Aus dem Department Innere Medizin
Klinik für Rheumatologie und klinische Immunologie des Universitätsklinikums Freiburg i. Br.
Analyse der Antikörper-Glykosylierung bei Patienten mit rheumatoider Arthritis
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der
Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br.
vorgelegt 2017
von Dorothee Angelika Prüsse, geb. Zoll geboren in Speyer
Dekanin: Prof. Dr. Kerstin Krieglstein 1. Gutachter: Prof. Dr. Reinhard E. Voll 2. Gutachterin: PD Dr. Alexandra Nieters Jahr der Promotion: 2017
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 8
1.1 Rheumatoide Arthritis ... 8
1.1.1 Epidemiologie ... 8
1.1.2 Risikofaktoren ... 8
1.1.3 Ätiologie und Pathogenese ... 10
1.1.4 Klinisches Bild ... 11
1.1.5 Diagnostik ... 12
1.1.6 Therapie ... 13
1.1.7 Einteilung der Erkrankung mittels RA-spezifischer AK ... 16
1.2 Citrullinierung als posttranslationale Veränderung der RA ... 17
1.2.1 Citrullinierung ... 17
1.2.2 Autoreaktives Potential von ACPAs ... 18
1.2.3 ACPA-Glykosylierung ... 19
1.3 Unterschiedliche Effektorfunktionen von IgG-AK ... 19
1.3.1 Einfluss der FcγRezeptoren ... 20
1.3.2 Einfluss der Glykosylierungen ... 21
1.4 Ziel der Arbeit ... 24
2 Material und Methoden ... 25
2.1 Erstellen einer Access-Datenbank ... 25
2.2 Patientenauswahl ... 25
2.2.1 Ersteinschluss ... 25
2.2.2 Folgevisite ... 26
2.2.3 Auswahl der Patienten für den Lektin-ELISA ... 27
2.3 Probengewinnung und -lagerung ... 28
2.4 Lektin-ELISA für Gesamt-IgG ... 28
2.5 Statistische Methoden ... 29
3 Ergebnisse ... 32
3.1 Ersteinschluss ... 32
3.1.1 Basisdaten ... 32
3.1.2 RF- und ACPA-Positivität ... 36
3.1.3 Aktivitätsparameter und knöcherne Erosionen ... 37
3.1.4 ANA-Titer und Vitamin D ... 41
3.1.5 Medikamente ... 42
3.1.6 Extraartikuläre Manifestationen ... 43
3.2 Vergleich zwischen Ersteinschluss und Folgevisite ... 44
3.2.1 ACPA-positive Patienten ... 45
3.2.2 ACPA-negative Patienten ... 50
3.3 Ergebnisse des Lektin-ELISAs für Gesamt-IgG ... 54
3.3.1 ELISA-Ergebnisse der ACPA-positiven Patienten ... 55
3.3.2 ELISA-Ergebnisse der ACPA-negativen Patienten ... 58
3.3.3 Vergleich der ELISA-Ergebnisse ACPA-positiv versus ACPA-negativ ... 60
3.4 Verknüpfung von Labor- und Datenbankergebnissen ... 63
3.4.1 Korrelation der Sialylierung des Gesamt-IgGs mit klinischen Parametern . 64
3.4.2 Auswertungen innerhalb von Medikamentengruppen ... 67
4 Diskussion ... 72
5 Zusammenfassung ... 88
6 Verzeichnisse ... 89
6.1 Abbildungsverzeichnis ... 89
6.2 Tabellenverzeichnis ... 91
6.3 Abkürzungsverzeichnis ... 92
7 Literatur ... 94
8 Anhang ... 103
8.1 Fragebögen (HAQ, DAS28) und Patienten-Einwilligungserklärung ... 103
8.2 RA-Diagnosekriterien ... 104
8.3 Spearman-Korrelation beider Durchgänge des Lektin-ELISAs ... 106
8.4 Rohdaten Differenzen ... 108
8.5 Bildschirmfotos der Access-Datenbank ... 109
8.6 Eidesstattliche Versicherung ... 111
9 Danksagung ... 112
Einleitung
8
1 Einleitung
1.1 Rheumatoide Arthritis
Die rheumatoide Arthritis (RA) ist eine chronische Multisystemerkrankung, bei der eine persistierende, entzündliche Synovitis im Mittelpunkt steht. Hierbei sind vor allem die peripheren Gelenke in symmetrischer Verteilung betroffen. Die Synovitis führt im Verlauf der Erkrankung zu Knorpelschäden und Knochenerosionen mit konsekutiven Gelenkdeformitäten (Song & Sieper, 2008).
1.1.1 Epidemiologie
Die Prävalenz beträgt circa 0,8% der Bevölkerung (0,3-2,1%), wobei Frauen dreimal häufiger betroffen sind als Männer. Die Prävalenz steigt mit dem Alter während sich die Geschlechterdifferenz mit zunehmendem Alter verringert. Der Erkrankungsgipfel liegt zwischen dem viertem und fünftem Lebensjahrzehnt (Song & Sieper, 2008). Die Inzidenz scheint in den letzten Jahrzehnten abzunehmen, insbesondere bei den weiblichen Patienten.
Sie lag zwischen 1955 und 1995 bei 44,6/100000 Einwohnern in Rochester, Minnesota (Doran, Pond, Crowson, O'Fallon, & Gabriel, 2002). Mögliche Erklärungen hierfür sind einmal der vermehrte Einsatz von oralen Kontrazeptiva, der einen hormonellen Einfluss auf die Krankheitsentstehung haben könnte. Eine weitere Hypothese ist, dass durch das Aufkommen neuer Therapiemöglichkeiten das Fortschreiten der Erkrankung so stark aufgehalten wird, dass einige zu den RA-Diagnosekriterien gehörigen Befunde wie Rheumaknoten und Knochenerosionen nicht mehr auftreten. Durch die neuen Medikamente könnte das Fortschreiten der Erkrankung aufgehalten werden, sodass insgesamt weniger Neuerkrankungen diagnostiziert werden (Symmons, 2002).
1.1.2 Risikofaktoren
Als Risikofaktoren lassen sich genetische Faktoren von Umweltfaktoren unterscheiden.
Familienuntersuchungen zeigen, dass das Konkordanzrisiko für monozygote Zwillinge bei 15 Prozent liegt. Dies bedeutet, dass das Erkrankungsrisiko bei identischer DNA mehr als 18-fach erhöht ist. Trotzdem erkrankt bei 85 Prozent der monozygoten Zwillinge nur einer der beiden Zwillinge. Dies legt die Überlegung nahe, dass weder Genetik noch Risikofaktoren alleine für das Auftreten der Erkrankung verantwortlich sind, sondern vielmehr das Zusammenspiel dieser beiden Faktoren. Es besteht ein großer Einfluss von Umweltfaktoren,
Einleitung
9 zu denen Alter, Geschlecht, hormonelle Faktoren, Infektionen, Traumata und sogenannte Lifestyle-Faktoren, wie Rauchen und Übergewicht zählen (Klareskog, Padyukov, &
Alfredsson, 2007; Symmons, 2002).
Schon 1978 entdeckte Statsny, dass ein Zusammenhang zwischen den Klasse-II- Haupthistokompatibilitätskomplex-Allelen HLA-DR4 (laut neuer Nomenklatur HLA-DRB1) und RA besteht. In Studien wurde gezeigt, dass 70 Prozent der RA-Patienten HLA-DRB1 exprimieren, im Vergleich zu 28 Prozent der gesunden Kontrollpersonen (Stastny, 1978).
Besonders bei Patienten mit AK gegen citrullinierte Peptide (Anti citrullinated peptide antibodies, ACPA) ist dieser Zusammenhang stark ausgeprägt (Song & Sieper, 2008). Eines der Gene auf diesem Gen-Locus kodiert für ein Enzym (Peptidylarginindeiminase I4, PADI4), das citrullinierte Peptide bildet (Suzuki et al., 2003). Es gibt außerdem ein weiteres Gen, bei dessen Genvarianten es vermehrt zu ACPA-positiver RA kommt. Dabei handelt es sich um das Gen der Protein-Tyrosin-Phosphatase PTPN22. Sowohl HLA-DRB1 als auch PTPN22 haben Funktionen im erworbenen Immunsystem. Die HLA-DRB1-Allele, die mit der RA assoziiert sind, werden auch als „shared epitope“ (SE) bezeichnet.
Es gibt aber wahrscheinlich auch nicht-genetische Ursachen für die Entstehung von ACPAs.
Interessanterweise dürften zwei davon ihren Ursprung nicht in Gelenknähe, sondern im Gastrointestinaltrakt und in der Lunge haben.
Bei erstgenanntem handelt es sich um eine Entzündung des Zahnhalteapparates, Periodontitis, die durch Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) ausgelöst wird. Dieses Bakterium besitzt eine bakterielle Peptidylarginindeiminase (PAD), die durch Deiminierung eines Arginis zu Citrullin führt (siehe unten). Dadurch kommt es vermehrt zu citrullinierten Peptiden, die Antigene für ACPAs darstellen. Es wurde gezeigt, dass Periodontitis zu erhöhten ACPA-Spiegeln führt.
Bei zweitgenanntem handelt es sich um die bereits erwähnte Tatsache, dass Zigarettenrauch der „Haupt-Umwelt-Risikofaktor“ (major environmental risk factor) für eine RA ist. Nun wurde gezeigt, dass in den Lungen von Rauchern auch erhöhte ACPA-Spiegel vorhanden sind. Dies scheint besonders dann der Fall zu sein, wenn zusätzlich zur Exposition mit Zigarettenrauch eine genetische Veranlagung im Sinne der HLA-DRB1-SE-Allele vorliegt (Lappin et al., 2013; Perry, Kelly, Eggleton, De Soyza, & Hutchinson, 2014).
Zudem scheint es einen weiteren Umweltrisikofaktor für RA zu geben. Laut einiger Studien wurde ein Zusammenhang zwischen Vitamin D und rheumatischen Erkrankungen beobachtet (Merlino et al., 2004). Es wäre möglich, dass Vitamin-D-Mangel das Risiko für die Entwicklung einer RA erhöht.
Einleitung
10 1.1.3 Ätiologie und Pathogenese
Noch immer ist keine eindeutige Ursache für die RA bekannt. Es gibt Theorien, laut derer als Ursache die Reaktion eines genetisch anfälligen Wirtes auf ein infektiöses Agens diskutiert wird. Da die rheumatoide Arthritis weltweit vorkommt, müsste es sich hierbei um einen ubiquitär vorkommenden Mikroorganismus handeln. Wie durch dieses infektiöse Agens eine chronisch entzündliche Arthritis ausgelöst werden könnte, ist bisher unklar (Song & Sieper, 2008).
Im Folgenden wird zunächst die Pathogenese der Synovitis und anschließend die Pathogenese der Knorpel- und Knochendestruktion besprochen.
Die ersten Läsionen der RA-Synovitis zeigen sich als mikrovaskuläre Schädigung im Synovium. Es wird eine Hyperplasie und Hypertrophie der Synovialdeckzellen beobachtet, welche als sogenannte „lining cells“ in der Lichtmikroskopie imponieren (Stanford et al., 2015). Schon vor Ausbruch der Erkrankung gibt es ein perivaskuläres Infiltrat aus myeolischen Zellen. Ab dem Stadium der klinisch manifesten Arthritis dominieren CD4-positive T-Lymphozyten das Zellbild. Durch aktivierte Mastzellen kommt es zur Degranulation der Mastzellgranula, welche ebenfalls die Entzündung in Gang halten. Die synovialen Fibroblasten sezernieren in ihrem aktivierten Zustand Matrix-abbauende Enzyme wie Kollagenase und Kathepsine. So steuern viele verschiedene Zellen den Krankheitsprozess durch Sekretion von Chemokinen und Zytokinen (Song & Sieper, 2008) . Die Unterhaltung des Krankheitsprozesses ist also immunologischer Natur, auch wenn der auslösende Faktor weiter nicht bekannt ist. Es wird angenommen, dass die Aufrechterhaltung der Entzündung durch CD4-positive T-Lymphozyten geschieht. Dafür spricht erstens die Prädominanz dieser Zellart im Synovium. Zweitens wird sowohl im Blut, als auch in der Synovialflüssigkeit, vermehrt der von diesen Zellen produzierte lösliche IL-2-Rezeptor gefunden. Des Weiteren wird eine Senkung der Krankheitsaktivität beobachtet, wenn es zur Verringerung der T-Lymphozyten kommt. Dies ist entweder durch Drainage des Ductus thoracicus oder durch periphere Lymphapharese möglich. Auch Medikamente, die zur Suppression der Proliferation oder Funktion der T-Zellen führen (Leflunomid, Ciclosporin), haben diesen Effekt. Das Biologikum Abatacept (CTLA-Ig) inhibiert die T-Zell-Aktivierung, indem es als T-Zell-Kostimulationskompetitor wirkt und somit zur Reduktion der Krankheitsaktivität führt. Die CD4-positiven T-Lymphozyten differenzieren sich zu T-Helferzellen Typ 1 (TH1-Zellen), welche das proinflammatorische IFN-γ sezernieren. Differenzierten sie sich hingegen zu T-Helferzellen Typ 2 (TH2-Zellen), käme es zur Sekretion des antiinflammatorischen IL-4. Durch IFN-γ kommt es zur Makrophagenaktivierung, welche
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11 ebenfalls proinflammatorische Substanzen wie TNF-α und IL-1 sezernieren (Raza et al., 2005; Song & Sieper, 2008). Die T-Zellen, welche CD154 exprimieren, produzieren außerdem Chemokine, die zur B-Zell-Aktivierung führen. Die B-Zellen werden zu Plasmazellen und bilden Immunglobuline und Rheumafaktor. Dieser führt zur Bildung von Immunkomplexen und zur Komplementaktivierung. Die Rolle der B-Lymphozyten am Entzündungsprozess zeigt sich bei Patienten, die mit Rituximab (monoklonaler AK gegen B-Zell-Marker CD20) behandelt wurden: Hier kommt es in Folge von einer Depletion der B-Lymphozyten zur Verminderung des Titers an Rheumafaktor und zur Besserung der Entzündungssymptome (Fillatreau, 2015; Song & Sieper, 2008).
Das wuchernde synoviale Gewebe, auch als Pannus bezeichnet, breitet sich über den Gelenkknorpel aus und initiiert so die Pathogenese der Knorpel- und Knochendestruktion.
Der Pannus ist ein gefäßreiches Granulationsgewebe, welches proliferierende Fibroblasten besitzt. Die Fibroblasten sind durch IL-1 und TNF stimuliert und produzieren Kollagenase und Stromelysin. Gemeinsam mit IL-6 führen diese Moleküle zur Aktivierung von Osteoklasten. Diese Zellen demineralisieren den Knochen und führen zu den Erosionen im Knochen (Song & Sieper, 2008).
1.1.4 Klinisches Bild
Die RA ist klassischerweise eine chronische Polyarthritis. Der Beginn ist bei circa 60 Prozent schleichend und geht mit Allgemeinsymptomen wie Abgeschlagenheit, Anorexie und undifferenzierten muskuloskelettalen Beschwerden einher. Durch diese Prodromi kann sich die Diagnosestellung verzögern, bevor Zeichen der Synovitis auf eine RA hinweisen.
Typischerweise besteht ein symmetrischer Befall mehrere Gelenke, meist der Finger-, Hand-, Knie- Zehen- und Fußgelenke. Der Schmerz ist das führende Symptom der klinisch manifesten RA, meist begleitet von einer sogenannten Morgensteifigkeit. Darunter wird die Schwierigkeit verstanden, die betroffenen Gelenke morgens nach dem Aufstehen oder nach längerem Verharren ein einer bestimmten Position zu bewegen (Lineker, Badley, Charles, Hart, & Streiner, 1999). Wie der Begriff vorwegnimmt, ist die Morgensteifigkeit zu Tagesbeginn am stärksten ausgeprägt. Dies liegt daran, dass nachts und in den frühen Morgenstunden der endogene Steroidspiegel am niedrigsten ist. Entgegengesetzt den niedrigen Spiegeln an Steroiden, scheint durch eine Änderung des zirkadianen Rhythmus das Epiphysenhormon Melatonin erhöht zu sein, welches einen proinflammatorischen Einfluss auf die zeitabhängige Entzündungsreaktion bei RA hat (Cutolo et al., 2005). Durch die Synovitis kommt es zu Schwellung, Druckschmerzhaftigkeit und Bewegungseinschränkung
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12 der betroffenen Gelenke. Am häufigsten sind die proximalen Interphalangealgelenke (PIP) und Metakarpophalangealgelenke (MCP) betroffen, während die distalen Interphalangealgelenke (DIP) meist ausgespart sind. Durch die persistierende Entzündung kann es zu typischen Deformitäten wie Ulnardeviation oder Z-Deformität, Schwanenhalsdeformität und Knopflochdeformität kommen (Song & Sieper, 2008).
Die RA ist eine systemische Erkrankung, bei der bis zu 40 Prozent der Betroffenen zusätzlich zu den Gelenkbeschwerden extraartikuläre Manifestationen aufweisen. Allgemein lässt sich sagen, dass diese gehäuft bei Patienten mit im Blut zirkulierendem Rheumafaktor (RF) oder ACPA auftreten. Es können hierbei Rheumaknoten, pleuropulmonale Manifestationen, eine rheumatoide Vaskulitis mit Polyneuropathie, sekundäres Sicca-Syndrom, ophthalmologische Manifestationen oder selten ein Felty-Syndrom mit Splenomegalie und Neutropenie auftreten (Carmona et al., 2003; Song & Sieper, 2008).
Außerdem haben Patienten mit RA ein erhöhtes kardiovaskuläres Risiko (Kramer & Giles, 2011).
1.1.5 Diagnostik
Zur Diagnosestellung der RA existiert kein einzelner diagnostischer Test, was die frühe Diagnosestellung erschwert (Visser, 2005). Deshalb müssen die Ergebnisse verschiedener Untersuchungen kombiniert werden, um die klinische Verdachtsdiagnose zu sichern. Diese beinhalten sowohl Anamnese, klinische Untersuchung, Labortests, als auch bildgebende Verfahren.
RA-Patienten weisen meist eine unspezifische Entzündungskonstellation im Blut auf, dazu gehören eine erhöhte Blutsenkungsgeschwindigkeit (BSG) und ein erhöhtes C reaktives Protein (CRP) (Sokka & Pincus, 2009). Spezifischere Labormethoden, um den Verdacht einer RA zu erhärten, sind der serologische Nachweis von Rheumafaktoren (RF) und ACPA.
Die Röntgenuntersuchung stellt weiterhin ein wichtiges Verfahren der bildgebenden Diagnostik dar. Typische erosive Veränderungen in den Prädilektionsgelenken können eine RA beweisen, dies ist in der Frühphase der Erkrankung allerdings sehr selten der Fall (Aletaha et al., 2010). Frühestens nach 6 bis 24 Monaten zeigen sich bei einer aggressiv-erosiv verlaufenden RA röntgenologisch sichtbare Erosionen. Das Fehlen röntgenologischer Erosionen schließt eine RA in der Frühphase nicht aus (Machold et al., 2002). Weitere bildgebende Verfahren wie die Gelenksonographie, Magnetresonanztomographie und Szintigraphie haben ebenfalls ihren festen Stellenwert in
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13 der Diagnostik und eignen sich besonders in der Frühphase zur Darstellung von Gelenkergüssen und Knochenstoffwechselstörungen (Hetland et al., 2009).
Die Klassifikationskriterien des American College of Rheumatology (ACR) wurden 1987 aufgestellt. Die ACR-Kriterien (siehe Anhang 8.2) haben eine Sensitivität von 91-94 Prozent und eine Spezifität von 89 Prozent (Arnett et al., 2005). Außerdem wurden 2010 speziell zur Frühdiagnostik neue EULAR/ACR-Kriterien entwickelt. Diese beinhalten lediglich die Anzahl der geschwollenen Gelenke, Positivität von RF und/oder ACPA und Dauer der Beschwerden. Damit soll eine frühere Therapie möglich gemacht werden, da in der Frühphase einige der pathologischen Veränderungen noch reversibel sind und mit einer frühen aggressiven Therapie abgewandt werden können. Sie haben eine höhere Sensitivität, aber eine niedrigere Spezifität als die ACR-Kriterien von 1987 (Aletaha et al., 2010).
1.1.6 Therapie
Die verschiedenen Therapiemöglichkeiten dienen alle dem Ziel, die Beschwerden der RA symptomatisch zu verbessern, es handelt sich nicht um eine kurative Behandlung. Zum Teil werden dabei unspezifisch die entzündlichen und immunologischen Prozesse der Erkrankung supprimiert. Durch den noch recht neuen Einsatz von Biologika wird versucht, gezielt in das Krankheitsgeschehen einzugreifen. Die Behandlungsziele der RA-Therapie sind Schmerzlinderung, Hemmung der Entzündungsaktivität und Erhalt der Gelenkfunktion. Auf lange Sicht sollen auch Verhinderung der Gelenkdestruktion und Vermeidung weiterer Organkomplikationen eine Rolle spielen (Song & Sieper, 2008). In Abbildung 1 ist ein Schema dargestellt, das als Entscheidungshilfe zur individuellen Therapie dient. Das Ansprechen auf die jeweilige Therapie sollte in drei- bis sechsmonatigen Abständen überprüft werden und dann je nach Ergebnis eine Therapieeskalation vorgenommen werden. Die Erfassung der Krankheitsaktivität und des Krankheitsverlaufs wird mit Hilfe des DAS28 (28 joint Disease Activity Score, siehe Anhang 8.1) und des HAQ (Health Assessment Questionnaire, siehe Anhang 8.1) vorgenommen. In den DAS28 fließen die Anzahl der druckschmerzhaften sowie die Anzahl der geschwollenen Gelenke ein, außerdem entweder BSG oder CRP und eine Zahl von eins bis zehn auf der visuellen analogen Schmerzskala (VAS), die die aktuellen Schmerzen verdeutlichen soll. Mittels einer Formel wird ein Wert für den DAS28 berechnet, dieser verdeutlicht die aktuelle Intensität der Krankheitsaktivität (gering, moderat, hoch) oder das Vorliegen einer Remission. Der HAQ ist ein standardisierter Fragebogen zur Funktionalität, der abfragt in wieweit die Tätigkeiten des täglichen Lebens
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14 noch selbstständig durchführbar sind. Er kann Werte zwischen eins und drei annehmen, je höher der Wert umso größer sind die Einschränkungen der Patienten im täglichen Leben.
Therapeutisches Ziel sollte eine Remission der Erkrankung sein (ACR-EULAR- Remissionskriterien im Anhang 8.2).
Zu Beginn der Erkrankung werden nicht-steroidalen Antiphlogistika (NSAID, nonsteroidal antiinflammatory drugs) und niedrig dosierte orale Glukokortikoide zur Therapie empfohlen, gleichzeitig soll aber eine Basistherapie begonnen werden. Bei den NSAID handelt es sich um Hemmer der Cyclooxygenase (COX). Es gibt eine Unterform, die Coxibe, welche selektiv die COX-2 hemmen und dadurch seltener gastrointestinale Nebenwirkungen wie Magenulcera verursachen (Bombardier et al., 2000). Allerdings konnte in Studien gezeigt werden, dass Coxibe mit einem erhöhtem kardiovaskulärem Risiko einhergehen (Solomon et al., 2008).
Dies kann speziell bei RA-Patienten ein Problem darstellen, da diese RA-bedingt ein erhöhtes kardiovaskuläres Risiko haben (s.o.). Naproxen, ein unselektives NSAID, kann bei RA- Patienten zum Einsatz kommen. Es hat einen protektiven Faktor auf die Koronargefäße, führt allerdings wie die anderen NSAIDs zu vermehrt gastrointestinalen Beschwerden (Bombardier et al., 2000). Deshalb sollte bei jedem Patienten individuell abgewogen werden, ob selektive COX-2-Hemmer oder unselektive NSAIDs zu empfehlen sind. Bei dem Einsatz von niedrig dosierten oralen Glukokortikoiden (< 7,5 mg/Tag) werden sich die entzündungshemmenden Eigenschaften von Steroiden zu Nutze gemacht. Außerdem wurde ein positiver Einfluss auf die Hemmung der Gelenkdestruktion nachgewiesen (Kirwan, Bijlsma, Boers, & Shea, 2007).
Häufig werden Steroide mit einer Substanz der zweiten Therapiestufe kombiniert.
Als zweites ist die Gruppe der krankheitsmodifizierenden Antirheumatika (disease-modifying anti-rheumatic drugs, DMARD) zu nennen. Sie zielen darauf ab, den Verlauf der Erkrankung positiv zu beeinflussen und nicht nur die Symptome zu lindern. Die im Folgenden aufgeführten Substanzen werden zu den „klassischen“ DMARDs gezählt, da auch Steroide und Biologika in das Krankheitsgeschehen eingreifen können und somit auch im weiteren Sinne als „DMARDs“ bezeichnet werden können. Methotrexat hat sich als Mittel der Wahl durchgesetzt, es werden auch Substanzen wie Sulfasalazin, (Hydroxy-)Chloroquin, Leflunomid eingesetzt. Azathioprin, Ciclosporin und Cyclophosphamid, Goldsalze und D-Penicillamin gelten als Reservesubstanzen. Da sie nur minimale direkt antientzündliche/analgetische Wirkung haben, sollten sie zumindest anfangs mit einem NSAID kombiniert werden. Häufig sind unter dieser Therapie auch die serologischen Entzündungsmarker (CRP, BSG, Rheumafaktor) rückläufig. Heute ist bewiesen, dass der frühe Einsatz dieser Medikamentengruppe einen wesentlichen Einfluss auf die Progression
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15 der Erkrankung im Sinne radiologisch nachweisbarer Erosionen hat. Es können verschiedene DMARD untereinander oder mit anderen Medikamentengruppen kombiniert werden (O'Dell, 2004; O'Dell et al., 1996).
Bei nicht-Erreichen des Therapieziels durch Mono- oder Kombinationstherapie mit klassischen DMARDs wird die Gruppe der Biologika eingesetzt. Es handelt sich hierbei um therapeutische AK, die Moleküle binden und somit direkt in das immunologische Geschehen eingreifen können. Die größte Gruppe stellen die Inhibitoren des Tumor-Nekrose-Faktors dar (TNF-Blocker). Dazu zählen die monoklonalen AK Adalimumab, Certolizumab, Infliximab, Golimumab sowie das Fusionsprotein Etanercept. TNF-Blocker bringen ihren größten Nutzen in Kombination mit Methotrexat. Ein weiterer Angriffspunkt der therapeutischen AK ist das Oberflächenprotein CD20. Rituximab bindet CD20 und führt so zu einer Depletion der B-Zellen (Edwards et al., 2004). Diese Therapie ist vor allem bei Patienten mit RF- und ACPA-positiver RA erfolgreich (McInnes & O'Dell, 2010). An anderer Stelle greift Anakinra, ein rekombinanter IL-1-Rezeptor-Antagonist, in das Krankheitsgeschehen ein und verhindert somit die Bindung der proinflammatorischen Interleukine IL-1α und IL-1β an ihren Rezeptor.
Vom Wirkmechanismus ähnlich, aber am IL-6-Rezeptor angreifend wirkt Tocilizumab.
Zuletzt ist noch Abatacept zu nennen, ein Fusionsprotein aus CTLA4 und dem Fc-Teil von IgG1, das die T-Zell-Aktivierung hemmt. Es wird vor allem bei Patienten angewandt, die nicht auf eine TNF-Blockade angesprochen haben (McInnes & O'Dell, 2010; O'Dell, 2004;
Song & Sieper, 2008).
Außerdem spielen bei der RA auch nicht-medikamentöse Behandlungsformen eine große Rolle. Zu nennen sind hier ausreichend Bewegung, Physiotherapie, eine ausgewogene Ernährung und alternative komplementärmedizinische Arzneimittel (Rao & Mihaliak, 1999).
Abbildung 1: Medikamentöse Therapie der RA
Die Behandlung beginnt bei gesicherter RA mit einem klassischen DMARD in Kombination mit NSAID und/oder Steroiden, bei Nicht-Erreichen des Therapie-Ziels werden Biologika hinzugegeben, auch hier kann ein Wechsel durchgeführt werden (modifiziert nach Zeitschrift für Rheumatologie, S1 Leitlinie: Medikamentöse Therapie der rheumatoide Arthritis, deutsche Gesellschaft für Rheumatologie e.V.)
• klassische DMARDs in Monotherapie oder Kombination (+/- NSAID +/- Steroide)
• 1. Biologikum (+/- klassisches DMARD +/- NSAID +/- Steroide)
• 2. Biologikum (+/- NSAID +/- Steroide)
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16 1.1.7 Einteilung der Erkrankung mittels RA-spezifischer AK
Bei 65-80 Prozent der RA-Patienten lassen sich Rheumafaktoren (RF) mittels ELISA-Testverfahren (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) nachweisen. Es handelt sich um AK gegen den Fc-Teil des humanen Immunglobulin-γ (IgG). Wird bei diesen Patienten eine RA diagnostiziert, werden diese auch als „seropositive“ RA-Patienten bezeichnet.
Patienten mit diagnostizierter RA und negativem RF zählen formal zur Gruppe seronegativer Patienten, auch bei ACPA-Positivität. Dies hat historische Gründe, da RF schon vor ACPAs zur Diagnostik der rheumatoiden Arthritis verwendet wurde. In dieser Arbeit wird auf die Unterteilung in „seropositiv“ und „seronegativ“ verzichtet, statt dessen unterscheiden wir zwischen RF-positiven und ACPA-positiven RA-Patienten. Die Spezifität von RF für RA- Patienten liegt bei 80%, die Sensitivität bei 70%. Allerdings können RF auch bei anderen rheumatologischen Erkrankungen auftreten (systemischer Lupus erythematodes (SLE), Sjögren-Syndrom) und auch bei der gesunden Bevölkerung lassen sie sich in fünf Prozent nachweisen, mit dem Lebensalter zunehmend (Saraux et al., 2002).
ACPAs haben eine ähnliche Sensitivität wie RF von 64-76%, ihr Vorteil diesen gegenüber ist aber eine höhere Spezifität von über 95% (Whiting et al., 2010). Das Vorhandensein von ACPAs kann mehrere Jahre vor Ausbruch einer manifesten RA ein früher und spezifischer Hinweis auf das mögliche Entwickeln einer RA sein. Der positive prädiktive Wert ist hoch mit einer Odds Ratio zwischen 58 und 8 (im Gegensatz Odds Ratio von RF zwischen 29 und 5,6) (Nishimura et al., 2007; Symmons, 2002). Rantapää-Dahlqvist et al. führten eine Fall-Kontroll-Studie in Schweden durch, mittels der getestet werden sollte, ob RA-Patienten auch schon vor Ausbruch der Erkrankung erhöhte ACPA-Werte vorwiesen. Die Patienten dieser Studie hatten vor Beginn der RA-typischen Symptome Blut gespendet. Mit diesen Seren wurde ein Anti-CCP-2-ELISA durchgeführt und die ACPA-Titer bestimmt. Die Sensitivität stieg von 4% neun Jahre vor Krankheitsausbruch auf 52% anderthalb Jahre vor Krankheitsausbruch mit einer gleich bleibenden Spezifität von 98% an (Rantapää-Dahlqvist et al., 2003).
Das Vorliegen von ACPAs und RF bei einer frühen RA spricht außerdem für einen schweren, erosiv-destruierenden Verlauf bei Fortschreiten der Erkrankung (Nishimura et al., 2007).
Seit 2010 sind RF und ACPAs auch in den neuen ACR/EULAR-Kriterien zur Diagnose einer frühen RA enthalten.
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17 1.2 Citrullinierung als posttranslationale Veränderung der RA
Posttranslationale Veränderungen sind Modifikationen von bestimmten Peptidsequenzen, die nach der Biosynthese in das Protein eingefügt werden (Schartl, Gessler, & Eckardstein, 2009).
In Kapitel 1.1 wurde schon mehrfach auf sogenannte ACPAs eingegangen. Dies sind AK, die citrullinierte Peptide binden. Bei der Citrullinierung handelt es sich um eine posttranslationale Veränderung, die im Folgenden näher beschrieben wird. Eine noch größere Rolle für diese Arbeit spielt allerdings eine weitere posttranslationale Veränderung: die Glykosylierung von Peptiden, also das Anheften von Kohlenhydratketten an bestehende Proteine. Alle AK sind Glykopeptide, die erst durch die Glykosylierung voll funktionsfähig sind (siehe 1.3).
1.2.1 Citrullinierung
Bei der Citrullinierung handelt es sich um eine Deiminierung der Aminosäure Arginin zu Citrullin (Abbildung 2). Dies geschieht durch ein calciumabhängiges Enzym, die Peptidylarginindeiminase (PAD). Es wurde außerdem ein neues AK-System unabhängig von RF und ACPAs entdeckt. Dabei handelt es sich um AK gegen carbamylierte Proteine (Anti- carP-AK). Anfangs wurde angenommen, dass diese Anti-carP-AK ebenfalls mittels CCP- ELISA erkannt würden. Dies war allerdings nicht der Fall. Das bedeutet, dass es sich hiermit um eine eigenständige Gruppe handelt, die es in Zukunft ermöglichen könnte, RA-Patienten noch weiter in Gruppen zu klassifizieren (Shi et al., 2011). Carbamylierung und Citrullinierung ähneln sich in vielerlei Hinsicht. Sowohl die Citrullinierung als auch die Carbamylierung sind posttranslationale Veränderungen von Aminosäuren. In beiden Fällen wird eine positiv geladene Aminosäure durch eine negativ geladene ersetzt. Dies sind physiologische Prozesse, die unter physiologischen und pathologischen Bedingungen stattfinden können. Es wird angenommen, dass auch Stress und Entzündung Trigger sein könnten, die diese posttranslationalen Veränderungen initiieren. Normalerweise sind sie für unser Immunsystem unsichtbar, da es sich um körpereigene Substanzen handelt. Bei der RA scheint unser Körper auf diese veränderten Proteine zu reagieren und es kommt zu einer Autoimmunreaktion im Sinne einer spezifischen T- und B-Zell-Antwort. Dies würde bedeuten, dass der Autoimmunität eine Kaskade immunologischer Veränderungen vorangeht, beginnend mit einer entzündungsinduzierenden Citrullinierung („inflammation-induced citrullination“) (Bax, Huizinga, & Toes, 2014).
Wie bereits in Abschnitt 1.1.2 erwähnt, findet Citrullinierung von Peptiden keineswegs nur in Gelenksnähe statt. Vielmehr scheint sich gerade die Initiierung dieses Vorgangs auch in der Lunge und der Mundhöhle abzuspielen (Mastrangelo et al., 2015; Perry et al., 2014).
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18
Abbildung 2 (Bax et al., 2014): Entstehung von Citrullin, mit freundlicher Genehmigung des Springer-Verlags Durch Deiminierung der körpereigenen Aminosäure Arginin durch das Ca2+abhängige Enzym Peptidylarginindeiminase (PAD) entsteht die nicht-proteinogene Aminosäure Citrullin
1.2.2 Autoreaktives Potential von ACPAs
Unter ACPA wird eine Gruppe von AKn zusammengefasst, die Epitope mit citrullinierten
„Resten“ binden. 2002 wurde der erste kommerzielle Test auf den Markt gebracht um ACPAs als Biomarker für die RA nachzuweisen, dabei handelte es sich um den CCP-ELISA. Deshalb wird diese Gruppe von AK auch häufig als CCP-AK (AK gegen cyclische citrullinierte Peptide) benannt.
ACPAs können als IgM-AK gefunden werden, aber auch in Form von IgG und IgA. Dies impliziert, dass es einen ACPA-Isotypenwechsel gibt, bei dem sich die konstante Region der AK verändert. Die Anzahl der ACPA-Isotypen scheint mit der Entwicklung der Erkrankung und dem zukünftigen radiologischen Gelenkschaden zu korrelieren (van der Woude, Syversen, et al., 2010). Die Expansion der ACPA-Isotypen scheint bereits Jahre vor Krankheitsausbruch stattzufinden. Denn bei etablierter RA verändern sich die Isotypen nicht mehr, während sie in den Jahren der Krankheitsentstehung noch zunehmen (van der Woude, Rantapää-Dahlqvist, et al., 2010; Verpoort et al., 2006). Dies ist ein weiterer Hinweis darauf, dass ACPAs eine Rolle in der Frühpathogenese der RA spielen. Wie bereits in 1.1.2 erwähnt, scheint die ACPA-Produktion zunächst in gelenkfernen Regionen wie Lunge und Gastrointestinaltrakt stattzufinden. Erst Jahre später kommt es durch einen sogenannten
„second Hit“ im Synovium (beispielsweise lokale Entzündung oder Trauma im Gelenk) zur Citrullinierung von synovialen Peptiden. Diese werden von ACPAs erkannt und es kommt zu einer chronischen Autoimmunreaktion, die sich klinisch als ACPA-positive RA präsentiert (Perry et al., 2014).
Es stellt sich die Frage, wie genau ACPAs unseren Organismus schädigen. Geschieht dies nur durch die Initiierung der Autoimmunität oder gibt es auch direkte pathogenetische Einflüsse?
Eine mögliche Antwort ist die Beobachtung, dass PAD4, eines der Enzyme, die für die
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19 Citrullinierung verantwortlich sind, in Zusammenhang mit „neutrophilen extrazellulären Fallen“ (neutrophil extracellular traps, NETs) stehen. Dies sind hoch dekondensierte Chromatinstrukturen aus der DNA von neutrophilen Granulozyten, die Pathogene binden und töten (Li et al., 2010). Dies ist in Abbildung 3 dargestellt. Auch bei anderen Autoimmunerkrankungen (z.B. SLE) wurde eine erhöhte NETose-Rate gezeigt. Die direkte Verbindung zur RA entstand durch die Entdeckung, dass citrulliniertes Histon H4 eine Zielstruktur für RA-Seren ist (Pratesi et al., 2014). Wenn NETose Antigene (Zielstrukturen) für ACPAs generiert, wäre dies eine Verbindung zwischen angeborenem und erworbenem Immunsystem.
Abbildung 3 (Bax et al., 2014): Entstehung von NETs als Beispiel für das autoreaktive Potential der ACPAs, mit freundlicher Genehmigung des Springer-Verlags
Citrullinierte Antigene werden durch PAD4 in NETs produziert und sind Zielstrukturen für ACPAs
1.2.3 ACPA-Glykosylierung
Auf die Bedeutung der Glykosylierung von AK wird im Verlauf dieser Arbeit noch tiefer eingegangen. An dieser Stelle soll lediglich erwähnt werden, dass Änderungen in der Glykosylierung von AK auch in Bezug auf ACPAs eine Rolle spielen. Ganz allgemein wird angenommen, dass die Glykosylierungen des Fc-Teils von AK einen Einfluss auf die pro- oder antiinflammatorische Wirkung von AK haben (Kaneko, Nimmerjahn, & Ravetch, 2006).
Es wurde die Glykosylierung von IgG1-ACPAs bestimmt und festgestellt, dass sich die Glykosylierung von IgG1-ACPAs der Synovialflüssigkeit von der des Serums unterschied. So hatten die IgG-ACPAs der Synovialflüssigkeit beispielsweise weniger Sialinsäure gebunden (Scherer et al., 2010). Dies legt die Überlegung nahe, dass eine entzündliche Umgebung Änderungen in den Glykosylierungsmustern induziert.
1.3 Unterschiedliche Effektorfunktionen von IgG-AK
IgG-AK sind Moleküle mit unterschiedlichen Effektorfunktionen. Auf der einen Seite führen sie zur Zerstörung von Pathogenen oder, im Falle einer Autoimmunität auch zur Zerstörung
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20 körpereigener Strukturen. Auf der anderen Seite werden sie in Form von intravenösen Immunglobulinen (IVIG) zur Therapie von Autoimmunerkrankungen genutzt (Negi et al., 2007). Im Falle der Krebstherapie werden monoklonale AK wie Rituximab oder Trastuzumab verwendet, um deren destruktive Eigenschaften zu nutzen. Dazu zählen die Ausschüttung proinflammatorischer Mediatoren, AK-abhängige zelluläre Phagozytose (antibody dependent cellular phagocytosis, ADCP), AK-abhängige zelluläre Zytotoxitität (antibody dependent cellular cytotoxicity, ADCC) und Komplement-abhängige Zytotoxizität (complement dependent cytotoxicity, CDC) (Lux & Nimmerjahn, 2011). Doch wie kommt es dazu, dass ein und dasselbe Molekül so gegensätzliche Wirkungen haben kann? Es wurde heraus gefunden, dass die funktionellen Fc-Rezeptoren für IgG (FcγR) eine wichtige Rolle bezüglich Aktivierung und Inhibierung von IgG spielen. Außerdem scheinen die unterschiedlichen Zuckerreste der IgG-Moleküle eine große Auswirkung auf die Effektorfunktionen der AK zu haben.
1.3.1 Einfluss der FcγRezeptoren
Es gibt aktivierende und hemmende FcγR (Abbildung 4). Die FcγRIA/IIA/IIIA/IV dienen der Aktivierung. Dies geschieht über „Immunrezeptor Tyrosin basierte Aktivierungsmotive“
(immune-receptor tyrosine based activation motifs, ITAM). FcγRIIB führt zu einer Inhibierung über „Immunrezeptor Tyrosin basierte Inhibierungsmotive“ (immune-receptor tyrosine based inhibation motifs, ITIM) (Nimmerjahn & Ravetch, 2005; Takai, 2002). Durch die Koexpression von diesen unterschiedlichen Rezeptortypen auf vielen Zellen des angeborenen Immunsystems (Basophile, Eosinophile, Neutrophile, Mastzellen, Monozyten und Makrophagen) wird eine Schwelle für die Aktivierung des Immunsystems gesetzt.
Dadurch binden Immunkomplexe nicht nur aktivierende Rezeptoren, sondern auch inhibierende. So wird einer überschießenden Aktivierung des Immunsystems vorgebeugt (Lux
& Nimmerjahn, 2011). Die Rezeptoraffinität hängt entscheidend davon ab, welche Zuckerreste an den IgG-Molekülen gebunden sind. Dies bedeutet, dass die unterschiedlichen Glykosylierungen der AK (siehe unten) bestimmen, an welche FcγR die IgG-Moleküle bevorzugt binden. Somit besitzen sie einen entscheidenden Einfluss auf die Effektorfunktion der AK (Jefferis, Lund, & Goodall, 1995; Kaneko et al., 2006).
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21
Abbildung 4 (Lux & Nimmerjahn, 2011): aktivierende und hemmende humane Fc-Rezeptoren für IgG, mit freundlicher Genehmigung des Springer-Verlags
Es gibt drei aktivierende FcγR (grün) und einen hemmenden FcγR (rot), die Aktivierung findet überImmunrezeptor Tyrosin basierte Aktivierungsmotive (ITAM) statt, die Hemmung über Immunrezeptor Tyrosin basierte Inhibierungsmotive (ITIM)
1.3.2 Einfluss der Glykosylierungen
Alle IgG-Moleküle sind Glykoproteine mit einem Zuckerrest an dem Asparagin 297 (ASN297) der CH2-Domäne der Fc-Fragmente. Diese Zuckerreste spielen eine große Rolle für die Stabilität der AK. Außerdem beeinflussen sie die Funktion der AK entscheidend, indem sie die Bindungsaffinität an den jeweiligen FcγR bestimmen. Wie oben beschrieben, gibt es aktivierende und hemmende FcγR. Dies bedeutet, dass je nach AK-Glykosylierung das Immunsystem aktiviert oder gehemmt wird. Es gibt also Glykosylierungen, die proinflammatorische oder antiinflammatorische Eigenschaften besitzen. Des Weiteren haben die Zuckerreste auch Einfluss auf die Komplementaktivierung (Scherer et al., 2010).
Der Vorgang der Glykosylierung ist die wichtigste posttranslationale Veränderung von Proteinen und findet im endoplasmatischen Retikulum (ER) und im Golgi-Apparat statt. Die glykosidische Bindung der AK ist eine N-Glykosylierung, da die Kohlenhydratseitenkette über eine NH-Gruppe (Asparagin) mit der Aminosäure verknüpft wird. Zunächst wird im Zytosol und im ER ein immer identisches Kohlenhydratgrundgerüst an die Aminosäure angefügt. Erst im Golgi-Apparat findet mittels spezifischer Glykosyltransferasen die Anheftung der Glykoprotein-typischen Saccharidreste statt (Horn, 2012).
Das Herz des Zuckerrests, der eine biantennäre, heptamere Struktur aufweist, besteht aus Mannose und N-Acetylglukosamin (GlcNAc). Diese Struktur wird auch als „Core“ oder Kern bezeichnet. An den Enden können zusätzlich noch Galaktose und Sialinsäure hängen. Dies ist variabel und nicht zwingend der Fall. Je nach Präsenz von Galaktose an den Enden, werden die IgG-Moleküle als IgG-G0/G1/G2 eingeteilt. Bei IgG-G0 ist keine Galaktose gebunden (und somit auch keine Sialinsäure, da diese an Galaktose gebunden ist). IgG-G1 hat ein Galaktosemolekül gebunden (und daran eventuell ein Sialinsäuremolekül). IgG-G2 besitzt zwei Galaktosemoleküle gebunden (und daran eventuell ein oder zwei Sialinsäuremoleküle) (Abbildung 5). Es gibt insgesamt 30 bis 40 Varianten von IgG im Serum Gesunder (Arnold, Wormald, Sim, Rudd, & Dwek, 2007). Die Entfernung des Zuckerrests stört die Fc-
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22 abhängigen Effektorfunktionen und zwar sowohl die proinflammatorischen, als auch die antiiflammatorischen Funktionen (Kaneko et al., 2006). Dies zeigt, dass die Zucker eine wichtige Rolle bezüglich der Funktionalität der AK besitzen. Studien mit Patienten mit RA oder Spondylarthropatie zeigten, dass je nach Krankheitsaktivität unterschiedliche Glykosylierungen vorliegen (Parekh et al., 1988). Außerdem fand man heraus, dass bei Patienten mit Autoimmunerkrankungen IgG-G0 (ohne Galaktose und Sialinsäure) erhöht war und es vermehrt zu Bindung an aktivierenden FcγR kam. Bei schwangeren Frauen hingegen, als Beispiel für einen antiinflammatorischen Zustand in dem autoimmune Prozesse unterdrückt werden, fand man häufiger die voll ausgebildete Glykanstruktur mit Galaktose und terminaler Sialinsäure (Scherer et al., 2010; van de Geijn et al., 2009).
Im Folgenden werden die entscheidenden Eigenschaften der vier variablen Zucker des IgG-Zuckerrests diskutiert.
Abbildung 5 (Lux & Nimmerjahn, 2011): Zuckerrest eines IgG-AKs am Asparagin 297 mit freundlicher Genehmigung des Springer-Verlags
Die schwarz und fettgedruckten Moleküle sind obligat vorhanden und bilden das Herz des Oligosacchararids. Die bunten Zucker sind variabel und können vorhanden sein. Je nach Vorhandensein von Galaktose werden die IgG-AK in Gruppen von IgG-G0-G2 eingeteilt.
Fucose:
Fucose moduliert die proinflammatorischen Veränderungen von IgG. Das Entfernen von Fucose führt zu einer 50-fach stärkeren ADCC-Aktivität von therapeutischen AK (Satoh, Iida,
& Shitara, 2006). Alle IgG-Subklassen zeigen erhöhte Aktivität nach Entfernen von Fucose (Niwa et al., 2005; Shinkawa et al., 2003). Für diese erhöhte Aktivität scheint die selektiv erhöhte Affinität für den aktivierenden FcγRIIIA verantwortlich zu sein, die durch das Entfernen von Fucose auftritt. Dies könnte daran liegen, dass der FcγRIIIA und IgG in Anwesenheit von Fucose in zu engem Kontakt stehen und es so durch ein sterisches Hindernis nicht zur Bindung kommt. Bei Abwesenheit von Fucose kann das IgG-Molekül dann ungehindert an den FcR binden (Ferrara, Stuart, Sondermann, Brünker, & Umaña, 2006).
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23 N-Acetylglucosamin (GlcNAc):
Im Gegensatz zur häufigen Glykosylierung von IgG mit Fucose liegt eine Glykosylierung mit GlcNAc seltener vor. Was die Auswirkungen auf die ADCC-Aktivität betrifft, so wirkt GlcNAc weniger aktivierend als die Abwesenheit von Fucose (Shinkawa et al., 2003).
Galaktose:
Es gibt verschiedene Studien, die Glykosylierungen mit Galaktose untersucht haben. Die Resultate sind insgesamt allerdings nicht einheitlich, sodass aktuell nicht von einer evidenten Rolle auf die Beeinflussung der Aktivität von IgG ausgegangen werden kann (Lux &
Nimmerjahn, 2011). Es lässt sich aber festhalten, dass RA-Patienten vermehrt das keine Galaktose enthaltende IgG-G0 aufweisen (Rademacher, Williams, & Dwek, 1994).
Sialinsäure:
Die IgG-G0-AK zeichnen sich wie vorher beschrieben durch Abwesenheit von Galaktose und Sialinsäure aus. Ursprünglich ging man davon aus, dass dies die proinflammatorische Eigenschaft erkläre. Eine weitere Hypothese ist aber, dass durch den Verlust von Sialinsäure antiinflammatorische Eigenschaften verloren gehen. Dass AK auch antiinflammatorische Wirkung haben können, ist bekannt. Man macht sich dies bei der Therapie mit IVIG bei unterschiedlichen Autoimmunerkrankungen zunutze. Durch das Entfernen des Zuckerrests mit Sialinsäure verloren die IVIG ihre antiinflammatorische Wirkung (Nimmerjahn &
Ravetch, 2008). Interessanterweise hatten andere sialylierte Serumproteine keine entzündungshemmenden Eigenschaften. Dies bedeutet, dass sowohl die Glykosylierung mit Sialinsäure, als auch das IgG-Aminosäure-Grundgerüst vorhanden sein müssen, um die antiinflammatorische Wirkung zu entfalten (Kaneko et al., 2006). Eine mögliche Erklärung ist, dass die negativ geladenen Sialinsäurereste die Tertiärstruktur des IgGs verändern und somit Einfluss auf dessen Effektorfunktion haben. IgG-Moleküle, die Sialinsäure enthalten, haben eine geringe Affinität zu FcγR. Es gibt allerdings andere Rezeptoren, DC-SIGN, die bevorzugt von dieser IgG-Glykovariante gebunden werden (Anthony, Wermeling, Karlsson,
& Ravetch, 2008). Bei einer Therapie mit IVIG kommt es zur Hochregulierung von inhibitorischen FcγRIIB und zur Herunterregulierung von aktivierenden FcγR (Tackenberg et al., 2009). Dadurch ist die Schwelle zur Aktivierung des angeborenen Immunsystems erhöht und inflammatorische Prozesse werden gehemmt. Wie es genau zur Änderung in den FcγR kommt, ist noch unklar. Spekuliert wird über eine Beeinflussung durch antiinflammatorische Zytokine (Lux & Nimmerjahn, 2011).
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24 1.4 Ziel der Arbeit
Wie in den vorangehenden Abschnitten beschrieben, handelt es sich bei der rheumatoiden Arthritis (RA) um eine epidemiologisch bedeutsame Erkrankung von der eine Vielzahl von Menschen betroffen ist. Die vorliegende Arbeit soll auf lange Sicht zu einer Optimierung der Behandlung der Patienten beitragen.
Die Glykosylierung krankheitsspezifischer AK, aber auch der Gesamt-Immunglobuline, die jeder Mensch besitzt (IgG), besitzt wahrscheinlich eine große Rolle bei der Pathogenese der RA. Diese Glykosylierungen können sich in Abhängigkeit von der Krankheitsaktivität verändern. Dabei konnten bestimmte Gruppen spezifischer Zuckerreste in Verbindung mit entzündungsfördernden und andere mit entzündungshemmenden Eigenschaften gebracht werden. Ziel dieser Arbeit war es, zu untersuchen, inwiefern die AK-Glykosylierung auch durch immunmodulatorische Medikamente beeinflusst werden kann.
Um dies zu untersuchen, führten wir eine prospektive Studie durch. Es sollten aktive RA-Patienten eingeschlossen werden, die auf ein neues Medikament umgestellt wurden. An den Seren dieser Patienten sollte vor und nach Therapieumstellung die AK-Glykosylierung bestimmt werden. Um zu überprüfen, ob bestimmte Glykosylierungsmuster mit einer erhöhten oder erniedrigten Krankheitsaktivität korrelierten, wurde den Patienten bei jeder Visite ein Fragebogen zu Tätigkeiten des alltäglichen Lebens vorgelegt (HAQ).
Laborparameter, die für eine entzündliche Krankheitsaktivität sprechen, sollten ebenso bei jeder Vorstellung bestimmt werden. Zusammen mit der klinischen Untersuchung wurde daraus ein standardisierter Aktivitätsscore berechnet (DAS28). Um unsere Arbeitshypothese
„Glykosylierungen von AK verändern sich bei Therapieumstellung und stehen in Zusammenhang mit der Krankheitsaktivität“ zu überprüfen, sollten schlussendlich die gewonnenen Laborergebnisse mit den klinischen Parametern in Bezug gesetzt werden.
Um die erhobenen Daten auch für weitere RA-Forschungsprojekte zugänglich zu machen, wurde eine Microsoft®Access-Datenbank etabliert. Die Daten der Patienten, die in die Studie eingeschlossen wurden, obwohl sie nicht die Kriterien für Untersuchung der Glykosylierung erfüllten, sollten ebenfalls wissenschaftlich genutzt werden. Hiermit sollten epidemiologische Aspekte der RA überprüft werden, wie beispielsweise das Vorliegen von Risikofaktoren wie Nikotinabusus und Vitamin-D-Mangel und deren Zusammenhang mit ACPA- und RF-Positivität.
Material und Methoden
25
2 Material und Methoden
2.1 Erstellen einer Access-Datenbank
Das Erstellen einer passwortgeschützten Access-Datenbank (Microsoft Access™) war eines der Hauptaufgaben dieser Arbeit. Ziel war es, die gesammelten Daten der RA-Patienten in übersichtlicher Form zusammen zu führen und abrufbar zu machen. Hier gilt unser besonderer Dank der Unterstützung durch Frau Ingeborg Wünsche.
Microsoft Access™ ist ein relationales Datenbanksystem. Für jeden neu eingeschlossenen Patient wurde ein Formular „Einschluss und Visite“ angelegt in das die verschiedenen Parameter eingetragen wurden. Dazu zählten Basisparameter wie Alter, Datum des Studieneinschlusses, Zeitpunkt der Erstmanifestation und Erstdiagnose, Größe, Gewicht, BMI (Body-Mass-Index). Außerdem wurden die errechneten Werte des DAS28 und des HAQ eingetragen. Folgende Laborwerte wurden bestimmt und eingetragen: CRP, BSG, Vitamin D, Kreatinin, Ferritin, Harnsäure, IgG, IgA, IgM. Außerdem wurde aus einer Liste mit möglichen RA-Medikamenten bei jeder Visite einzeln ausgewählt, welches der Patient zu diesem Zeitpunkt genommen hatte. Zusätzlich wurde eine Medikamententabelle für alle Medikamente, die der Patient jemals zuvor genommen hatte eingefügt. Ein Feld
„Medikamenten-Umstellung“ zur Auswahl „ja/nein“ wurde neben der Tabelle platziert um vergleichen zu können ob zwischen Ersteinschluss und Folgevisite oder zwischen erster und zweiter Folgevisite eine Therapieumstellung stattgefunden hatte (siehe Bildschirmfoto (Screenshot) der anonymisierten Datenbank im Anhang 8.5)
2.2 Patientenauswahl
Für die "RA-Kohorte" wurden sowohl ACPA-/RF-positive Patienten, als auch ACPA-/RF-negative RA-Patienten eingeschlossen.
2.2.1 Ersteinschluss
Die Einschlusskriterien für unsere Studie waren wie folgt definiert:
- ärztlich diagnostizierte RA (ACR-EULAR-Klassifikationskriterien erfüllt) und - Patienten mit Erstdiagnose (Therapieeinleitung) oder
- Patienten, die unter DMARD-/Biologikum-Therapie aktiv sind und umgestellt werden sollen (Therapieumstellung)
Material und Methoden
26 Um die potentiell in Frage kommenden Patienten heraus zu filtern, wurden wöchentlich die Terminplaner aller Rheumaambulanzen des Universitätsklinikum Freiburg (UKF) durchgeschaut. Bei allen RA-Patienten wurde eine entsprechende Memo-Notiz in das Kalenderfeld eingefügt. Damit sollten die Ambulanzärzte darauf aufmerksam gemacht werden, dass sie bei diesem Patient die Einschlusskriterien individuell prüfen und den Patient gegebenenfalls in die Studie einschließen sollten.
Im Falle eines Studieneinschlusses wurde der Patient über die Studie und den Verbleib seiner Daten aufgeklärt (Einverständniserklärung im Anhang 8.1) sowie die gegebenenfalls offenen Fragen beantwortet. Dann wurde dem Patienten ein standardisierter HAQ-Fragebogen ausgehändigt und der jeweilige Ambulanzarzt berechnete den aktuellen Aktivitätsscore DAS28. Außerdem wurden zwei Serumröhrchen abgenommen und an das immunologische Labor des UKF geschickt. Dort wurden alle Routineparameter bestimmt. Bei Ersteinschluss waren das Folgende: RF, ACPA, ANA-Screening, quantitative Immunglobuline IgG/IgM/IgA und CRP. RF wurde nephelomethrisch als IgM-AK gemessen, die Bestimmung des ACPA- Titers erfolgte durch CCP-2-ALISA. Im allgemeinen Routinelabor des UKF wurde außerdem ein großes Blutbild und ein Differentialblutbild angefordert. Zusätzlich wurde bei jeder Visite eine BSG abgenommen.
Die eingeschlossenen Patienten wurden im immunologischen Labor systematisch erfasst, die Proben dort systematisch gesammelt und bei -80°C gelagert. Es wurden die Einverständniserklärungen und HAQ-Fragebögen für jeden neu eingeschlossenen Patient alphabetisch in Ordner abgeheftet und im Rheumazentrum unter Sicherstellung des Datenschutzes aufbewahrt. Die Werte des DAS28 wurden dem zugehörigen Arztbrief entnommen. Der neu eingeschlossene Patient wurde dann mit einem neuen Formular in die Access-Datenbank aufgenommen.
2.2.2 Folgevisite
Die Folgevisite sollte drei bis sechs Monate nach Ersteinschluss und erfolgter Therapieumstellung erfolgen. Das genaue Datum wurde dem Arztbrief des Ersteinschlusses entnommen und dann in ein Feld "Folgevisite" in die Access-Datenbank eingetragen. So konnte man in einer Abfrage chronologisch alle Folgevisitentermine des jeweiligen Patienten überblicken. Einige Tage vor der Folgevisite wurde dem/der Arzt/Ärztin, der/die in der jeweiligen Ambulanz, in der der Patient seinen Wiedervorstellungstermin hatte, eine E-Mail geschickt, um ihn an die Folgevisite im Rahmen der Studie zu erinnern. In dem Terminplaner des UKF wurde außerdem eine Erinnerungsnotiz für die Ambulanzärzte eingefügt.
Material und Methoden
27 Für die Folgevisite wurden folgende Laborparameter abgenommen: im immunologischen Labor des UKF quantitative Immunglobuline (IgG, IgM, IgA), CRP und im Routinelabor des UKF kleines Blutbild inklusive Ferritin, Kreatinin und Harnsäure. Wie bei der ersten Visite wurde auch bei allen Folgevisiten die BSG bestimmt und damit der DAS28 berechnet sowie der HAQ-Fragebogen ausgefüllt. Alle Parameter wurden daraufhin in das Formular
"Folgevisite" der Access-Datenbank eingetragen. Des Weiteren wurde die aktuelle Medikation mit der Medikation bei Ersteinschluss verglichen und bei einer Änderung das Feld "Medikamenten-Umstellung" mit „ja“ vermerkt.
2.2.3 Auswahl der Patienten für den Lektin-ELISA
Die Laborexperimente zur Bestimmung der Glykosylierung des Gesamt-IgG mittels Lektin- ELISA wurden an einer Subgruppe der Studienpopulation durchgeführt. Die Kriterien anhand derer wir die Seren für die Experimente auswählten, definierten wir folgendermaßen:
Einschlusskriterien für den Lektin-ELISA für Gesamt-IgG:
- ärztlich diagnostizierte aktive RA
- mindestens zwei Visiten im Rahmen der RA-Studie (Einschlussvisite und mindestens eine Folgevisite im Abstand von drei bis sechs Monaten)
- Medikamentenumstellung oder Medikamentenneueinstellung erfolgt zwischen zwei Visiten (=Blutentnahmen) und Einnahme des neuen Medikaments für mindestens drei Monate
Um die Arbeitshypothese „Änderung der Glykosylierung von AK je nach Krankheitsaktivität und Art der Medikamenteneinnahme“ zu überprüfen, wählten wir einen Abstand von drei bis sechs Monaten zwischen den beiden Blutentnahmen, denn Immunglobuline haben eine Plasmahalbwertszeit von drei bis vier Wochen (Mankarious et al., 1988). Dies bedeutet, dass sich nach drei bis sechs Monaten 87,5% bis 93,75% der im Blut zirkulierenden Immunglobuline verändert haben könnten, da sie in der Zwischenzeit zerfallen und neu gebildet worden sind.
Um sicher zu stellen, dass die Patienten in diesem Zeitraum auch tatsächlich das neu verordnete Medikament eingenommen hatten, wurde im MeDoc-Terminplaner des UKF überprüft, an welchem Datum nach Einschluss in die Studie ein Rezept mit dem neuen Medikament ausgestellt worden war und wann der Patient in der Infusionsambulanz des UKF zur Applikation des neuen Medikaments vorstellig war. Bei oral einzunehmen Medikamenten wie Sulfasalazin oder Methotrexat in Tablettenform wurde das Datum der Rezeptausstellung
Material und Methoden
28 verwendet und im folgenden Arztbrief überprüft, ob der Patient eine regelmäßige Einnahme bestätigte.
2.3 Probengewinnung und -lagerung
Von allen eingeschlossenen RA-Patienten wurden jeweils zwei Serumröhrchen abgenommen und ins immunologische Routinelabor des UKF geschickt. Dort wurden diese aliquotiert und jeweils zehn Aliquots à 300-500 µl bei -80°C eingefroren (Gefrierschrank Liebherr premium (neu)). Es wurde jedem Patient bei jeder Visite im Rahmen der RA-Studie eine laufende Nummer zugewiesen. Bei einem Patient, der beispielsweise drei mal zur RA-Visite kam, hatten wir insgesamt drei mal zehn Aliquots, von denen die zehn immer der gleichen laufenden Nummer zugeordnet waren. Im Gefrierschrank wurden immer zehn mal zehn Aliquots einer laufenden Nummer in einer Box verstaut und außen mit den beinhaltenden laufenden Nummern (1-10, 11-20, 21-30 etc.) beschriftet. Diese laufenden Nummern wurden in das Formular „Labor“ der Access-Datenbank eingefügt. So wurde ermöglicht, gezielt Seren aufzutauen und für weitere Untersuchungen zu verwenden.
2.4 Lektin-ELISA für Gesamt-IgG
Zum Nachweis der spezifischen Glykosylierung des Gesamt-IgGs wurde ein Lektin-ELISA durchgeführt. Dieser war bereits im Labor der AG Voll von Dr. rer. nat. Andrea Maul-Pavicic (Diplom-Biologin) und Sandra Schaffer (Diplom-Biologin) etabliert worden. Dabei handelt es sich um einen Enzym-gekoppelten Immunadsorptionstest, bei dem Lektine spezifische Zuckerreste binden. Es wurden die Lektine Sambucus nigra Lektin (SNA) und Lens culinaris Lektin (LCA) verwendet. Da SNA an Sialinsäure und LCA an Mannose bindet, konnten diese beiden Zucker spezifisch an den IgG-AK nachgewiesen werden.
Es wurden MaxiSorp® 96-Loch-Flachbodenplatten (Nunc) verwendet, welche mit 10 µg/ml Ziege anti-human IgG Fab-Fragmenten (Jackson) in 50 µl Volumen pro Vertiefung bei 4°C über Nacht inkubiert wurden. Anschließend wurde die Platte dreimal mit PBS-T (0,05%
Tween20) gewaschen. Um die unspezifischen Bindungsstellen zu blockieren, wurde im Anschluss 30 Minuten mit einem kohlenhydratfreien Blockierungspuffer (Carbo-Free™
Blocking Solution, Vector Laboratories) blockiert. Nun wurden die Patientenseren in geeigneter Verdünnung auf die Platte aufgetragen und eine Stunde bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Dann wurde erneut dreimal mit PBS-T gewaschen und daraufhin wurden 100 µl des jeweiligen Lektins in Lektinpuffer verdünnt aufgetragen und eine Stunde bei RT
Material und Methoden
29 inkubiert. Nach erneutem dreimaligem Waschen mit PBS-T wurde die Platte mit 0,1 µg/ml Meerrettichperoxidase-gekoppeltem Streptavidin (Sigma) in einem Volumen von 100 µl/Vertiefung eine Stunde bei RT inkubiert. Durch Streptavidin wurde die Bindung an die biotinylierten Proteine erzielt. Die Peroxidase führt zu einem grünen Farbumschlag, der photometrisch als optische Dichte (OD) messbar ist. Anschließend wurden 100 µl ABTS (Roche) pro Vertiefung hinzugegeben, das als Substrat für die Peroxidase fungiert. Dieses wurde vor Zugabe circa 20-30 Minuten bei RT equilibriert. Die Enzym-Substrat-Reaktion wurde an einem zuvor ermittelten geeigneten Zeitpunkt mit einer einprozentigen Natriumlarylsulfat-Lösung (SDS-Lösung) abgestoppt und die OD photometrisch bei einer Wellenlänge von 490nm bestimmt (Infinite® ELISA-Reader, Tecan).
Die Gesamt-IgG-Konzentration unserer Patientenseren war bereits bei der Ersteinschluss-/Folgevisite Blutentnahme im immunologischen Labor des UKF bestimmt worden. Schließlich wurde die gemessene OD der Lektine auf diese Gesamt-IgG-Konzentration normiert. Es wurde jeweils die Ratio OD SNA:IgG-Konzentration und die Ratio OD LCA:IgG-Konzentration berechnet.
Die „vorher-nachher“-Seren eines Patienten wurden jeweils auf der gleichen ELISA-Platte getestet. Dadurch wurden systematische Fehler, die alle Seren bei Ersteinschluss oder alle Seren bei Folgevisite betreffen könnten, verhindert und der direkte Vergleich zwischen Ersteinschluss und Folgevisite ermöglicht.
2.5 Statistische Methoden
Für die Auswertung der Daten wurde zwischen deskriptiver und induktiver Statistik unterschieden. Zunächst werteten wir die Daten unserer Stichprobe deskriptiv mit Tabellen und Diagrammen aus. So konnten die „Eigenschaften“ der Studienpopulation analysiert werden. Mit dem Programm Microsoft®Excel und der Statistiksoftware GraphPadPrism® wurden Kenngrößen wie Mittelwert und Standartabweichung berechnet.
Um anschließend die Ergebnisse unserer Stichprobe zu verallgemeinern und auf ihre statistische Signifikanz zu prüfen, nutzten wir GraphPadPrism® zur induktiven Statistik. Das Ziel hierbei war das Übertragen der Ergebnisse unserer Studienpatienten auf die Grundgesamtheit.
Um zu entscheiden, welche statistischen Tests sinnvoll waren, wurde zu Beginn geprüft, ob eine Normalverteilung der Zufallsvariablen vorlag. Da dies nicht der Fall war, wurde sich anstelle des parametrischen t-Tests für die nicht-parametrischen Rangsummentests Wilcoxon-Test und Mann-Whitney-U-Test entschieden. Ein weiterer Grund für die Wahl der
Material und Methoden
30 nicht-parametrischen Tests war, dass sich einige der Messwerte oberhalb beziehungsweise unterhalb der Messgrenze lagen. Dabei handelte es sich beispielsweise um CRP-Werte < 3,48 mg/l oder ACPA-Werte > 200 IE/ml. Wenn in diesen Fällen der Höchst- oder Tiefstwert einfach „geschätzt“ worden wäre, hätte dies bei einem t-Test die Ergebnisse verzerrt, da diese stark von der Schätzung abhängig gewesen wären. Auch durch Ausschluss dieser Werte wären die Ergebnisse verzerrt worden. Da bei Verwendung von nicht-parametrischen Rangsummentests nicht mit Absolutwerten, sondern mit den Rangziffern gerechnet wird, wurde dieses Problem umgangen. Durch Zuordnung der Werte „> max“ so hohe Werte zugeordnet werden, dass sie den höchsten Rang erhielten und Werten „< min“ den niedrigsten Rang erhielten, kam es zu keiner Verzerrung der Ergebnisse.
Statistische Signifikanz definierten wir als p-Werte < 0,05. „Sehr signifikant“ werteten wir Ergebnisse mit p-Werten < 0,01 und „hochsignifikant“ Ergebnisse mit p-Werten < 0,0001.
Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Test (Wilcoxon-signed-rank-test)
Es handelt sich um einen nicht-parametrischen Test für zwei verbundene Stichproben.
In GraphPadPrism® konnten über die „Funktion“ „gepaarte Proben“ (paired samples) direkt zwei durch den gleichen Patienten verbundene Werte verglichen werden. Diesen Test nutzten wir für den vorher-nachher-Vergleich bei einzelnen Patienten. „Vorher“ stellte dabei die Visite vor Therapieumstellung dar und „nachher“ die Visite nach Therapieumstellung.
Mann-Whitney-U-Test
Hierbei handelt es sich um einen nicht-parametrischen Test zum Vergleich von zwei unverbundenen Stichproben. Dieser Test wurde angewandt um die Ergebnisse des ELISAs ACPA-positiv versus (vs.) ACPA-negativ auf statistisch signifikante Unterschiede zu prüfen.
Wir prüften damit beispielsweise, ob sich die Mediane der Glykosylierungen von Sialinsäure und Mannose zwischen ACPA-positiven und ACPA-negativen Patienten unterschieden und testeten getrennt bei Ersteinschluss und Folgevisite.
Spearman-Rangkorrelationstest
Es sollte außerdem überprüft werden, ob die Stärke der Glykosylierungen mit Sialinsäure mit den Parametern DAS28, HAQ und CRP korrelierte. Dazu wurden die Differenzen der Ergebnisse zwischen den beiden Visiten berechnet, da wir überprüfen wollten, ob sich die Glykosylierung analog zur Veränderung der anderen Parameter zwischen Ersteinschluss und Folgevisite verändert habe. Es wurde sowohl für die ACPA-positiven als auch für die ACPA-negativen Patienten der Rangkorrelationstest nach Spearmann durchgeführt und die Spearmann-Korrelationskoeffizienten berechnet.
Material und Methoden
31 Zusätzlich wurde der Spearman-Rangkorrelationstest durchgeführt, um die Werte der Vitamin-D-Spiegel und des BMI mit RA-typischen Parametern (DAS28, HAQ, RF, ACPA und CRP) zu korrelieren und um die Ergebnisse beider ELISA-Durchgänge auf Korrelation miteinander zu testen.
Fisher’s exact Test
Bei dem Fisher’s exact Test handelt es sich um einen Signifikanztest auf Unabhängigkeit in der Kontigenztafel. Dabei wurde getestet, ob binär verteilte Merkmale wie „Erosionen/keine Erosionen“ oder „Nikotinabusus/kein Nikotinabusus“ statistisch signifikant häufiger bei ACPA-positiven oder ACPA-negativen Patienten vorkamen.
Ergebnisse
32
3 Ergebnisse
3.1 Ersteinschluss
Zwischen November 2013 und Juni 2015 erfüllten 104 Patienten die Einschlusskriterien der Studie. Von den 104 die Einschlusskriterien erfüllenden Patienten, lehnte einer nachträglich seine Mitarbeit ab und vier sendeten die Einwilligungserklärung nicht an uns zurück. Die Auswertungen wurden deshalb an 99 Patienten durchgeführt. Von diesen Patienten waren 41 zu einer Visite vorstellig, 58 Patienten waren bis zum Ende der Datenerhebungsphase mindestens zweimalig da. Die folgenden Daten beziehen sich nur auf die Ersteinschlüsse der 99 Patienten (Tabelle 1). Der Vergleich der Parameter von Ersteinschluss und Folgevisite ist unter 3.2 dargestellt.
Studienpatienten insgesamt Anzahl Visiten
N %
99
1 41 41,4
≥ 2 58 58,6
2 37 37,4
3 14 14,1
4 7 7,1
5 1 1,0
Tabelle 1: Anzahl der Visiten der Studienpatienten
3.1.1 Basisdaten
In Tabelle 2 sind die Basisdaten der Studienpatienten zu Studieneinschluss aufgeführt. Es wurde für alle Parameter berechnet, welcher Prozentsatz der Patienten ACPA-positiv/
bzw. -negativ und RF-positiv/ bzw. -negativ waren.
Geschlecht
Insgesamt wurden 66 Frauen (66,7%) und 33 Männer (33,3%) in die Studie eingeschlossen.
Die Verteilung Frauen zu Männer betrug 2:1.Von den Männern waren 60,6% (20/33) ACPA-positiv im Vergleich zu 54,5% (36/66) ACPA-positiven Frauen (Abbildung 6).
BMI
Der BMI konnte bei 92 Patienten berechnet werden. Davon waren 35 Patienten normalgewichtig (BMI zwischen 18,5 kg/m2 und 25 kg/m2), 2 Patienten untergewichtig (BMI
< 18,5 kg/m2) und 55 Patienten übergewichtig (BMI > 25 kg/m2). Wir führten außerdem eine Spearman-Korrelation von BMI mit DAS28, HAQ, RF, ACPA und CRP durch. Die dabei berechneten Werte sind in Tabelle 3 ersichtlich. Die „Anzahl der XY-Paare“ gibt an, wie viele Paare von zwei verglichenen Werten eines Patienten vorlagen. Da zum Teil bei einem
