3 Material und Methoden
3.1 Erstellung der Inhibitionskontrolle
3.1.1 Verwendete Plasmide
Die verwendeten Plasmide pJL6 und pJL8 stammen aus der Stammsammlung der Arbeitsgruppe (AG) Bange und sind in der Tab. 3.1 aufgeführt.
Tab. 3.1: Verwendete Plasmide zur Erstellung der neuen Inhibitionskontrolle Plasmid repliziert in E. coli Selektionsmarker Herkunft
pJL6 + Ampicillin AG Bange pJL8 + Ampicillin AG Bange
3.1.2 Verwendete Bakterien
Zur Erstellung der Inhibitionskontrolle wurden die Stämme Staphylococcus aureus (ATCC 25923) und E. coli (HB101) verwendet.
3.1.3 Plasmidkonstruktion
3.1.3.1 Mini-Präparation von Plasmid-DNA
Zur Präparation der DNA aus Plasmiden wurde das Puffersystem QIAamp Plasmid Mini Kit® von der Fa. QIAGEN angewendet.
3 ml einer Übernachtkultur in LB-Medium wurden bei 10.000 x g für 7 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde in 200 µl Resuspensionspuffer (P1) gelöst und mit 200 µl Lysispuffer (P2) für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zugabe von 200 µl Neutralisationspuffer (P3) wurde der Ansatz für 15 Minuten auf Eis gestellt. Die Zelltrümmer wurden bei 10.000 x g für 5 Minuten herunterzentrifugiert und der Überstand in ein neues Mikroschraubgefäß überführt. Es folgte eine Phenol/Chloroformfällung durch Zugabe der gleichen Menge an Phenol/Chloroform/
Isoamylalkohol im Verhältnis von 25:24:1. Die Phasen wurden gemischt und dann zentrifugiert. Aus der wässrigen Phase wurde die DNA durch Zugabe von 1 ml 96%igem Ethanol auf Eis gefällt. Anschließend wurde das Pellet bei 10.000 x g für
5 Minuten zentrifugiert und mit 1 ml 70%igem Ethanol gewaschen. Das Pellet wurde bei 37°C getrocknet und in 30 µl sterilem Aqua dest. aufgenommen.
3.1.3.2 Midi-Präparation von Plasmid-DNA
Zur Midi-Präparation der DNA aus Plasmiden wurde der GenEluteTM Plasmid Midiprep Kit von der Fa. SIGMA angewendet.
Zur Präparation wurden 40 ml einer Übernachtkultur in LB-Medium verwendet. Die Durchführung der Präparation erfolgte strikt nach Angaben des Herstellers. Die im Eluat gelöst vorliegende DNA wurde bei 4°C gelagert.
3.1.3.3 Restriktionsenzymverdau
Das Reaktionsvolumen betrug zwischen 10 und 15 µl, es wurden 1-3 Einheiten Enzym pro µg DNA verwendet und anschließend bei 37°C für eine Stunde verdaut.
Die in dieser Arbeit verwendeten Enzyme und ihre Puffer sind im Anhang aufgeführt.
3.1.3.4 Dephosphorylierung
Um bei der anschließenden Ligation den Ringschluss des Plasmidvektors ohne Insert zu vermeiden, wurde vor der Ligation der Vektor enzymatisch mit Hilfe der alkalischen Phosphatase dephosphoryliert.
Der Ansatz wurde mit einem Volumen von max. 50 µl durchgeführt:
• x µl DNA
• x µl Aqua dest.
• 1 µl alkalische Phosphatase (1 U/µl)
• µl AP-Puffer (10-fach)
Die Reaktion wurde für eine Stunde bei 37°C inkubiert.
3.1.3.5 Agarosegelelektrophorese
Bei der Agarosegelelekrophorese werden DNA-Fragmente nach ihrer Größe getrennt. Aufgrund der negativ geladenen Phosphatgruppen wandert die DNA in Richtung Anode. Durch den Farbstoff Ethidiumbromid, der in der DNA interkaliert, werden die DNA-Banden im Gel unter UV-Licht sichtbar gemacht.
Die Elektrophorese wurde je nach Agarosekonzentration und erwarteter DNA-Fragmentgröße bei einer Spannung von 50-120 V für 1-2 Stunden in einer Elektrophoresekammer durchgeführt. Dazu wurde die jeweilige Menge an Agarose in 100 ml Aqua dest. und 2 ml TAE-Puffer (50-fach) in der Mikrowelle vollständig gelöst und auf einen Gelträger gegossen.
Nach Erstarren des Gels wurden die Geltaschen mit einem Größenstandard und den DNA-Proben beladen. Zur Beschwerung der DNA wurde 1/10 des Volumens an Bromphenolblau-DNA-Farbmarker mit Glycerin zuvor zu den DNA-Proben hinzu-gefügt. Als Laufpuffer wurde TAE-Puffer (1-fach) benutzt. Nach 20 minütiger Färbung in der Ethidiumbromidlösung (0,8 mg/l) wurde das Gel unter UV-Licht beurteilt und fotografiert.
3.1.3.6 Isolation und Aufreinigung von DNA-Banden aus dem Gel
Die Isolierung und Aufreinigung von einzelnen DNA-Banden erfolgte nach der Auftrennung im Elektrophorese-Gel. Das Gel wurde unter einer UV-Lampe betrachtet und die entsprechende Bande mit einem Skalpell ausgeschnitten und in einem Mikroschraubgefäß gewogen.
Die Aufreinigung der DNA erfolgte mit dem GFXTMPCR DNA and Gel Band Purification Kit der Fa. AMERSHAM.
Die Durchführung erfolgte nach dem Protokoll des Herstellers.
3.1.3.7 Aufreinigung von DNA aus Lösungen
Die Aufreinigung aus Lösungen erfolgte mit dem gleichen Kit wie die Aufreinigung aus dem Gel.
Im Unterschied dazu wurden hier Bindungspuffer und Probe direkt auf die Säule aufgetragen. Der Inkubationsschritt bei 60°C entfiel.
3.1.3.8 Ligation
Bei der Ligation werden kompatible DNA-Enden mit Hilfe der T4-DNA-Ligase kovalent miteinander verknüpft.
Die Ligation wurde in einem Volumen von 20 µl durchgeführt:
• x µl Vektor-DNA
• x µl Insert-DNA
• 4 µl Ligase-Puffer (5-fach)
• 1-2 µl T4-Ligase
Die Substanzen wurden gemischt und nach Zugabe der T4-Ligase wurde die Reaktion über Nacht bei 15°C im Wasserbad inkubiert.
Die Menge des Insert richtete sich nach der Menge der Vektor-DNA und dem optimalen molaren Verhältnis von Vektor und Insert, das bei Enden mit Überhang (sticky ends) bei 1:1 und bei Enden mit glatten Enden (blunt ends) bei 1:3 liegt.
Als Positivkontrolle wurde das ungeschnittene Vektorplasmid verwendet.
Um eine Religation des Vektors ohne Insert zu erkennen, wurde in einem Parallelansatz Wasser statt des Inserts verwendet.
3.1.3.9 Herstellung elektrokompetenter Bakterienzellen
Als Escherichia (E.) coli Stamm wurde HB101 verwendet. 2,5 ml einer Übernachtkultur in LB-Medium wurden in 500 ml LB-Medium inokuliert und bei 37°C und 300 rpm bis zum Erreichen einer OD600 von 0,5 bebrütet. Die Kultur wurde dann für 15 Minuten auf Eis gestellt und anschließend bei 6.000 x g für 20 Minuten bei 4°C zentrifugiert.
Das Pellet wurde zweimal mit eiskaltem Aqua dest. und anschließend mit eiskaltem Glycerin (10%) gewaschen. Die Zellen wurden in 6 ml 10%igem Glycerin gelöst und aliquotiert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –70°C gelagert.
3.1.3.10 Transformation von Escherichia coli mit Plasmid-DNA
Die bei –70°C gefrorenen Zellen wurden auf Eis aufgetaut. 30 µl der kompetenten Zellen und 1 µl DNA wurden gemischt und auf Eis in eine Elektroporationsküvette (Elektrodenabstand 2mm) gegeben.
Die Elektroporation erfolgte im Gene-Pulser® der Fa. BIORAD bei 2,5 kV, 25 µF und 200 Ohm. Der Elektroporationsansatz wurde in 1 ml LB-Medium überführt und bei 37°C für eine Stunde im Schüttler inkubiert, um eine Expression der Antibiotika-resistenz zu ermöglichen. Anschließend wurde auf ampicillinhaltigen LB-Agarplatten (100µg/ml) ausplattiert.
3.1.3.11 Amplifikation mit der konventionellen Polymerase-Kettenreaktion Mittels konventioneller Block-PCR wurde ein 350 bp Fragment vom 16S rRNA-Gen von Staphylococcus aureus amplifiziert. Die DNA war zuvor, wie in Kapitel 3.4.5 beschrieben, aus einer LB-Kultur isoliert worden.
Als Primerpaar wurden die in Tab. 3.2 dargestellten universellen Primer LC1 und AB1 verwendet. Die in dieser Arbeit für die Primer angegebenen Schmelztemperaturen wurden von der Fa. MWG berechnet.
Tab. 3.2: Verwendete Primer für die konventionelle Polymerase-Kettenreaktion Name amplifiziertes
Fragment
Richtung Sequenz Schmelz-
temperatur LC1 16S rRNA-Gen forward 5`-GAG TTT GAT CCT GGC TCA GGA-3` 59,8°C AB1 16S rRNA-Gen reverse 5`-ACT GCT GCC TCC CGT AGG AG-3` 63,5°C
Das Gesamtvolumen für den Reaktionsansatz betrug 100 µl.
• 1 µl Primer LC1 (100 pmol/µl)
• 1 µl Primer AB1 (100 pmol/µl)
• 0.5 µl Pfu Turbo Polymerase
• 5 µl dNTPs (4 mM)
• 10 µl Puffer (10-fach Pfu-Polymerase Reaktionspuffer)
• 72.5 µl Aqua dest.
• 10 µl DNA-Template
Tab. 3.3: Programm für die konventionelle Polymerase-Kettenreaktion Temperatur Zeit Zykluszahl Zyklen
Die Lagerung des PCR-Produktes erfolgte bei 4°C im Kühlschrank.
3.1.3.12 Amplifikation und Schmelzpunktanalyse
Die verwendeten Primersequenzen zur Amplifikation des 1.000 bp Fragmentes auf dem 16S rRNA-Gen von Mykobakterien sind in Tab. 3.4 aufgelistet.
Für die Entwicklung der Primer und Sonden in dieser Arbeit wurden veröffentlichte Sequenzen aus der Gendatenbank verwendet (vgl. Kapitel 3.5.1).
Tab. 3.4: Verwendete Primer für die Polymerase-Kettenreaktion im real-time Modus Name amplifiziertes
Fragment Richtung Sequenz Schmelz-
temperatur LC1 16S rRNA-Gen forward 5`-GAG TTT GAT CCT GGC TCA GGA-3` 59,8°C LC4 16S rRNA-Gen reverse 5`-TGC ACA CAG GCC ACA AGG GA-3` 61,4°C
Die verwendeten Sequenzen für die Sondenpaare in diesem Kapitel sind in Tab. 3.5 aufgeführt.
Detektionssonden, die im F2-Kanal gemessen werden, sind mit dem Farbstoff LCRed 640 markiert, Detektionssonden für den F3-Kanal mit dem Farbstoff LCRed 705. Die aufgezeigten Schmelztemperaturen wurden nach der thermodynamischen Methode von der Fa. TIB MOLBIOL berechnet.
Tab. 3.5: Verwendete Sondenpaare für die Polymerase-Kettenreaktion im real-time Modus
Name Nachweis LCRed Sequenz Schmelz-
temperatur LC39 Mycobacterium - 5`-GCA ACG CGA AGA ACC TTA CCT GG-3` 65,0°C LC40 Mycobacterium 640 5`-TTT GAC ATG CAC AGG ACG-3` 54,2°C LC11 TBC - 5`-CGC GGG CTC ATC CCA CAC CG-3` 71,4°C LC12 TBC 705 5`-TAA AGC GCT TTC CAC CAC AAG A-3` 60,1°C
Der Ansatz des Mastermixes und die Durchführung der PCR-Reaktion werden in Kapitel 3.4 beschrieben, die Quantifizierung der Plasmid-DNA in Kapitel 3.3.4.
Die genomische DNA der verwendeten Mykobakterien (M. tuberculosis und M. gordonae) stammte aus der Stammsammlung der AG Bange und ist in Kapitel 3.4.1 und 3.4.2 näher beschrieben.