3 Material und Methoden
4.2 Untersuchung von kulturellen Patientenproben
4.2.1.1 Bestimmung einer neuen Kopienanzahl der Inhibitionskontrolle für die Untersuchung kultureller Patientenisolate
Die Inhibitionskontrollen waren mit 50 Kopien des Kontrollplasmids pJL6 pro PCR-Reaktion durchgeführt worden. Die Inhibitionsrate lag damit bei 22,5% und war entsprechend zu hoch. In diesem Versuch sollte getestet werden, welche Anzahl an Kopien des Kontrollplasmids in allen Proben nachzuweisen ist. Dabei wurde bereits die neue Inhibitionskontrolle pAB2 verwendet, die im weiteren Verlauf dieser Studie verwendet werden sollte (s. a. Kapitel 4.1).
Sechs kulturell negative MGIT-Proben wurden gewaschen, mit Glasperlen behandelt und anschließend mit unterschiedlichen Mengen an Kontrollplasmid versetzt. Die folgende Schmelzpunktanalyse wurde mit der genusspezifischen Sonde LC39/40 zum Nachweis der Inhibitionskontrolle pAB2 durchgeführt.
Das Ergebnis ist in Tab. 4.2 dargestellt. Ein Signal bei der spezifischen Temperatur von 48°C für die Inhibitionskontrolle wurde als positiv gewertet, sobald es über die Nulllinie hinausging.
Tab. 4.2: Nachweisgrenze der Inhibitionskontrolle in kulturellen Patientenisolaten Kopien
pAB2 Probe 1 Probe 2 Probe 3 Probe 4 Probe 5 Probe 6
500 + + + + + +
300 + + + + - +
100 - - + + - +
50 - - - +
10 - - - +
Lediglich 500 Kopien der Inhibitionskontrolle ließen sich in allen sechs Proben nachweisen. Daher sollte im Hauptteil dieser Studie die Anzahl der Kopien des Kontrollplasmids auf 500 pro Reaktionsansatz erhöht werden. Da sich, laut Aussage der Fa. BECTON DICKINSON, bei einem positiven Signal mindestens 105 bis 106 KBE pro Milliliter in einem MGIT-Kulturröhrchen und damit pro PCR-Reaktion zwischen 103 und 104 Genomkopien in der Reaktionskapillare befinden, wurde der Einsatz von 500 Kopien Kontrollplasmid pro Reaktion für den weiteren Verlauf dieser Untersuchung von kulturellen Proben aus dem MGIT-Automaten als unbedenklich erachtet.
4.2.1.2 Spezifische Detektion des M. chelonae-abscessus-Komplexes
In der Vergangenheit hatte sich gezeigt, dass am Institut für Medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene der MHH neben dem TBC hauptsächlich M. avium und der M. chelonae-abscessus-Komplex aus Patientenproben nachgewiesen wurden (BANGE et al. 1999; BANGE u. BÖTTGER 2002). Deshalb wurde der Einsatz einer weiteren Sonde, die spezifisch für den M. chelonae-abscessus-Komplex detektiert, geplant.
Zur Erstellung der Sonde wurde ein Alignment der Sequenzen des 16S rRNA-Gens von allen klinisch bedeutsamen Mykobakterien hergestellt (vgl. Kapitel 8.1). Im Bereich der hypervariablen Region A unterscheiden sich die meisten der Mykobakterienspezies voneinander. Zum Nachweis von M. chelonae und M. abscessus, die sich in der Sequenz des 16S rRNA-Gens nicht voneinander unterscheiden lassen, wurde mit der Hilfe des Sequenzvergleiches eine Sonde entwickelt. Als Ankersonde wurde eine Sonde ausgewählt, die zu allen getesteten Mykobakterien eine vollständige Homologie hatte.
LC68: 5`-GGC CGC GGG CCC ATC CCA CAC-3` (21 bp) Ankersonde - genusspezifisch (Fluoreszein markiert)
Die Sequenz der Detektionssonde war spezifisch für M. chelonae und M. abscessus und sollte sich damit deutlich in ihrem Schmelzpunkt von den anderen Mykobakterien unterscheiden.
LC86: 5`-CAA AAG CTT TGC ACC ACT CAC-3` (21 bp) Detektionssonde – speziesspezifisch (LCRed 705 markiert)
Die Spezifität der neuen Sonde wurde anhand der genomischen DNA von 36 verschiedenen Mykobakterien-Spezies überprüft. Gezeigt werden hier nur Daten aus einem Lauf. Als Vertreter der sequenzgleichen Mitglieder des TBC wurde die genomische DNA von M. tuberculosis verwendet. Mit den Primern LC1 und LC4 wurde das 1.000 bp Fragment auf dem 16S rRNA-Gen der Mykobakterien amplifiziert und mit der neuen M. chelonae / abscessus-Sonde detektiert.
Abb. 4.11: Spezifität der M. chelonae/abscessus-Sonde LC86
eingesetzte Sonde: M. chelonae/abscessus-Sonde LC68/86
eingesetzte DNA: genomische DNA von M. abscessus, M. chelonae und 29 weiteren Mykobakterien
Die Detektionssonde LC86 schmolz für die beiden sequenzgleichen Spezies M. chelonae und M. abscessus bei einer Temperatur von 66,5°C ab. Die anderen Mykobakterien zeigten bedingt durch Fehlbasen mit der Detektionssonde ein Signal bei einer niedrigeren Temperatur (<56°C) bzw. bei zu vielen Fehlbasen mit der Sequenz der Detektionssonde gar kein Signal (vgl. Abb. 4.11). Sequenzgleiche Stämme zeigten einen gemeinsamen Schmelzpunkt.
Der Mittelwert für den spezifischen Schmelzpunkt von M. chelonae und M. abscessus lag für die Sonde LC86/68 bei 65,8°C, die berechnete Standardabweichung betrug 0,34°C (n=10).
4.2.2 Hauptstudie I (01.06.02 – 31.10.02)
Da sich in der Pilotstudie gezeigt hatte, dass die PCR mit anschließender Schmelzpunktanalyse die Nachweisrate der klassischen Methodik um 60,0%
verbesserte, wurde für die Hauptstudie ein neues Eingangskriterium festgelegt. Es wurden alle MGIT-Proben, die im Kulturautomaten ein positives Signal gaben, mit der neuen Methode untersucht. An der Methodik wurde folgendes verändert: Die Fertigstellung der Inhibitionskontrolle pAB2 erlaubte nun den Einsatz der genusspezifischen Sonde und der TBC-spezifischen Sonde in einem Lauf (vgl.
Kapitel 4.1). Um die Unterscheidung zwischen dem TBC und NTM zu beschleunigen, sollten deshalb in der Hauptstudie beide Sonden im ersten Durchgang verwendet werden.
Im zweiten Durchgang wurde die M. avium-Sonde und die M. chelonae / abscessus-Sonde zum weiteren Nachweis von NTM verwendet. Ein zweiter Durchgang wurde immer dann durchgeführt, wenn der erste positiv für Mykobakterien, aber negativ für den TBC ausgefallen war.
Die Kopienanzahl der Inhibitionskontrolle pAB2 wurde von 50 auf 500 Kopien erhöht (vgl. Tab. 4.2). Die DNA-Amplifikate sämtlicher PCR-Reaktionen, in denen Mykobakterien nachgewiesen werden konnten, wurden aus den Reaktionskapillaren isoliert und anschließend sequenziert. Wurden innerhalb von acht Wochen von einem Patienten in mehreren Proben, sofern diese nicht aus unterschiedlichen Materialien waren (z.B. Sputum, Trachealsekret, Urin, usw.), Mykobakterien in der LightCycler-Reaktion nachgewiesen, so wurde das Amplifikat nur einmal sequenziert, sofern keine Unstimmigkeiten mit der vorherigen Diagnose vorlagen.
Zwischen dem 01.06.02 und 31.10.02 wurden 1526 Proben kulturell angelegt. Von diesen erfüllten 530 Kulturen das Eingangskriterium.
77 Proben enthielten säurefeste Stäbchen, wobei in der Sequenzierung in allen Proben Mykobakterien gefunden wurden. Von diesen enthielten 37 Proben den TBC, während in 40 Proben NTM gefunden wurden. Von diesen 40 Proben enthielten 17 Proben M. avium, drei Proben M. intracellulare, 10 Proben den M. chelonae-abscessus-Komplex, vier Proben M. malmoense und sechs Proben M. gordonae.
101 Proben enthielten als Ergebnis der PCR Mykobakterien. 53 Proben enthielten den TBC, 48 Proben hatten NTM. Von diesen 48 Proben wurde ein zweiter Lauf
durchgeführt, wobei in 19 Proben M. avium und in 15 Proben den M. chelonae-abscessus-Komplex nachgewiesen wurde.
Demnach konnte nach zwei Durchgängen in 87 von 101 Proben mit Hilfe der PCR mit anschließender Schmelzpunktanalyse eine eindeutige Speziesdiagnose gestellt werden (86,1%). Bei den noch ausbleibenden 14 Proben wurde mit der Sequenzierung des 16S rRNA-Gens eine weitere Differenzierung durchgeführt (vgl.
Tab. 4.3).
Das Ergebnis aus allen 77 Proben, die säurefeste Stäbchen enthielten und bei denen in der anschließenden Sequenzierung Mykobakterien gefunden wurden, wurde mit der PCR bestätigt.
Zusätzlich wurden jedoch mit Hilfe der Amplifikation und anschließender Schmelzpunktanalyse 24 weitere Proben als positiv detektiert. Neun dieser 24 Proben waren im ZN-Präparat negativ für Mykobakterien. Diese wurden im Rahmen der Routinediagnostik wieder zurück in den MGIT-Kulturautomaten zurückgestellt und weiter inkubiert. Alle neun Proben wurden während dieser zweiten Inkubation erneut positiv vom Automaten gemeldet und bei der anschließenden ZN-Färbung zeigten alle Proben säurefeste Stäbchen. Im Durchschnitt wurden die Proben in diesen Fällen 7,8 Tage später als mit der LightCycler-Technologie nachgewiesen.
Die übrigen 15 Probenwaren in der ZN-Färbung negativ für säurefeste Stäbchen und kontaminiert mit anderen Bakterien. Zehn Proben stammten von Patienten, bei denen entweder in einer Parallelprobe oder mit der konventionellen PCR Mykobakterien nachgewiesen werden konnten. Fünf Proben stammten von CF-Patienten, diese wurden ein weiteres Mal mit Oxalsäure dekontaminiert und erneut im MGIT-Automaten inkubiert. Davon wurden drei Proben später positiv für säurefeste Stäbchen und es wurden in der Sequenzierung Mykobakterien nachgewiesen. Durchschnittlich dauerte die Diagnose mit einer erneuten Dekontamination mit Oxalsäure 7,8 Tage länger. Zwei Proben blieben nach der Oxalsäuredekontamination steril, allerdings konnte bei beiden Patienten in Parallelproben Mykobakterien nachgewiesen werden.
Die zusätzlich mit der PCR detektierten Proben waren damit auch mit der herkömmlichen Diagnostik erfasst worden, bzw. erfolgte der Nachweis aus Parallelproben. Nachteilig blieb die zeitliche Verzögerung bis zur endgültigen Diagnose.
Die direkte Sequenzierung der 24 zusätzlich detektierten Amplifikationsprodukten ergab, dass sich in 16 Proben der TBC, in einer Probe M. avium und sieben weiteren Proben der M. chelonae-abscessus-Komplex befanden. In keinem Fall wurde ein Problem bei der Amplifikation der Inhibitionskontrolle beobachtet.
Die Ergebnisse der Hauptstudie I sind in Tab. 4.3 zusammengefasst.
Tab. 4.3: Vergleich der Ergebnisse der Routinediagnostik und PCR in der Hauptstudie I Routine-Diagnostik PCR-Analyse
ZN-Färbung Sequenz
16S rRNA-Gen Genus Spezies 77 x positiv 101 x positiv
* nach Sequenzierung des 16 rRNA-Gens vom PCR-Amplifikat
Zusammengefasst wurde im Zeitraum vom 01.06.02 – 31.10.02 aus 1526 kulturell angelegten Proben mit Hilfe der etablierten Technik (MGIT-Kulturautomat → ZN-Färbung → Sequenzanalyse) in 77 Proben Mykobakterien isoliert. Untersuchte man mit Hilfe der PCR mit anschließender Schmelzpunktanalyse alle Proben, die im MGIT-Automaten ein positives Signal gaben, so wurden in 101 Proben Mykobakterien gefunden. Dieses Ergebnis entspricht einer Nachweisrate von 5,04%
für den kulturellen Nachweis mit der ZN-Färbung und anschließender Sequenzierung, bzw. 6,61% für den kulturellen Nachweis mit Hilfe der PCR bei erweiterten Einschlusskriterien. Bezogen auf die absolute Anzahl positiver Proben konnten durch den Einsatz der neuen Methode 31,2% mehr Proben als kulturell positiv identifiziert werden.
Eine weitere Aufschlüsselung der Ergebnisse der PCR-Analyse bezüglich der untersuchten Patientenmaterialien ist im Anhang in Tab. 8.2 aufgeführt. Bei den untersuchten Patientengruppen wurden in der Hauptstudie I folgende Mykobakterien-Spezies isoliert:
Von 19 untersuchten HIV-Patienten wurden 69 Proben untersucht und bei fünf Patienten Mykobakterien (2 x TBC und 3 x M. avium) isoliert.
Von 45 untersuchten Transplantationspatienten wurden 104 Proben untersucht und bei drei Patienten Mykobakterien (1 x M. chelonae-abscessus-Komplex und 2 x M. gordonae) isoliert.
Von 130 untersuchten CF-Patienten wurden 229 Proben untersucht und bei 13 Patienten Mykobakterien (8 x der M. chelonae-abscessus-Komplex, 4 x M. avium, 2 x M. intracellulare und 1 x der TBC) isoliert. Bei einem Patienten wurde eine Doppelinfektion mit dem M. chelonae-abscessus-Komplex und M. intracellulare nachgewiesen.
Von den übrigen 64 Patienten wurden 128 Proben untersucht und bei 11 Patienten Mykobakterien (6 x der TBC und jeweils 1 x M. avium, M. malmoense, M. genavense, M. gordonae und M. intracellulare) isoliert.
4.2.3 Hauptstudie II (01.11.02 – 31.03.03)
Die höhere Nachweisrate von Mykobakterien aus Kulturisolaten mittels PCR und anschließender Schmelzpunktanalyse im Vergleich zur herkömmlichen Diagnostik wurde in der Hauptstudie bestätigt. Jedoch wurde bei 530 Proben eine LightCycler-Diagnostik durchgeführt, in 482 Fällen mit einem Lauf, in 48 Fällen mit zwei Läufen.
Bei einem Preis von ca. 4,- € pro Lauf (reine Materialkosten) beliefen sich die Kosten dabei auf insgesamt 2.312,- €. Wir stellten uns daraufhin die Frage, ob es eine Möglichkeit gibt, die neue Diagnostikmethode auf einen Teil der im MGIT-Kulturautomat positiv gemeldeten Proben zu beschränken.
Ein Möglichkeit wäre, nur die Proben zu untersuchen, die säurefeste Stäbchen in der ZN-Färbung aufweisen. Dadurch wäre die Anzahl der mit der PCR untersuchten Proben von 530 auf 77 reduziert worden, wobei gleichzeitig die Kosten von 2.312,- € um 86 % auf 335,- € gesenkt worden wären.
Allerdings hatte sowohl die Pilotstudie als auch die Hauptstudie eindeutig gezeigt, dass dadurch die Nachweisrate bezogen auf die untersuchten Proben des kulturellen Nachweises deutlich gesenkt wurde. Bezogen auf die untersuchten Patienten konnte die Nachweisrate durch den erheblichen Aufwand allerdings nicht gesteigert werden.
Aus diesem Grunde entschlossen wir uns, vorwiegend aus ökonomischen Überlegungen, in einem dritten Teil dieser Untersuchung (Hauptstudie II) lediglich die Kulturen zu untersuchen, in denen säurefeste Stäbchen nachgewiesen werden konnten.
Hinsichtlich der Durchführung der Untersuchung gab es keine Veränderung gegenüber der ersten Hauptstudie. Zu diesem Zeitpunkt hatten wir allerdings eine Methode entwickelt, die M. tuberculosis von den anderen Mitgliedern des TBC unterscheidet (vgl. Kapitel 4.4). Daher wurden mit der M. tuberculosis-Sonde alle TBC-positiven Isolate in einem zweiten Durchgang untersucht. Bei einem negativen Ergebnis mit dieser Sonde wurde eine weitere Diagnostik auf das Vorliegen von M. bovis und M. bovis BCG mit den entsprechenden Sonden durchgeführt.
Zwischen dem 01.11.02 und 31.03.03 wurden insgesamt 1.329 Proben kulturell angelegt. Von diesen erfüllten 54 Kulturen das Eingangskriterium.
54 Proben enthielten laut ZN-Färbung säurefeste Stäbchen, wobei in der anschließenden Sequenzierung in 50 Proben Mykobakterien gefunden wurden. Die
fehlenden vier Proben blieben in der Sequenzierung negativ für Mykobakterien. Von den 50 Proben enthielten 14 Proben den TBC, während in 36 Proben NTM gefunden wurden. Von diesen 36 Proben enthielten 12 Proben M. avium, fünf Proben M. intracellulare, 12 Proben den M. chelonae-abscessus-Komplex, vier Proben M. xenopi, eine Probe M. malmoense, eine Probe M. szulgai und eine Probe M. gastri / kansasii.
Das Ergebnis aus allen 50 Proben, die säurefeste Stäbchen enthielten und bei denen in der anschließenden Sequenzierung Mykobakterien gefunden wurden, wurde mit der PCR bestätigt. In keinem Fall wurde ein Problem bei der Amplifikation der Inhibitionskontrolle beobachtet. Die Ergebnisse der Hauptstudie II sind in der Tab.
4.4 zusammengefasst.
Tab. 4.4: Vergleich der Ergebnisse der Routinediagnostik und PCR in der Hauptstudie II PCR-Analyse
ZN-Färbung Sequenz Genus Spezies
54 x positiv 50 x positiv
14 x TBC 14 x TBC
davon
1 x M. africanum**
50 Proben enthielten nach der Amplifikation mit dem LightCycler Mykobakterien. 14 Proben enthielten den TBC und wurden in einem weiteren Lauf mit der M. tuberculosis-Sonde weiter differenziert. 13 dieser Proben konnten als M. tuberculosis identifiziert werden. Die verbleibende Probe konnte mit den Sonden zur Unterscheidung im TBC nicht weiter differenziert werden. Zur Bestimmung wurde diese Probe ins NRZ nach Borstel geschickt und als M. africanum identifiziert. 36 Proben enthielten NTM. Von diesen 36 Proben wurde ein zweiter Lauf durchgeführt, wobei in 12 Proben M. avium und in 12 Proben der M. chelonae-abscessus-Komplex nachgewiesen wurde. Demnach konnte nach zwei Läufen in 37 von 50 Proben mit Hilfe der neuen Diagnostikmethode eine eindeutige Speziesdiagnose gestellt werden (74%). Zusätzlich gelang die eindeutige Identifizierung von M. tuberculosis aus dem TBC. Bei den noch ausbleibenden 12 Proben erfolgte mit Hilfe der Sequenzierung des 16S rRNA-Gens eine weitere Differenzierung (vgl. Tab. 4.4).
Routine-Diagnostik
* nach Sequenzierung des 16 rRNA-Gens vom PCR-Amplifikat
** Analyse im NRZ, positiv mit der TBC-spezifischen Sonde
1 x M. szulgai *
Zusammengefasst wurde in dem Zeitraum 01.11.03 – 31.03.03 aus 1.329 kulturell angelegten Proben mit Hilfe der etablierten Technik in 50 Proben Mykobakterien isoliert und mit der PCR und anschließenden Schmelzpunktanalyse ebenfalls.
Zeitdauer, Arbeitsaufwand und damit verbundenen Personalkosten bis zur Diagnose konnten damit durch den Einsatz der PCR mit Schmelzpunktanalyse gegenüber der bisherigen Diagnostik deutlich gesenkt werden.
Eine weitere Aufschlüsselung der Ergebnisse der PCR-Analyse bezüglich der untersuchten Patientenmaterialien ist im Anhang in Tab. 8.3 aufgeführt. Bei den untersuchten Patientengruppen wurden in der Hauptstudie folgende Mykobakterien-Spezies isoliert:
Von vier untersuchten HIV-Patienten wurden fünf Proben untersucht und bei vier Patienten Mykobakterien (jeweils 1 x TBC, M. avium, M. gastri/kansasii und M.
gordonae) isoliert.
Von zwei untersuchten Transplantationspatienten wurden zwei Proben untersucht und bei beiden Mykobakterien (1 x M. chelonae-abscessus-Komplex und 1 x M. xenopi) isoliert.
Von 16 untersuchten CF-Patienten wurden 19 Proben untersucht und bei 14 Patienten Mykobakterien (7 x der M. chelonae-abscessus-Komplex, 5 x M. avium, 2 x M. intracellulare) isoliert.
Von den übrigen 20 untersuchten Patienten wurden 28 Proben untersucht und bei 18 Patienten Mykobakterien (6 x der TBC, 4 x M. avium, 1 x M. chelonae-abscessus-Komplex, 3 x M. intracellulare, 2 x M. xenopi und jeweils 1 x M. szulgai und M.
malmoense) isoliert.
Insgesamt wurden in allen drei Studien Kulturen von insgesamt 704 Patientenproben untersucht. Davon waren 566 respiratorische und 138 nichtrespiratorische Materialien. Mykobakterien wurden in 137 respiratorischen Materialien (24,2%) und in 34 nichtrespiratorischen Materialien (24,6%) nachgewiesen.
Von den 18 Patienten, bei denen der TBC isoliert wurde, hatten drei eine HIV-Infektion und ein Patient litt an CF. Vier der 18 Patienten stammten aus Deutschland, von denen zwei eine HIV-Infektion hatten. Vier weitere Patienten stammten aus dem mittleren Osten (Türkei, Iran), zwei aus Asien (Thailand, Vietnam), zwei aus Osteuropa (Polen) und einer aus Afrika (Nigeria). Fünf der TBC positiven Proben stammten von Patienten aus dem nationalen Ringversuch für Mykobakterien und konnten nicht weiter identifiziert werden.
Von den 21 Patienten, bei denen M. avium nachgewiesen wurde, waren vier mit dem HI-Virus infiziert und 12 an CF erkrankt. Bei fünf weiteren Patienten war keine Vorerkrankung bekannt.
Von den 20 Patienten, bei denen der M. chelonae-abscessus-Komplex nachgewiesen wurde, waren 17 an CF erkrankt und bei zwei Patienten war eine Lungentransplantation durchgeführt worden.
Von den 12 Patienten, bei denen M. intracellulare nachgewiesen wurde, war einer HIV positiv und fünf Patienten an CF erkrankt. Bei sechs weiteren Patienten war keine Vorerkrankung bekannt.
Die damit am häufigsten isolierte Spezies bei HIV-Patienten waren in dieser Studie M. avium gefolgt von dem TBC.
Die am häufigsten isolierten Spezies bei CF-Patienten waren der M. chelonae-abscessus-Komplex gefolgt von M. avium.
4.2.4 Untersuchung von Proben aus dem Klinikum Hannover Nordstadt