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Teil II: Fluoreszierende Nucleotid-Prodrugs für Zellaufnahmestudien

8 Resultate und Diskussion

8.8 Zellaufnahmestudien mit fluoreszierenden Prodrugs

8.8.1 Zellaufnahmestudien mit dem 3-Me-cycloSal-6-H-ddBCNAMP 89

Die Inkubationen der CEM-Zellen mit den verschiedenen Prodrugs wurden in Zusammenarbeit mit ILONA HAUBER am Heinrich-Pette-Institut, Leibniz-Institut für Experimentelle Virologie, durchgeführt. Bei den von PERTENBREITER durchgeführten Zellaufnahmestudien wurden Inkubationszeiten von 2 Stunden bzw. 6 Stunden und eine Konzentration des jeweiligen Prodrugs in der Inkubationslösung von 100 µM bzw. 200 µM verwendet. GOLLNEST konnte mit Inkubationszeiten von 1 Stunde bzw. 3 Stunden und jeweils einer Konzentration der TriPPPro-Verbindung 97 von 100 µM gute Ergebnisse erzielen.

Für die Zellaufnahmestudien mit dem 3-Me-cycloSal-6-H-ddBCNAMP 89 wurde eine Inkubationszeit von 6 Stunden und eine Konzentration des Prodrugs in der Inkubations-lösung von 100 µM gewählt. Das Monophosphat-Prodrug 89 hat in CEM-Zellextrakt eine Hydrolysehalbwertszeit von 15 Stunden[135] und somit sollte nach 6 Stunden bereits eine detektierbare Menge des Monophosphats 126 gebildet worden sein. Die Inkubation und Aufarbeitung der Zellen wurde nach dem am Anfang dieses Kapitels (Abschnitt 8.8) beschriebenen Protokoll durchgeführt. Von PERTENBREITER wurde für die in dieser Arbeit verwendeten BCNAs eine optimale Anregungswellenlänge von 340 nm und eine maximale Emissionswellenlänge von 410 nm bestimmt,[135] weshalb diese Einstellungen bei der Fluoreszenzdetektion verwendet wurden.

Das mit dem Zelllysat mittels Fluoreszenzdetektion erhaltene Chromatogramm ist in Abb. 137 dargestellt. Da als hoch polare Verbindung nur das 6-H-ddBCNA-Monophosphat 126 erwartet wurde, wurde als Laufmittel ein Gradient aus Wasser und Acetonitril (Methode F) ohne Zusatz von Ionenpaarreagenzien verwendet. Mit diesem Laufmittelgemisch zeigen Nucleotide keine nennenswerte Retention bei der RP-Chromatographie und eluieren somit mit der Laufmittelfront. Im Chromatogramm sind deutliche Signale zu sehen, was für eine Zellaufnahme von BCNA-Verbindungen spricht. Durch die Messung einer Blindprobe, bei der der Inkubationslösung DMSO anstatt des Prodrugs zugesetzt wurde, konnte ausgeschlossen werden, dass es sich bei den Signalen um Zellbestandteile handelt. Tatsächlich konnte durch Coinjektion das Signal bei 13.4 Minuten dem 3-Me-cycloSal-6-H-ddBCNAMP 89 zugeordnet werden. Zudem wurde die erfolgreiche Freisetzung des gewünschten Monophosphats 126 und die Bildung des Nucleosids 115 beobachtet. Die Entstehung des Nucleosids ist vermutlich auf Dephosphorylierung des Monophosphats 126 durch

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Phosphatasen zurückzuführen. Welche Verbindung bei 9.7 Minuten eluierte, konnte nicht ermittelt werden. Die Vermutung, dass es sich dabei um die Nucleobase handelt, konnte nicht bestätigt werden.

Abb. 137: Ergebnisse der Zellaufnahmestudien des 3-Me-cycloSal-6-H-ddBCNAMPs 89 (Konzentration des Prodrugs in der Inkubationslösung: 100 µM, Inkubationszeit: 6 h,

HPLC-Methode F, λex = 340 nm, λem = 410 nm).

Um zu ermitteln, ob der Peak bei 1.8 Minuten wirklich nur das 6-H-ddBCNAMP 126 ist, wurde die Probe erneut mittels RP-HPLC untersucht und diesmal eine Tetrabutylammonium-phosphat-Lösung als Laufpuffer verwendet. Mit Ionenpaarreagenzien werden geladene Moleküle zu späteren Retentionszeiten verschoben und können damit besser, aufgrund ihrer Retentionszeit, zugeordnet werden. Der verwendete Laufpuffer verursachte jedoch einen starken Untergrund. Das erhaltene Chromatogramm ist in Abb. 138 dargestellt. Bei den Signalen bei 8 - 9, 15 und 18 Minuten handelt es sich um Puffersignale. Die Ursache hierfür konnte nicht geklärt werden. Trotz des starken Untergrunds konnten durch Coinjektion die Signale des Prodrugs 89, des Monophosphats 126 und des Nucleosids zugeordnet werden.

Allerdings ist tatsächlich nur ein Anteil des Signals bei 1.8 Minuten des in Abb. 137 dargestellten Chromatogramms das Monophosphat. Die Hauptkomponente des Signals, die im zweiten Chromatogramm eine Retentionszeit von 5.9 Minuten aufweist, konnte nicht identifiziert werden, jedoch muss von einer unerwünschten Metabolisierung ausgegangen werden. Das Signal bei 1.4 Minuten ist das bei der Synthese des 6-H-ddBCNAMP 126 (Abschnitt 8.3) erhaltene Zersetzungsprodukt. Nichtsdestotrotz konnte intrazellulär 6-H-ddBCNAMP 126 nachgewiesen werden, was die Zellaufnahme des Prodrugs 89 und die zumindest teilweise erfolgreiche intrazelluläre Freisetzung des Monophosphats 126 bestätigt.

BCNAMP 126

3-Me-cycloSal-6-H-ddBCNAMP 89 BCNA 115

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Abb. 138: Ergebnisse der Zellaufnahmestudien des 3-Me-cycloSal-6-H-ddBCNAMPs 89 (Konzentration des Prodrugs in der Inkubationslösung: 100 µM, Inkubationszeit: 6 h,

HPLC-Methode G, λex = 340 nm, λem = 410 nm).

Damit die Zellaufnahmestudien im Konzentrationsbereich liegen, mit denen die antiviralen Tests durchgeführt werden, wurde die Konzentration des Monophosphat-Prodrugs 89 in der Inkubationslösung von 100 µM auf 10 µM reduziert. Ein weiterer Grund für die Reduzierung der Konzentration war, dass der CC50-Wert des cycloSal-Prodrugs 89 in CEM-Zellen bei 112 µM[135] und damit nur leicht über der verwendeten Konzentration liegt und bei der Inkubation mit dem Prodrug ein verlangsamtes Zellwachstum beobachtet wurde. Es ist nicht auszuschließen, dass mit der hohen Konzentration auch weitere zelluläre Prozesse unbeabsichtigt negativ beeinflusst werden. Zudem wurde die Inkubationszeit auf 15 Minuten bzw. 60 Minuten reduziert. Weiterhin wurde, um einen Vergleich der Aufnahme der verschiedenen Prodrugs möglich zu machen, der Inkubationslösung als internen Standard Cf1743 100 zugesetzt. Es wurde zuvor geprüft, dass es zu keiner Überlagerung des Nucleosids 100 mit den Prodrugs oder deren Metaboliten kommt. Durch die zusätzliche Durchführung der Zellaufnahmestudien ohne internen Standard, konnte ein Einfluss des Cf1743 100 auf die Aufnahme der Prodrugs ausgeschlossen werden.

Auch wurde versucht, durch Änderung des Laufpuffers auf Tetrabutylammoniumacetat, eine Verminderung der Untergrundsignale zu erreichen. Das beste Ergebnis wurde erzielt, wenn Tetra-n-butylammoniumhydroxid (40% in H2O) von Sigma-Aldrich (Produktnr.: 86854) zum Ansetzen des Puffers verwendet und der Puffer vor der Verwendung für mindestens 24 Stunden gelagert wurde. Zudem war es zwingend erforderlich, die Äquilibrierungszeit der HPLC-Säule auf das Anfangsverhältnis des Laufmittels zu minimieren. Mit steigender Äquilibrierungszeit erhöhte sich die Intensität der Puffersignale um ein Vielfaches.

BCNAMP 126

3-Me-cycloSal-6-H-ddBCNAMP 89 BCNA 115

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Die Chromatogramme der Inkubationslösungen und der Zelllysate sind in Abb. 139 dargestellt. In der Inkubationslösung, also im extrazellulären Medium, konnte 3-Me-cycloSal-6-H-ddBCNAMP 89, neben dem internen Standard (Cf1743 100), detektiert werden. Das Signal bei 1.2 Minuten konnte nicht zugeordnet werden. Es ist jedoch zu vermuten, dass es dem Kulturmedium zuzuordnen ist, da das Signal auch bei den Zellaufnahmestudien mit den monomaskierten Prodrugs 103 und 105 (Abschnitt 8.8.4 und 8.8.6) beobachtet wurde.

Intrazellulär konnte dagegen aufgrund der geringen Intensitäten und der erwähnten Puffersignalprobleme nur eindeutig der interne Standard identifiziert werden. Die Verschiebung der Retentionszeiten ist auf gerätebedingte Schwankungen zurückzuführen.

Abb. 139: Ergebnisse der Zellaufnahmestudien des 3-Me-cycloSal-6-H-ddBCNAMPs 89 (Konzentration des Prodrugs in der Inkubationslösung: 10 µM, HPLC-Methode G, λex = 340 nm, λem =

410 nm).

Somit ist möglicherweise die maximale Inkubationszeit von 60 Minuten zu kurz gewählt, um signifikante Mengen des Monophosphats detektieren zu können. Allerdings ist die geringe Intensität des detektierten Monophosphat-Prodrugs 89 im Vergleich zum internen Standard überraschend, was für eine Zersetzung des Prodrugs 89 oder des freigesetzten Monophosphats 126 zu nicht fluoreszierenden Verbindungen spricht. Die geringe Stabilität des 6-H-ddBCNAMPs 126 wurde schon bei der Synthese der Verbindung beobachtet (Abschnitt 8.3). Es wäre sinnvoll, Zellaufnahmestudien mit dem 3-Me-cycloSal-Prodrug des 6-Propyl-substituierten ddBCNAs 116 durchzuführen, um das Ergebnis besser einordnen zu können. Mit dem 6-Prop-ddBCNA 116 konnten mit den entsprechenden DiPPro- und TriPPPro-Verbindungen sehr gute Ergebnisse erzielt werden (Abschnitt 8.8.2 - 8.8.6).

3-Me-cycloSal-6-H-ddBCNAMP 89

Cf1743 100

Cf1743 100

intrazellulär intrazellulär

extrazellulär extrazellulär

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