3'-S-Phosphorthiolatverbrückte Oligonucleotide
und
Fluoreszierende Nucleotid-Prodrugs für
Zellaufnahmestudien
Dissertation
zur Erlangung des naturwissenschaftlichen Doktorgrades
von
Inga Susanne Reimer
vorgelegt dem Fachbereich Chemie der Universität Hamburg
Die Druckfreigabe für diese Arbeit wurde am 03.04.2017 durch das Studienbüro des Fachbereichs Chemie der Universität Hamburg erteilt.
Die vorliegende Arbeit wurde am Institut für Organische Chemie der Universität Hamburg im Arbeitskreis von Prof. Dr. Chris Meier in der Zeit von Oktober 2012 bis Januar 2017 angefertigt.
1. Gutachter: Prof. Dr. Chris Meier
2. Gutachter: Prof. Dr. Dr. h.c. mult. Wittko Francke
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungen und Symbole ... I
Zusammenfassung ... IV
Abstract... VII
Teil I: 3'-S-Phosphorthiolatverbrückte Oligonucleotide
1 Einleitung ... 1
2 Kenntnisstand ... 3
2.1 Horizontaler Gentransfer bei Prokaryoten ... 3
2.2 Plasmid pMV158 ... 5
2.3 Relaxase MobM ... 7
2.4 3‘-S-Phosphorthiolatverbrückte Oligonucleotide ... 8
2.5 Synthese der Phosphorthioamidite ... 12
3 Aufgabenstellung ... 16
4 Resultate und Diskussion ... 17
4.1 Inversion der 3‘-Hydroxylgruppe des Guanosins 30 bzw. 2‘-Desoxy- guanosins 19 ... 17
4.2 Einbringen des Schwefels ... 26
4.3 Synthese des 2‘-Desoxyguanosin-3‘-phosphorthioamidits ... 27
4.4 Fazit der verwendeten Syntheserouten ... 30
4.5 Synthese des 3‘-S-phosphorthiolatverbrückten Oligonucleotids ... 31
4.6 Einsatz eines 3‘-S-phosphorthiolatverbrückten Dinucleotids ... 39
4.6.1 Synthese des 3‘-O-tert-Butyldimethylsilylthymidins 53 ... 39
4.6.2 Testsynthese eines 3‘-TBDMS-geschützten Dinucleotids mit einem O-Phosphoramidit ... 40
4.6.3 Abspaltung der TBDMS-Gruppe an der 3‘-Position des O-verbrückten Dinucleotids 59 ... 42
4.6.4 Die 4-Monomethoxytritylsulfenyl-Schutzgruppe ... 42
4.6.5 Synthese des 3’-O-(4-Methoxytritylsulfenyl)thymidins 61 ... 44
4.6.6 Synthese des 3‘-S-phosphorthiolatverbrückten Dinucleotids 51 ... 46
Teil II: Fluoreszierende Nucleotid-Prodrugs für Zellaufnahmestudien
5 Einleitung ... 516.1 Wirkstoffe zur Behandlung von HIV-Infektionen ... 54
6.2 Combined antiretroviral therapy (cART) ... 56
6.3 Phosphorylierung zum antiviral aktiven Nucleosidtriphosphat ... 57
6.4 Nucleosidmonophosphat-Prodrugs ... 58
6.4.1 cycloSal-Prodrugs ... 60
6.5 Nucleosiddi- und -triphosphat-Prodrugs ... 63
6.5.1 DiPPro- und TriPPPro-Verbindungen ... 65
6.6 Evaluierung der Zellaufnahme von Prodrugs ... 68
6.6.1 Bicyclische Nucleosidanaloga (BCNAs) ... 70
7 Aufgabenstellung ... 74
8 Resultate und Diskussion ... 77
8.1 Eignung der BCNAs als Fluoreszenzsonden für Prodrugsysteme ... 77
8.2 Synthese der Bicyclischen Nucleosidanaloga ... 79
8.3 Synthese des 3-Me-cycloSal-ddBCNA-Prodrugs 89 ... 83
8.4 Synthese der fluoreszierenden Nucleosiddiphosphat-Prodrugs ... 85
8.4.1 Synthese des 6-Prop-ddBCNA-Monophosphats 128 ... 86
8.4.2 Synthese des symmetrisch maskierten DiPPro-6-Prop-ddBCNADPs 94 ... 91
8.4.3 Synthese des nicht-symmetrisch maskierten DiPPro-6-Prop-ddBCNADP 102 ... 94
8.4.4 Synthese des monomaskierten DiPPro-6-Prop-ddBCNADPs 103 ... 98
8.5 Synthese der fluoreszierenden Nucleosidtriphosphat-Prodrugs ... 102
8.5.1 Synthese des nicht-symmetrisch maskierten TriPPPro-6-Prop-ddBCNATPs 104 ... 103
8.5.2 Synthese des monomaskierten TriPPPro-6-Prop-ddBCNATPs 105 ... 107
8.6 Cf1743-Prodrugs ... 111
8.6.1 Synthese der Cf1743-Prodrugs ... 111
8.6.2 Antivirale Aktivität der Cf1743-Prodrugs ... 114
8.7 Hydrolyseverhalten der fluoreszierenden Prodrugs ... 115
8.7.1 Hydrolyse des symmetrisch maskierten C9-DiPPro-6-Prop-ddBCNADPs 94 ... 116
8.7.2 Hydrolyse des nicht-symmetrisch maskierten C4/C14-DiPPro-6-Prop-ddBCNADPs 102 ... 118
8.7.3 Hydrolyse des C17-monomaskierten DiPPro-6-Prop-ddBCNADPs 103 ... 121
8.7.4 Hydrolyse des nicht-symmetrisch maskierten C4/C14-TriPPPro-6-Prop-ddBCNATPs 104 ... 123
8.7.5 Hydrolyse des C17-monomaskierten TriPPPro-6-Prop-ddBCNATPs 105 ... 125
8.8 Zellaufnahmestudien mit fluoreszierenden Prodrugs ... 128
8.8.1 Zellaufnahmestudien mit dem 3-Me-cycloSal-6-H-ddBCNAMP 89 ... 129
8.8.2 Zellaufnahmestudien mit dem C9-DiPPro-6-Prop-ddBCNADP 94 ... 133
8.8.3 Zellaufnahmestudien mit dem C4/C14-DiPPro-6-Prop-ddBCNADP 102 ... 134
8.8.4 Zellaufnahmestudien mit dem C17-monomaskierten DiPPro-6-Prop-ddBCNADP 103 ... 135
8.8.5 Zellaufnahmestudien mit dem C4/C14-TriPPPro-6-Prop-ddBCNATP 104 ... 136
8.8.6 Zellaufnahmestudien mit dem C17-monomaskierten TriPPPro-6-Prop-ddBCNATP 105 ... 138
8.8.7 Fazit der Zellaufnahmestudien mit den fluoreszierenden Prodrugs ... 139
9 Experimenteller Teil ... 141
9.1 Allgemeines ... 141
9.1.1 Edukte und Reagenzien ... 141
9.1.2 Lösungsmittel ... 141
9.1.3 Chromatographie ... 142
9.1.4 Spektroskopie und Spektrometrie ... 146
9.1.5 Weitere Geräte ... 147
9.2 Synthesen ... 149
9.2.1 Allgemeine Arbeitsvorschriften (AAV) ... 149
9.2.2 Synthese von 2‘-Desoxyguanosinphosphorthioamiditen ... 152
9.2.3 Synthese des Thymidin-Bausteins ... 170
9.2.4 Synthese eines Dinucleotidphosphorthioamidits ... 177
9.2.5 Synthesizer ... 180
9.2.6 Synthese des 3‘-S-phosphorthiolatverbrückten Oligonucleotids 27 ... 181
9.2.7 Synthese von bicyclischen Nucleosidanaloga (BCNA) ... 183
9.2.8 Synthese von BCNAMP und BCNADP ... 193
9.2.9 Synthese von Nucleosiddi- und Triphosphatprodrugs ... 202
9.3 Hydrolysestudien in CEM/0-Zellextrakt ... 221 9.4 Zellaufnahmestudien ... 222 10 Literaturverzeichnis ... 224 Anhang ... 237 Gefahrstoffverzeichnis ... 237 Synthesizer Methoden ... 245 Verbindungsübersicht ... 248 Danksagung ... 252 Eidesstattliche Versicherung ... 253
I
Abkürzungen und Symbole
3TC Lamivudin
ABC Abacavir
Ac Acetyl
ACV Aciclovir
AIDS aquired immunodeficiency syndrome
AZT Zidovudin
BCNA Bicyclisches Nucleosidanalogon BisAB Bis(4-acyloxybenzyl) BisPOC Bisisopropyloxycarbonyloxymethyl BisPOM Bispivaloyloxymethyl BTT 5-Benzylthio-1H-tetrazol Bu Butyl Bz Benzoyl CAN Ammoniumcer(IV)-nitrat
cART combined antiretroviral therapy
CatA Cathepsin A
CEM/0 humane T-Lymphozyten-Zellinie (Wildtyp) CES1 Carboxyesterase 1
CPG controlled pore glas cycloSal cycloSaligenyl d4T Stavudin d4U 2‘,3‘-Didesoxy-2‘,3‘-didehydrouridin DBU 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en DCA Dichloressigsäure DCI 4,5-Dicyanoimidazol ddC Zalcitabin ddI Didanosin ddNTP 2‘,3‘-Didesoxynucleosidtriphosphat ddU 2‘,3‘-Didesoxyuridin DEAD Diethylazodicarboxylat DIAD Diisopropylazodicarboxylat DIPEA N,N-Diisopropylethylamin DMF N,N-Dimethylformamid DMF-DEA N,N-Dimethylformamiddiethylacetal DMSO Dimethylsulfoxid
II DMTr 4,4‘-Dimethoxytrityl
DNA deoxyribonucleic acid
DNA pol DNA-Polymerase
dNTP 2‘-Desoxynucleosidtriphosphat DPP Diphenylphosphonat ER endoplasmatisches Retikulum ESI Elektrospray-Ionisation Et Ethyl ETT 5-Ethylthio-1H-tetrazol FCS fötales Kälberserum
FDA U. S. Food and Drug Administration
Fm Fluorenylmethyl FTC Emtricitabin HBV Hepatitis-B-Virus HCV Hepatitis-C-Virus HDP Hexadecyloxypropyl HGT horizontaler Gentransfer HIV human immunodeficiency virus
HIV-1 HIV Typ 1
HIV-2 HIV Typ 2
HPLC high performance liquid chromatography
HTLV human T-cell leukemia virus iBu Isobutyryl
IEX ion exchange
IR inverted repeats isc intersystem crossing
LAV-II lymphadenophathy-AIDS-virus type II
LPC Lysophosphatidylcholin MDR multidrug resistance Me Methyl MK-0518 Raltegravir MMTr 4-Monomethoxytrityl MMTrS 4-Monomethoxytritylsulfenyl Ms Methansulfonyl NCS N-Chlorsuccinimid (N)DP (Nucleosid-)Diphosphat NDPK Nucleosiddiphosphatkinase
III (N)MP (Nucleosid-)Monophosphat
NNRTI Nicht-Nucleosidischer Reverse Transkriptase-Inhibitor NRTI Nucleosidischer Reverse Transkriptase-Inhibitor (N)TP (Nucleosid-)Triphosphat
Nucl Nucleosid
oriT origin of transfer
PBP Penicillin-Bindungsproteine
Pr Propyl
QRDR quinolone resistance determining region
RNA ribonucleic acid
RP reversed phase
RPMI Roswell Park Memorial Institute
RT Reverse Transkriptase
SG Schutzgruppe
SIV simian immunodeficiency virus
SQV Saquinavir
STR single-tablet regimen
T-20 Enfuvirtid
T4CP type IV coupling protein
T4SS type IV secretion system
TAF Tenofoviralafenamid TBAF Tetrabutylammoniumfluorid TBDMS tert-Butyldimethylsilyl TCA Trichloressigsäure TDF Tenofovirdisoproxilfumarat TFAA Trifluoressigsäureanhydrid TFV Tenofovir THF Tetrahydrofuran TK(-) Thymidinkinase(-defizient) TMS Trimethylsilyl Ts Tosyl
T-Strang transferred strand
UV Ultraviolett
IV
Zusammenfassung
Teil I: 3'-S-Phosphorthiolatverbrückte Oligonucleotide
Eine wichtige Rolle bei der Verbreitung von Resistenzen bei Bakterien spielt die Konjugation, bei der mobile genetische Elemente, wie Plasmide, übertragen werden. Das Schlüsselenzym bei diesem Prozess ist die Relaxase. Diese DNA-Strangtransferasen können Plasmid-DNA strang- und sequenzspezifisch schneiden. Die Relaxase MobM des Streptokokkenplasmids pMV158 ist der Prototyp der MOBV-Familie. Zur Aufklärung des Mechanismus der
Bindungsspaltung durch die Relaxase MobM sollten phosphorthiolatverbrückte Oligo-nucleotide eingesetzt werden. Durch das, bei der Reaktion gebildete, stabile DNA-Protein-Addukt sollten biochemische und kristallographische Untersuchungen möglich werden. Das erste Ziel dieser Arbeit war die Darstellung des für die Untersuchung der Relaxase MobM benötigten 3‘-S-phosphorthiolatverbrückten Oligonucleotids. Die 3‘-S-Phosphorthiolat-Verbrückung sollte hierbei zwischen einer 2‘-Desoxyguanosineinheit und einer Thymidineinheit liegen, da dies das Spaltungsmotiv (oriT) der Relaxase MobM beinhaltet. Phosphorthiolatverbrückte Oligonucleotide können mittels automatisierter Festphasen-synthese mit Phosphorthioamiditen als Monomerbausteine synthetisiert werden. Es sollte somit zunächst das N2 -Dimethylformamidin-5’-O-(4,4’-dimethoxytrityl)-2‘-desoxy-3’-thio-guanosin-3’-S-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidit dargestellt werden.
Zur Darstellung des gewünschten 2‘-Desoxyguanosin-3‘-phosphorthioamidits wurde eine 6-stufige Syntheseroute entwickelt, worüber das Thioamidit in einer Gesamtausbeute von 23%, ausgehend von 2‘-Desoxyguanosin, erhalten wurde (Abschnitt 4.1 - 4.4). Der Schlüsselschritt der Route war die Inversion der 3‘-Hydroxylgruppe mit gleichzeitiger Mesylierung über eine Mitsunobu-Reaktion mit Methansulfonsäure. Das Einbringen des Schwefels an der 3‘-Position erfolgte durch eine SN2-Reaktion mit Natriumthiobenzoat. Nach
Hydrolyse der Benzoylgruppe und BTT-vermittelter Phosphorylierung wurde das gewünschte 2‘-Desoxyguanosin-3‘-phosphorthioamidit erhalten. Die Gesamtausbeute liegt damit im Bereich der, von PIPERAKIS publizierten, 8-stufigen Route für 2‘-Desoxyguanosin-3‘-phosphorthioamidite (21% Gesamtausbeute ausgehend von 2‘-Desoxyguanosin)[1]. Die
Hauptunterschiede der Routen liegen bei der Schutzgruppenstrategie, der Inversion der 3‘-Hydroxylgruppe und dem Einbringen des Schwefels.
Mit diesem modifizierten Baustein konnte das, für die mechanistischen Untersuchungen benötigte, 3‘-S-phosphorthiolatverbrückte Oligonucleotid erfolgreich über die automatisierte Festphasensynthese mit Phosphoramiditen als Monomerbausteine dargestellt werden (Ab-schnitt 4.5). Essentiell ist hierbei eine Fällung des Phosphorthioamidits aus n-Hexan vor dem Einsatz in der Oligonucleotidsynthese. Nach Optimierung der Synthesebedingungen und der Reinigung lag die Ausbeute des Oligonucleotids bei 7%. Die Synthesen wurden mehrfach
V
wiederholt, so dass insgesamt 330 nmol des gewünschten 3‘-S-phosphorthiolatverbrückten Oligonucleotids in hoher Reinheit erhalten wurden. Damit konnte ausreichend Material für die Untersuchung der Relaxase MobM dargestellt werden. Zum Zeitpunkt des Abschluss dieser Arbeit lagen allerdings noch keine Ergebnisse zu diesen Untersuchungen vor.
Aufgrund der relativ niedrigen Ausbeute der Oligonucleotidsynthese wurde untersucht, ob diese durch Verwendung eines 3‘-S-phosphorthiolatverbrückten Dinucleotids gesteigert werden kann (Abschnitt 4.6). Durch die Vorverlagerung des ineffizienten Schritts sollte der hohe zeitliche Reinigungsaufwand des Oligonucleotids verringert werden. Hierfür wurde das
N2
-Dimethylformamidin-5’-O-(4,4’-dimethoxytrityl)-2‘-desoxy-3’-thioguanosin-3’-S-[(2-cyano-ethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidit mit einem 3‘-geschützten Thymidin umgesetzt. Als Schutzgruppen wurden die TBDMS- und die oxidativ spaltbare MMTrS-Gruppe erprobt. Aufgrund des geringen Umsatzes bei der Kupplung und der Labilität des gebildeten 3‘-S-phosphorthiolatverbrückten Dinucleotids konnte jedoch in beiden Fällen das für die Oligo-nucleotidsynthese benötigte Dinucleotid-3‘-phosphoramidit nicht erhalten werden. Somit war es über diesen Weg nicht möglich, die Ausbeute der Oligonucleotidsynthese zu steigern.
Teil II: Fluoreszierende Nucleotid-Prodrugs für Zellaufnahmestudien
Neben Protease-Inhibitoren bilden Nucleosidische Reverse Transkriptase-Inhibitoren (NRTIs) heutzutage die Grundlage der Behandlung von HIV-Infektionen. In ihrer Darreichungsform sind die NRTIs inaktiv und müssen zunächst durch zelluläre Enzyme zum Triphosphat metabolisiert werden. Die Phosphorylierung der Nucleosidanaloga ist jedoch aufgrund der Substratspezifität der zellulären Kinasen häufig ineffizient. Aus diesem Grund wurden verschiedene Nucleotid-Prodrugkonzepte entwickelt, um die antivirale Aktivität im Vergleich zu den entsprechenden Nucleosiden zu steigern. Das DiPPro- und das TriPPPro-Konzept sind die ersten Ansätze, mit denen eine erfolgreiche intrazelluläre Freisetzung des Nucleosiddi- bzw. -triphosphats realisiert werden konnte.
Das zweite Ziel dieser Arbeit war eine Validierung dieser Prodrugkonzepte in Bezug auf deren Zellaufnahme und Metabolisierung durch Verwendung von fluoreszierenden Prodrug-analoga. Zudem sollte als Monophosphat-Prodrug eine cycloSal-Verbindung untersucht werden. Als fluoreszierende Sonden wurden Bicyclische Nucleosidanaloga (BCNAs) eingesetzt, die sich bereits mehrfach in Zelltests bewährt haben. Eine weitere für die Zellaufnahmestudien hilfreiche Eigenschaft der BCNAs ist, dass sie keine Substrate für zelluläre Kinasen sind. Wenn bei den Untersuchungen phosphorylierte BCNA-Verbindungen detektiert werden, kann somit auf eine erfolgreiche Zellaufnahme und die gewünschte intrazelluläre enzymatische Hydrolyse geschlossen werden.
Für diese Zellaufnahmestudien wurden drei DiPPro-BCNADP-Verbindungen (eine symmetrisch maskierte, eine nicht-symmetrisch maskierte und eine monomaskierte) und
VI
zwei TriPPPro-BCNATP-Verbindungen (eine nicht-symmetrisch maskierte und eine monomaskierte) dargestellt (Abschnitt 8.4 und 8.5). Hierbei konnten für die problematischen Synthesen des BCNA-Monophosphats und -Diphosphats Synthesewege entwickelt werden, worüber sich diese Verbindungen in sehr guten Ausbeuten von 67% und 83% synthetisieren ließen (Abschnitt 8.4.1 und 8.5.2). Weiterhin wurden die monomaskierten Prodrugs über eine neue Route zugänglich gemacht, über die erstmals eine monomaskierte DiPPro-Verbindung in einer guter Ausbeute von 40% erhalten werden konnte (Abschnitt 8.4.4).
Ein weiteres Ziel war die Synthese einer DiPPro- und einer TriPPPro-Verbindung des anti-VZV-aktiven Nucleosids Cf1743 zur Untersuchung des Wirkmechanismus. Cf1743 ist der bis heute potenteste bekannte VZV-Wirkstoff. Die beiden Prodrugs konnten erfolgreich dargestellt werden. Allerdings konnten durch die Bildung des Nucleosids durch Dephosphorylierung der Metabolite der Prodrugs während der antiviralen Tests keine Rückschlüsse auf den Wirkmechanismus der BCNAs gezogen werden (Abschnitt 8.6). Mit den für die Zellaufnahmestudien synthetisierten fluoreszierenden BCNA-Prodrugs wurden zunächst Hydrolysestudien in CEM-Zellextrakt durchgeführt, um deren Metabolisierungseigenschaften zu überprüfen (Abschnitt 8.7). Es wurde in allen Fällen die gewünschte Freisetzung des Nucleosiddi- bzw. -triphosphats beobachtet. Hervorzuheben sind hierbei die monomaskierten Prodrugs, bei deren Hydrolyse selektiv das Di- bzw. Triphosphat gebildet wurde. Damit konnte die Annahme bestätigt werden, dass durch die zusätzliche negative Ladung an der endständigen Phosphateinheit ein Bruch der Phosphoranhydridbindung verhindert werden kann.
Die Zellaufnahmestudien mit den cycloSal-, DiPPro- und TriPPPro-Verbindungen wurden mit CEM-Zellen durchgeführt. Nach der Inkubation wurden die Zellen lysiert und das Zelllysat mittels HPLC mit Fluoreszenzdetektion untersucht. Es konnte bei allen untersuchten
cycloSal-, DiPPro- und TriPPPro-Verbindungen die Zellaufnahme des Prodrugs bestätigt und
intrazellulär das gewünschte Mono-, Di- bzw. Triphosphat nachgewiesen werden (Abschnitt 8.8). Bei allen drei DiPPro-Verbindungen wurde intrazellulär ein sehr gutes Diphosphat- zu Monophosphat-Verhältnis beobachtet. Analog zu den Ergebnissen der Hydrolyse in Zellextrakt ist das monomaskierte Diphosphat-Prodrug hierbei hervorzuheben, bei dem nach einer Inkubationszeit von einer Stunde mit Abstand das beste Verhältnis erhalten wurde. Dieser Trend konnte bei den Triphosphat-Prodrugs allerdings nicht festgestellt werden, bei denen der Anteil des Triphosphats an den intrazellulär detektierten Metaboliten bei den Zellaufnahmestudien mit der nicht-symmetrisch maskierten und der monomaskierten TriPPPro-Verbindung etwa gleich hoch war. Mit den durchgeführten Studien konnte erstmals die erfolgreiche Zellaufnahme von monomaskierten DiPPro- bzw. TriPPPro-Verbindungen nachgewiesen werden. Diese zeigten mit ihren ausgezeichneten Hydrolyseeigenschaften ausgesprochen vielversprechende Eigenschaften.
VII
Abstract
Part I: Oligonucleotides containing a 3'-S-phosphorothiolate linkage
Bacterial conjugation is a transfer process of transmittable gens, like plasmids, and plays an important role in the distribution of antibiotic resistance. Herein, the key enzyme is the relaxase. Relaxases are DNA strand transferases, which cleave plasmids strand- and sequence-specific. The relaxase MobM of the streptococcal plasmid pMV158 is the prototype of the MOBV family. For a detailed study of the cleavage reaction, catalyzed by the relaxase
MobM, oligonucleotides containing a phosphorothiolate linkage ought to be used. With the stable protein-DNA adduct, which is formed in the reaction, biochemical and crystallographic experiments should be possible.
The first aim of this thesis was the synthesis of an oligonucleotide containing a 3’-S-phosphorothiolate linkage, which was needed for the experiments with the relaxase MobM. This phosphorothiolate linkage should be located between a 2’-deoxyguanosine unit and a thymidine unit, since the origin of transfer (oriT) of the relaxase MobM includes that sequence. Phosphorothiolate modified oligonucleotides can be synthesized via automated solid-phase synthesis with phosphorthioamidites as building blocks. So first, N2 -[(dimethyl- amino)-methylene]-5'-O-(4,4’-dimethoxytrityl)-2'-deoxy-3'-thioguanosine-3'-S-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite was synthesized.
A 6-step synthesis route for the desired 2’-deoxyguanosine-3’-phosphorothioamidite has been successfully developed. By this synthesis, the thioamidite was obtained in an overall yield of 23%, starting from 2’-deoxyguanosine (section 4.1 - 4.4). The key step of this route was the inversion of the 3’-hydroxyl group with a simultaneous mesylation via a Mitsunobu reaction with methanesulfonic acid. The integration of the sulfur was done by an SN2-reaction
with sodium thiobenzoate. After hydrolysis of the benzoyl group and BTT-mediated phosphorylation, the desired 2’-deoxyguanosine-3’-phosphorothioamidite was gained. Thus, the overall yield is in the range of the published 8-step synthesis route for 2’-deoxy-guanosine-3’-phosphorothioamidites (21% overall yield starting from 2’-deoxyguanosine)[1].
The main differences between the two routes are the protective group stategie, the inversion of the 3’-hydroxyl group and the integration of the sulfur.
With this modified building block the oligonucleotide containing a 3’-S-phosphorothiolate linkage needed for the mechanistic studies of the relaxase MobM was successfully obtained (section 4.5). The synthesis was performed via automated solid-phase synthesis with phosphoramidites as building blocks. Hereby, a precipitation of the phosphorothioamidite was essential before its use in the oligonucleotide synthesis. After optimization of the reaction conditions and the purification the oligonucleotide was obtained in a yield of 7%. By repeating the synthesis several times 330 nmol of the desired phosphorothiolate modified
VIII
oligonucleotide were gained in high purity. Thereby, sufficient material for the experiments with the relaxase MobM could be synthesized. At the time of the submission of this thesis, no results of these experiments were received.
Due to the relatively low yield of the oligonucleotide synthesis, attempts were made to improve the yield by using a dinucleotide with a phosphorothiolate linkage (section 4.6). By performing the inefficient step first, the time-consuming purification of the oligonucleotide should be decreased. Therefore, the N2 -[(dimethylamino)-methylene]-5'-O-(4,4’-dimethoxy-trityl)-2'-deoxy-3'-thioguanosine-3'-S-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite was coupled with a 3’-protected thymidine. The TBDMS and the oxidative-cleavable MMTrS group were tested as protective groups. Due to the low conversion of the coupling reaction and the lability of the formed phosphorothiolate modified dinucleotide, the desired dinucleotide-3’-phosphoroamidite could not be obtained in both cases. Therefore, it was not possible to improve the yield of the oligonucleotide synthesis by this route.
Part II: Fluorescent nucleotide prodrugs for cell uptake studies
In addition to protease inhibitors, the basis for the treatment of HIV infections are nowadays nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NRTIs). NRTIs are inactive in their pharmaceutical form and have to be intracellular metabolized to their corresponding triphosphate by cellular kinases. Due to the substrate specificity of the involved kinases, this phosphorylation is often inefficient. For this reason several pronucleotide concepts have been developed to improve the antiviral activity in comparison to the parent nucleosides. With the DiPPro- and the TriPPPro-approach nucleoside di- and triphosphates were bioreversibly masked successfully for the first time.
The objective of this thesis was the validation of these prodrug concepts with regard to their cell uptake and metabolism by using fluorescent prodrug analogs. In addition, as a monophosphate prodrug a cycloSal-compound should be analyzed. Bicyclic nucleoside analogs (BCNAs) were applied as fluorescent probes, which have already been used successfully several times in cell tests. Furthermore, BCNAs are not substrates for cellular kinases. So, if phosphorylated BCNA-species can be detected in cell uptake studies, this would strongly indicate the successful uptake of the compound and their desired enzymatic hydrolysis.
For these cell uptake studies three DiPPro-BCNADP-compounds (a symmetrically masked, a non-symmetrically masked and a monomasked) and two TriPPPro-BCNATP-compounds (a non-symmetrically masked and a monomasked) were synthesized (section 8.4 and 8.5). Thereby, synthesis routes for the BCNA-monophosphate and -diphosphate synthesis were developed. Via this method, the compounds were obtained in very good yields of 67% and 83% (section 8.4.1 and 8.5.2). In addition, a new synthesis route for monomasked prodrugs
IX
was developed and, for the first time, a monomasked DiPPro-compound was obtained in a good yield of 40% (section 8.4.4).
A further aim was the synthesis of a DiPPro- and a TriPPPro-compound of the anti-VZV active nucleoside Cf1743 to study its mode of action. Cf1743 is the most potent known anti-VZV drug. Both prodrugs were prepared successfully. However, due to the formation of the nucleoside by dephosphorylation of the metabolites of the prodrugs during the antiviral tests, no conclusion with regard to the mode of action was possible (section 8.6).
With the fluorescent BCNA-prodrugs, synthesized for the cell uptake studies, hydrolysis studies with CEM cell extract were performed to verify their metabolic properties (section 8.7). In all cases the release of the desired nucleoside di- or triphosphate was observed. Hereby, a special focus should be placed on the monomasked prodrugs. By their hydrolysis the di- or triphosphate was selectively formed. Thus, the assumption could be verified that the additional negative charge at the terminal phosphate unit can prevent a cleavage of the phosphoric anhydride bond.
For the cell uptake studies with the cycloSal-, DiPPro- and TriPPPro-compounds CEM-cells were used. After incubation the cells were lysed and the cell lysate was analyzed by HPLC with fluorescence detection. With all tested cycloSal-, DiPPro- and TriPPPro-compounds the successful cell uptake of the prodrug was confirmed and intracellular the release of the desired mono-, di- or triphosphate was proven (section 8.8). In case of the three DiPPro-compounds a very good diphosphate to monophosphate ratio was obtained intracellularly. Analogous to the results of the hydrolysis in cell extract, the monomasked diphosphate prodrug is to be emphasized. With this compound, after an incubation time of one hour, by far the best ratio was detected. This trend could not be observed when the non-symmetrically masked and the monomasked triphosphate prodrug were used. The portion of the nucleoside triphosphate in comparison to the intracellular detected metabolites was in both cases in the same range. By the performed cell uptake studies, the successful cell uptake of monomasked DiPPro- and TriPPPro-compounds was confirmed for the first time. These compounds showed with their excellent hydrolysis results very promising properties.
Teil I
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1
Einleitung
Antibiotikaresistenzen von Bakterien gehören zu den größten gesundheitlichen Problemen der heutigen Menschheit, wovon jeder unabhängig des Alters oder der Bevölkerungsschicht betroffen sein kann. Jährlich sterben allein in der Europäischen Union 25.000 Menschen an Krankheiten, verursacht durch multiresistente Bakterien.[2] Die ansteigende Verabreichung von Antibiotika, deren Einsatz in der Landwirtschaft und mangelnde Hygiene in Krankenhäusern beschleunigt die Bildung und Verbreitung multiresistenter Stämme zunehmend. Hierdurch wird die Behandlung von immer mehr Infektionen, aufgrund der verringerten Anwendbarkeit etablierter Antibiotika, immer schwieriger. Es muss verhindert werden, dass ehemals leicht zu heilende Krankheiten wieder zu höheren Mortalitätsraten führen.
Eine Infektion mit dem Gram-positiven Bakterium Streptococcus pneumoniae
(Pneumokokken) kann unter anderem zu Lungenentzündung, Meningitis und Bakteriämie führen. An den Folgen dieser Erkrankungen sterben weltweit jährlich 1.6 Millionen Menschen. Etwa eine Million davon sind Kinder unter fünf Jahren, womit diese Infektion eine der Hauptursachen für Todesfälle in dieser Altersgruppe ist. Die Anzahl der Pneumokokkenerkrankungen in Europa liegt bei 10 - 100 Fällen pro 100.000 Einwohnern.[3] Zur Behandlung von Pneumokokkeninfektionen kann eine Vielzahl an Antibiotika, wie Penicilline, Cephalosporine, Trimethoprim-Sulfamethoxazole, Macrolide und Fluorquinolone eingesetzt werden. Meist finden β-Lactam-Antibiotika wie Penicilline und Cephalosporine Anwendung, zum Beispiel Penicillin G 1 und Cefotaxim 2 (Abb. 1).[4]
Abb. 1: β-Lactam-Antibiotika zur Behandlung von Pneumokokkeninfektionen.
Im Jahr 1967 wurde in Australien der erste Fall von penicillinresistenten Pneumokokken beschrieben.[5] Zuvor konnten alle Pneumokokkeninfektionen problemlos mit Penicillin behandelt werden. Seitdem wird weltweit ein starker Anstieg von antibiotikaresistenten Pneumokokken beobachtet.[2]
β-Lactame verhindern die Quervernetzung der Peptidoglycane in bakteriellen Zellwänden, indem sie im aktiven Zentrum der Penicillin-Bindungsproteine (PBPs), die Transglycosylase-aktiv sind, binden. Durch die Inhibierung der Enzyme wird somit die Synthese der Zellwand verhindert, was zum Absterben des Bakteriums führt.[6] β-Lactam-resistente Pneumokokken
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weisen bis zu 100 Mutationen in Genen auf, die für die PBPs codieren. Hierdurch wird die Bindungsaffinität der PBPs gegenüber β-Lactam-Antibiotika stark herabgesetzt. Penicillinresistente Pneumokokken sind häufig ebenfalls resistent gegen weitere Antibiotika, in den meisten Fällen gegen Trimethoprim-Sulfamethoxazole und Macrolide.[7]
Bei diesen multiresistenten Stämmen werden zur Behandlung meist Fluorquinolone, wie Levofloxacin 3 und Moxifloxacin 4 (Abb. 2), eingesetzt.
Abb. 2: Fluorquinolone Levofloxacin 3 und Moxifloxacin 4.
Fluorquinolone inhibieren die DNA-Gyrase und die Topoisomerase IV und stören damit das DNA-Supercoiling beim Replikationszyklus der Bakterien. Jedoch wurden auch schon fluorquinolonresistente Pneumokokkenstämme beobachtet.[8] Die Resistenz resultiert aus chromosomalen Mutationen in der quinolone resistance determining region (QRDR) der
gyrA-Gene der DNA-Gyrase und der parC-Gene der Topoisomerase IV. Diese Resistenzen
treten mit <2% in den meisten Ländern eher selten auf.[9] Es besteht jedoch die Gefahr, dass aufgrund des vermehrten Einsatzes dieser Antibiotika auch die Anzahl fluorquinolonresistenter Bakterienstämme zunimmt.
Der erste Fall von Pneumokokken, die multidrug resistance (MDR) zeigten, also resistent gegen mindestens drei Antibiotikaklassen sind, wurde 1977 beschrieben und trat in Südafrika auf.[10] Seitdem gibt es einen kontinuierlichen Anstieg von MDR. 1995 lag der Anteil an MDR von der Gesamtzahl an S. Pneumoniae in den USA bei 9% und 2005 schon bei 20%. Heutzutage sind weltweit bis zu 30% der Pneumokokken multidrug resistant.[11] Eine wichtige Rolle bei der Verbreitung von Resistenzen spielt, neben der klonalen Ausbreitung resistenter Stämme, der horizontale Gentransfer (HGT).[12] Die meisten der bekannten Resistenzgene befinden sich auf mobilen genetischen Elementen, wie den Plasmiden. Diese können durch horizontalen Gentransfer auf andere Bakterien übertragen werden.[13]
Ein tieferes Verständnis des horizontalen Gentransfers könnte somit dazu führen, die Ausbreitung von Antibiotika-Resistenzen einzudämmen.
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Kenntnisstand
2.1 Horizontaler Gentransfer bei Prokaryoten
Der horizontale Gentransfer bezeichnet den Prozess, bei dem Prokaryoten Genmaterial aus ihrer Umgebung aufnehmen. Dies kann auf drei verschiedenen Wegen erfolgen: der Transformation, der Transduktion und der Konjugation.
Bei der Transformation nimmt ein Bakterium aktiv freie, extrazelluläre Plasmid-DNA oder chromosomale DNA auf und baut diese in das zelleigene Genom ein.[14] Dieses Phänomen wurde erstmalig 1928 von GRIFFITH beobachtet.[15] Als Transduktion wird bezeichnet, wenn Bakteriophagen wirtseigenes genetisches Material von einem Bakterium in das nächste transferieren.[16] Die häufigste Art der Übertragung von Genen, die Konjugation, wurde wie die Transduktion von LEDERBERG und TATUM 1946[17] entdeckt. Bei der Konjugation wird durch Zellkontakt ein Plasmid von einer Donor- in eine Empfängerzelle übertragen. Somit spielt vor allem die Konjugation eine wichtige Rolle bei der Verbreitung von Resistenzen. Bei der bakteriellen Konjugation sind zwei Multiproteinkomplexe beteiligt. Zum einen das Relaxosom, das für die Prozessierung und Replikation der Plasmid-DNA verantwortlich ist, und zum anderen das type IV secretion system (T4SS), das für den Transport der Gene in die Empfängerzelle sorgt. Diese beiden Proteinkomplexe werden durch ein Kupplungsprotein (T4CP) verbunden.[18,19] Ein Schlüsselenzym des Relaxosoms ist die Relaxase. Relaxasen wurden erstmalig in Plasmid-Relaxationskomplexen entdeckt.[20] Relaxasen sind DNA-Strangtransferasen, die DNA strang- und sequenzspezifisch schneiden können. Zudem wirken sie bei der bakteriellen Konjugation als Pilotprotein, wobei sie als DNA-Protein-Komplex in die Empfängerzelle übertragen werden.[18]
Der allgemeine Mechanismus der bakteriellen Konjugation ist in Abb. 3 dargestellt. Zunächst binden verschiedene Proteine, unter anderem die Relaxase, an den origin of transfer (oriT) des Plasmids und bilden somit das Relaxosom (1). Anschließend spaltet die Relaxase eine Phosphordiesterbindung an einer spezifischen Stelle des oriT, die nic genannt wird, und bleibt kovalent an das 5’-Ende des T-Strangs (transferred strand) gebunden (2). Durch das Kupplungsprotein (T4CP) wird der entstandene DNA-Protein-Komplex in unmittelbare Umgebung des T4SS gebracht (3). Nun wird der DNA-Protein-Komplex über das T4SS in die Empfängerzelle transportiert (4). Abschließend findet in beiden Zellen die Replikation des komplementären Stranges statt (5a,b) und die Relaxase überträgt das 5’-Ende des T-Strangs auf das freie 3’-Ende, sodass wieder ein zirkularisierter Strang entsteht (5b).[21]
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Abb. 3: Allgemeiner Mechanismus der bakteriellen Konjugation (bearbeitet nach [21]).
Aufgrund ihrer Übertragungseigenschaften können Plasmide in drei Kategorien unterteilt werden (Abb. 4). Ein konjugatives Plasmid codiert alle Enzyme, die für die Konjugation notwendig sind. Diese Bereiche sind zum einen die mob-Region, in der die Relaxase und das T4CP codiert sind und sich der oriT befindet, und zum anderen die tra-Region, in der die Enzyme des T4SS codiert sind. Mobilisierbare Plasmide haben nur eine mob-Region, in der unter Umständen auch kein T4CP codiert ist. Diese Plasmide benötigen zum Transfer ein konjugatives Plasmid der Donorzelle. Nichtmobilisierbare Plasmide tragen keines der drei für die Konjugation wichtigen Bereiche und können nur durch Transformation oder Transduktion übertragen werden.[22]
Abb. 4: Einteilung von Plasmiden in konjugative und mobilisierbare Plasmide aufgrund ihrer Übertragungseigenschaften (bearbeitet nach [22]).
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Eine differenziertere Klassifizierung von durch Konjugation übertragbaren Plasmiden wurde auf der Grundlage von Übereinstimmungen in der Aminosäuresequenz der Relaxasen der Plasmide vorgenommen.[23,24] Die Relaxase nimmt eine Schlüsselrolle bei der Konjugation ein. Es ist das einzige Protein, das in allen übertragbaren Plasmiden, ob konjugativ oder mobilisierbar, codiert ist. Dieses Enzym bildet somit eine ideale Basis für eine Klassifizierung. Da Relaxasen oft große Multidomän-Proteine sind, wurden nur die 300 Aminosäuren des N-Terminus der Relaxasen zur Analyse berücksichtigt. Dieser Bereich beinhaltet die für die Klassifizierung wichtige Relaxase-Domäne. Aufgrund von übereinstimmenden Aminosäuresequenzen wurden die durch Konjugation übertragbaren Plasmide in sechs MOB-Familien eingeteilt: MOBF, MOBH, MOBQ, MOBC, MOBP und
MOBV.[24]
Diese Klassifizierung und Einteilung der bekannten Plasmide aufgrund ihrer Übertragungseigenschaften und ihrer Relaxasen hat zu einem besseren Verständnis dieser Eigenschaften beigetragen. Ein Anteil von 39% der prokaryotischen Plasmide können durch Konjugation übertragen werden, wovon 62% mobilisierbare Plasmide sind. Die MOB-Familien sind unterschiedlich stark in den verschiedenen Bakterienklassen vertreten. Mobilisierbare Plasmide sind meist mit um die 5 kb relativ klein. Diese haben eine hohe Vervielfältigungsrate und verbreiten sich dadurch schneller als konjugative Plasmide. Die meisten mobilisierbaren Plasmide gehören der MOBV-Familie an, gefolgt von MOBC, MOBP
und MOBQ.[25]
2.2 Plasmid pMV158
Das Plasmid pMV158 ist ein Tetracyclin-resistentes, 5.54 kb-großes Streptokokkenplasmid und wurde erstmals 1980 von BURDETT beschrieben.[26] Dieses mobilisierbare Plasmid ist eines der einfachsten Systeme für einen effizienten DNA-Transfer zwischen Prokaryoten und der Prototyp der MOBV-Familie.[24,27] In der mob-Region des pMV158 ist nur ein Protein, die
Relaxase MobM, codiert. Zudem ist dort der oriT lokalisiert.[28] Somit wird zum Transport des T-Strangs in die Empfängerzelle ein Übertragungskomplex eines konjugativen Plasmids in der Donorzelle benötigt. Als Helferplasmid des pMV158 können unterschiedliche konjugative Plasmide fungieren, wie das Plasmid pIP501[29] des Gram-positiven Bakteriums
Streptococcus agalactiae, pAMβ1[30] und RP4[31]. pMV158 kann zwischen Gram-positiven aber auch zwischen Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien übertragen werden.[30,31] In Abb. 5 ist die Genkarte des pMV158 dargestellt. Das Plasmid besitzt vier Protein-codierende Bereiche, mobM, copG, repB und tetL. Hierbei ist die Richtung der Transkription bei allen gleich, was die Pfeile verdeutlichen. Die Proteine der Gene copG und repB sind bei der Plasmid-DNA-Replikation beteiligt. Das tetL-Gen ist verantwortlich für die Tetracyclin-Resistenz des Bakteriums. mobM codiert die bei der Konjugation entscheidende Relaxase
6
MobM. Zudem sind der origin of transfer, oriT, der Replikationsursprung des Leitstranges,
dso, und die des Folgestranges, ssoU und ssoA, ausgewiesen.[32,33]
Abb. 5: Genkarte des Plasmids pMV158.[32]
Die oriT-Sequenz des Plasmids pMV158 liegt zwischen den Einheiten 3564 und 2605 (Abb. 6).[32] Die minimale Sequenz für eine effiziente MobM-Bindung umfasst 26 Nucleotide und ist in Abb. 6 grau hinterlegt. Diese Sequenz liegt vor der Spaltungsstelle nic, welche sich zwischen Guanin 3595 und Thymin 3596 befindet.[25]
Abb. 6: oriT des pMV158 mit inverted repeats (IR) und Spaltungsstelle (nic) (bearbeitet nach [25]).
Innerhalb des oriT gibt es drei teilweise überlappende inverse Wiederholungen, IR1, IR2 und IR3 (Abb. 6). Diese inversen Wiederholungen können Haarnadelschleifen ausbilden, wie in Abb. 7 dargestellt ist.
Abb. 7: Mögliche Haarnadelschleifen der inversen Wiederholungen (IR) innerhalb des oriT, wobei nic mit einem Pfeil und die minimale Sequenz für eine effektive Bindung von MobM schwarz
7
IR1 und IR3 sind Erkennungsmerkmale für die Relaxase MobM bei ssDNA-Substraten. IR2 ist an der Autoregulation des mobM-Gens beteiligt. Es wird angenommen, dass MobM auf zwei verschiedene Weisen an oriT binden kann. Wenn IR1 oder IR3 an der Bindung beteiligt sind, wird das Relaxosom gebildet. Wenn IR2 an der Bindung beteiligt ist, wird die Expression des mobM-Gens gesteuert. Somit kann die Bindung von MobM an oriT nicht nur den Plasmidtransfer initiieren, sondern auch zu einer Regulation des mobM-Gens führen.[24,27,33]
2.3 Relaxase MobM
Die Relaxase MobM besteht aus 494 Aminosäureeinheiten (57874 Da), liegt als Dimer mit zwei identischen Untereinheiten vor und nimmt eine zentrale Rolle bei der Konjugation des Plasmids pMV158 ein. Hierbei bindet sie an den oriT des Plasmids pMV158, spaltet die Phosphordiesterbindung am nic und bildet einen DNA-Protein-Komplex. Am 3’-Ende des gespaltenen Plasmids entsteht dabei eine freie Hydroxylgruppe. Der DNA-Protein-Komplex wird in die Rezipientenzelle transferiert. Dort wird der DNA-Strang wieder rezirkularisiert und die Relaxase freigesetzt.[24,34]
MobM verfügt über drei wichtige Domänen. Die Erste befindet sich am N-Terminus. Sie ist bei der DNA-Erkennung und Bindungsspaltung am oriT beteiligt. Die zweite Domäne ist eine leucinreiche Region, die möglicherweise bei der Dimerisierung und Autoregulation des
mobM-Gens eine wichtige Rolle spielt. Die Dritte ist eine coiled coil Region am C-Terminus,
die wahrscheinlich an der Bindung der Relaxase an die Zellmembran beteiligt ist.[34]
Im aktiven Zentrum der Relaxase koordinieren drei Histidinreste (3H-Motiv) zweiwertige Metallionen, wie Mn2+- oder Mg2+-Ionen. Diese Metallionen polarisieren die Phosphordiester-Gruppe und begünstigen damit einen nucleophilen Angriff.[27] Bei den meisten bis heute untersuchten Relaxasen erfolgt der nucleophile Angriff, der zur Bindungsspaltung führt, durch einen Tyrosinrest. Es wird angenommen, dass bei der Relaxase MobM diese Rolle das Tyr44 einnimmt.[24,34] Im Fall der Relaxase des Plasmids pBBR1, welches ebenfalls zur MOBV-Familie gehört, wurde jedoch gezeigt, dass kein Tyrosinrest der Relaxase am Transfer
beteiligt ist.[35] Somit ist es auch möglich, dass die MOBV-Relaxasen einem anderen
Katalysemechanismus folgen.
Zur Aufklärung des Mechanismus wäre eine Kristallstruktur des DNA-Protein-Adduktes hilfreich. Dies ist jedoch schwierig zu realisieren, da die Bindungsspaltung des Phosphordiesters eine Gleichgewichtsreaktion ist. Die bei der Spaltung entstehende Hydroxylgruppe des 3’-Endes kann erneut nucleophil am Phosphoratom angreifen. Dieses Problem wurde von GONZALEZ-PEREZ, durch die Verwendung von 3‘-S-phosphorthiolatverbrückten Oligonucleotiden bei der Untersuchung der Relaxase TrwC des Plasmids R388 aus dem Gram-negativen Bakterium Escherichia Coli, gelöst.[36]
8
Phosphorthiolatverbrückte Oligonucleotide verhindern die Rückreaktion der Bindungsspaltung (Abb. 8) und ermöglichen dadurch eine Analyse des stabilen DNA-Protein-Komplexes.
Abb. 8: Schematische Darstellung der Phosphordiesterspaltung am nic des Plasmids R388 durch die Relaxase TrwC.[36]
Die Spaltung des DNA-Strangs läuft analog zu der Reaktion mit einem natürlichen Substrat ab. Durch einen nucleophilen Angriff eines Tyrosinrestes der Relaxase wird das 5’-Ende kovalent an das Protein gebunden. Zudem entsteht am 3’-Ende eine freie Thiolgruppe. Die Rückreaktion findet dagegen nicht statt. Die Thiolgruppe ist ein weiches Nucleophil und kann somit keine Umesterung am Phosphatzentrum als hartes Elektrophil einleiten.[36]
Zur Aufklärung des Mechanismus der Bindungsspaltung katalysiert durch die Relaxase MobM wäre es auch hier vielversprechend, phosphorthiolatverbrückte Oligonucleotide zur Untersuchung des DNA-Protein-Komplexes zu verwenden. Für diese Untersuchung wird ein Oligonucleotid benötigt, bei dem eine 2‘-Desoxyguanosineinheit 3‘-S-phosphorthiolat-verbrückt zu einer Thymidineinheit vorliegt, da die zu spaltende Bindung zwischen einer Guanosin- und einer Thymidineinheit liegt.
2.4 3‘-S-Phosphorthiolatverbrückte Oligonucleotide
Phosphorthiolatverbrückte Oligonucleotide wurden schon mehrfach bei strukturellen und mechanistischen Untersuchungen von DNA-prozessierenden Enzymen eingesetzt, da sie isoelektronisch zu den natürlichen Strukturen sind und dadurch in vielen Fällen ebenfalls Substrate dieser Enzyme sind. Beispiele hierfür sind Studien der Restriktionsendonuclease
EcoRV[37], des Ribozyms Tetrahymena[38] und der Exonucleasedomäne der DNA Polymerase I aus E. coli[39]. Zudem wurden schon, wie in Abschnitt 2.3 beschrieben, phosphorthiolatverbrückte Oligonucleotide bei der Untersuchung der Relaxase TrwC eingesetzt.[36]
Bei 3‘-S-Phosphorthiolaten ist das 3‘-Sauerstoffatom der Phosphatgruppe gegen ein Schwefelatom ausgetauscht, was in Abb. 9 dargestellt ist. Phosphorthiolate können auch als RNA vorliegen, es soll im Folgenden jedoch nur auf DNA eingegangen werden. Zum Vergleich sind auch die Strukturen von DNA und Phosphorthioaten, bei denen ein
nicht-9
verbrückendes Sauerstoffatom der Phosphatgruppe gegen ein Schwefelatom ausgetauscht ist, abgebildet (Abb. 9).
Abb. 9: Allgemeine Strukturen von 3‘-S-Phosphorthiolaten, DNA und Phosphorthioaten.
Phosphorthioate sind leicht zugänglich, wie z. B. durch Einführung des Schwefels bei der Oxidation des Phosphits durch S8 in 2,6-Lutidin oder in einem Gemisch aus CS2 und
Pyridin.[40] 3‘-S-Phosphorthiolate dagegen sind deutlich aufwendiger zu synthetisieren. Die erste Darstellung von 3‘-S-phosphorthiolatverbrückten Oligonucleotiden wurde von COSSTICK und VYLE 1989 veröffentlicht.[41,42] In den letzten zwei Jahrzehnten wurde fast ausschließlich mit Pyrimidin-Nucleotiden mit 3‘-SP-Verbrückung gearbeitet, da diese im Vergleich zu Purin-Nucleotiden leichter zu synthetisieren sind und erst 2013 von der Gruppe um COSSTICK die erste chemische Syntheseroute von 2‘-Desoxyguanosin-3‘-S-phosphorthiolaten veröffentlicht wurde.[1]
Für die Synthese von Oligonucleotiden hat sich die automatisierte Festphasensynthese mit Phosphoramiditen als Monomerbausteine bewährt.[43] Diese Methode wurde auch bei der Synthese der phosphorthiolatverbrückten Oligonucleotide mit Phosphorthioamiditen als Monomerbausteine (Abb. 10) eingesetzt.[1,41,44]
Abb. 10: Monomerbausteine der chemischen DNA-Synthese nach der Phosphoramiditmethode.
Im Gegensatz zu der Biosynthese von Nucleinsäuren erfolgt die chemische Synthese aufgrund der höheren Reaktivität der 5’-Hydroxylgruppe in 3’→5’-Richtung. Somit befindet sich die Phosphoramiditgruppe an der 3‘-Hydroxylgruppe des Monomerbausteins. Alle
10
weiteren nicht an der Kupplung beteiligten funktionellen Gruppen werden, um Nebenreaktionen zu minimieren, mit geeigneten Schutzgruppen versehen.
Als Schutzgruppen der Phosphatgruppe und der exozyklischen Aminofunktionen werden basenlabile Schutzgruppen verwendet. Als Phosphatschutzgruppe wird eine 2-Cyanoethylgruppe verwendet. Zudem hat sich für die Phosphoramiditgruppe ein Diisopropylaminrest bewährt, da damit eine gute Zugänglichkeit und Lagerfähigkeit erreicht wird.[45,46] Als Schutzgruppen für die exocyclischen Aminofunktionen von Guanin, Adenin und Cytosin haben sich Acylgruppen durchgesetzt.[47] Die am häufigsten verwendeten Schutzgruppen sind die Isobutyrylgruppe bei Guanin, die Benzoylgruppe bei Adenin und die Acetylgruppe bei Cytosin. Bei Thymin ist keine Schutzgruppe notwendig.
Auch die Spaltung des Oligonucleotids von der Festphase erfolgt im basischen Milieu. Das Startmonomer der DNA-Synthese ist über die 3’-Hydroxylgruppe meist über einen Succinyllinker und einen langkettigen Alkylamidspacer an controlled pore glas (CPG) als Festphase gebunden. Als feste Phase wird alternativ auch das Divinylbenzol-quervernetzte Polystyrol verwendet.[46]
Die Abspaltung der Schutzgruppe der 5‘-Hydroxylgruppe darf die anderen Schutzgruppen nicht beeinflussen, so dass hier eine orthogonale Schutzgruppenstrategie verwendet werden muss. Hierbei hat sich die Verwendung der säurelabilen 4,4‘-Dimethoxytritylgruppe (DMTr) bewährt. Diese Schutzgruppe hat zudem den positiven Nebeneffekt, dass bei der Abspaltung ein Tritylkation freisetzt wird, welches ausgezeichnet spektroskopisch detektiert werden kann und sich damit die Kupplungsrate abschätzen lässt.
Der Synthesezyklus von Oligonucleotiden durch automatisierte Festphasensynthese mittels Phosphoramiditmethode ist in Abb. 11 dargestellt.
Im ersten Schritt erfolgt die saure Abspaltung der DMTr-Gruppe. Anschließend wird das Nucleosidphosphoramidit mit einem Aktivator hinzugegeben, was zur Kettenverlängerung führt. Dann erfolgt die Oxidation des Phosphits zum Phosphat. Die nicht umgesetzten 5’-Hydroxylgruppen werden, um Fehlsequenzen zu vermeiden, verestert (Capping). Dieser Zyklus wird so oft durchlaufen, bis die gewünschte Oligonucleotidsequenz erreicht ist. Abschließend erfolgen die Spaltung des Oligonucleotids von der festen Phase und die Abspaltung der Schutzgruppen.
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Abb. 11: Synthesezyklus der automatisierten Festphasensynthese von Oligonucleotiden.
Bei der Detritylierung wird Trichloressigsäure (TCA) oder die mildere Dichloressigsäure (DCA) verwendet. Als Aktivator im zweiten Schritt fungiert 4,5-Dicyanoimidazol (DCI), 5-Ethylthio-1H-tetrazol (ETT) oder 5-Benzylthio-1H-tetrazol (BTT), wobei von DCI zu BTT immer kürzere Kupplungszeiten erreicht werden können.[48-50] Um das Phosphit zum Phosphat zu oxidieren, hat sich ein Gemisch aus Iod, Wasser und Pyridin in Tetrahydrofuran bewährt. Beim Capping wird N-Methylimidazol mit Säureanhydriden wie Essigsäureanhydrid eingesetzt. Die basische Spaltung von der Festphase und die Abspaltung der Schutzgruppen erfolgt mit einer konzentrierten Ammoniaklösung. Um den Prozess zu beschleunigen, kann 40% Methylamin zugesetzt werden.
Bei Phosphorthioamiditen muss ein leicht verändertes Syntheseprotokoll im Vergleich zu den standardmäßig eingesetzten 3’-O-Phosphoramiditen eingesetzt werden, da sich die Eigenschaften des Amidits durch den Austausch des Sauerstoffatoms mit dem Schwefelatom ändern. Zum einen wird die Elektronendichte am Stickstoff herabgesetzt, wodurch das Stickstoffatom weniger basisch wird. Zudem wird die partielle positive Ladung am Phosphoratom in der N-protonierten Form kleiner und die P-N-Bindung kürzer. Somit wird das S-Phosphoramidit im Vergleich zum O-Phosphoramidit durch den Aktivator langsamer protoniert und in der N-protonierten Form ist ein nucleophiler Angriff des deprotonierten Aktivators bzw. der 5‘-OH-Gruppe eines zweiten Nucleosidbausteins auf das Phosphoratom weniger begünstigt.[51,52] Die entscheidenden Modifizierungen des
12
Syntheseprotokolls sind eine längere Kupplungszeit, die Verwendung von saureren Aktivatoren, wie ETT oder BTT, eine höhere Konzentration der Phosphorthioamidite und eine niedrigere Iodkonzentration beim Oxidationsschritt.[44]
2.5 Synthese der Phosphorthioamidite
Für den Einbau von Phosphorthiolaten in Oligonucleotide ist die Synthese der entsprechenden 2‘-Desoxynucleosid-3‘-phosphorthioamidite notwendig. Eine effiziente Syntheseroute der Pyrimidinnucleoside wurde von der Gruppe um COSSTICK[44,53] publiziert und ist in Abb. 12 dargestellt. Hierbei wurde die 2-Carbonylgruppe der Nucleobase (5) ausgenutzt und über eine intramolekulare Mitsunobu-Reaktion die Anhydroverbindung 6 erhalten. Der entstandene Ring wurde anschließend über eine SN2-Reaktion mit
Natriumthiobenzoat zur Verbindung 7 geöffnet. Durch diese beiden Schlüsselschritte wurde die Einführung des Schwefels an der 3‘-Position unter zweifacher Inversion und somit Retention der Konfiguration realisiert. Dann wurde unter basischen Bedingungen die Benzoylgruppe abgespalten und das erhaltene Thiol 8 zum Synthesebaustein für die Oligonucleotidsynthese, dem Phosphorthioamidit 9, umgesetzt.[44,53]
Abb. 12: Synthese der Pyrimidin-Bausteine.[44]
Diese elegante Route für Pyrimidine unter Ausnutzung der 2-Carbonylgruppe lässt sich jedoch nicht so leicht auf Purine übertragen, da sie keine Carbonylgruppe in geeigneter Position tragen. Bei den Purinen erfolgt die Verbrückung über das N3-Atom des Purins. Der Ring lässt sich allerdings nicht selektiv auf gewünschte Weise durch ein Nucleophil öffnen. Stattdessen erfolgt ein nucleophiler Angriff auf das C-2-Atom (10) und die Öffnung des Pyrimidinrings des Purins (11), was in Abb. 13 am Beispiel von Guanosin dargestellt ist.[54,55]
5a: T 5b: CBz 6a: X= O; R= CH3 6b: X= NBz; R= H 7a: T 7b: CBz 8a: T 8b: CBz 9a: T 9b: CBz
13
Abb. 13: Nucleophile Öffnung des Purins der cyclischen Anhydroverbindung 10 zum Anhydronucleosid 11.[54,55]
Die Gruppe um COSSTICK hat zwei Wege zur Darstellung des 2‘-Desoxy-3‘-thioadenosin-Bausteins 12 publiziert.[56-58] Bei der 1992 von LI et al.[56] veröffentlichten Syntheseroute (Abb. 14) erfolgt der Schlüsselschritt, die Inversion der 3‘-Hydroxylgruppe, mittels reduktiver [1,2]-Hydridumlagerung, welche ursprünglich von HANSSKE und ROBINS entwickelt wurde.[59] Die stereospezifische Einführung des Schwefels erfolgte analog zur Pyrimidinroute durch eine SN2-Reaktion mit Natriumthiobenzoat als Schwefelnucleophil.
Zunächst erfolgte eine regioselektive Tosylierung der 2‘-Hydroxylgruppe von Adenosin 13. Das tosylierte Nucleosid 14 wurde durch reduktive [1,2]-Hydridumlagerung zum Desoxy-xylo-Nucleosid 15 umgesetzt.[54] Durch Tritylierung der 5’-Hydroxylgruppe, Mesylierung der 3’-Hydroxylgruppe und Schützung der exocyclischen Aminogruppe mit Benzoylchlorid wurden zum einen die für die Oligonucleotidsynthese geeigneten Schutzgruppen eingeführt und zum anderen die 3‘-Hydroxylgruppe in eine gute Abgangsgruppe überführt. Hierdurch konnte im nächsten Schritt das Nucleosid 16 mit Natriumthiobenzoat in einer SN2-Reaktion zum
Thioester 17 umgesetzt werden, womit das Schwefelatom mit der richtigen Konfiguration eingeführt wurde. Durch Hydrolyse des Thiobenzoats zu dem Thiol 18 und Umsetzung zum Phosphorthioamidit 12 wurde der 2’-Desoxy-3‘-thioadenosin-Synthesebaustein für die Oligonucleotidsynthese erhalten.[56]
Abb. 14: Synthese des 2‘-Desoxy-3‘-thioadonosin-Bausteins 12.[56]
10 11
13
14 16
12 18 17
14
Auch bei 2‘-Desoxyguanosin 19 lässt sich der Schwefel, wie in Abb. 13 dargestellt, nicht über eine cyclische Anhydrozwischenstufe einführen. Eine Syntheseroute zum 2’-Desoxy-3‘-thioguanosin-Synthesebaustein 20 wurde 2013 von PIPERAKIS veröffentlicht (Abb. 15).[1] Die Inversion der 3‘-Hydroxylgruppe erfolgte hier nach dem von EISENHUTH und RICHERT entwickelten one-pot 3’-OH-Oxidations-Reduktions-Protokoll.[60] Das Einbringen des Schwefels unter erneuter Inversion der Konfiguration wurde durch Umsetzung mit Thiobenzoesäure unter Mitsunobu-Bedingungen erreicht.
Als Ausgangsverbindung wurde 2‘-Desoxyguanosin 19 verwendet. Die exocyclische Aminogruppe wurde mit der Isobutyrylgruppe (iBu) geschützt. Für die 5‘-Hydroxylgruppe wurde die tert-Butyldimethylsilyl-Schutzgruppe (TBDMS) verwendet, da damit eine Ausbeute von 79% bei der anschließenden Oxidations-Reduktions-Abfolge erreicht wurde, im Gegensatz zu einer Ausbeute von 20% mit der für die Oligonucleotidsynthese notwendigen Tritylschutzgruppe. Somit wurden dafür die zwei zusätzlichen Schritte in Kauf genommen. Die Oxidation der 3‘-Hydroxylgruppe des geschützten Nucleosids 21 erfolgte mit Dess-Martin-Periodinan. Bei der anschließenden Reduktion des entstandenen Ketons mit Natriumborhydrid wurde eine hohe Stereoselektivität zum xylo-Produkt 22 durch Durchführung der Reaktion bei -60 °C erreicht.[1]
Abb. 15: Synthese des 2‘-Desoxy-3‘-thioguanosin-Bausteins 20.[1]
19 21 23 26 20 24 22 25
15
Der zweite Schlüsselschritt, die Einführung des Schwefels am C-3‘ unter Inversion der Konfiguration zu dem Thioester 23, erfolgte mittels Mitsunobu-Reaktion. Als schwefelhaltiges Nucleophil wurde Thiobenzoesäure verwendet. Auch bei diesem Schritt konnten mit dem TBDMS-geschützten Nucleosid deutlich höhere Ausbeuten erzielt werden (65%) als mit dem 4,4‘-Dimethoxytrityl-geschützten Nucleosid (5%). Hierbei wurden eine teilweise Detritylierung und kein vollständiger Umsatz des Eduktes beobachtet. Als Alternative wurde ebenfalls die bei der Synthese des analogen 2‘-Desoxyadenosins verwendeten Strategie der Mesylierung der 3‘-xylo-OH-Gruppe und anschließender SN2-Reaktion mit Natriumthiobenzoat getestet.
Jedoch konnten hierbei vor allem durch die Mesylierung nicht so gute Ausbeuten erreicht werden, wie bei der Mitsunobu-Reaktion.[55] Die Umschützung der 5‘-Hydroxylgruppe erfolgte zunächst durch die Abspaltung der TBDMS-Gruppe durch Tetrabutylammoniumfluorid (TBAF) mit Zusatz von Essigsäure, da ansonsten auch die Benzoylgruppe abgespalten wird, zur 5‘-OH-freien Verbindung 24. Die Tritylierung erfolge anschließend mit 4,4‘-Dimethoxytritylchlorid (DMTrCl) zum Nucleosid 25. Analog zur dA-Route wurde nun zum Thiol 26 hydrolysiert und dieses zum Phosphorthioamidit 20 umgesetzt, welches den benötigten Baustein für die Synthese von 3‘-S-phosphorthiolatverbrückten Oligonucleotiden darstellt.[1,55]
16
3
Aufgabenstellung
Die Konjugation von Plasmiden spielt eine entscheidende Rolle bei der Übertragung von Resistenzgenen und damit bei der Zunahme multiresistenter Bakterien. Das Schlüsselenzym bei diesem Prozess ist die Relaxase. Relaxasen katalysieren die Spaltung von Plasmid-DNA. Zur Aufklärung des Mechanismus haben sich 3‘-S-phosphorthiolatverbrückte Oligonucleotide bewährt. Zur Untersuchung des Spaltungsmechanismus der Relaxase MobM des mobilisierbaren Streptokokkenplasmids pMV138 sollte das, in Abb. 16 dargestellte, Oligonucleotid 27 synthetisiert werden, welches an der Spaltungsstelle nic eine Schwefelverbrückung aufweist.
Abb. 16: 3‘-S-phosphorthiolatverbrücktes Oligonucleotid 27 (die Modifikation ist mit „*“ gekennzeichnet).
Für die Synthese von Oligonucleotiden hat sich die automatisierte Festphasensynthese mit Phosphoramiditen als Monomerbausteine bewährt. Diese Methode sollte auch bei der Synthese des phosphorthiolatverbrückten Oligonucleotids 27 eingesetzt werden. Dafür sollte das in Abb. 17 dargestellte 2‘-Desoxyguanosin-3‘-phosphorthioamidit 28 synthetisiert werden. Um möglicherweise höhere Ausbeuten bei der automatisierten Oligonucleotid-synthese zu erreichen, sollte zudem ein phosphorthiolatverbrücktes Dimer 29 eingesetzt werden (Abb. 17).
Abb. 17: Monomerbausteine für die Synthese des phosphorthiolatverbrückten Oligonucleotids 27.
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4
Resultate und Diskussion
Die Synthesestrategie zur Darstellung des gewünschten 2‘-Desoxyguanosin-3‘-phosphorthioamidits, unter Nutzung des chiral pool, ist in Abb. 18 dargestellt. Ausgehend von Guanosin oder 2‘-Desoxyguanosin bestand diese aus drei wesentlichen Schritten, die Umsetzung zum Phosphoramidit, das Einbringen des Schwefels an der 3‘-Position in der entsprechenden Konfiguration und die Inversion der 3‘-Hydroxylgruppe. Die Realisierung dieser drei Schritte soll in den nächsten drei Kapiteln vorgestellt werden. Die Schutzgruppen (SG) in Abb. 18 sind als Platzhalter anzusehen. Auf die jeweilige Schutzgruppenstrategie wird bei der Beschreibung der unterschiedlichen Wege eingegangen.
Abb. 18: Retrosyntheseschema des 2‘-Desoxyguanosin-3‘-phosphorthioamidits.
4.1 Inversion der 3‘-Hydroxylgruppe des Guanosins 30 bzw. 2‘-Desoxyguanosins 19
Die erste Syntheseroute zur Inversion der Konfiguration der 3‘-Hydroxylgruppe sollte über die, bereits in Abschnitt 2.5 vorgestellte, regioselektive Tosylierung mit anschließender [1,2]-Hydridumlagerung erfolgen.[56,59] Des Weiteren sollten zum einen die für die Oligonucleotidsynthese geeigneten Schutzgruppen eingeführt und zum anderen die 3‘-Hydroxylgruppe, zum Einbringen des Schwefels, in eine gute Abgangsgruppe überführt werden.
Mit der von SHANG[61] publizierten Synthese von 2‘-O-Tosylguanosin 31 konnte gegenüber anderen Protokollen[54,62] in eigenen Vorarbeiten der beste Umsatz erzielt werden.[63] Es wurde Guanosin in Acetonitril suspendiert und mit n-Dibutylzinnoxid als Katalysator und p-Toluolsulfonsäurechlorid umgesetzt (Abb. 19). Der gebildete Chlorwasserstoff wurde als
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Triethylammoniumchlorid abgefangen. Nach einer Reaktionszeit von 28 Stunden wurde das Reaktionsgemisch filtriert und 2‘-O-Tosylguanosin 31 mit Salzverunreinigungen erhalten. Aufgrund der schlechten Löslichkeit des 2‘-O-Tosylguanosins 31 wurde auf eine chromatographische Reinigung verzichtet und das Rohprodukt im nächsten Schritt eingesetzt. Die [1,2]-Hydridumlagerung erfolgte durch Umsetzung des 2‘-O-Tosylguanosins 31 in Dimethylsulfoxid mit Lithiumtriethylborhydrid (1 M in THF). Nach Umkristallisation aus Methanol wurde 2‘-Desoxy-xylo-guanosin 32 in einer Ausbeute von 60% über zwei Stufen erhalten.[63] Aufgrund der geringen Löslichkeit des 2‘-O-Tosylguanosins 31 musste allerdings ein großes Volumen an Dimethylsulfoxid als Lösungsmittel eingesetzt werden. Die Aufarbeitung bzw. Entfernung des Lösungsmittels war damit sehr zeitintensiv.
Abb. 19: Synthese des 2‘-Desoxy-xylo-guanosins 32.[63]
Die Schutzgruppenstrategie bei der Oligonucleotidsynthese wurde bereits in Abschnitt 2.4 ausführlich dargestellt. Als Schutzgruppe für die exocyclische Aminofunktion der Nucleobase wurde an dieser Stelle anstatt der für Guanin am häufigsten verwendeten Isobutyrylgruppe die Formamidingruppe eingesetzt. Zum einen sind die Abspaltungszeiten der Formamidingruppe mit Ammoniak bei Raumtemperatur mit 16 Stunden deutlich kürzer als die der Isobutyrylgruppe (36 Stunden).[64] Zum anderen bietet sie bei der Schützung der Nucleobase den synthetischen Vorteil, dass N,N-Dimethylformamiddiethylacetal (DMF-DEA) selektiv mit der Aminogruppe reagiert und somit die Hydroxylgruppen nicht, wie bei der Reaktion mit Isobuttersäureanhydrid, zuvor blockiert werden müssen. Als Schutzgruppe für die 5‘-Hydroxylgruppe wurde zunächst die stabilere Monomethoxytritylgruppe, analog zu der in Abschnitt 2.5 beschriebenen Syntheseroute des 2’-Desoxy-3‘-thioadenosin-Bausteins 12, verwendet und die Reaktionsbedingungen anschließend auf die reaktivere Dimethoxytrityl-gruppe übertragen. Damit der Schwefel in einer nucleophilen Substitutionsreaktion eingeführt werden kann, wurde zudem die 3‘-Hydroxylgruppe durch Mesylierung in eine gute Abgangsgruppe umgewandelt.
Die Reaktionsabfolge zur Darstellung des N2 -Dimethylformamidin-3’-O-methansulfonyl-5’-O-(4-methoxytrityl)-2'-desoxy-xylo-guanosins 33 ist in Abb. 20 dargestellt. Im ersten Schritt erfolgte die Umsetzung von 2‘-Desoxy-xylo-guanosin 32 mit DMF-DEA. Nach chromatographischer Reinigung wurde N2-Dimethylformamidin-2'-desoxy-xylo-guanosin 34 in einer Ausbeute von 76% erhalten. Die für diese Reaktion vergleichsweise niedrige Ausbeute
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ist auf die geringe Löslichkeit des Produkts zurückzuführen, was zu Verlusten bei der Chromatographie führte. Anschließend wurde N2 -Dimethylformamidin-2'-desoxy-xylo-guanosin 34 durch Zugabe von 4-Methoxytritylchlorid zum MMTr-geschützten Nucleosid 35 umgesetzt. Nach säulenchromatographischer Reinigung, bei der sich ein geringer Prozentsatz, trotz Zusatz von Triethylamin zum Laufmittel, aufgrund der Säurelabilität des Produkts zersetzte, wurde N2 -Dimethylformamidin-5’-O-(4-methoxytrityl)-2'-desoxy-xylo-guanosin 35 in einer Ausbeute von 72% erhalten.
Abb. 20: Synthese des N2
-Dimethylformamidin-3’-O-methansulfonyl-5’-O-(4-methoxytrityl)-2'-desoxy-xylo-guanosins 33.
Die Mesylierung stellte den schwierigsten Schritt bei dieser Route dar. Zunächst wurde nach der Zugabe von Methansulfonylchlorid bei 4 °C nur eine Zersetzung zu einer Vielzahl undefinierbarer Produkte beobachtet. Durch eine Reduzierung der Temperatur bei der Zugabe des Methansulfonylchlorids von 4 °C auf -20 °C konnte die Ausbeute auf 64% gesteigert werden. Beim Upscalen des Reaktionsansatzes auf Grammmaßstab reduzierte sich die Ausbeute etwas auf 50%. Die Probleme bei der Mesylierung des geschützten 2‘-Desoxy-xylo-guanosins wurden ebenfalls von PIPERAKIS beobachtet.[55] Die Gründe für die unerwünschte Zersetzung des Edukts 35 unter den Reaktionsbedingungen sind nicht bekannt.
Analog zu den beschriebenen Synthesen wurde N2 -Dimethylformamidin-2'-desoxy-xylo-guanosin 34 zum DMTr-geschützten Nucleosid 36 und anschließend mit Methansulfonylchlorid zu N2 -Dimethylformamidin-3’-O-methansulfonyl-5’-O-(4,4’-dimethoxy-trityl)-2'-desoxy-xylo-guanosin 37 umgesetzt (Abb. 21). Die Ausbeuten von 65% und 55% lagen im gleichen Bereich wie die Ausbeuten der entsprechenden MMTr-Synthesen.
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Abb. 21: Synthese des N2 -Dimethylformamidin-3’-O-methansulfonyl-5’-O-(4,4’-dimethoxytrityl)-2'-desoxy-xylo-guanosins 37.
Alle in dieser Arbeit synthetisierten 5‘-DMTr-geschützten Nucleoside wurden mittels zirkulärer, präparativer Dünnschichtchromatographie am Chromatotron gereinigt. Mit der üblichen Säulenchromatographie mit Kieselgel musste, um eine Abspaltung der DMTr-Gruppe zu verhindern, Triethylamin zum Laufmittel zugesetzt werden (0.5% v/v). Im anschließenden 1H-NMR-Spektrum der gereinigten Verbindung wurden jedoch immer signifikante Mengen an Triethylammoniumsalz-Verunreinigungen beobachtet. Am Chromatotron dagegen wurden die Platten mit einem Laufmittel mit 0.5% Triethylamin-Zusatz äquilibriert. Dem Laufmittel zur Trennung des Substanzgemischs wurde kein Triethylamin zugesetzt. Mit dieser Methode konnte eine Abspaltung der Tritylgruppe während der Reinigung verhindert und eine Verunreinigung der Verbindung mit Triethylammonium-salzen ausgeschlossen werden.
Über den Weg der [1,2]-Hydridumlagerung, der anschließenden Schützung der funktionellen Gruppen und Mesylierung der 3‘-Hydroxylgruppe konnte der benötigte xylo-Baustein 37 erfolgreich dargestellt werden. Aufgrund der zeitintensiven Aufarbeitung der [1,2]-Hydrid-umlagerung und der geringen Ausbeute bei der Mesylierung bestand allerdings der Bedarf an Optimierung, weswegen weitere Alternativen untersucht wurden.
Während der Anfertigung dieser Arbeit veröffentlichte PIPERAKIS eine Syntheseroute zum 2’-Desoxy-3‘-thioguanosin-Synthesebaustein,[1] welche bereits in Abschnitt 2.5 vorgestellt
wurde. Hierbei wird zur Inversion der 3‘-Hydroxylgruppe das Oxidations-Reduktions-Protokoll von EISENHUTH und RICHERT verwendet.[60] Als Schutzgruppen werden die Isobutyrylgruppe und, aufgrund der deutlich besseren Ausbeuten bei der Inversion, die tert-Butyldimethylsilylgruppe verwendet (Abschnitt 2.5). Bei Verwendung von Tritylschutzgruppen werden diese beim Oxidationsschritt teilweise abgespalten, was zur Reduzierung der Ausbeute führt.[60] Um eine hohe Vergleichbarkeit der eigenen Ergebnisse mit den Referenzsynthesen zu gewährleisten, wurden die gleichen Schutzgruppen verwendet. Zusätzlich wurden die Reaktionen mit der in dieser Arbeit favorisierten Formamidin- anstatt der Isobutyrylgruppe durchgeführt.
Die Darstellung des N2-Isobutyryl-5’-O-tert-butyldimethylsilyl-2'-desoxyguanosins 21 ist in Abb. 22 dargestellt. Es wurde von 2‘-Desoxyguanosin 19 ausgegangen. Die freien Hydroxylgruppen wurden zunächst mit Trimethylsilylchlorid silyliert, um Nebenreaktionen zu
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