MEDIZIN KURZBERICHT
Der Stellenwert der
Polymerase-Kettenreaktion (PCR) für die klinische Diagnostik von
Infektionskrankheiten
Dieter Bitter-Suermann
D
as Prinzip der enzymatischen„In-vitro-DNA-Amplifikati- on" wurde erstmalig 1985 von Saiki et al. beschrieben und als „Polymerase Chain Reacti- on" (PCR) bezeichnet (1, 2). Die Methode beruht darauf, daß nach Denaturierung von Doppelstrang-D- NA (zum Beispiel chromosomaler DNA) die Enden der entstandenen Einzelstrang-DNA-Paare mit hinzu- gefügten komplementären syntheti- schen Oligonukleotiden (Primer) hy- bridisieren und dann mittels des En- zyms DNA-Polymerase und den vier Desoxy-Nukleotiden (dATP, dGTP, dCTP und dTTP) zu Doppelstrang- DNA-Ketten aufgefüllt werden. Die- ser Prozeß kann zyklisch wiederholt werden, wobei in vitro synthetisierte DNA-Fragmente von der durch die zwei Primer bestimmten Länge ent- stehen. Der theoretische Amplifika- tionsfaktor beträgt N = 2" (n: An- zahl der Zyklen). Mit dieser Metho- de können auch Nukleinsäureab- schnitte (zum Beispiel bekannte Gensequenzen) von Infektionserre- gern spezifisch mittels PCR in vitro amplifiziert werden, wodurch die Diagnostik von Infektionskrankhei- ten in den letzten Jahren eine neue Dimension erhalten hat (3, 4). Im Prinzip genügt dabei die Anwesen- heit einer Kopie eines spezifischen RNA/DNA-Bereiches aus dem Ge- nom eines Mikroorganismus, um mit der PCR innerhalb weniger Stunden einen positiven Erregernachweis zu führen. Dieses Prinzip hat große Hoffnungen auf eine unkomplizierte, rasche und gezielte Infektionsdia- gnostik geweckt.
Trotz der möglichen und bereits tatsächlich erzielten Fortschritte durch die Anwendung der PCR vor
allem im Bereich der Hochschulme- dizin, wo die Umsetzung von For- schungsergebnissen in klinische Er- probung und den gezielten Einsatz bei Problemfällen fließender gelingt, ist diese Methode aber noch nicht so ausgereift, daß sie im diagnostischen Routinebetrieb allgemein und zuver- lässig eingesetzt werden kann. Als besonders problematisch soll die Ex- traktion der Nukleinsäuren genannt werden, die hinsichtlich der verschie- denen Untersuchungsmaterialien (Blut, Liquor, Sputum, Urin, Gewebe und andere) und hinsichtlich der ver- muteten Krankheitserreger sehr dif- ferenzierte Probenaufbereitungs- techniken erforderlich macht. Ein zweites äußerst wichtiges Problem stellt die hohe Empfindlichkeit der Methode selbst dar. Bereits die ge- ringste Kontamination der Proben durch Fremd-Nukleinsäuren im La- bor kann zu falsch positiven Ergeb- nissen führen.
In teilweiser Unkenntnis dieser Situation ist es für viele klinisch täti- ge Kollegen zur Zeit unverständlich, daß trotz einer schier endlosen An- zahl von Publikationen in den ent- sprechenden nationalen und interna- tionalen Fachzeitschriften das PCR- Verfahren noch nicht in gleichem Umfang als diagnostische Routinelei- stung angeboten wird. Es ist für alle an der Entwicklung der PCR aktiv Beteiligten eine frustrierende, aber nicht zu ignorierende Tatsache, daß aus methodeninhärenten Schwierig- keiten der Schritt von einer in einem Forschungslabor etablierten Metho- de hin zu einem im diagnostischen Labor routinemäßig praktikablen Untersuchungsverfahren mit seinen Qualitätsanforderungen bezüglich Standardisierung, Reproduzierbar-
keit und Validität immer noch nicht vollzogen werden konnte.
Schließlich soll nicht unerwähnt bleiben, daß der alleinige qualitative Nachweis von erregerspezifischen Nukleinsäuren in Patientenmaterial nicht per se die Ätiologie einer Er- krankung beweist. Den Übergangs- bereichen zwischen transienter Be- siedlung, latenter Infektion und ma- nifester akuter oder chronischer In- fektion wurde bei der Evaluation der PCR bisher wenig Rechnung getra- gen. Darüber hinaus ist in den mei- sten Fällen nicht bekannt, wie häufig und wie lange erregerspezifische Ge- nomsequenzen nach erfolgreicher Therapie oder klinischer Ausheilung einer Infektion im Wirtsorganismus mittels PCR nachgewiesen werden können.
Genamplifikationsverfahren wie die PCR sind ohne Zweifel von ho- hem Wert für die Abklärung speziel- ler diagnostischer Fragen. Die unkri- tische Anwendung und mangelhafte Qualität der Durchführung der PCR in der Infektionsdiagnostik sowie ei- ne oberflächliche oder fehlerhafte Interpretation können jedoch unter Umständen mehr Verwirrung stiften und Fehldiagnosen liefern, als es ne- gative Befunde bei konventioneller mikrobieller Diagnostik tun (5). Es wird in der nächsten Zukunft deshalb nötig sein, insbesondere im Kontext mit kulturellen, serologischen und Antigennachweisverfahren den Stel- lenwert der PCR genauer zu definie- ren. Dies erfordert eine gründliche klinisch-mikrobiologische Evaluati- on, die den diagnostischen Wert ei- ner derartigen Untersuchung für den jeweiligen Erregernachweis präzi- siert. Hierzu gehören auch die Er- mittlung des positiven und negativen Deutsches Ärzteblatt 90, Heft 48, 3. Dezember 1993 (53) A1-3231
Erreger mögliche Indikation Nachweis im Liquor bei Verdacht auf Neuro- borreliose
Nachweis aus Gelenk- punktat bei Verdacht auf Lyme-Arthritis bei Kindern
Borrelia burg- dorferi (6)
Nachweis im Liquor be- ziehungsweise Frucht- wasser bei Verdacht auf Neugeborenentoxoplas- mose
Nachweis im Liquor be- ziehungsweise Hirnbi- opsie bei Verdacht auf akute Toxoplasma-En- zephalitis bei HIV-Pa- tienten
Toxoplasma gondii (7)
Shiga-like To- xin produzie- rende E. coli
Nachweis des Toxin- Gens aus Stuhlprobe bei klinischem Verdacht (hämorrhagische Entero- colitis)
Chlamydia pneumoniae
Nachweis aus der bron- choalveolären Lavage (BAL) bei Verdacht auf Chlamydien-Pneumonie Nachweis aus Ersturin (die ersten 40 ml des Morgenurins) zur Ab- klärung unklarer Fertili- tätsstörungen bezie- hungsweise Salpingiti- den bei der Frau. Für andere Indikationen, zum Beispiel Urethritis stehen hochspezifische und für diese Anwen- Chlamydia tra-
chomatis
Erreger mögliche Indikation dungsbereiche suffi- ziente Antigen- und Kulturnachweise zur Verfügung.
Nachweis von M. tuber- culosis aus Liquor, Bi- opsaten, Pleuraflüssig- keit bei entsprechender Organmanifestation Nachweis von M. avium im peripheren Blut bei Verdacht auf dissemi- nierte Infektion bei HIV-Personen Identifizierung nicht-tu- berkulöser Mykobakte- rien
Myko- bakterien
Erreger mögliche Indikation Nachweis im periphe- ren Blut:
Überwachung von Transplantierten und anderen Immunsuppri- mierten (Alternative:
Nachweis von pp65 in Cytospin-Präparaten) Nachweis in Liquor, Bronchiallavage, Biop- saten: bei Verdacht auf entsprechende Organ- manifestation
Cytomegalo- Virus
Epstein-Barr- Virus
Nachweis im Liquor bei Verdacht auf EBV-as-
Erreger mögliche Indikation soz Guillain-Barr&Syn- drom
Nachweis in Biopsaten unter anderem bei V. a.
EBV-assoz. Tumor/
Lymphoproliferation (Alternative: EBNA- Ag-Nachweis) Nachweis im Serum be- ziehungsweise Biopsat bei chronischer Hepati- tis (mit unklarer Serolo- gie) oder Leberzellkar- zinom unklarer Ätiolo- gie
Therapiekontrolle bei chronischer Hepatitis B Abklärung bei isolier- tem anti-HBc-Nachweis (bei HBc-Ag Positiven:
Spot-Hybridisierung) Hepatitis-B-
Virus
Überprüfung der Virus- aktivität bei anti-HCV positiven Personen Therapiekontrolle Bei anti-HCV-negativer akuter oder chronischer Hepatitis sowie Leber- zellkarzinom unklarer Ätiologie
Abklärung des Infekti- onsstatus bei Kindern von HCV-infizierten Müttern
Hepatitis-C- Virus
Herpex-sim- plex-Virus
Liquordiagnostik bei V. a. Herpes-simplex- Enzephalitis und beim Neugeborenen Abklärung des Infekti- onsstatus bei Kindern infizierter Mütter Abklärung bei Ak-Ne- gativen mit dokumen- tierter Exposition HIV-1/2
(analog HTLV-1/2)
Virusnachweis bei Pa- tienten mit aplastischer Krise, bei Patientinnen mit unklarem Exanthem in der Schwangerschaft sowie im fetalen Materi- al bei Hydrops fetalis Parvovirus
Rubellavirus Virusnachweis bei V. a.
pränatale Infektion Varizella-
Zoster-Virus
Virusnachweis im Li- quor bei neurologischen Komplikationen von Windpocken und Her- pes zoster
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prädiktiven Faktors, die quantitative Standardisierung sowie der Aufbau einer entsprechenden Qualitätskon- trolle.
Auch die Deutsche Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie (DGHM), die Gesellschaft für Viro- logie (GfV) und der Berufsverband der Ärzte für Mikrobiologie und In- fektionsepidemiologie (BV) stehen einer Aufnahme von PCR-Verfahren für den Erregernachweis in den Lei- stungskatalog nicht ablehnend gegen- über. Ganz im Gegenteil sollte die Entwicklung dieser Methoden aktiv gefördert werden. Für bestimmte kli- nische Problemfälle und an entspre- chend ausgewiesenen Institutionen mit stringenter Qualitätskontrolle stellt die PCR ein wertvolles diagno- stisches Verfahren dar. Es wurde da- her ein Katalog von Indikationen er- stellt, die einen Einsatz der PCR in der klinischen Diagnostik von Infek-
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tionskrankheiten im Kontext mit al- len anderen diagnostischen Metho- den unter den oben angeführten Ein- schränkungen als wünschenswert er- scheinen lassen. Es ist zu diskutieren, ob in Zusammenarbeit mit der Bun- desärztekammer und der Kassenärzt- lichen Bundesvereinigung gemeinsa- me Pilotstudien durchgeführt werden sollten, um den Stellenwert der PCR für bestimmte diagnostische Frage- stellungen zu definieren, die gegen- wärtige Praxis der Durchführung zu verbessern und fundierte und aus- wertbare Erfahrungen zu sammeln, die die Grundlage für einen Eingang in eine vernünftig kalkulierte Ab- rechnung darstellen (gemessen an den gegenwärtig zum Teil willkürlich adaptierten und zu kostenträchtigen Bewertungsziffern).
In folgenden Situationen kann die PCR-Methode zur Diagnosestel- lung hilfreich sein:
Virologie
An der Erarbeitung des Textes waren maßgeblich be- teiligt:
PD Dr. E. C. Böttger (DGHM), Institut für Medizi- nische Mikrobiologie, Medizi- nische Hochschule Hannover Bakteriologie/Parasitologie
A1-3232 (54) Deutsches Ärzteblatt 90, Heft 48, 3. Dezember 1993
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Prof. Dr. B. Fleckenstein, Prä- sident der Gesellschaft für Vi- rologie (GfV), Institut für kli- nische Virologie Erlangen Prof. Dr. J. Heesemann (DGHM), Institut für Hygiene und Mikrobiologie, Universität Würzburg
Prof. Dr. G. Sieg!, Vorsitzen- der der Kommission für Klini- sche Diagnostik und Epidemio- logie der GfV, Institut für kli- nische Mikrobiologie und Im- munologie, St. Gallen
Prof. Dr. R. Ringelmann, Vor- sitzender des Berufsverbandes der Ärzte für Mikrobiologie und Infektionsepidemiologie, Institut für Medizinische Mi- krobiologie, Städtisches Kran- kenhaus Karlsruhe
KURZBERICHT / FÜR SIE REFERIERT
Deutsches Arzteblatt
90 (1993) A1-3231-3234 [Heft 48]
Literatur:
1. Saiki, R. K., S. Scharf, F. Faloona, K. B.
Mullis, G. T. Horn, H. A. Ehrlich and N.
Arnheim: Enzymatic amplification of ß-glo- bin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.
Science 230 (1986) 1350
2. Mullis, K. B. and F. A. Faloona: Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalyzed chain reaction. Methods Enzy- mol. 155 (1987) 335
3. Diagnostic Molecular Microbiology. Eds.:
D. H. Persing, F. Tenover, T. J. White and T. F. Smith, 1993, American Society for Microbiology, U.S.A.
4. D. Thiele: Die „Polymerase Chain Reacti- on" (PCR) und ihre Anwendungsmöglich- keiten. Immun Infekt. 19 (1991) 138 5. Titelnot, K., P. Kirschner, M. Schmidt, E.
C. Böttger und J. Heesemann: Schnelligkeit versus Zuverlässigkeit: Eine kritische Ana- lyse der Schnelldiagnostik von Mykobakte- riosen mittels Polymerase-Ketten-Reaktion
(PCR). Immun. Infekt. 20 (1992) 56-59 6. Huppertz, H. Schmidt and H. Karch:
Detection of Borrelia burgdorferi by nested polymerase chain reaction in cerebrospinal fluid and urine of children with neurobor- reliosis. Eur. J. Pediatr. 152 (1993) 414 7. Groß, U., A. Roggenkamp, K. Janitschke
and J. Heesemann: Improved Sensitivity of the Polymerase Chain Reaction for Detec- tion of Toxoplasma gondii in biological and human clinical specimens. Eur. J. Clin.
Microbiol. Infect. Dis. 11 (1992) 33
Anschrift des Verfassers:
Prof. Dr. med.
Dieter Bitter-Suermann Präsident der
Deutschen Gesellschaft
für Hygiene und Mikrobiologie Institut für Medizinische Mikrobiolo- gie der Medizinischen Hochschule Hannover
Konstanty-Gutschow-Straße 8 30625 Hannover
Thrombolyse bei Herzinfarkt: Welche Therapie ist die beste?
In einer Internationalen Multi- centerstudie (GUSTO-Studie) mit insgesamt 41 000 Patienten wurden vier verschiedene Thrombolysesche- mata (Streptokinase + subkutanes Heparin, Streptokinase + intravenö- ses Heparin, Gewebsplasminogenak- tivator (t-PA) + i.v.-Heparin und ei- ne Kombination von Streptokinase, t- PA und i.v.-Heparin im Hinblick auf die 30-Tage-Mortalität miteinander verglichen.
Mit einer Mortalitätsrate von 6,3 Prozent schnitt die Gruppe mit t-PA und i.v.-Heparin gegenüber den an- deren oben genannten Gruppen (7,0 — 7,4 Prozent) am besten ab. Es ergab sich mit diesem Therapiesche- ma eine bedeutsame Reduktion der 30-Tage-Mortalität gegenüber den Streptokinasegruppen um 14 Pro- zent. Obwohl die Rate hämorrhagi- scher Insulte bei der t-PA und i.v.- Heparin-Gruppe mit 0,94 Prozent auch am höchsten lag, ergab sich trotzdem eine signifikante Verbesse- rung, wenn man die 30-Tage-Mortali-
tät und die Rate schwerer Apople- xien zusammen betrachtete. acc
Global Utilisation of Streptokinase and Tissue Plasminogen Activator for Oc- cluded Coronary Arteries (GUSTO)-In- vestigators: An international randomized trial comparing four thrombolytic stra- tegies for acute myocardial infarction. N.
Engl. J. Med. 329 (1993) 673-682.
Dr. Eric Topoi, Dep. of Cardiology, One Clinic Center, Cleveland Clinic Founda- tion, Cleveland, OH. 44195, USA.
Gastroduodenaler Reflux bei
Langzeitbeatmung
Unter Langzeitbeatmung tritt re- lativ häufig bei Patienten einer Inten- sivstation eine Pneumonie auf. Als Ursache ist eine bakterielle Besiede- lung des Magens mit Keimaszension im Gespräch, wobei hier insbesonde- re die Streßulkusprophylaxe mit H2- Rezeptorantagonisten angeschuldigt wurde.
Die Autoren führten bei 100 langzeitbeatmeten Patienten einer Intensivstation eine Untersuchung mit der Frage durch, ob die Pneumo-
niekeime aus dem Magen oder aus dem Oropharynx stammen. Bei 19 Patienten ließen sich Gram-negative Bakterien in der Lunge nachweisen.
Bei elf Patienten fanden sich identi- sche Keime auch im Magen. In kei- nem Fall war die oropharyngeale Flora identisch mit der aus der Lun- ge gewonnenen Flora. Die bakteriel- le Fehlbesiedelung im Magen mit Gram-negativen Keimen war mit dem Nachweis von Bilirubin im Ma- gensaft korreliert. Auch in der Lunge ließ sich Bilirubin nachweisen. Lag das Magen-pH unter 3,5, fanden sich nur bei fünf Aspiraten Gram-negati- ve Keime. Offensichtlich führt ein duodeno-gastraler Reflux zu einer Keimbesiedelung des Magens mit aufsteigender Kolonisation der tiefen Atemwege. Möglicherweise lassen sich durch Gabe von Prokinetika Mo- tilitätsstörungen beseitigen und da- mit eine Pneumonieprophylaxe bei Intensivpatienten betreiben.
Inglis, T. J. J., M. J. Sherratt, L. J. Spro- at, J. S. Gibson, P. M. Hawkey: Gastro- duodenal dysfunction and bacterial colo- nisation of the ventilated lung. Lancet 341 (1993) 911-913
Department of Microbiology, University of Leeds, Leeds General Infirmary, Großbritannien.
A1-3234 (56) Deutsches Ärzteblatt 90, Heft 48, 3. Dezember 1993
