Medizinischen Hochschule Hannover
Diagnostik von Mykobakterien mittels Polymerase-Kettenreaktion:
Nachweis aus Patientenmaterial und Erweiterung der Speziesdiagnostik
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Antje Bohrßen
aus Hannover
Hannover 2003
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Achim Gruber, Ph. D.
PD Dr. Franz-Christoph Bange
1. Gutachter: Prof. Dr. Achim Gruber, Ph. D.
2. Gutachter: Prof. Dr. Gerald-F. Gerlach
Tag der mündlichen Prüfung: 24.11.2003
Teile der hier vorliegenden Arbeit wurden wie folgt vorab veröffentlicht:
LACHNIK, J., B. ACKERMANN, A. BOHRSSEN, S. MAASS, C. DIEPHAUS, A.
PUNCKEN, M. STERMANN u. F.-C. BANGE (2002):
Rapid-cycle PCR and fluorimetry for detection of mycobacteria.
J. Clin. Microbiol. 40 (9): 3364-3373
STERMANN, M., A. BOHRSSEN, C. DIEPHAUS, S. MAASS u. F.-C. BANGE (2003):
A polymorphic nucleotide within the promotor of nitrate reductase (NarGHJI) is specific for M. tuberculosis.
J. Clin. Microbiol. 41 (7): 3252-3259
Inhaltsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis VI Tabellenverzeichnis VIII Abkürzungsverzeichnis X
1 Einleitung 1
2 Literaturübersicht 3
2.1 Taxonomie und allgemeine Eigenschaften von Mykobakterien 3 2.2 Vorkommen und Bedeutung 4 2.3 Der M. tuberculosis-Komplex 4
2.3.1 M. tuberculosis 5
2.3.2 M. africanum 6
2.3.3 M. microti 6
2.3.4 M. canetti 7
2.3.5 M. bovis 8
2.3.6 M. bovis BCG 9
2.3.7 Tuberkulose beim Menschen 10
2.3.7.1 Epidemiologie und Bedeutung 10
2.3.7.2 Ätiologie und Pathogenese 11
2.4 Nichttuberkulöse Mykobakterien 13 2.4.1 Einteilung nichttuberkulöser Mykobakterien 13
2.4.2 Mykobakteriosen 13
2.5 Diagnostik von Mykobakterien 16
2.5.1 Probenentnahme 16
2.5.2 Aufbereitung von Patientenmaterial 16
2.5.3 Mikroskopischer Nachweis 17
2.5.4 Kultureller Nachweis 18
2.5.5 Biochemische Differenzierung 19
2.5.5.1 Niacin-Test 20
2.5.5.2 Nitratreduktase-Test 20
2.5.5.3 Pyrazinamidase-Test 21
2.5.6 Molekularbiologische Nachweismethoden von Mykobakterien 21
2.5.7 Kommerzielle Testsysteme 24
2.5.8 Molekularbiologische Differenzierung des M. tuberculosis-Komplexes 26
2.6 Diagnostik von Mykobakterien an der Medizinischen Hochschule Hannover 27
2.7 Polymerase-Kettenreaktion im real time-Modus 30 2.7.1 Prinzip der Amplifikation und Schmelzpunktanalyse am LightCycler 30 2.7.2 Grundlagen für das Design von Primern 32 2.7.3 Grundlagen für das Design von Sonden 32 2.8 Zielsetzung der Arbeit 34
3 Material und Methoden 35
3.1 Erstellung der Inhibitionskontrolle 35
3.1.1 Verwendete Plasmide 35
3.1.2 Verwendete Bakterien 35
3.1.3 Plasmidkonstruktion 35
3.1.3.1 Mini-Präparation von Plasmid-DNA 35 3.1.3.2 Midi-Präparation von Plasmid-DNA 36
3.1.3.3 Restriktionsenzymverdau 36
3.1.3.4 Dephosphorylierung 36
3.1.3.5 Agarosegelelektrophorese 36
3.1.3.6 Isolation und Aufreinigung von DNA-Banden aus dem Gel 37 3.1.3.7 Aufreinigung von DNA aus Lösungen 37
3.1.3.8 Ligation 37
3.1.3.9 Herstellung elektrokompetenter Bakterienzellen 38 3.1.3.10 Transformation von Escherichia coli mit Plasmid-DNA 38 3.1.3.11 Amplifikation mit der konventionellen Polymerase-Kettenreaktion 38 3.1.3.12 Amplifikation und Schmelzpunktanalyse 39 3.2 Untersuchung von kulturellen Patientenmaterialien 40
3.2.1 Kulturen 40
3.2.2 Isolierung der genomischen DNA 42
3.2.3 Amplifikation und Schmelzpunktanalyse 42 3.2.4 Aufreinigung der Amplifikate zur Sequenzierung 43 3.3 Direktnachweis von Mykobakterien-DNA aus Patientenproben 44 3.3.1 Titerbestimmung von Bakterienkulturen 44 3.3.2 Dekontamination von Patientenmaterial 44 3.3.3 Präparation von genomischer DNA aus Patientenmaterial 45
3.3.4 Quantifizierung von DNA 46
3.3.4.1 Gelelektrophorese mit Hilfe eines Größenstandards 46 3.3.4.2 Quantifizierung von DNA mit Hilfe des Pico-Green Kits® 46
3.3.4.3 Bestimmung der Kopienzahl 46
3.3.5 Berechnung der Sensitivität und Spezifität 47 3.3.6 Amplifikation und Schmelzpunktanalyse 47 3.4 Unterscheidung innerhalb des M. tuberculosis-Komplexes 48 3.4.1 Verwendete Bakterienstämme des M. tuberculosis-Komplexes 48 3.4.2 Verwendete Bakterienstämme nichttuberkulöser Mykobakterien 48
3.4.3 Kulturbedingungen 49
3.4.4 Kulturkonservierung 49
3.4.5 Präparation genomischer DNA 49
3.4.6 Amplifikation und Schmelzpunktanalyse 50 3.5 DNA-Amplifikation und Schmelzpunktanalyse 50
3.5.1 Alignment von Primern und Sonden 51
3.5.2 Primer 51
3.5.3 Sonden 51
3.5.4 Ansetzen von Template und Mastermix 51
3.5.5 LightCycler-Programmierung 52
3.6 Sequenzierungen 54
3.7 Unterstützende Software 54 3.8 Sonstige Materialien 54
4 Ergebnisse 55
4.1 Erstellung einer Inhibitionskontrolle für die Polymerase-Kettenreaktion 55 4.1.1 Versuche mit der Inhibitionskontrolle pJL6 56
4.1.2 Klonierungsstrategie 58
4.1.3 Restriktionsverdau der Inhibitionskontrollen mit EcoNI 59 4.1.4 Subklonierung des Inserts von pJL6 in den Vektor von pJL8 60 4.1.5 Klonierung der neuen Inhibitionskontrolle 61 4.1.6 Vergleich der Inhibitionskontrollen in der PCR-Reaktion 62 4.1.7 Versuche mit der neuen Inhibitionskontrolle pAB2 63 4.2 Untersuchung von kulturellen Patientenproben 65 4.2.1 Pilotstudie (01.04.02 – 31.05.02) 66
4.2.1.1 Bestimmung einer neuen Kopienanzahl der Inhibitionskontrolle für die Untersuchung kultureller Patientenisolate 69 4.2.1.2 Spezifische Detektion des M. chelonae-abscessus-Komplexes 70 4.2.2 Hauptstudie I (01.06.02 – 31.10.02) 72 4.2.3 Hauptstudie II (01.11.02 – 31.03.03) 75 4.2.4 Untersuchung von Proben aus dem Klinikum Hannover Nordstadt 78 4.2.4.1 Abschnitt I (01.06.02 –31.10.02) 79 4.2.4.2 Abschnitt II (01.11.2002 – 31.03.2003) 80
4.3 Direktnachweis von mykobakterieller DNA aus Patientenproben 81 4.3.1 Präparation von Mykobakterien-DNA aus Patientenmaterial 82 4.3.1.1 Titerbestimmung einer Bakterienkultur 83 4.3.1.2 Überprüfung der Kreuzkontamination im King-Fisher-Automaten 83 4.3.2 Verbesserung der Sensitivität bei der Präparation von Mykobakterien-DNA
aus Patientenmaterial 85
4.3.2.1 Verwendung von Lysozym zur Lyse der Zellwand 86
4.3.2.2 Anwendung von Proteinase K 88
4.3.2.3 Reduktion der Inkubationszeit bei paralleler Verwendung von Lysozym
und Proteinase K 91
4.3.2.4 Anwendung der Inhibitionskontrolle beim Direktnachweis 93 4.3.3 Anwendung des Direktnachweisformats 95 4.3.3.1 Interpretation der Ergebnisse der Schmelzpunktanalyse 95 4.3.3.2 Anwendung an Proben mit tuberkulösen Mykobakterien 96 4.3.3.3 Anwendung an Proben mit nichttuberkulösen Mykobakterien 97 4.4 Unterscheidung innerhalb des M. tuberculosis-Komplexes 99 4.4.1 Identifizierung von M. tuberculosis 100 4.4.1.1 Entwicklung einer Sonde zur Detektion des T/C-Polymorphismus 100 4.4.1.2 Spezifität der neuen M. tuberculosis-Sonde LC64 103 4.4.2 Identifizierung von bovinen Mykobakterien 104 4.4.3 Identifizierung von M. bovis BCG 106
4.4.3.1 Entwicklung einer Sonde zur Identifizierung von M. bovis BCG am
3` Übergang der RD1-Region 106
4.4.3.2 Entwicklung einer Sonde zur Identifizierung von M. bovis BCG am
5` Übergang der RD1-Region 108
4.4.4 Anwendung an Kulturisolaten aus Patientenproben 111
5 Diskussion 115
6 Zusammenfassung / Summary 126
7 Literaturverzeichnis 130
8 Anhang 146
8.1 Sequenzvergleiche 146
8.2 Weitere Differenzierung der kulturellen Patientenisolate 148 8.3 Versuch zur Kreuzkontamination im KingFisher mL Partikelprozessor 149 8.4 Wiederholungsversuche zur Präparation von Mykobakterien-DNA direkt
aus Patientenmaterial 149 8.5 Nährmedien und Zusätze 151
8.6 Lösungen und Puffer 152 8.6.1 Allgemein verwendete Lösungen und Zusätze 152 8.6.2 Lösungen und Puffer für die Dekontamination 152 8.6.3 Lösungen und Puffer für die Untersuchung von Kulturisolaten 153 8.6.4 Lösungen und Puffer für die Aufbereitung von Patientenmaterialien 153
8.7 Kits 153
8.8 Enzyme 154
8.8.1 Restriktionsenzyme 154
8.8.2 Weitere Enzyme 154
8.9 Chemikalien 154
8.10 Geräte 155
8.11 Verbrauchsmaterialien 155
Abbildungsverzeichnis
Abb. 2.1: Übersicht der Mykobakterien-Diagnostik der Medizinischen Hochschule
Hannover 28 Abb. 4.1: Genusspezifische Sonde mit der Inhibitionskontrolle pJL6 im F2-Kanal 57 Abb. 4.2: TBC-spezifische Sonde mit der Inhibitionskontrolle pJL6 im F3-Kanal 57 Abb. 4.3: 16S rRNA-Gen von M. tuberculosis subkloniert in pJL6 59 Abb. 4.4: Verändertes 16S rRNA-Gen von M. tuberculosis im neuen Konstrukt 59 Abb. 4.5: Gelansicht: Plasmide pJL6 und pJL8 nach EcoNI-Verdau 60
Abb. 4.6: Vektorkarte von pAB1 61
Abb. 4.7: Vektorkarte von pAB2 62
Abb. 4.8: Vergleich der Inhibitionskontrolle pJL6 mit pAB2 in der PCR-Reaktion 63 Abb. 4.9: Genusspezifische Sonde mit der Inhibitionskontrolle pAB2 im F2-Kanal 64 Abb. 4.10: TBC-spezifische Sonde mit der Inhibitionskontrolle pAB2 im F3-Kanal 64 Abb. 4.11: Spezifität der M. chelonae/abscessus-Sonde LC86 71 Abb. 4.12: Überprüfung der Positivkontrollen hinsichtlich der Kreuzkontamination 84 Abb. 4.13: Überprüfung der Negativkontrollen hinsichtlich der Kreuzkontamination 84 Abb. 4.14: Verschiedene Inkubationszeiten mit Lysozym bei 50 Bakterien BCG 87 Abb. 4.15: Verschiedene Inkubationszeiten mit Lysozym bei 25 Bakterien BCG 87 Abb. 4.16: Verschiedene Inkubationszeiten mit Lysozym bei 10 Bakterien BCG 88 Abb. 4.17: Auswirkung beim Einsatz von Proteinase K bei 50 Bakterien BCG 89 Abb. 4.18: Auswirkung beim Einsatz von Proteinase K bei 25 Bakterien BCG 90 Abb. 4.19: Auswirkung beim Einsatz von Proteinase K bei 10 Bakterien BCG 90 Abb. 4.20: Kombinierte Anwendung von Lysozym und Proteinase K bei 50 Bakterien
BCG 91
Abb. 4.21: Kombinierte Anwendung von Lysozym und Proteinase K bei 25 Bakterien
BCG 92
Abb. 4.22: Kombinierte Anwendung von Lysozym und Proteinase K bei 10 Bakterien
BCG 92
Abb. 4.23: Sensitivität der Proben-DNA beim Einsatz von 200 Kopien pAB2 94 Abb. 4.24: Sensitivität der Proben-DNA beim Einsatz von 100 Kopien pAB2 94 Abb. 4.25: Sensitivität und Spezifität für die Untersuchung tuberkulöser Proben 97 Abb. 4.26: Sensitivität und Spezifität für alle untersuchten Proben 98 Abb. 4.27: Sensitivität und Spezifität für alle untersuchten Proben, die säurefeste
Stäbchen im Direktausstrich zeigen 99
Abb. 4.28: Sequenzvergleich vom Promotorbereich narGHJI von tuberkulösen und
bovinen Mykobakterien (Ausschnitt) 100
Abb. 4.29: Promotorsonde LC65 zur Identifizierung von M. tuberculosis 101 Abb. 4.30: Promotorsonde LC64 zur Identifizierung von M. tuberculosis 102 Abb. 4.31: Spezifität der M. tuberculosis-Sonde LC64 mit nichttuberkulösen
Mykobakterien 103 Abb. 4.32: Sequenzvergleich vom oxyR-Gen von tuberkulösen und bovinen
Mykobakterien (Ausschnitt) 104
Abb. 4.33: Bovine Sonde LC94 zur Identifizierung von bovinen Mykobakterien 105 Abb. 4.34: Darstellung der RD1-Region am 3` Übergang mit der BCG-Sonde LC79 107 Abb. 4.35: BCG-Sonde LC79 zur Identifizierung von M. bovis BCG 108 Abb. 4.36: Darstellung der RD1-Region am 5` Übergang mit der BCG-Sonde LC85 109 Abb. 4.37: BCG-Sonde LC85 zur Identifizierung von M. bovis BCG 110 Abb. 4.38: Gelansicht: Amplifikate der Spezies des M. tuberculosis-Komplexes vom
Promotor- und RD1-Fragment 111
Abb. 4.39: Übersicht der Differenzierung des M. tuberculosis-Komplexes 112 Abb. 8.3: Versuch der Fa. THERMOLABSYSTEMS zur Kreuzkontamination 149
Tabellenverzeichnis
Tab. 2.1: Einteilung nichttuberkulöser Mykobakterien nach RUNYON 13 Tab. 2.2: Nitratreduktase-Aktivität der Spezies des M. tuberculosis-Komplexes 20 Tab. 3.1: Verwendete Plasmide zur Erstellung der neuen Inhibitionskontrolle 35 Tab. 3.2: Verwendete Primer für die konventionelle Polymerase-Kettenreaktion 39 Tab. 3.3: Programm für die konventionelle Polymerase-Kettenreaktion 39 Tab. 3.4: Verwendete Primer für die Polymerase-Kettenreaktion im real-time Modus 39 Tab. 3.5: Verwendete Sondenpaare für die Polymerase-Kettenreaktion im real-time
Modus 40 Tab. 3.6: Untersuchte Probenmaterialien der Pilotstudie 41
Tab. 3.7: Patientengruppen der Pilotstudie 41
Tab. 3.8: Untersuchte Probenmaterialien der Hauptstudie I 41
Tab. 3.9: Patientengruppen der Hauptstudie I 42
Tab. 3.10: Untersuchte Probenmaterialien der Hauptstudie II 42
Tab. 3.11: Patientengruppen der Hauptstudie II 42
Tab. 3.12: Verwendete Primer für die Untersuchung von Kulturisolaten 43 Tab. 3.13: Verwendete Sondenpaare für die Untersuchung von Kulturisolaten 43 Tab. 3.14: Verwendete Primer für den Direktnachweis von mykobakterieller DNA 47 Tab. 3.15: Verwendete Sondenpaare für den Direktnachweis von mykobakterieller DNA 48 Tab. 3.16: Aufstellung der verwendeten nichttuberkulösen Mykobakterien 49 Tab. 3.17: Verwendete Primer zur Unterscheidung innerhalb des M. tuberculosis-
Komplexes 50 Tab. 3.18: Programm für die Amplifikation und anschließende Sondenhybridisierung am
LightCycler 53 Tab. 4.1: Vergleich der Ergebnisse der Routinediagnostik und PCR in der Pilotstudie 68 Tab. 4.2: Nachweisgrenze der Inhibitionskontrolle in kulturellen Patientenisolaten 70 Tab. 4.3: Vergleich der Ergebnisse der Routinediagnostik und PCR in der Hauptstudie I 74 Tab. 4.4: Vergleich der Ergebnisse der Routinediagnostik und PCR in der Hauptstudie II 76 Tab. 4.5: Ergebnisse des Abschnitts I der Studie Nordstadtkrankenhaus 79 Tab. 4.6: Ergebnisse des Abschnitts II der Studie Nordstadtkrankenhaus 81 Tab. 4.7: Interpretation der Ergebnisse der Schmelzpunktanalyse aus Direktmaterial 96 Tab. 4.8: Unterscheidung des M. tuberculosis-Komplexes an klinischen
Patientenmaterialien 113 Tab. 4.9: Schmelzpunkt-Profil der Mykobakterien des M. tuberculosis-Komplexes 113 Tab. 8.1: Isolierte Mykobakterien-Spezies mit Hilfe der PCR in der Pilotstudie 148 Tab. 8.2: Isolierte Mykobakterien-Spezies mit Hilfe der PCR in der Hauptstudie I 148
Tab. 8.3: Isolierte Mykobakterien-Spezies mit Hilfe der PCR in der Hauptstudie II 149 Tab. 8.4: Vergleich: Auswirkung auf die Präparationausbeute bei verschiedenen
Inkubationszeiten mit Lysozym 150
Tab. 8.5: Vergleich: Auswirkung auf die Präparationsausbeute mit und ohne
Proteinase K 150
Tab. 8.6: Vergleich: Auswirkung auf die Präparationsausbeute bei gleichzeitigem
Einsatz von Proteinase K für verschieden Lysozyminkubationszeiten 151
Tab. 8.7: Verwendete Kits 153
Tab. 8.8: Verwendete Restriktionsenzyme 154
Tab. 8.9: Weitere verwendete Enzyme 154
Tab. 8.10: Verwendete Chemikalien 154
Tab. 8.11: Verwendete Geräte 155
Tab. 8.12: Verbrauchsmaterialien 155
Abkürzungsverzeichnis
A Base Adenin
Abb. Abbildung
AIDS Erworbenes Immundefizienz Syndrom (engl. acquired immune deficiency syndrome)
AFB säurefeste Stäbchen (engl. acid fast bacilli) AG Arbeitsgruppe
ATCC Amerikanische Kulturensammlung (engl. American Type Culture Collection)
Aqua dest. Aqua destillata
BCG Bacillus Calmette Guérin
BgVV Bundesinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin
BSA Bovines Serum Albumin bp Basenpaare (engl. base pairs)
C Base Cytosin
CF Cystische Fibrose
CGD Chronische granulomatöse Erkrankung (engl. chronic granulomatous disease)
DNA Desoxyribonukleinsäure (engl. deoxyribonucleic acid) dNTP Desoxyribonukleotidtriphosphat
DR Direkte Wiederholung (engl. direct repeat)
DSMZ Deutsche Stammsammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure (engl. ethylene diamine tetra acetate) ELISA Enzym-Immunoassay (engl. enzyme linked immunosorbent assay)
Fa. Firma
FDA Amerikanische Aufsichtsbehörde für Nahrungs- und Arzneimittel (engl.
Food and Drug Administration) FITC Fluoreszenz-Isothiocyanat
FRET Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer
G Base Guanin
x g Gravitätskonstante (9,81 m/sec²) gyrB Gen für die Gyrase
h Stunde (engl. hour)
He-La Helene Lang Zellen
HIV Humanes Immundefizienz Virus hsp Gen für ein Hitzeschockprotein
HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (engl. high performance liquid chromatography)
ID Identität
IS Insertionssequenz
ITS Sequenzen zwischen transkribierten Sequenzen (engl. internal transcribed spacer)
KBE Kolonie bildende Einheit KF KingFisher mL Gerät kb Kilobasenpaare
LB Medium Luria-Bertani Medium (Lennox L Broth) LC LightCycler
LCR Ligase-Kettenreaktion (engl. ligase chain reaction) M. Mycobacterium
MAC Mycobacterium avium-intracellulare-Complex
MGIT Indikatorröhrchen für mykobakterielles Wachstum (engl. mycobacterial growth indicator tube)
MHH Medizinische Hochschule Hannover
mRNA Boten-Ribonukleinsäure (engl. messenger ribonucleic acid) NALC N-Acetyl-L-Cystein
narGHJI Gene für die anaerobe Nitratreduktase
NCBI Nationales Zentrum für biotechnologische Information (engl. National Center for Biotechnology Information)
NAD Nicotinamidadenindinukleotid
NADP Nicotinamidadenindinukleotid-phosphat
NRZ Nationales Referenzzentrum für Mykobakterien NTM Nichttuberkulöse Mykobakterien
OD(x) Optische Dichte,gemessen bei einer Wellenlänge von x nm ori Startpunkt der Replikation (engl. origin of replication)
oxyR Gene für die oxidative Stressantwort
PANTA Polymixin B, Amphotericin B, Nalixinsäure, Trimethoprim, Azlocillin PCR Polymerase-Kettenreaktion (engl. polymerase chain reaction) Pfu Pyrococcus furiosus
pH negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionen-Konzentration PZA Pyrazinamid
RD Region mit unterschiedlichen Sequenzen (engl. region of differences) RFLP Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (engl. restriction fragment
lenght polymorphism)
rRNA ribosomale Ribonukleinsäure (engl. ribosomal ribonucleic acid) rpm Umdrehungen pro Minute (engl. rounds per minute)
RT Reverse Transkriptase RV Ringversuch
S Sedimentationskonstante in Svedberg
SCID Schwerer kombinierter Immundefekt (engl. severe combined immunodeficiency)
SD Standardabweichung (engl. standard deviation)
SDA Stangverdrängungsamplifikation (engl. strand displacement amplification)
SDS Natriumdodecylsulfat (engl. sodiumdodecylsulfate) ssp. Subspezies
T Base Thymin
TAE TRIS-Acetat-EDTA Taq Thermus aquaticus TBC M. tuberculosis-Complex
TE TRIS-EDTA
TRIS Tris(hydromethyl)aminoethan
U Einheit der Enzymaktivität (engl. unit) UV Ultraviolett
WHO Weltgesundheitsorganisation (engl. world health organisation) ZN Ziehl-Neelsen
1 Einleitung
Die Tuberkulose verschuldet jährlich zwei bis drei Millionen Todesfälle beim Menschen. Weltweit ist sie die häufigste bakteriell bedingte Todesursache, etwa ein Drittel der Weltbevölkerung ist mit dem Tuberkulose-Erreger infiziert. In Folge der Verbreitung des Humanen Immundefizienz Virus (HIV), mehrfach-resistenten Bakterienstämmen und erhöhtem internationalen Reiseverkehr wird von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) angenommen, dass zwischen 2002 und 2020 ca. eine Milliarde Menschen neu infiziert, 150 Millionen an Tuberkulose erkranken und 36 Millionen an Tuberkulose sterben werden (WHO 2003). Laut Mitteilung des Robert-Koch-Instituts ist die Tuberkulose nach den Virushepatitiden vom Typ B und C, sowie dem erworbenen Immundefizienz Syndrom (AIDS) die vierthäufigste infektionsbedingte Todesursache in Deutschland (ROBERT-KOCH-INSTITUT 2003).
Unterschieden wird zwischen den klassischen Tuberkulosen, die beim Mensch hauptsächlich durch Mycobacterium (M.) tuberculosis und beim Rind hauptsächlich durch M. bovis verursacht werden, und den Mykobakteriosen, die durch fakultativ pathogene Mykobakterien (sog. nichttuberkulöse oder atypische Mykobakterien) ausgelöst werden. Die Bedeutung der Mykobakteriosen, vor allem bedingt durch den M. avium-intracellulare-Komplex, ist durch die Verbreitung von HIV und AIDS in den letzten Jahren drastisch gestiegen (METCHOCK et al. 1999).
Die Diagnostik gestaltet sich aufgrund des langsamen Wachstums von Mykobakterien schwierig und zeitaufwendig. Der klassische mikrobiologische Nachweis umfasst die Färbung auf Säurefestigkeit und die anschließende Detektion in der Kultur. Um den langen Zeitraum bis zum endgültigen Nachweis aus der Kultur zu überbrücken, sollte ein Direktnachweis aus Patientenmaterial, der zwischen tuberkulösen und nichttuberkulösen Mykobakterien unterscheiden kann, mit Hilfe weiterer Methoden erfolgen. In den letzten Jahren wurden dafür verstärkt molekularbiologische Nachweismethoden entwickelt, die vor allem auf der Grundlage der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) basieren (VAN SOOLINGEN 2001). Die spezifische Identifizierung erfolgt anschließend mit Hilfe von Gensonden, Restriktionsenzymen oder der Sequenzanalyse.
Ziel dieser Promotionsarbeit war es, im ersten Abschnitt ein in vitro entwickeltes Nachweisformat für Mykobakterien mit Hilfe der PCR und anschließender Schmelzpunktanalyse an Patientenisolaten aus der Kultur zu testen. Dabei sollte durch den Einsatz von verschiedenen spezifischen Sonden eine Unterscheidung von tuberkulösen und nichttuberkulösen Mykobakterien im Rahmen einer Multiplex-PCR
ermöglicht werden. Als Zielstruktur diente das 16S rRNA-Gen. Von den nichttuberkulösen Mykobakterien sollten außerdem die im Institut für Medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene der Medizinischen Hochschule Hannover (MHH) nach dem M. tuberculosis-Komplex (TBC) am häufigsten nachgewiesenen Erreger, M. avium ssp. avium und der M. chelonae-abscessus-Komplex, weiter differenziert werden. Die arbeits- und kostenintensive Sequenzierung von mykobakterieller Desoxyribonukleinsäure (DNA) aus der Kultur könnte damit in den meisten Fällen durch die Amplifikation mit anschließender Schmelzpunktanalyse ersetzt werden.
Um die Mykobakterien-Diagnostik noch weiter zu optimieren, sollte in einem weiteren Abschnitt ein Nachweis von Mykobakterien-DNA aus Direktmaterial erfolgen. Dafür musste eine Präparationsmethode zur Isolierung von genomischer mykobakterieller DNA aus Patientenmaterial entwickelt werden, die eine anschließende Amplifikation mittels PCR ermöglichte. Die Methode sollte sensitiv, spezifisch und wenig zeitaufwendig für die Anwendung in der klinischen Diagnostik sein.
Zudem sollte eine Unterscheidung und Identifizierung der wichtigsten Spezies des TBC, M. tuberculosis, M. bovis und dem attenuierten M. bovis-Stamm, Bacillus Calmette Guérin (BCG), aus Kulturisolaten mit Hilfe der PCR erfolgen. Dafür mussten andere Zielstrukturen verwendet werden, da alle Spezies des TBC in ihrer Sequenz auf dem 16S rRNA-Gen identisch sind.
Der Arbeitsaufwand und Zeitbedarf in der Mykobakteriendiagnostik würde durch den Einsatz der PCR mit anschließender Schmelzpunktanalyse deutlich reduziert werden. Dies bedeutet einen enormen Fortschritt für die klinische Praxis, da Therapie- und Isolierungsmaßnahmen schneller und gezielter eingeleitet werden können.
2 Literaturübersicht
2.1 Taxonomie und allgemeine Eigenschaften von Mykobakterien Mykobakterien gehören zur Familie der Mycobacteriaceae und leben als Saprophyten, opportunistische und obligate Krankheitserreger.
Sie sind schlanke, gerade bis leicht gekrümmte Stäbchen mit 0,2-0,6 µm Breite und 1 bis 10 µm Länge. Sie wachsen unter aeroben bis mikroaerophilen Bedingungen (5- 10% CO2), sind unbeweglich und bilden keine Sporen (SALFINGER u. KAFADER 1992).
Die Zellwand hat einen hohen Lipidgehalt, der aus Wachsen und charakteristischen Mykolsäuren mit langen Seitenketten besteht. Aufgrund der Wachshülle sind Mykobakterien mit den üblichen Anilinfarbstoffen nicht anfärbbar. Sie werden jedoch als grampositiv eingestuft. Für den Nachweis von Mykobakterien werden besondere Färbemethoden (z.B. nach Ziehl-Neelsen, Auramin-Färbung) angewendet. Dabei zeigt sich nach der Entfärbung mit salzsaurem Alkohol die typische Resistenz, der Farbstoff bleibt in der Lipidschicht der Zellwand, was als Säurefestigkeit bezeichnet wird (HAHN 1999).
Die Genomgröße eines Mykobakteriums beträgt etwa 4,4 Millionen Basenpaare (COLE et al. 1998). Der hohe G/C-Gehalt der DNA (62-70%) ist den anderen mykolsäurehaltigen Bakterien wie Nocardien (60-69%), Rhodokokken (59-69%) und Corynebakterien (51-59%) sehr ähnlich (METCHOCK et al. 1999).
Um dem Genus Mycobacterium zugeschrieben zu werden, muss ein neues, langsam wachsendes Bakterium folgende Anforderungen erfüllen (LEVY-FREBAULT u.
PORTALES 1992):
• Säurefestigkeit,
• Anwesenheit von Mykolsäuren bestehend aus 60-90 Kohlenstoffatomen, die durch Pyrolyse in Fettsäuremethylester mit 22-26 Kohlenstoffatomen
gespalten werden können und
• G/C-Gehalt der DNA von mindestens 61-71%.
Diese Minimalanforderungen gelten lediglich für langsamwachsende Mykobakterien, für schnellwachsende Spezies gelten diese Kriterien bis zum heutigen Tage nicht.
Primär können Mykobakterien in zwei Gruppen eingeteilt werden:
Gruppe 1: alle Spezies des TBC
Gruppe 2: alle Spezies, die nicht dem TBC angehören
Letztere werden auch als atypische oder nichttuberkulöse Mykobakterien bezeichnet.
Die Bakterien des TBC sind genetisch so eng miteinander verwandt, dass man eher von „Subspezies“ als von „Spezies“ sprechen kann (VAN SOOLINGEN et al. 1997).
Eine weitere Einteilung der Mykobakterien beruht auf der Wachstumsgeschwindig- keit. Schnellwachsende Mykobakterien benötigen weniger als sieben Tage, um sichtbare Kolonien auf Festmedien zu formen, während langsamwachsende Mykobakterien unter vergleichbaren Bedingungen mehr als sieben Tage benötigen.
Die Koloniemorphologie variiert unter den verschiedenen Spezies, sie reicht von rauen bis glatten Kolonien, die pigmentiert oder unpigmentiert sein können. Als Wachstumssubstrate werden Stickstoff und Ammoniumquellen benötigt, zusätzlich Mineralsalze. Eine Ausnahmestellung gegenüber allen anderen Mykobakterien nimmt M. leprae ein, welches nicht in vitro angezüchtet werden kann (METCHOCK et al. 1999).
Weiterhin können Mykobakterien auch nach dem Pathogenitätspotential eingeteilt werden (BÖTTGER 1991):
Risikogruppe I: beinhaltet alle saprophytären Mykobakterien, deren Nachweis nur in Ausnahmefällen eine klinische Relevanz besitzt
Risikogruppe II: beinhaltet die fakultativ pathogenen Mykobakterien, deren Nachweis bei immunsupprimierten Patienten von hoher Bedeutung ist
Risikogruppe III: beinhaltet alle obligat pathogenen Mykobakterien
2.2 Vorkommen und Bedeutung
Die meisten Mykobakterien sind ubiquitär vorkommende Umweltkeime, vor allem im Erdboden und Wasser, die saprophytär leben. Sie konnten in Ackerböden, Staub (v.a. M. fortuitum), Klärschlamm, Aquarien, natürlichen und künstlichen Gewässern, Schwimmbädern (v.a. M. marinum) und in Wasserleitungen (v.a. M. gordonae, M. kansasii) nachgewiesen werden (DEDIE 1993). Ausschließlich pathogene Keime, wie M. tuberculosis und M. leprae, welche sich in der unbelebten Umwelt nicht vermehren können und rein parasitär leben, stellen die Ausnahme in der Gattung Mycobacterium dar (SCHULE-RÖBBECKE 1993).
2.3 Der M. tuberculosis-Komplex
Der klassische TBC beinhaltet die Spezies M. tuberculosis, M. africanum, M. microti, M. canetti und M. bovis. M. bovis BCG ist ein attenuierter Stamm vom virulenten
Stamm M. bovis und wird in vielen Ländern als Impfstoff gegen die Tuberkulose verwendet (TALBOT et al. 1997b).
Die einzelnen Spezies sind sich in ihrem Erscheinungsbild sehr ähnlich und können aufgrund des identischen 16S rRNA-Gens mit Hilfe kommerziell erhältlicher Kits zum Nachweis von tuberkulösen Mykobakterien nicht weiter differenziert werden. Eine Differenzierung innerhalb des TBC ist jedoch für die Behandlung der erkrankten Patienten und für epidemiologische Zwecke, v.a. dort, wo die Tuberkulose endemische Proportionen erreicht hat, oder wo die Übertragung von M. bovis zwischen Mensch und Tier eine grosse Rolle spielt, nötig (PARSONS et al. 2002).
Zudem kann es insbesondere bei immunsupprimierten Patienten wichtig sein, M. bovis BCG als Erreger zu identifizieren bzw. auszuschließen, da diese Personengruppen an M. bovis BCG induzierten Krankheiten erkranken können (TALBOT et al. 1997b).
Eine Differenzierung erfolgt zumeist durch phänotypische Charakterisierung, wie Koloniemorphologie, Wachstumsgeschwindigkeit oder durch biochemische Tests.
Dabei treten jedoch bei einzelnen Spezies aufgrund abweichenden Verhaltens Schwierigkeiten in der Differenzierung auf und können so zu einer falschen Klassifizierung führen.
2.3.1 M. tuberculosis
M. tuberculosis, 1886 von Robert Koch entdeckt, ist der klassische Erreger der humanen Tuberkulose.
Infektionen bei Tieren mit diesem Erreger sind äußerst selten und werden in der Regel durch den Menschen übertragen.
Es wird davon ausgegangen, dass sich M. tuberculosis, der weltweit am meisten verbreitete Erreger der humanen Tuberkulose, aus M. bovis, dem Erreger der bovinen Tuberkulose, durch Adaption des tierischen Agens an den menschlichen Wirt entwickelt hat (BROSCH et al. 2002). Etwa 95% der in der MHH isolierten Spezies des TBC sind M. tuberculosis zuzuweisen.
Virulente Stämme von M. tuberculosis zeigen in der Kultur ein zopf- bzw.
strangartiges Wachstum, was durch den sog. Cordfaktor verursacht wird. Dieser Cordfaktor wird durch das Trehalose-6,6-Dimykolat, ein besonderes Lipid, gebildet.
Nach Extraktion dieses Cordfaktors geht die Virulenz von M. tuberculosis verloren (HAHN 1999).
Die Identifizierung von M. tuberculosis aus dem TBC erfolgt im Routinelabor häufig über die Bestimmung der Nitratreduktaseaktivität (SREEVATSAN et al. 1996).
M. tuberculosis ist im Gegensatz zu den anderen TBC-Spezies in der Lage, sehr schnell und in großen Mengen aus Nitrat Nitrit zu bilden. Diese Eigenschaft macht man sich zunutze und misst die Nitritproduktion in einer Diazo-Reaktion (vgl.
Kapitel 2.5.5.2).
2.3.2 M. africanum
Erste Beschreibungen von diesem Erreger des TBC stammen von CASTETS und Mitarbeitern (1968).
M. africanum wird als Erreger der humanen Tuberkulose in bestimmten Regionen Afrikas angesehen. Dort werden mehr als 60% der Tuberkulose-Fälle nicht M. tuberculosis, sondern M. africanum zugeschrieben. Allerdings gibt es eine sehr hohe Variabilität in der Prävalenz innerhalb unterschiedlicher Regionen Afrikas (KALLENIUS et al. 1999; BONARD et al. 2000).
M. africanum wird aufgrund der biochemischen Eigenschaften als eine Zwischenform von M. tuberculosis und M. bovis angesehen. Im Gegensatz zu M. tuberculosis und M. bovis zeigt M. africanum eine höhere Variabilität in der Phänotyperscheinung, was zu einer erschwerten Diagnose und teilweise zu einer falschen Klassifizierung führt (VAN SOOLINGEN 2001; NIEMANN et al. 2002). Aufgrund der biochemischen Charakterisierung kann M. africanum in zwei Subtypen eingeteilt werden. Stämme, die in Westafrika isoliert werden konnten, wurden dem Subtyp I zugeordnet, während Stämme aus dem Osten Afrikas dem Subtyp II zugeordnet wurden. Die biochemische Charakterisierung dieser Subtypen zeigte, dass Subtyp I eher zu den Eigenschaften von M. bovis passt, während Subtyp II M. tuberculosis ähnlicher ist (NIEMANN et al. 2002). Das Erscheinungsbild der Tuberkulose bedingt durch M. africanum unterscheidet sich nicht von den durch M. tuberculosis hervorgerufenen Symptomen.
2.3.3 M. microti
M. microti wurde zum ersten Mal 1937 als Erreger der Tuberkulose bei Wühlmäusen beschrieben (WELLS u. OXON 1937) und trägt daher auch die Bezeichnung
„VoleTB“. Aufgrund von molekularbiologischen Untersuchungen kann man M. microti in die Subspezies „Vole-Typ“ und „Ilama-Typ“ einteilen (VAN SOOLINGEN et al.
1998, 2001). Charakteristische Erscheinungsbilder einer Infektion sind die typischen Hautläsionen und Lymphadenitiden.
M. microti zeigt unter dem Mikroskop eine pleomorphe, charakteristische Morphologie. Die säurefesten Stäbchen sind s-förmig, manchmal spiralförmig oder sichelförmig im Frischmaterial zu sehen. Dieses typische kurvige Erscheinungsbild geht jedoch bei der in vitro Kultur verloren (CAVANAGH et al. 2002).
Typisch für den Erreger ist das besonders langsame Wachstum in der Kultur von mindestens acht Wochen (VAN SOOLINGEN et al. 1998).
Lange Zeit galt M. microti als nicht pathogen für den Menschen. HORSTKOTTE und Mitarbeiter (2001) beschrieben die erste pulmonale Infektion mit M. microti Ilama Typ I bei HIV-positiven Patienten. In den Niederlanden wurden vier Fälle von Infektionen mit M. microti beim Menschen beschrieben (VAN SOOLINGEN et al. 1998; KREMER et al. 1998). Die aus diesen Patienten isolierten Erreger zeigten Ähnlichkeiten mit den zuvor aus Frettchen und Schwein isolierten Erregern von M. microti. Eine der beschrieben Personen war nicht immunsupprimiert. Drei weitere Fälle wurden für immunkompetente Personen in der Schweiz und in Deutschland beschrieben (NIEMANN et al. 2000b). Bei allen beschriebenen Erkrankungen bedingt durch M. microti handelte es sich um pulmonale oder generalisierte Formen der Tuberkulose.
Die Detektion von M. microti wird durch das besonders langsame Wachstum dieser Spezies behindert. Auf festen Nährböden benötigt der Erreger mindestens 6 bis 12 Wochen, um sichtbare Kolonien auszubilden (CAVANAGH et al. 2002). In flüssigen Nährböden erfolgt das Wachstum schneller. In vielen Routinelaboratorien werden die Kulturen jedoch nicht lange genug inkubiert, um ein Wachstum dieser Spezies nachzuweisen. Vor allem in Gebieten mit hoher Prävalenz an Nagern wird angenommen, dass es weit mehr Infektionen mit M. microti gibt, als nachgewiesen wurden (VAN SOOLINGEN 2001).
2.3.4 M. canetti
M. canetti wurde 1997 erstmalig als neue Spezies des TBC beschrieben (VAN SOOLINGEN et al. 1997).
Bei diesem Erreger handelt es sich um eine selten vorkommende Variante von M. tuberculosis. Dieser vermutlich ausschließlich die humane Tuberkulose hervorrufende Erreger wurde von Patienten aus Afrika isoliert, bzw. von Patienten, die Kontakt dorthin hatten (BROSCH et al. 2002). Der Erreger verhält sich in biochemischen Tests ähnlich wie M. tuberculosis.
Im Gegensatz zu den anderen Mitgliedern des TBC bildet M. canetti auf festen Nährböden jedoch glatte, glänzende Kolonien, was einen sehr auffälligen
Unterschied darstellt. Einige dieser Kolonien können sich unwiderruflich in rauhe Formen umwandeln. Beide Formen sind hoch infektiös im Meerschweinchen- Versuch. Weiterhin hat M. canetti eine wesentlich kürzere Generationszeit als M. bovis und M. tuberculosis, Unterschiede im Lipidgehalt der Zellwand (charakteristische Glykolipide und Lipooligosaccharide) und Unterschiede im Polymorphismus der Insertionssequenz (IS) IS1081 (VAN SOOLINGEN et al. 1997).
Das charakteristische Glykolipid wurde erstmals in einer Variante von M. tuberculosis bei einem französischen Bauern 1969 von Georges Canetti isoliert (GOH et al.
2001).
Alle bekannten, neueren Fälle von M. canetti stammen von Patienten aus Afrika. Es ist demzufolge möglich, dass die Region um Ostafrika das geographische Zentrum für M. canetti darstellt. VAN SOOLINGEN und Mitarbeiter (1997) beschrieben zwei Fälle einer Lymphknoten-Tuberkulose, deren Stämme eindeutig als M. canetti identifiziert werden konnten. In den von MILTGEN und Mitarbeitern (2002) beschriebenen Fällen lag eine Lungentuberkulose bei immunkompetenten Personen vor.
2.3.5 M. bovis
M. bovis gilt als der klassische Erreger der bovinen Tuberkulose. Infektionen mit M. bovis beim Menschen entstehen zumeist über den Verzehr roher Milch von infizierten Kühen. Eine Übertragung von Mensch zu Mensch ist mit diesem Erreger selten (VAN SOOLINGEN 2001). Auch andere Tiere, wie Hunde, Katzen, Schweine und einige Vogelarten können sich mit M. bovis infizieren. Im Vergleich zu Infektionen mit M. tuberculosis ist das klinische Erscheinungsbild von M. bovis häufiger extrapulmonal.
Das Hauptkriterium für die Differenzierung von M. bovis ist die Pyrazinamid (PZA)- Resistenz. Allerdings zeigten Studien, dass nicht alle M. bovis-Stämme dieses Merkmal aufwiesen. Einige Stämme waren PZA sensibel (COLLINS et al. 1981;
WAYNE et al. 1991; NIEMANN et al. 2000b).
Aufgrund der erfolgreichen Rindertuberkulosebekämpfung in Deutschland, die durch die Verordnung zum Schutz gegen die Tuberkulose des Rindes geregelt wird, kommt die Erkrankung nur noch sehr selten vor. Laut Tierseuchenbericht gab es im Jahr 2003 im ersten Quartal drei Fälle von Rindertuberkulose in Deutschland (BUNDESMINISTERIUM FÜR VERBRAUCHERSCHUTZ 2003).
Infektionen mit M. bovis beim Wildtier sind bekannt (NOLAN u. WILESMITH 1994;
DE LISLE et al. 2002). Weltweit verursacht M. bovis in der Veterinärmedizin einen wirtschaftlichen Schaden von drei Millionen Dollar (GARNIER et al. 2003).
Der größte Anteil der Tuberkulose beim Tier wird durch M. bovis verursacht.
Stämme, die aus Ziegen isoliert wurden, zeigten genetische Unterschiede, die bei den herkömmlichen M. bovis-Stämmen nicht gefunden werden konnten. Eine neue Bezeichnung für diesen Stamm als M. bovis ssp. caprae (im folgenden M. bovis caprae genannt) wurde von ARANZAZ und Mitarbeitern (1999) vorgeschlagen.
PRODINGER und Mitarbeiter (2002) beschrieben zwölf Fälle von M. bovis caprae in Österreich seit 1994, bei denen Rinder, Hirsche, aber auch Menschen betroffen waren. Der Kontakt mit Rindern, nicht aber mit Ziegen, war bei drei der vier infizierten Menschen gegeben.
2.3.6 M. bovis BCG
Von 1908 bis 1921 wurde der virulente Stamm von M. bovis 231 mal im Institut Pasteur von Albert Calmette und Camille Guèrin auf verschiedenen Nährböden passagiert. Seit 1921 wird dieser attenuierte M. bovis-Stamm als Lebendvakzine gegen die Tuberkulose in der ganzen Welt eingesetzt.
Die meisten Personen tolerieren den Impfstoff ohne Komplikationen und bilden eine spezifische Immunität gegen Infektionen mit dem TBC aus. Die WHO empfiehlt noch heute in endemischen Tuberkulose-Gebieten eine einmalige Vakzination von allen Kindern, die keine Symptome einer HIV-Infektion zeigen.
Treten nach der Impfung Komplikationen auf, so handelt es sich meistens um lokale Infektionen in Form von eitrigen Lymphadenitiden. Allerdings gibt es Berichte (CASANOVA et al. 1995, 1996; TALBOT et al. 1997a, 1997b; ANTAYA et al. 2001), in denen von Personen berichtet wird, die schwere Infektionen durch die Vakzination mit dem attenuierten M. bovis-Stamm zeigen. Dabei handelt es sich um Patienten, die eine geschwächte zelluläre Immunität besitzen. Es traten neben lokal begrenzten Infektionen an der Impfstelle auch systemische Infektionen mit hoher Mortalität auf.
50% der disseminierten BCG-Infektionen traten bei Kindern mit einem festgestellten immundefizienten Syndrom auf, wie dem schweren kombinierten Immundefekt (SCID), den chronisch granulomatösen Erkrankungen (CGD) oder HIV. Die restlichen 50% werden als idiopathisch angesehen, allerdings wird ein nichtdiagnostizierter, genetisch bedingter Immundefekt vermutet (CASANOVA et al.
1995).
TALBOT und Mitarbeiter (1997a) untersuchten 28 veröffentlichte Fälle von generalisierten BCG-Erkrankungen und kamen dabei zu zwei neuen Erkenntnissen:
während früher die generalisierte BCG-Erkrankung als eine Erkrankung von Kleinkindern angesehen wurde, treten seit einiger Zeit Fälle auf, bei denen ältere Kinder und auch Erwachsene betroffen sind, die mit dem HI-Virus infiziert sind. Die beobachteten Fälle traten nach einer erneuten Vakzination mit dem BCG-Stamm auf.
Heutzutage scheinen die größten Risikogruppen immunsupprimierte Kinder und Personen im fortgeschrittenen Stadium von AIDS zu sein.
M. bovis BCG ist weiterhin als effektive Immuntherapie bei verschiedenen Krebserkrankungen (z.B. Behandlung von Harnblasenkarzinomen) bekannt (BROSMAN 1992). Allerdings treten auch bei diesen Personen Komplikationen bedingt durch den M. bovis BCG-Stamm auf, wie z. B. lokale Entzündungen und eine generalisierte BCGitis (LAMM et al. 1992).
2.3.7 Tuberkulose beim Menschen
2.3.7.1 Epidemiologie und Bedeutung
Die Tuberkulose ist seit Jahrhunderten diejenige bakterielle Infektionskrankheit, an der weltweit die meisten Menschen sterben. Inzidenz und Prävalenz der Erkrankung sind in den letzten 15 Jahren, bedingt durch zunehmenden internationalen Reiseverkehr, ansteigende Migration und das gehäufte Auftreten von HIV-Patienten, insbesondere in den Entwicklungsländern, stark gestiegen (STOKSTAD 2000;
NAKATANI et al. 2002).
Etwa ein Drittel der Weltbevölkerung ist latent mit M. tuberculosis infiziert, von denen nach Expertenschätzungen etwa 10% im Laufe ihres Lebens erkranken werden. In den Entwicklungsländern sterben jährlich zwei bis drei Millionen Menschen an Tuberkulose (WHO 2003).
Im Jahr 2000 hatte ein Drittel aller HIV-Infizierten eine Koinfektion mit Tuberkulose.
Für diese ist die Tuberkulose die häufigste Todesursache.
Weltweit treten etwa 95% aller Tuberkulosefälle in Entwicklungsländern auf.
Besonders stark betroffen sind Südostasien, Afrika und lateinamerikanische Staaten.
In Europa ist die Sterblichkeitsrate an Tuberkulose in Russland am höchsten (YEROKHIN et al. 2001). Betroffen sind dort v.a. Gefängnisinsassen, mit Inzidenzen von 7.000/100.000 Insassen (DEUTSCHES ZENTRALKOMMITEE ZUR BEKÄMPFUNG DER TUBERKULOSE 2003).
Die Tuberkulosesituation in Deutschland wird laut HAHN (1999) als nicht bedrohlich angesehen, allerdings gehört Deutschland nicht zu den sog. „low incidence countries“. Die Zahl der gemeldeten Neuerkrankungen an aktiver Tuberkulose im Jahr 2002 betrug 7.723. Das entspricht einer Inzidenz von 9,4 Erkrankungen auf 100.000 Einwohner. Der Anteil an erkrankten Ausländern beträgt 33,6% (ROBERT- KOCH-INSTITUT 2003).
Die Inzidenzraten lagen im Jahr 2000 bundesweit zwischen 17,2 Erkrankungen pro 100.000 Einwohner in Hamburg, 9,1 in Niedersachsen und 7,6 in Sachsen.
Niedersachsen und das Saarland haben steigende Inzidenzen zu verzeichnen, während sie in den anderen Bundesländern auf gleichem Niveau liegen.
Durch das Auftreten von multiresistenten Stämmen von M. tuberculosis ist die Anwendung von Therapeutika gegen die Tuberkulose ein Problem geworden (NOLAN 1997). Laut WHO ist die Anzahl an multiresistenten Stämmen in Deutschland und Dänemark seit 1996 um 50% auf 10,3% bzw. 13,1% angestiegen (STOKSTAD 2000). In Russland sind 7%, in bestimmten Regionen von Indien 14%
und in Estland 22% aller Stämme von M. tuberculosis resistent gegen Rifampicin und Isoniacid.
2.3.7.2 Ätiologie und Pathogenese
Die Tuberkulose wird durch Erreger des TBC hervorgerufen. Infektionsquellen sind erkrankte und infizierte Menschen. Der häufigste Übertragungsweg ist die Aerosolinfektion von Infizierten mit offener Tuberkulose, von untergeordneter Bedeutung bei der Übertragung sind Infektionen durch Staub, Nahrungsmittel- infektionen (Rohmilch, Fleisch) und Laborinfektionen. Das Sputum erkrankter und unbehandelter Personen enthält in jedem Tropfen große Mengen Mykobakterien.
Ansteckungsfähigkeit besteht, solange säurefeste Stäbchen im Direktpräparat nachweisbar sind.
Die ausgeworfenen Partikel sind 1-5 µm groß und können ein anderes Individuum beim Einatmen infizieren. Dabei reichen für gewöhnlich geringe Mengen an infektiösem Material aus, häufig ist aber auch die Resistenzlage der exponierten Person, die Häufigkeit und Dichte des Kontakts und die Virulenz des Erregers von Bedeutung (ROBERT-KOCH-INSTITUT 2003). Von extrapulmonalen Tuberkulosen geht kein nennenswertes Infektionsrisiko aus.
Voraussetzung für eine Erkrankung ist die Infektion mit großen Bakterienmengen und darauffolgender Erregervermehrung und –ausbreitung.
Charakteristische Ausbreitungswege sind (nach MATTHIESSEN 1992):
• lymphogene Streuung,
• hämatogene Aussaat nach Einbruch in das Gefäßsystem oder nach lymphogener Ausbreitung über den Angulus venosus,
• örtliche Ausbreitung (Organtuberkulose) sowie
• kanalikuläre Aussaat bei verkästen und eingeschmolzenen Prozessen.
An der Eintrittspforte entwickelt sich ein entzündlicher Primärherd, von dem durch die Ausbreitung der Entzündung über die Lymphgefäße zu den regionären Lymphknoten der sog. Primärkomplex entsteht (DEDIE 1993). In 96-98% der Fälle kommt es in der Folge zum Stillstand der Entzündung und vorübergehenden oder dauerhaften Ausheilung.
Im Verlauf der Tuberkulose treten typische Erscheinungen einer chronisch- spezifischen Entzündung auf. Die zelluläre Immunantwort bewirkt die Einwanderung von Epitheloidzellen, Langhans-Riesenzellen, Lymphozyten und Makrophagen, die einen Abwehrwall für die zentral gelegenen Mykobakterien darstellen (FRIEDLAND 1999). Eine exsudative Entzündung geht mit einer Infiltration polymorphkerniger Leukozyten, Makrophagen und Lymphozyten einher. Bei der produktiven und granulomatösen Entzündung bilden sich charakteristische Tuberkel oder Granulome aus. Im Zentrum dieser befinden sich Epitheloidzellen und Riesenzellen vom Langhanstyp. Das Zentrum kann verkäsen und verkalken. Die Mykobakterien persistieren in diesen Herden und bleiben über Jahrzehnte virulent. Von ihnen geht ständig die Bedrohung einer postprimären Erkrankung aus.
Eine lymphogene und / oder hämatogene Ausbreitung der Bakterien vor Eintritt einer zellulären Immunantwort führt zu einer Frühgeneralisation. Diese verläuft als Miliartuberkulose oder in Form einer protrahierten Generalisation (MATTHIESEN 1992). Kommt es mehr als zwei Jahre nach einer Infektion mit Mykobakterien zu einer Reaktivierung der alten Herde, entwickelt sich eine postprimäre Lungentuberkulose (MATTHYS 2000). Solche Verlaufsformen zeigen sich in einer chronischen Organtuberkulose, die durch kanalikuläre oder direkte Ausbreitung auf einen großen Teil oder auf das gesamte Organ entstanden ist (MATTHIESEN 1992).
Durch Einschmelzungsprozesse kommt es zur Kavernenbildung und / oder zu Einbrüchen in bestehende Hohlraumsysteme, z.B. den Bronchialbaum, wodurch eine offene Tuberkulose entsteht (MATTHYS 2000).
Bei schlechter Resistenzlage des Wirtes können persistierende Mykobakterien ein Wiederaufbrechen der Infektion bewirken. In diesem Fall spricht man von einer Spätgeneralisation (MATTHIESEN 1992).
2.4 Nichttuberkulöse Mykobakterien
2.4.1 Einteilung nichttuberkulöser Mykobakterien
Der Begriff nichttuberkulöse Mykobakterien (NTM) beinhaltet alle Spezies, die nicht Mitglieder des TBC sind. Die klassische, von RUNYON (1959) erstellte Einteilung der NTM, basiert auf den charakteristischen Anzeichen Wachstumsgeschwindigkeit, Koloniemorphologie und Pigmentierung. Demnach lassen sich bei den atypischen, für den Menschen pathogenen Mykobakterien vier Gruppen einteilen (vgl. Tab. 2.1).
Tab. 2.1: Einteilung nichttuberkulöser Mykobakterien nach RUNYON Langsamwachsende
Mykobakterien
Schnellwachsende Mykobakterien Runyon Gruppe I Runyon Gruppe II Runyon Gruppe III Runyon Gruppe IV Photochromogen Scotochromogen Nonchromogen Nonchromogen M. kansasii
M. marinum
M. gordonae M. scrofulaceum
M. avium Komplex
M. terrae Komplex M. fortuitum M. chelonae M. abscessus
Die Runyon-Gruppen I bis III werden als langsam wachsende Mykobakterien betrachtet, wobei die Wachstumsgeschwindigkeit von M. tuberculosis als Maßstab benutzt wird. In der Gruppe IV sind die schnell wachsenden Mykobakterien, die in weniger als sieben Tagen in den verwendeten Routinemedien wachsen.
2.4.2 Mykobakteriosen
Die NTM sind gewöhnlich ubiquitär in der Umwelt vorhanden, v.a. in Wasser (Trinkwassersysteme) und Schmutz. Für den immunkompetenten Menschen sind sie wenig infektiös.
Die Übertragung von Mensch zu Mensch ist selten, die meisten Infektionen beruhen auf Kontakt mit kontaminiertem Umweltmaterial. Erkrankungen, die auf NTM beruhen, werden als Mykobakteriosen bezeichnet und können in vier klinische Syndrome eingeteilt werden: Lungenerkrankungen, Lymphadenitiden, Hauterkrankungen und generalisierte Erkrankungen (SALFINGER u. KAFADER 1992; KOH et al. 2002).
Die Vermehrung der NTM findet wie bei der Tuberkulose primär intrazellulär statt.
Bakterielles Überleben, Infektion und Erkrankung gelingen meisten nur, wenn die T- Zell-abhängige Makrophagenaktivierung gestört ist. Werden die Makrophagen aktiviert, können die NTM meistens rasch und vollständig eliminiert werden. Gelingen Infektionen mit NTM bei generell funktionierendem T-Zellsystem, liegt häufig eine
lokale Schädigung vor (Lunge, Haut oder Bindegewebe). Bei ausreichendem Immunstatus entstehen am Ort der bakteriellen Besiedlung Granulome, in denen der Erreger abgekapselt wird. Bei mäßig geschwächter T-Zellaktivierung oder lokaler Schädigung kann die Infektion zur Krankheit führen, bleibt aber lokal begrenzt.
Bei stark geschwächter T-Zellfunktion sammeln sich Makrophagen diffus am Absiedlungsort. Die Erregerabwehr gelingt nicht mehr, der Keim kann sich ausbreiten und andere Organe befallen. Dies ist v. a. der Fall bei einer Defizienz der CD4 T- Zellen, welche die Makrophagenaktivierung kontrollieren. So erklärt sich die Häufigkeit von mykobakteriellen Infektionen bei AIDS-Patienten und anderen Patienten mit T-Zelldefekten (KAUFMANN 1994; ANTAYA 2001).
Bevor es zum Auftreten von AIDS kam, waren die Erkrankungen beim Menschen mit NTM überwiegend auf Erkrankungen der Lunge, Lymphknoten und Haut limitiert (FALKINGHAM III1996). Dies galt auch für immunkompetente Personen. Betroffen waren zumeist Männer ab einem Alter von 60 Jahren. Die meisten Patienten hatten prädisponierende Faktoren (Pneumoconidiosis, Raucherlunge) oder haben unter Bedingungen gearbeitet, in denen sie Staub ausgesetzt waren (sog. „Farmer Lung“).
Die pulmonale Infektion mit NTM beruht in den meisten Fällen auf einer Infektion mit dem M. avium-intracellulare-Komplex (MAC), gefolgt von M. kansasii (FALKINHAM III 1996).
Die Hautinfektionen bei immunkompetenten Personen gehen zumeist mit einem Trauma oder einer Injektion mit Kortikosteroiden einher.
Der MAC tritt als häufigste Ursache von Lymphadenitiden bei Kindern im Alter von ein bis fünf Jahren auf. Generalisierte Infektionen mit diesem Erreger sind bei immunkompetenten Personen eher selten.
Mit dem Auftreten von AIDS hat sich das Bild der NTM Erkrankungen radikal verändert. 25-50% der Patienten in Europa und den USA, die mit AIDS infiziert sind, haben eine Infektion mit NTM, v.a. MAC-Infektionen (FALKINHAM III 1996).
Bei AIDS-Patienten und anderen immundefizienten Personen verlaufen die Infektionen mit NTM meistens generalisiert.
Die Inzidenz der Infektion mit NTM wird erwartungsgemäß ansteigen, da es bedingt durch AIDS und andere immunsupprimierende Krankheiten einen ständig wachsenden Anteil an gefährdeten Personen gibt (FALKINHAM III 1996).
NTM werden auch mit einer steigenden Häufigkeit von Patienten mit cystischer Fibrose isoliert. Eine wichtige Rolle spielen hier die Erreger M. abscessus, M. chelonae und M. fortuitum, wobei auch Erreger des MAC und M. kansasii isoliert werden konnten (BANGE et al. 1999). Der M. chelonae-abscessus-Komplex wird am häufigsten aus dem respiratorischen Trakt von Patienten mit cystischer Fibrose
isoliert (BOXERBAUM 1980; KILBY et al. 1992; AITKEN et al. 1993; EBERT u.
OLIVIER 2002). Die meisten veröffentlichten Studien haben keine weitere Unterscheidung zwischen den beiden auf dem 16S rRNA-Gen sequenzgleichen Spezies gemacht, sondern beide Erreger als M. chelonae-abscessus-Komplex zusammengefasst. Nach Beschreibungen von GRIFFITH und Mitarbeitern (1993) war der am häufigsten nachgewiesene Erreger aus dem Komplex M. abscessus.
Für die Diagnose „Mykobakteriose“ reicht der einmalige Nachweis aus Patienten- material nicht aus. Vielmehr müssen hierfür mehrere Bedingungen erfüllt sein. Nach SALFINGER und KAFADER (1992) müssen entweder eines der folgenden Haupt- oder drei der folgenden Nebenkriterien gegeben sein:
Hauptkriterien:
• Nachweis von mehr als 100 Kolonien derselben Keimart in mindestens vier Proben bei einem Krankheitsbild, das dem Keim zugeordnet werden kann
• Isolierung von NTM aus einer Läsion, deren Histopathologie für eine Beteiligung von Mykobakterien spricht
Nebenkriterien:
• mindestens viermalige Isolierung derselben Erregerart oder Wachstum von mehr als 100 Kolonien in einer Probe
• Zeitlicher Zusammenhang zwischen Krankheit und Keimisolierung
• Isolierung des Keimes aus einem Organ oder Gewebe, das zuvor unbekannte histopathologische Veränderungen aufwies
Neben den genannten Erregern besitzen weiterhin M. kansasii, M. malmoense, M. marinum, M. scrofulaceum, M. haemophilum und M. ulcerans eine klinische Signifikanz (SALFINGER u. KAFADER 1992), wobei M. kansasii und M. marinum als häufig pathogen eingestuft werden können (METCHOCK et al. 1999). Die meisten der genannten Erreger verursachen chronische Lungeninfektionen. M. marinum ist insbesondere für Hautinfektionen verantwortlich, v.a. nach Kontakt mit kontaminiertem Wasser (sog. „Schwimmbadgranulom“). Ebenfalls chronische Hautinfektionen, einhergehend mit schweren Nekrosen, verursacht M. ulcerans (HAHN 1999). Von diesem Erreger sind v.a. tropische Gebiete und Australien betroffen.
In der MHH wurden im Jahr 2000 neben den Spezies des TBC, der MAC, M. abscessus, M. marinum, M. fortuitum, M. haemophilum, M. simiae, M. xenopi, M. gordonae, M. vaccae und M. terrae aus Patientenmaterial nachgewiesen.
2.5 Diagnostik von Mykobakterien
2.5.1 Probenentnahme
Die Auswahl der Proben richtet sich nach der Organmanifestation. Die meisten Proben werden aus dem Respirationstrakt gewonnen (Sputum, Bronchialsekret, Bronchiallavage). Besonders günstig für die Mykobakteriendiagnostik aus dem Respirationstrakt sind Morgensputen, da hier die Konzentration an Erregern gewöhnlich besonders hoch ist. Aber auch Urin, Magensekret, Gewebe, Liquor, Punktate und Abstrichproben können zur Diagnostik verwendet werden. Blut- und Stuhlproben werden zumeist von Patienten mit AIDS eingesendet. Die ersten Proben sollten nach Möglichkeit vor Einleitung einer Chemotherapie gewonnen werden.
Sofern möglich, sollten Proben an mindestens drei aufeinanderfolgenden Tagen entnommen und untersucht werden. Untersuchungen zur Behandlungskontrolle sollten im Abstand von zwei bis vier Wochen durchgeführt werden.
Um das Überwachsen von anderen Bakterien in der Probe zu verhindern, muss die versandte Probe so schnell wie möglich in das Labor gelangen. Grundsätzlich sollten die Proben so steril wie möglich entnommen werden, um Kontaminationen mit anderen Erregern oder Mykobakterien, die in der Umwelt leben, zu vermeiden (METCHOCK et al. 1999).
2.5.2 Aufbereitung von Patientenmaterial
Viele der eingesendeten Patientenproben sind kontaminiert mit der Normalflora der entsprechenden Entnahmestelle. Da Mykobakterien langsam wachsen und eine lange Inkubationszeit benötigen, können sie leicht von Begleitflora überwuchert werden, die mit dem Probenmaterial mit angelegt wird.
Deshalb sind Vorbehandlungen des eingesendeten Materials vor dem Anlegen zum Nachweis von Mykobakterien notwendig. Die Vorbehandlung des zu untersuchenden Materials bewirkt eine Homogenisierung der Probe (z.B. bei Geweben), eine Dekontamination der Begleitflora und eine Anreicherung der Mykobakterien durch Zentrifugation. Biopsieproben, Liquor und Blut brauchen nicht dekontaminiert werden, da sie primär steril sind.
Eine weit verbreitete und anerkannte Möglichkeit der Vorbehandlung zum kulturellen Nachweis von Mykobakterien ist die Natriumhydroxid-N-Acetyl-L-Cystein- (NaOH- NALC) Methode (WHITTIER et al. 1993, 1997). Auch eine Kurzzeitbehandlung der Proben mit NaOH zur Dekontamination in Kombination mit Natrium-Laurylsulfat (SDS-Methode) ist geeignet (SALFINGER u. KAFADER 1992).
2.5.3 Mikroskopischer Nachweis
Für die Diagnose von Mykobakterien mittels Mikroskopie wird die Eigenschaft der Säurefestigkeit ausgenutzt. Dieses Screening hat den Vorteil, dass es eine sehr schnelle und einfache Möglichkeit ist, säurefeste Bakterien in der Probe nachzuweisen (SALFINGER u. KAFADER 1992). Allerdings gibt es auch andere Erreger, die in der Färbung ebenfalls säurefest erscheinen (Rhodokokken, Nocardien, Corynebakterien, Cryptosporidien etc.) und so nicht von Mykobakterien unterschieden werden können. Ferner kann man nicht zwischen Erregern des TBC und atypischen Mykobakterien unterscheiden und auch die Sensitivität von 40% ist im Vergleich zur Kultur niedrig. Als Minimum müssen 5 x 103 bis 104 säurefeste Stäbchen pro Milliliter in der Probe vorhanden sein, um ein positives Ergebnis in der Färbung zu erreichen, wobei die Mengen für einen Nachweis in der Kultur bei 101 bis 102 Erregern liegen (METCHOCK et al. 1999). Auch die Erfahrenheit des Untersuchers ist von großer Bedeutung bei der mikroskopischen Beurteilung.
Die gebräuchlichste und spezifischste Methode der Färbung ist die Färbung nach Ziehl-Neelsen (ZN). Säurefeste Bakterien erscheinen dabei als rotgefärbte Stäbchen auf blauem Hintergrund. Neben der Färbung kann ein geübter Untersucher auch anhand der Anordnung oder dem Aussehen der säurefesten Stäbchen zwischen einzelnen Mykobakterien-Spezies unterscheiden bzw. einen Verdacht äußern. So bestimmt der Cordfaktor von M. tuberculosis eine bestimmte Anordnung der Stäbchen, die V-förmig oder palisadenartig sein kann und auch als zopfförmig bezeichnet wird. M. kansasii erscheint meistens gebändert und die Stäbchen sind länger als die von M. tuberculosis. M. xenopi zeigt lange schlanke Stäbchen mit unregelmäßiger Lagerung, die an Vogelnester erinnern (SALFINGER u. KAFADER 1992).
Als Übersichtsfärbung hat sich die Fluoreszenzmikroskopie mittels Auramin gefärbter Präparate bewährt. Auramin ist ein Fluorochrom, das, wenn es an Mykolsäuren bindet, fluoresziert und resistent gegenüber der Entfärbung mit Alkohol ist. Aufgrund der Fluoreszenz kann das Präparat bei gleichbleibender Sensitivität durch eine geringere Anzahl an Gesichtsfeldern als nach der ZN-Färbung beurteilt werden, um die Diagnose „negativ für säurefeste Stäbchen“ zu stellen. Geringerer Zeitaufwand und größere Nachweisraten sind die Folge. Im Gegensatz zur ZN-Färbung ist bei der Auraminfärbung jedoch die Morphologie nicht so gut zu beurteilen, so dass im Zweifelsfall eine nachfolgende Bestätigung mit der ZN-Färbung erforderlich ist (DEDIE 1993).
2.5.4 Kultureller Nachweis
Die Untersuchung auf Mykobakterien in der Kultur wird als „Goldstandard“ in der bakteriologischen Diagnostik betrachtet (TAYLOR et al. 2001).
Das angereicherte, homogenisierte und bei Bedarf dekontaminierte Material wird auf verschiedene Nährböden überimpft. Dabei sollten flüssige und feste Nährböden, die selektiv für Mykobakterien sind, kombiniert werden.
Feste Medien basieren auf der Grundlage von Ei oder Agar, wobei alle Malachitgrün enthalten, ein Farbstoff, der das Wachstum der Kontaminationsflora hemmt. Die koagulierten Eiernährböden in den Modifikationen nach Löwenstein-Jensen, Stonebrink, Gottsacker, etc. besitzen eine gute Pufferkapazität und können toxische Stoffe im Untersuchungsmaterial inaktivieren. Die Agarnährböden 7H10 und 7H11 nach Middlebrook eignen sich gut für die Differenzierung und Vereinzelung von Mykobakterien. Agarnährböden inaktivieren die toxischen Stoffe nur wenig, deshalb sind sie nur nach Vorbehandlungen mit SDS oder der NaOH-NALC-Methode geeignet (SALFINGER u. KAFADER 1992; DEDIE 1993).
Die Kulturen werden für sechs bis acht Wochen bebrütet und im wöchentlichen Abstand abgelesen. Eine erhöhte CO2-Spannung (5-10%) wirkt sich positiv auf das Wachstum aus. Von bewachsenen Kulturen ist ein ZN-Präparat anzufertigen, um zu überprüfen, ob es sich um säurefeste Stäbchen handelt. Der Vorteil fester Kulturmedien gegenüber der Flüssigkultur liegt darin, dass eine makroskopische Beurteilung der Kolonien möglich ist. Die Selektivität ist bei Festmedien höher und die Kontaminationsrate geringer.
Als flüssige Kulturmedien eignen sich die 7H9-Bouillon nach MIDDLEBROOK, die Tb-Bouillon nach DUBOS-MIDDLEBROOK und das Substrat 30 nach KIRCHNER.
Auch automatische Kultursysteme der Fa. BECTON-DICKINSON eignen sich für den Nachweis von Mykobakterien. Das radiometrische BACTEC®-AFB System erlaubt den Nachweis von Mykobakterien in einem sehr frühen Stadium. Die durchschnittliche Detektionszeit wird für NTM mit einer Dauer von sieben Tagen angegeben, für M. tuberculosis neun bis vierzehn Tage. Um das Wachstum der Kontaminanten zu unterdrücken und gleichzeitig das Wachstum zu beschleunigen, wird dem BACTEC 12B Medium ein Gemisch aus antimikrobiellen Stoffen (PANTA) zugefügt (METCHOCK et al. 1999).
Der Gebrauch dieser automatischen Kultursysteme hat die Nachweisrate und Detektionszeit von Mykobakterien deutlich verbessert (METCHOCK et al. 1999). Vor allem die im Direktausstrich negativen Proben für säurefeste Stäbchen und Proben von bereits behandelten Patienten mit chronischen Erkrankungen können mit diesen Systemen besser erfasst werden.
Limitierend beim BACTEC®-System ist die Unfähigkeit, die Kolonienmorphologie zu beurteilen, Mischinfektionen zu erkennen, das Überwachsen von Kontaminanten, hohe Kosten und die Verwendung von radioaktivem Material.
Das BACTEC®-MGITTM-960-System der Fa. BECTON DICKINSON ist nicht radiometrisch und eignet sich für alle klinischen Materialien. Eingebettet in Silikon am Boden des Nachweisröhrchens befindet sich eine fluoreszierende Verbindung. Diese Verbindung spricht auf das Vorliegen von gelöstem Sauerstoff in der Bouillon an.
Anfänglich ist nur wenig Fluoreszenz nachweisbar, da die große Menge an aufgelöstem Sauerstoff die Emission der fluoreszierenden Verbindung absorbiert.
Später nehmen die wachsenden, aktiv aspirierenden Mikroorganismen den Sauerstoff auf und die steigende Fluoreszenz kann vom Gerät gemessen werden.
Die in das Gerät eingegebenen Röhrchen werden fortwährend bei 37°C inkubiert und die Fluoreszenz jede Stunde vom Gerät gemessen. Positive Röhrchen werden vom Gerät angezeigt. Ein positives Röhrchen enthält etwa 105 bis 106 koloniebildende Einheiten (KBE) pro Milliliter (BECTON DICKINSON 1999).
Die Sensitivität und die durchschnittliche Detektionszeit entsprechen den Angaben für das BACTEC®-AFB System. Allerdings sind die Kontaminationsraten mit diesem System deutlich höher (METCHOCK et al. 1999).
Die Flüssigkultur besitzt im Gegensatz zu den festen Kulturmedien eine höhere Sensitivität und eine kürzere Wachstumszeit. Allerdings ist die Kontaminationsrate höher und auch der höhere Kostenfaktor ist zu berücksichtigen (SALFINGER u.
KAFADER 1992).
2.5.5 Biochemische Differenzierung
Nachdem die Mykobakterienisolate in eine erste Gruppe aufgrund ihrer Wachstumsgeschwindigkeit, der Pigmentierung, ZN-Färbung etc. differenziert wurden, findet in der traditionellen Diagnostik mit Hilfe von biochemischen Tests eine weitere Differenzierung der Spezies bzw. des Spezies-Komplex statt. Mykobakterien sollten stets so weit wie möglich innerhalb der Spezies differenziert werden (BROSCH et al. 2002). Es sollen hier nur einige, wichtige Verfahren aufgeführt werden, die sich im Wesentlichen auf die Unterscheidung innerhalb des TBC beziehen.
