. für die Differenzierung von T-Zellen, Enterozy- ten, dendritische Zellen und Leukozyten, aber auch die Lymphangiogenese und IL-6 und IL-17 Signalwege^{63, 96}. Durch probiotische Gabe von C. butyricum, L. plantarum und Enterococcus faecium konnten Qadis et al.⁹⁷ zeigen, dass die enterische Mikro- biota die Funktion peripherer Leukozyten im Blut direkt beeinflussen kann, da dies zu einer Erhöhung der Anzahl an TLR2⁺ Monozyten, CD3⁺, WC1⁺ γδ, CD4⁺ und CD8⁺ T-Zellen im Blut und einer Verstärkung der Expression von IL-6, INF-γ und TNF-α peripherer Leukozyten führte. Die Umstellung der Mikrobiota beim Absetzen führt zudem zu einer verminderten Expression von TLR in der Mukosa, CD3⁺, CD4⁺ und CD8⁺ T-Zellen im Jejunum und Ileum nehmen zu¹⁰.

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Literatur

18 2.4 Periphere Leukozyten

2.4.1 Polymorphkernige neutrophile Granulozyten (PMN)

Neutrophile Granulozyten sind Teil des angeborenen Immunsystems. Sie entwickeln sich aus hämatopoetischen Stammzellen und zirkulieren bis zu acht Stunden im Blut, bevor sie apoptotisch werden. Ihr Aufgabenbereich besteht im Wesentlichen in der Phagozytose von Pathogenen und deren Abtötung durch ROS-Bildung und antimikrobieller Peptide in den Granula⁸¹. Außerdem kommt es durch Ausschüttung von Granulaproteinen zu einer Rekrutierung von Monozyten⁹⁸. Bei adulten Rindern sind 20 - 30% der peripheren Leukozyten PMN⁸¹. Bei Kälbern dagegen gibt es wider- sprüchliche Angaben bezüglich des Anteils peripherer Leukozyten im Blut. Menge et al.⁹⁹ stellten eine Abnahme des prozentualen Anteils in den ersten Lebenswochen von 77% direkt nach der Geburt auf 32% mit drei bis neun Wochen fest. Bei Batista et al.¹⁰⁰ dagegen traten in den ersten 90 Tagen wesentlich geringe Schwankungen auf, beginnend mit einem Anteil PMN von 18% an den Gesamtleukozyten in der ersten Lebenswoche. Auch über die funktionelle Kapazität der PMN neonataler Kälber gibt es unterschiedliche Ergebnisse. So stellten Menge et al.⁹⁹ eine reduzierte Pha- gozytosekapazität, aber zugleich verstärkte Bildung reaktiver Sauerstoffspezies bei Kälbern direkt post natum im Vergleich zu drei bis neun Wochen alten Kälbern fest.

Bei Batista et al.¹⁰⁰ dagegen blieb der Anteil phagozytierender PMN und die ROS- Bildung in den ersten 90 Tagen unverändert.

2.4.2 Mononukleäre Zellen (MNC) 2.4.2.1 Monozyten

Ein weiterer Teil des angeborenen Immunsystems sind die Monozyten. Sie entstehen aus pluripotenten Stammzellen des Knochenmarks und differenzieren sich zu Gewebsmakrophagen und dendritischen Zellen aus. Ihre Aufgabe besteht in der Phagozytose von Pathogenen, Antigenpräsentation für T-Zellen und der Ausschüt- tung von Chemokinen und Zytokinen. Bei adulten Rindern stellen Monozyten 5% der Leukozytenpopulation dar⁸¹. Bei Kälbern beobachteten Batista et al.¹⁰⁰ in der ersten

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Lebenswochen einen Monozytenanteil von 3,2% der Gesamtleukozyten, der in den ersten 90 Tagen stabil blieb. Bei Hülsebusch⁹⁴ dagegen kam es in der ersten Le- benswoche annähernd zu einer Verdopplung des Monozytenanteils von 6,6% auf 12,3% und einem weiteren Anstieg innerhalb der darauffolgenden zwei Wochen. In Bezug auf die Funktionsfähigkeit der Monozyten stellten Batista et al.¹⁰⁰ in der ersten Lebenswoche die höchste Phagozytosekapazität fest, in den darauffolgenden Wo- chen kommt es zu einem Abfall der Phagozytosekapazität bei der -intensität. Menge et al.⁹⁹ konnten auch eine initial verstärkte Phagozytosekapa- zität und anschließend eine Abnahme nachweisen. Die Aufnahme von Kolostrum wirkte sich positiv auf die Phagozytosekapazität aus. Monozyten von Kälber, die mit Kolostrum versorgt wurden, zeigten eine Abnahme der ROS-Bildung in den ersten Stunden post natum, ohne Kolostrumaufnahme blieb die ROS-Bildung konstant.

Monozyten können in Bezug auf ihre Oberflächenmoleküle CD14 und CD16 in drei Subpopulationen aufgeteilt werden. Dabei bilden die klassischen Monozyten (cM) mit 89,0% den größten Anteil, 4,4% der Monozyten sind intermediäre Monozyten (intM) und 5,7% sind nicht-klassische Monozyten (ncM). In humanmedizinischen Studien wird vermutet, dass intermediäre Monozyten eine Übergangsform von klassischen zu nicht-klassischen Monozyten sind¹⁰¹. Bei Rindern konnte gezeigt werden, dass eine in-vitro-Stimulation von Monozyten mit INF-γ zu einer Zunahme der intM bei gleich- zeitiger Abnahme der cM führt, ncM blieben jedoch unverändert¹⁰².

Die CD14⁺/CD16^-klassischen Monozyten phagozytieren von den drei Subpopulatio- nen am besten Serum-opsonierte Bakterien. Sie exprimieren insbesondere Makro- phagen-1 Antigen und L-Selektin, die in Kombination mit dem Chemokin CCL5 die Einwanderung ins Gewebe ermöglichen und damit eine proinflammatorische Immun- antwort erzeugen. Intermediäre Monozyten sind CD14⁺/CD16⁺ und zeigen von allen drei Subpopulationen die stärkste Fähigkeit ROS zu generieren. IntM produzieren verstärkt proinflammatorische Zytokine wie TNFα und IL-1β. Sie exprimieren ver- stärkt das Endothel-Adhäsionsmolekül (Platelet endothelial cell adhesion molecule 1(PECAM 1)), welches zur Einwanderung ins Gewebe benötigt wird. Nicht-klassische Monozyten sind CD14^-/CD16^-, sie haben die geringste Phagozytosekapazität, zeigen die geringste ROS-Produktion und sind kaum in der Lage IL-1β zu produzieren. Sie

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Literatur

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exprimieren verstärkt das Integrin LFA1 und VLA-4, die vermutlich eine patrouillie- rende Funktion entlang des Endothels ermöglichen98, 102, 103.

2.4.2.2 Lymphozyten

Lymphozyten lassen sich in drei Subpopulationen unterteilen: NK-Zellen, T- und B- Zellen⁸¹. Bei adulten Rindern stellen sie 45 - 65% der Gesamtleukozyten dar¹⁰⁴. In den ersten 10 - 12 Lebenswochen erreichen die CD4⁺, CD8⁺ und γδ TCR⁺Lympho- zyten ein stabiles Niveau. In dieser Zeit kommt es zu einer Zunahme insbesondere der CD4⁺ und CD21⁺ Zellen und damit zu einer Verschiebung der Zell-Verhältnisse innerhalb der Lymphozyten und so zu einer Abnahme des relativen Anteils der γδ TCR⁺ Zellen bei gleichbleibender absoluter γδ TCR⁺Zell-Zahl¹⁰⁵.

2.4.2.2.1 CD4⁺ αβ-T-Zellen

Die CD4⁺ αβ-T-Zellen sind Th-Zellen. Sie besitzen Antigen-Rezeptoren mit gepaarten αβ Peptidketten. Sie sind CD4 positiv, d.h. sie weisen Rezeptoren für Major Histo- compatibility Complex (MHC) II Moleküle antigenpräsentierender Zellen auf. Sie werden in drei Populationen unterteilt, die durch unterschiedliche Stimulation von dendritischen Zellen, Makrophagen und B-Zellen entstehen. Th1-Zellen reagieren auf eine Stimulation durch IL-12 mit einer Sekretion von IL-2 und INT-γ. Sie unterstützen eine Zell-abhängige Immunantwort durch Aktivierung von NK-Zellen, B-Zellen, T-Zellen und Makrophagen. Th2 Zellen werden durch IL-1 stimuliert und produzieren IL-4, IL- 13 und IL-10. Sie stimulieren das B-Zell-Wachstum und deren Freisetzung von Anti- körpern¹⁰⁶. Th1- und Th2-Zellen hemmen sich gegenseitig⁸¹. Th17- Zellen reagieren auf Stimuli durch IL-6, Transforming Growth factor β und IL-23 und sezernieren IL- 17. Ihre Aufgabe liegt in der Aktivierung von PMN, es wird jedoch auch eine Beteili- gung an der Entstehung von Autoimmunerkrankungen vermutet^{81, 107}.

Bei adulten Rindern stellen CD4⁺ Zellen 8 - 31% der Gesamtlymphozytenpopulation dar⁸¹. Bei Kälbern stellten Kampen et al.¹⁰⁵ zunächst einen leichten Anstieg von ca.

20% auf 25% der Gesamtlymphozyten im Alter von sechs bis acht Wochen und einen Abfall im Alter von 14 - 16 Wochen auf 20% fest. Die absoluten Zellzahlen stie-

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gen von 9,3 x 10⁵ Zellen/ ml nach der Geburt auf 1,8 x 10⁶ Zellen/ ml im Alter von zehn bis zwölf Wochen und nahmen bis zur 27 - 29. Lebenswoche wieder ab auf 1,2 x 10⁶Zellen/ ml.

2.4.2.2.2 CD8⁺ αβ-T-Zellen

CD8⁺ αβ-T-Zellen sind zytotoxische T-Zellen. Sie sind CD8 positiv, d.h. sie weisen Rezeptoren für MHC I Moleküle antigenpräsentierender Zellen auf. Zytotoxische T- Zellen können ihre Zielzellen über zwei Wege abtöten. Zum einem werden Perforine und Granzyme aus Lysosomen ausgeschüttet, die eine Apoptose induzieren. Dies geschieht insbesondere bei virusinfizierten Zellen. Zum anderen kann über Bindung an den CD95 Rezeptor eine Signalkaskade ausgelöst werde, die zur Apoptose führt.

Dies geschieht zur Beseitigung überschüssiger T-Zellen. Durch die Bildung von IFNγ werden Makrophagen und PMN aktiviert⁸¹.

Bei adulten Tieren sind 10 - 30% der Lymphozyten CD8⁺⁸¹. Kälber in ihren ersten sieben Lebensmonaten wiesen einen CD8⁺ Anteil von 10% der Lymphozyten auf bzw. 5,2 - 8,3 x 10⁵ Zellen/ ml^{94, 105}.

2.5 Vaginal seeding

Besonders in Brasilien, im Iran und der Dominikanischen Republik ist es in den letzten 20 Jahren zu einem deutlichen Anstieg der elektiven Kaiserschnitte gekommen.

Dominguez-Bello et al.¹ konnten in einer Studie zeigen, dass Kinder nach Sectio caesarea eine wesentlich veränderte Mikrobiota aufweisen im Vergleich zu natürlich geborenen Kindern. Diese Kinder zeigen zudem langfristig Veränderungen im Im- munsystem, wie beispielsweise eine vermehrte Bildung von IgA, IgM und IgG sezer- nierende Plasmazellen¹⁰⁸. Bei Mäusen konnte nachgewiesen werde, dass nach einem Kaiserschnitt langfristig die Zahl der Foxp3⁺ Treg-Zellen und CD103⁺ dendritische Zellen gesenkt und die Expression von Il10 in mesenterischen Lymphknoten und der Milz verringert waren³.

Darüber hinaus wird diskutiert, ob eine Sectio caesarea zu einem leicht erhöhten Ri- siko für neuropsychatrische Erkrankungen, wie z.B. bipolare affektive Störung, Au-

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Literatur

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tismus-Spektrum-Störung, Zwangsstörungen und Aufmerksamkeitsdefizit- Hyperaktivitätsstörung, führt⁵. Bei Mäusen konnte dagegen bereits gezeigt werden, dass es nach einer Geburt per Kaiserschnitt zu langfristigen Veränderungen im do- paminergen System, verstärktem Angstverhalten, Stereotypien und Defizite im Sozi- alverhalten kommt⁴³.

In einer Studie von Dominguez-Bello et al.¹ wurden per Sectio caesarea entwickelte Babys der Vaginalflüssigkeit der Mutter ausgesetzt („Vaginal seeding“). Bei diesen ausschließlich elektiven Kaiserschnitten wurde vor Beginn der Operation ein Stück sterile Gaze eine Stunde in der Vagina der Mutter inkubiert und innerhalb der ersten zwei Minuten nach dem Kaiserschnitt zunächst über Mund, Gesicht und dann den restlichen Körper des Babys gestrichen. Innerhalb des ersten Lebensmonats wurden sechsmal Proben von analen, oralen und Hautregionen genommen und die Zusam- mensetzung des Mikrobioms mittels Gensequenzierung der V4 Region von 16S rRNA bestimmt. Dies wurde bei vier Kindern durchgeführt. Besonders in der ersten Lebenswoche glich das Mikrobiom dieser Kinder dem der vaginal geborenen Babys.

Am ersten Lebenstag ähnelte das Mikrobiom der Kinder nach „Vaginal seeding“ dem maternalen vaginalen Mikrobiom, das sich entweder langsam (Analbereich) oder schnell (oral und Haut) zu einer für die Körperregion typischen Flora wandelte. Trotz- dem blieb der Einfluss der Vaginalflora sichtbar. In anal gewonnenen Proben von Babys mit „Vaginal seeding“ kommt es, wie bei vaginal entwickelten Kindern, zu einem frühen Vorkommen von Lactobacillus spp. und ab der zweiten Lebenswoche von Bacteroides spp.. Kindern aus Kaiserschnitten ohne „Vaginal seeding“ fehlen Bakterien, die typisch für die vaginale Flora sind. Das sind in oralen und Hautproben insbesondere Lactobacillus spp. und in analen und Hautproben Bacteroidales. Die Studie konnte demnach nach einer Sectio caesarea bei den Babys ein Mikrobiom fördern, das dem vaginal geborener Kinder ähnelt. Unterschiede im Mikrobiom werden vor allem auf mangelhaften Transfer der vaginalen Bakterien mittels Gaze, aber auch auf antibiotische Therapie im Anschluss an den Kaiserschnitt zurückgeführt.

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23 3 Material und Methoden

3.1 Tiere

Die Studie wurde an 14 Holstein-Friesian Kälber an der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover durchgeführt. Die Kälber wurden im Rahmen studentischer Übungen per Sectio caesarea entwickelt und verblieben bis zu einem Alter von vier Wochen in der Klinik.

3.2 Haltung und Fütterung

Die Kälber wurden zunächst in Iglus mit Stroheinstreu mit bis zu vier Kälbern in einem ca. 10 m x 6 m großen Raum gehalten. Nach Erhalt eines negativen Ergebnis- ses der Untersuchung auf das Bovine Virusdiarrhoe Virus (zwei bis drei Tage) wurden sie umgestallt und in Iglus mit Stroheinstreu im Freien unter einer Überdachung gehalten. Innerhalb der ersten sechs Stunden wurden sie mit 4 l Kolostrum mittels Heusmann Soft-Drencher gedrencht. War das Kolostrum der Mutter qualitativ (Dich- temessung mittels Kolostrumspindel und Brix-Refraktometer, Grenzwert 22% Brix¹⁰⁹ oder quantitativ nicht ausreichend, wurde pasteurisiertes, tiefgefrorenes Kolostrum von einer Kuh des Lehr- und Forschungsguts Ruthe im ColostroMAT^® bei 42 °C in ca. 45 min aufgetaut. Das fremde Kolostrum wurde nach dem Abmelken mittels Brix- Refraktometer getestet (Grenzwert 22% Brix¹⁰⁹) und anschließend in einem Colos- troBAG^® mit dem ColostroMAT^®(beides Förster-Technik GmbH, Engen, Deutsch- land) bei 60°C für 60 min pasteurisiert, abgekühlt und eingefroren. Danach erfolgte die Fütterung mit Milchaustauscher (Sprayfo Royal^®, Trouw Nutrition Deutschland GmbH, Diepholz, Deutschland). Alle Kälber hatten freien Zugang zu Wasser, Heu und Kälberkorn.

3.3 Einteilung der Versuchsgruppen

Die Kälber wurden randomisiert nach Geschlecht in zwei Gruppen aufgeteilt. Grup- pe 1 blieb nach der Sectio caesarea unbehandelt (Gruppe nonVS, n=7), während bei

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Material und Methoden

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Gruppe 2 nach der Geburt ein „Vaginal seeding“ durchgeführt wurde (Gruppe VS, n=7).

3.4 Versuchsaufbau und Versuchsablauf

Die Mutterkühe wurden ca. vier Wochen vor dem geplanten Abkalbetermin in der Klinik aufgestallt. Es wurde eine regelmäßige Geburtsüberwachung durchgeführt.

Sobald die Öffnungsphase der Geburt einsetzte bzw. der Progesteronwert im Blut unter 1 ng/ ml fiel, wurde eine Sectio caesarea durchgeführt. Hierbei wurde zur Aus- schaltung der Bauchpresse eine Epiduralanästhesie mit 60 mg Procainhydrochlorid (Procasel^®; Selectavet Dr. Otto Fischer GmbH, Weyarn-Holzolling, Deutschland) verabreicht. Vor der Entwicklung des Kalbes wurde eine Kotprobe und ein Vaginaltupfer von der Mutter entnommen. Danach wurde für das „Vaginal seeding“ ein befeuchte- tes, steriles Tuch vaginal eingeführt und dort für ca. eine Stunde belassen. Nach der Entwicklung des Kalbes wurde Schleim aus Maul und Nase entfernt, der Kreislauf mit einem Kaltwasserguß angeregt und der Nabel jodiert. Dann wurden vom Kalb Kehl- kopftupfer- und Mekoniumsproben entnommen. Anschließend wurde bei Kälbern der Gruppe 2 mit dem Tuch aus der Vagina der Kuh das „Vaginal seeding“ durchgeführt.

Die Beurteilung der Vitalität des Kalbes erfolgte mittels modifizierten APGAR Score¹¹⁰ und das Körpergewicht des Kalbes wurde erfasst. Eine arterielle Blutprobe zur Blutgasanalyse und venöse Blutproben wurden entnommen. Das Kalb wurde innerhalb der ersten zwei Stunden mit einem Heusmann Soft-Drencher mit 4 l Kolost- rum gedrencht. War das Kolostrum der Mutter qualitativ (Dichtemessung mittels Ko- lostrumspindel und Brix-Refraktometer, Grenzwert 22% Brix¹⁰⁹ oder quantitativ nicht ausreichend, wurde pasteurisiertes, tiefgefrorenes Kolostrum von einer Kuh des Lehr- und Forschungsgut Ruthe verabreicht. Eine Probe des Kolostrums der Mutter und ggf. des gedrenchten Fremd-Kolostrums wurde asserviert. Nach dem Drenchen wurden alle Kälber in den ersten zwölf Stunden mit dem Kolostrum der Mutter gefüt- tert, anschließend mit Milchaustauscher.

Am ersten Lebenstag wurden dem Kalb 1000 mg Eisen-Dextran (belfer^®, Bela-Pharm GmbH & Co. KG, Vechta, Deutschland), ein Kombinationspräparat aus 150 mg Reti-

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nolpalmitat, 0,625 mg Colecalciferol, 150 mg alpha-Tocopherolacetat und 500 mg Ascorbinsäure (Ursovit AD3EC^®, Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Deutschland) und ein Kombinationspräparat aus 750 mg alpha-Tocopherolacetat und 5,5 mg Nat- riumselenit (Vitamin-E-Selen^®, aniMedica GmbH a LIVISTO company, Senden- Bösensell, Deutschland) subkutan verabreicht. Im weiteren Verlauf (Abb. 2) wurden an Tag eins, drei und danach wöchentlich Kotproben, Kehlkopfabstriche und arterielle Blutgasproben entnommen. Venöse Blutproben wurden an Tag eins, drei und an- schließend zweimal wöchentlich gewonnen. Einmalig wurde an Tag 14 460 Interfe- ron-Einheiten inaktiviertes Parapoxvirus ovis, Stamm D 1701 (Zylexis^®; Zoetis Deutschland GmbH, Berlin, Deutschland) intramuskulär verabreicht. Die Kälber wurden täglich einer allgemeinen Untersuchung unterzogen.

3.5 „Vaginal seeding“

Nach der Entnahme des Vaginaltupfers wurde ein steriles, aufgerolltes Handtuch (40 x 70 cm) mit ca. 50 ml 0,9% Natriumchlorid-Lösung (B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland) befeuchtet. Die Labien wurden durch eine Hilfsperson ge- spreizt, das Tuch manuell eingeführt, in der Vagina etwas ausgebreitet und dort für ca. eine Stunde belassen. Nach Entwicklung des Kalbes und der entsprechenden Probenahme wurde, nach erneuter Reinigung der Vulva, das Tuch aus der Vagina heraus genommen. Mit dem Tuch wurde dem Kalb für eine Minute über den Kopf gestrichen, hierbei wurde mit dem Tuch auch in die Nasen- und Maulöffnung einge- gangen. Anschließend wurde mit dem Tuch der restliche Körper insbesondere der äußere Nabel abgerieben.

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Material und Methoden

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Abb. 2 Schematische Darstellung des zeitlichen Ablaufs der Probennahme