Untersuchungen zum Einfluss von Clostridiengaben bei Grassilagen mit auffällig niedrigen Reineiweißanteilen auf die Pansenfermentation (in vitro)

Untersuchungen zum Einfluss von

Clostridiengaben bei Grassilagen mit auffällig niedrigen Reineiweißanteilen auf die

Pansenfermentation (in vitro)

INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin

-Doctor medicinae veterinariae- (Dr. med. vet.)

vorgelegt von Annika Irle

Herdecke

Hannover 2011

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. H. Bollwein Klinik für Rinder

Dr. M. Höltershinken Klinik für Rinder

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. H. Bollwein 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. G. Klein

Tag der mündlichen Prüfung: 07.11.2011

Isaac Newton

In Liebe meinen Eltern

Inhaltsverzeichnis

Seite Abkürzungsverzeichnis……….IV

1 Einleitung ... 1

2 Literaturübersicht ... 2

2.1 Der Pansen... 2

2.2 Protozoen des Pansens... 3

2.2.1 Fermentation von Futterbestandteilen durch die Protozoen ... 4

2.2.2 Endosymbiotische Bakterien in Protozoen... 5

2.2.3 Bakterien als Nahrung der Protozoen ... 6

2.3 Bakterien und deren Funktion im Pansen ... 7

2.4 Fremdbakterien im Pansen... 10

2.4.1 Clostridium botulinum ... 10

2.4.2 Clostridium perfringens ... 15

2.4.3 Escherichia coli... 16

2.4.4 Salmonella spp.. ... 20

2.5 Silagen als Grundfuttermittel... 24

3 Material und Methoden... 25

3.1 Das Langzeitinkubationssystem RuSiTec... 25

3.1.1 Aufbau ... 25

3.1.2 Beschickung des RuSiTec ... 26

3.2 Futterkomponenten... 26

3.2.1 Herkunft und Beschaffenheit des Heus und Kraftfutters ... 26

3.2.2 Herkunft der Silagen ... 27

3.2.3 Herkunft der Clostridien ... 27

3.3 Spendertier ... 27

3.4 Versuchsdurchführung... 27

3.4.1 Versuche... 28

3.5 Literaturangabe zur Analyse der Fermentationsparameter... 32

3.6 Protozoenbeurteilung... 32

3.7 PCR ... 33

3.8 Färbeversuche der Protozoen ... 34

3.8.1 Vitalfärbung von Protozoen... 34

3.8.2 Färbemethoden zur Differenzierung von Clostridien in Protozoen... 47

3.9 Statistische Auswertung... 48

4 Ergebnisse ... 49

4.1 Analyseparameter aus dem RuSiTec ... 49

4.1.1 Milieuparameter ... 49

4.1.2 Parameter des Stickstoffstoffwechsels ... 50

4.1.3 Parameter des Kohlenhydratstoffwechsels... 59

4.2 Motilität der Protozoen ... 66

4.3 Vakuolenfüllung der Protozoen... 66

4.4 Austestung der Vitalfärbung im RuSiTec ... 66

4.5 Ergebnisse der PCR-Untersuchungen ausgewählter RuSiTec-Proben ... 71

5 Diskussion... 73

5.1 Intention der Arbeit ... 73

5.2 Kritische Betrachtung der Versuchsanstellung ... 73

5.2.1 Das RuSiTec-System... 73

5.2.2 Beurteilung der verwendeten Futtermittel ... 74

5.2.3 Beurteilung der eingesetzten Clostridien ... 74

5.3 Verwendete Parameter und kritische Betrachtung... 76

5.4 Bewertung der ergänzenden Methode (Vitalfärbung der Protozoen) .... 76

5.5 Statistik ... 77

5.6 Auswirkungen von Grassilage- und Clostridienzulage auf die Fermentationsvorgänge ... 77

5.6.1 Milieuveränderungen ... 77

5.6.2 Auswirkungen auf den Stickstoffstoffwechsel ... 77

5.6.3 Auswirkungen auf den Kohlenhydratstoffwechsel... 85

5.6.4 Auswirkungen auf die Protozoenvitalität ... 89

5.7 Ergebnisse aus der PCR ... 89

5.8 Zusammenfassende Wertung und Ausblick... 90

6 Zusammenfassung ... 93

7 Summary ... 95

8 Literaturverzeichnis... 97

9 Anhang ... 125

9.1 Nährstoffanalyse der eingesetzten Futtermittel... 125

9.2 Gehalte freier Aminosäuren in den eingesetzten Grassilagen ... 126

9.3 In den RuSiTec-Läufen eingesetzte Materialien und Reagenzien ... 126

9.4 Ansätze zur Reinigung von Fermenterproben ... 128

9.5 Methodenbeschreibung der PCR-Analyse aus dem Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit ... 129

9.6 Statistische Daten ... 138

9.7 Prozentualer Vergleich der verschiedenen Phasen im RuSiTec... 204

9.8 Vergleich zwischen der alleinigen Zulage von Silage und der Kombination aus Silage- und Clostridienzulage... 210

9.9 Prozentuale Verteilung der Hefeaufnahme durch die Protozoen ... 228

Abkürzungsverzeichnis

AS Aminosäuren

AUC Area under the curve Aqua bidest. Aqua bidestillata

Bakt. Bakterien

B. megaterium Bacillus megaterium BoNT Botulinum Neuro Toxin

Ca Calcium

C. botulinum Clostridium botulinum C. perfringens Clostridium perfringens CO2 Kohlenstoffdioxid

CZ Clostridienzulage

Dipl. Protozoen der Gattung Diplodinium E. coli Escherichia coli

Ent. Protozoen der Gattung Entodinium Ent. caudatum Entodinium caudatum

FlFS Flüchtige Fettsäuren

FlFS-Überst. Flüchtige Fettsäuren im Überstand gaschromatogr. gaschromatographisch

GFP Green Fluorescent Protein

H2 Wasserstoff

HAB Hyper Ammonia-producing Bacteria K. aerogenes Klebsiella aerogenes

KF Kraftfutter

K.-phase Kontrollphase

LMQS Institut für Lebensmittelqualität und –sicherheit

Mio. Million

n Anzahl

Na Natrium

NaCl Natriumchlorid

NH3 Ammoniak

n.n. nicht nachgewiesen

n.u. nicht untersucht

p Signifikanz

P Phosphor

PCR Polymerase Chain Reaction

pH negativer dekadischer Logarithmus der H⁺-Konzentration P. mirabilis Proteus mirabilis

Ra Rohasche

Rfe Rohfett

Rp Rohprotein

RT Raumtemperatur

RuSiTec Rumen Simulation Technique

s Standardabweichung

Sc. Streptococcus

SNARE Soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor Attachement Receptor

SZ Silagezulage

TMR Total Mixed Ration

TS Trockensubstanz

Vit. Vitamin

VK Variationskoeffizient

Vol. Volumen

% Prozent

< kleiner als

> größer als

= ist gleich

↓ Abfall

↑ Anstieg

x Mittelwert

1 Einleitung

In den letzten zwei Jahrzehnten tritt in deutschen landwirtschaftlichen Milchvieh- betrieben, deren Fütterung auf Grassilage basiert, ein Krankheitsbild unbekannter Genese auf, das mit Nachgeburtsverhaltung, Sterilität, erhöhter Milchzellzahl, Lahm- heiten, Stoffwechselerkrankungen, Verdauungsstörungen, Labmagenverlagerung und Festliegen bis hin zu plötzlichen Todesfällen einhergeht und somit zu einer hohen finanziellen Belastung der Betriebe führt. Untersuchungen auf Stoffwechseler- krankungen, latente Pansenazidosen oder Hypocalzämien ergeben negative Ergeb- nisse (EICKEN 2005a, b).

Eine These zur Ätiologie dieses unspezifischen Krankheitsbildes stammt von EICKEN (2005a). Er sieht einen Zusammenhang mit der Eiweißzusammensetzung der eingesetzten Silagen, da diese vermehrt einen erniedrigten Reineiweißanteil auf- wiesen. Außerdem führte sowohl ein Absetzen oder Verschneiden der Silagen, als auch ein Zusatz von Futtermitteln mit hohem Reineiweißanteil zur klinischen Besserung (EICKEN 2005b). Diese Erkrankung wird als „Faktorenerkrankung Milch- viehherde“ bezeichnet. Auswirkungen der betroffenen Silagen auf die Pansen- fermentation in vitro wurden bereits nachgewiesen (GAST 2010; GRESNER 2011;

LUMPP 2011; THEERMANN 2011; WICHERN 2011).

Eine zweite These wurde von BÖHNEL et al. (2000) aufgestellt. Er vermutet den ätiologischen Zusammenhang des Krankheitsbildes in der Kontamination der Futter- mittel mit Clostridien, da Antikörper gegen das ubiquitär vorkommende Botulinum- toxin im Blut und der Erreger selbst im Kot erkrankter Tiere sporadisch detektiert werden konnten. Pathogenetisch soll es zur Ansiedlung von Clostridium botulinum im unteren Darmabschnitt und somit zu einer kontinuierlichen Resorption des Botulinumtoxins kommen.

Ziel der vorliegenden Arbeit ist es zu klären, ob Clostridium botulinum und Clostridium perfringens Auswirkungen auf die Pansenfermentation in vitro haben oder die Kombination von Silagen mit auffällig niedrigen Reineiweißanteilen und Clostridien zu Schädigung oder Veränderung der Pansenfermentation in vitro führen.

Auch eine mögliche Auswirkung auf die Protozoenpopulation soll hierbei untersucht werden.

2 Literaturübersicht 2.1 Der Pansen

Der Pansen ist ein komplexes Ökosystem, welches als offenes, kontinuierliches Fermentationssystem bezeichnet werden kann (HUNGATE 1966; VAN SOEST 1982). In dieser Gärkammer ermöglicht ein Zusammenspiel von verschiedensten Bakterien, Protozoen und Pilzen eine optimale Nutzung der Wiederkäuerration. Die mikrobielle Besiedlung ist verantwortlich für den mikrobiellen Abbau von Futtermitteln und stellt ihrem Wirt erforderliche Nährstoffe zur Verfügung (STEWART et al. 1997).

Das Zusammenleben der Mikroben im Pansen führt zu Symbiosen, Wettbewerb um Ressourcen und Antagonismen (FIRKINS u. YU 2006; FIRKINS 2008)

Änderungen in Zusammensetzung oder Qualität der Fütterung können dieses

„geordnete Chaos“ stark durcheinander bringen und somit zu gesundheitlichen Störungen des Wirtsorganismus, dem Rind, führen. Kennzeichen eines physiolo- gischen Pansenmilieus sind in Tab. 2.1 aufgeführt.

Tab. 2.1: Kennzeichen eines physiologischen Pansenmilieus (CZERKAWSKI 1985; YOKOYAMA u. JOHNSON 1988)

Parameter Dimension

pH (log^-10) 6 bis 7

Temperatur (°C) 38 bis 42

Redoxpotential (mV) -250 bis -450

Zusammensetzung des Pansengases (Vol%)

65 Kohlendioxid 27 Methan 7 Stickstoff 0,8 Sauerstoff 0,2 Wasserstoff

NH3 (mmol/L) 2,35-11,7

Summe FlFS (mol%) 80-120

Essigsäure (mol%) 55-70

Propionsäure (mol%) 15-25

i-Buttersäure (mol%) 1-2

n-Buttersäure (mol%) 10-15

i-Valeriansäure (mol%) 1

n-Valeriansäure (mol%) 2-3

Da Protozoen und Bakterien maßgeblich an der Aufrechterhaltung des Milieus beteiligt sind, soll im Folgenden näher auf diese beiden Gruppen eingegangen werden.

2.2 Protozoen des Pansens

Eine besondere, wenn auch noch nicht endgültig geklärte Bedeutung haben die Protozoen. Sie regulieren unter anderem die Bakterienpopulation im Pansen sowohl qualitativ als auch quantitativ und haben durch ihre Stärkespeicherkapazität eine Pufferfunktion, durch die sie die Aufrechterhaltung biochemischer Parameter sichern.

Erstmals entdeckt wurden sie bereits 1843 von GRUBY u. DELAFOND. Ihre Anzahl im Pansen beläuft sich auf bis zu 10⁶/mL. Hierbei sind allein Ciliaten mit mehr als 30 verschiedenen Spezies vertreten. Eine kleinere Anzahl Flagellaten und Amoeben sind ebenfalls im Pansen anzutreffen. Die morphologische Einteilung der Protozoen ist in Abb. 2.1 dargestellt. Die Artenzusammensetzung schwankt fütterungsbedingt.

Mangelhaftes Futter wie auch eine erhebliche pH-Wert-Absenkung kann zum Ab- sterben von Protozoen führen, was wiederum Fermentationsprozesse beeinflusst.

Beispielsweise wird die Zusammensetzung der flüchtigen Fettsäuren verändert, der Ammoniakgehalt sinkt, Bakterien und Pilze breiten sich aus (näheres s. HÖHLING 2000). Bei Fütterung von Grassilage steigt die Gesamtzahl der Protozoen an (näheres s. GAST 2010). Im Labmagen oder Duodenum sind keine Protozoen mehr nachweisbar, da sie den physiologischen Verdauungsprozessen unterliegen (MANGOLD 1933).

Abb. 2.1: Morphologische Einteilung der Protozoen

2.2.1 Fermentation von Futterbestandteilen durch die Protozoen

Protozoen fermentieren Futterbestandteile. In Tab. 2.2 sind die speziesabhängigen Fermentationsmöglichkeiten aufgeführt.

Stärke besteht aus α-D-Glucose-Einheiten. Um sie verwerten zu können, muss sie enzymatisch durch Amylasen gespalten werden. Die meisten Protozoen sind in der Lage Stärke zu fermentieren (siehe Tab. 2.2).

Tab. 2.2: Protozoenarten des Pansens, von ihnen fermentierte Substrate und Fermentationsprodukte

Protozoenart Substrat Fermentationsprodukt Autor/Jahr Isotricha und

Dasytricha

Glucose, Fructose, Raffinose, Saccharose, Pektin

Isotricha intestinalis und Isotricha prostoma

Stärkekörner

H2, CO2, Acetat, Butyrat, Lactat und zu 69 %

Speicherpolysaccharide

OXFORD 1951;

MASSON u.

OXFORD 1951;

HEALD et al.

1953;

GUITIERREZ 1958;

HOWARD 1959 Entodinium

spp.

Stärkekörner Acetat, Butyrat, kleine Mengen Propionat und Ameisensäure, H2, CO2

und geringe Mengen Lactat

ABOU AKKADA u.

HOWARD 1960 Entodinium

exiguum

Getreidestärke FONDEVILA

u.

DEHORITY 2001b Eudiplodinium

bovis

Stärke, Xylan, Xylodextrin, Cellodextrin, Maltose, Xylobiose, Cellobiose und Saccharose

BAILEY u.

CLARKE 1963 Eudiplodinium

medium

Stärke und Hemicellulose Acetat und Butyrat, Ameisensäure

NAGA u.

EL-SHAZLY 1968

Epidinium ecaudatum

Hemicellulose, Stärke, Xylobiose, Cellobiose, Saccharose, Isomaltose und Melibiose

Fortsetzung Tab. 2.2 Epidinium

caudatum

Glucose,

Acicellulose, Xylose, Arabinose, Cellobiose, Galactose, Glucose und Xylose

intracelluläre Polysaccharide, acht Aminosäuren

COLEMAN u.

LAURIE 1974;

CLAYET et al. 1992 Ophryoscolex

purkynjei

Weizen Acetat und Butyrat,

weniger Propionat, Spuren von Formiat und Lactat, H2 und CO2

MAH u.

HUNGATE 1965

Pansenprotozoen sind auch in der Lage Cellulose zu verstoffwechseln. Eine Übersicht der cellulolytischen Aktivität von Pansenprotozoen ist in Tab. 2.3 aufgeführt.

Tab. 2.3: Cellulolytische Aktivität einiger ruminaler Protozoen Spezies cellulolytische Aktivität Autor/ Jahr

Eudiplodinium magii hoch COLEMAN 1985

Epidinium caudatum hoch COLEMAN 1985;

MICHALOWSKI et al.

2001

Ostracodinium dilobum hoch COLEMAN 1985

Metadinium affine mittel COLEMAN 1985

Eudiplodinium bovis mittel Ophryoscolex caudatus mittel Polyplastron multivesiculatum mittel Diplodinium pentacanthum niedrig

COLEMAN 1985

2.2.2 Endosymbiotische Bakterien in Protozoen

Einige Pansenciliaten wie Dasytricha ruminantium und Entodinium spp., die aus dem Schafpansen isoliert wurden, beherbergen intrazelluläre Bakterien. Diese Bakterien waren nicht in Verdauungsvakuolen zu finden (FINLAY et al. 1994). Es ist wahrscheinlich, dass alle im Cytoplasma lebenden Bakterien endosymbiotische Methanogene sind, die aus dem von den Protozoen produzierten Wasserstoff Methan bilden können. Vermutlich sind diese intrazellulären Bakterien in den Protozoen des Schafes den extrazellulären, auf der ciliaten Zelle befindlichen zahlenmäßig überlegen (FINLAY et al. 1994).

In dieser Studie (FINLAY et al. 1994) wurden auch intrazelluläre Bakterien nachgewiesen, welche nicht frei im Cytoplasma sondern einzeln eingeschlossen in membrangebundenen Vesikeln vorlagen, bei denen es sich nicht um Verdau- ungsvakuolen handelte. In holotrichen Protozoen, aus Schaf- oder Rinderpansen

isoliert, fand NOUZAREDE (1978) endosymbiotische bazillusartige Bakterien, die in der perinukleären Gegend Sporen gebildet hatten.

Auf der Oberfläche von Pansenciliaten wurden 200 Bakterienarten aus 11 Spezies nachgewiesen, die aufgrund ihrer spezifischen Fluoreszenz als Methanogene identifi- ziert werden konnten (VOGELS et al. 1980).

2.2.3 Bakterien als Nahrung der Protozoen

Bakterien sind auch als Nahrungsquelle für Protozoen von Bedeutung (JOHNSON et al. 1944). Es besteht der Hinweis, dass für das Wachstum notwendige Aminosäuren größtenteils aus Bakterien genutzt werden (OWEN u. COLEMAN 1977). Die Fressgewohnheiten der Einzeller variieren. In vitro kultiviertes Entodinium longinucle- atum fraß in Studien von OWEN u. COLEMAN (1977) verschiedene Bakterienarten, wie Selenomonas ruminantium, bei dem es sich um ein Pansenbakterium handelt, sowie Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Butyrivibrio fibrisolvens und Escherichia coli, bevorzugt aber Klebsiella aerogenes und Proteus mirabilis. Bacteroides rumini- cola, welches originär im Pansen vorkommt, und Pseudomonas sp. wurden von Entodinium longinucleatum nicht aufgenommen. Die Bakterienaufnahme betrug 130- 3400 Bakterien/Stunde/Protozoe. Die eingesetzte Bakteriensuspension enthielt 10⁹ Bakterien/mL (OWEN u. COLEMAN 1977).

Bakterien, die von dem Ciliaten Isotricha prostoma aufgenommen wurden, ent- sprachen einem bestimmten morphologischen Typus, wobei es sich häufig um stäb- chenförmige Bakterien handelte (GUTIERREZ 1958).

Entodinium caudatum hingegen nahm in einem Zeitraum von drei Stunden alle angebotenen Bakterien [Pansenbakterien: Streptococcus bovis 2 B; Fremdbakterien:

Streptococcus faecalis, B. megaterium, Clostridium welchii, Leuconostoc mesen- teroides, Salmonella Typhimurium, Serratia marcescens, Vibrio naetchnikovii, Bacterium D] in gleichem Maße auf (COLEMAN 1964). Entodinium simplex zeigte ebenfalls wenig Variation zwischen den aufgenommenen Bakterienspezies [Pansen- bakterien: Streptococcus bovis (Sc. bovis); Fremdbakterien: Sc. faecalis, Butyrivibrio fibrisolvens, B. megaterium, E. coli, K. aerogenes, P. mirabilis], wenn man das Gesamtvolumen der einzelnen Spezies miteinander verglich, das in einem Zeitraum von drei Stunden aufgenommen wurde. Dennoch bestanden Unterschiede in der Aufnahmegeschwindigkeit: so wurden P. mirabilis und K. aerogenes schneller aufgenommen(COLEMAN 1972). In der Regel waren Bakterien nach der Aufnahme durch das Protozoon bis zu fünf Min. in den Vesikeln des Endoplasmas lebensfähig.

30-60 Min. nach der Futteraufnahme erschienen die ersten löslichen Komponenten im Medium (Versuche mit E. coli und Ent. caudatum). Es bestanden allerdings auch hier Speziesunterschiede in der Verdauungsgeschwindigkeit bezüglich der Bakterien (vergl. Tab. 2.4). So war beispielsweise ein stäbchenförmiges Bakterium (unidenti- fiziert) nach 150 Min. trotz ständiger Futteraufnahme in Ent. caudatum immer noch lebensfähig (COLEMAN 1967; WHITE 1969).

Isolierte, markierte Bakterien (K. aerogenes, P. mirabilis) wurden mit Protozoen- suspensionen inkubiert. Beide wurden inkorporiert; nach 2,5 h waren von ersteren 35 %, von den letzteren 82 % in den Protozoen befindliche Bakterien noch lebensfähig. Nachfolgende Versuche von COLEMAN (1975b) zeigten, dass das

Überleben von K. aerogenes mit einer Glucose-Polysaccharid-Kapsel in Zusammen- hang stand, die unter anaeroben Bedingungen aus vom Protozoon bereitgestellten Zuckern gebildet wurde. Die Beständigkeit hing davon ab, wie schnell die Kapsel gebildet oder das Bakterium verdaut werden konnte.

Eine solche Schutzhülle könnte auch für andere Bakterien wie C. botulinum und C. perfringens eine Möglichkeit darstellen einer protozoalen Digestion im Pansen zu entgehen. Für diese Clostridienarten ist eine derartige Kapselbildung nicht beschrie- ben, aber für andere. So wurde die Herstellung von Kapselbestandteilen, den amylopectinartigen Polysacchariden, auch in Clostridium pasteurianum als einziges mengenmäßig signifikantes Glucan nachgewiesen (DARVILL et al. 1977). Die Produktion der Polysaccharide erfolgte vor der Sporulation. Auch in Clostridium butyricum wurde ein intrazelluläres Polysaccharid kurz vor Ende der exponentiellen Phase beschrieben (BERGERE et al. 1975). Es trat im Zellcytoplasma der Zelle als große Granula auf. BALDASSARRI et al. (1991) wies die Bildung einer dünnen ruthenium-rot-positiven Schicht bei Clostridium difficile während des Wachstums in glucosehaltigem Medium nach. Die 10-20 nm dicke Kapsel bestand aus Poly- sacchariden. Ebenso wurde eine Polysaccharidhülle bei Clostridium perfringens Hobbs Typ A beschrieben (CHERNIAK u. FREDERICK 1977).

Tab. 2.4: Lebensfähige Bakterien im Pansenprotozoon Ent. caudatum nach Ingestion (COLEMAN 1967; WILLIAMS u. COLEMAN 1992)

Bakterienart Inkubationszeit (Min.)

Lebensfähige Bakterien (%) aller inkorporierten Bakterien

E. coli 30 12,3*

K. aerogenes 150 35

P. mirabilis 150 82

Serratia marcescens 150 60

B. megaterium 5 0

Sc. bovis 150 1-7

Unidentifiziertes Stäbchen

150 8-70

*durchschnittliche Überlebenszeit von E. coli in den Futtervakuolen von Ent. caudatum betrug fünf Min.

2.3 Bakterien und deren Funktion im Pansen

Bakterien, die aus dem Pansen isoliert werden können, werden in sogenannte

„echte“ Bakterien (s. Abb. 2.2) und solche, die nur temporär über die Umwelt in den Pansen gelangt sind, eingeteilt (GALL u. HUHTANEN 1951). Unter anderem müssen folgende Bedingungen von „echten“ Pansenbakterien erfüllt werden:

1. anaerober Stoffwechsel

2. Anzahl: >1 Mio./g frischen Panseninhalts

3. Isolierung des Bakteriums mindestens zehn Mal aus zwei oder mehr Tieren 4. Isolierung des gleichen Bakteriums an mindestens zwei unterschiedlichen

Standorten

5. Herstellung ruminaler Endprodukte aus Substraten des Pansens

Abb. 2.2: „Echte“ Bakterien im Pansen (OGIMOTO 1981)

Die Bedingungen im Pansen werden durch kontinuierliche Futter- und Wasserzufuhr auf der einen Seite und Entfernung unverdaulicher Reste sowie der Fermentations- produkte auf der anderen Seite konstant gehalten. In diesem stabilen Milieu ist es einer Vielzahl von Bakterien möglich dauerhaft zu leben. Die Dichte der Bakterien beträgt 10¹⁰-10¹¹ Bakterien/g Panseninhalt (HUNGATE 1966; YOKOYAMA u.

JOHNSON 1988). Hauptsächlich handelt es sich bei den im Pansen lebenden Bakterien um nicht sporenbildende Anaerobier (HUNGATE 1966). 300 fakultativ anaerobe Stämme wurden aus mit Heu gefütterten Schafen isoliert (HEALD et al.

1953), davon 120 Streptokokken, die alle zur Lancefieldgruppe D gehörten. Hiervon hatten 82 % ähnliche Fermentations- und Reaktionseigenschaften wie Sc. bovis,

6 % solche wie Enterococcus faecalis, vormals Streptococcus faecalis (HEALD et al.

1953).

Trotz Pufferung im Pansen durch Bicarbonat, Phosphat, Ammonium und flüchtigen Fettsäuren, kann der pH-Wert je nach Fütterung zwischen 7,0 und unter 5,0 variieren. Zahlreiche in vivo- (HUNGATE et al. 1952; SLYTER et al. 1970; MACKIE u. GILCHRIST 1978) und in vitro- (HOBSON 1965) Studien zeigten, dass die Wirkung der panseneigenen Flora zur Erhaltung des physiologischen Pansenmilieus direkt pH-abhängig ist und eine acide Umgebung unter pH 5,9 die maximale Wachs- tumsrate senken kann (RUSSELL et al. 1979). Hierzu gibt es verschiedene Theorien:

• die chemiosmotische Theorie: bei niedrigem pH-Wert fehlt Energie, um Protonen durch die Zellmembran auszuschleusen und somit einen Gradienten aufzubauen, welcher der Speicherung und Umwandlung metabolischer Energie dient (MITCHELL 1961; LEWIS et al. 1994;

KAKINUMA 1998)

• fehlende Permeabilität der Membranen für Protonen führt zu Verbrauch von zusätzlicher Energie, um das Membranpotential aufrecht zu erhalten: die Folge ist reduziertes bakterielles Wachstum (STOUTHAMER 1979)

• wird das Bakterium einer aciden Umgebung ausgesetzt, kann auch der normalerweise neutrale (MITCHELL 1961) intracelluläre pH-Wert absinken (RIEBELING et al. 1975), Enzyme sind stark pH-abhängig, es folgt vermindertes Wachstum

Die Bakterienzusammensetzung hängt von der Fütterung ab. So zeigte sich die Bakterienflora deutlich vielfältiger, wenn Alfalfaheu oder Alfalfaheukonzentrat verfüttert wurde, als wenn Konzentrate oder Weizenstroh zum Einsatz kamen. Bei gleicher Fütterung blieb die Bakterienpopulation stabil, allerdings gab es individuelle Schwankungen zwischen Tieren gleicher Fütterung (BRYANT u. BURKEY 1952).

Das Ausmaß der mikrobiellen Proteinsynthese hängt von der Verfügbarkeit und Menge der im Futtermittel enthaltenen Nährstoffe (Kohlenhydrate, Fette und Proteine) und der somit bereitgestellten Energie ab (BOGUHN et al. 2006). Bei Einsatz von Maissilagen zeigte sich eine höhere mikrobielle Proteinsynthese im Vergleich zu Gras- oder Luzernesilagen (BOGUHN et al. 2006). In diesen Unter- suchungen wurde bei Verwendung von TMR eine Beziehung zwischen dem Roh- proteingehalt der TMR und der Effizienz der Proteinsynthese nachgewiesen.

Prinzipiell sind bakterielle Fermentationsprodukte flüchtige Fettsäuren, Kohlendioxid, Methan und Ammoniak. Somit wandeln die Mikroorganismen das Futter nicht nur in eine für das Rind verfügbare Form um, sondern produzieren de novo z. B. Proteine und Vitamine, die für das Rind essentiell sind (BRYANT 1959). Der Wiederkäuer ist auf Bakterien als Proteinquelle angewiesen. Daher ist die Gewährleistung eines adäquaten Wachstums der Pansenbakterien von Bedeutung.

2.4 Fremdbakterien im Pansen

Neben den Pansenbakterien existiert im Pansen eine Vielzahl an Bakterien, die nicht die Kriterien der „echten“ Pansenbakterien erfüllen. Diese Bakterien gelangen aus der Umwelt in den Pansen und sind dort in der Regel nur temporär nachzuweisen (GALL u. HUHTANEN 1951). Im Folgenden werden einige dieser Fremdbakterien, die bei Störungen des originären Pansenmilieus zu Erkrankungen führen können, vorgestellt.

2.4.1 Clostridium botulinum

Zur Familie der Bacillaceae gehörend sind Clostridien Sporenbildner. Das ermöglicht ihnen ein Überleben unter ungünstigen Umweltbedingungen, durch welche die Sporulation ausgelöst wird.

Clostridium botulinum (C. botulinum) beschreibt eine heterogene Gruppe anaerober Bakterien, deren Gemeinsamkeit in der Synthese des BoNT (Botulinumneurotoxin) und der Sporenbildung liegt. Die Benennung der verschiedenen Stämme erfolgt aufgrund unterschiedlicher Toxintypen. Problematisch ist hierbei, dass auch andere Clostridienspezies zur BoNT-Synthese fähig sind (HALL et al. 1985; McCROSKEY et al. 1986). So beschrieben HALL et al. (1985) beispielsweise einen Fall von Kinds- botulismus. Diese Form entsteht in der Regel durch die Absorption von Toxin über die Darmschleimhaut, welches in vivo im Darm nach Ansiedlung und Vermehrung von C. botulinum produziert wurde. Er führte das Toxin und die dadurch ent- standene Erkrankung bei dem von ihm beschriebenen Fall allerdings nicht auf C. botulinum sondern auf Clostridium barati zurück. Ähnliches entdeckten McCROSKEY et al. (1986): bei einem positiven Nachweis von Typ E Botulinumtoxin wurde der Kindsbotulismus auf Clostridium butyricum zurückgeführt.

Clostridien sind ubiquitär vorkommende Bakterien; ein Nachweis in Silagen, Rinder- kot oder Einstreu stellt daher kein ungewöhnliches Untersuchungsergebnis dar (KEHLER u. SCHOLZ 1996). Ein potentielles Risiko des Vorkommens von C. botulinum in Rindern ist ein Übergang des Toxins auf Milchprodukte und somit die Gefährdung des Menschen (LINDSTRÖM et al. 2010). Bereits eine geringe Verschmutzung des Euters mit Kot oder über die Stallluft, die durch eingetrocknete Kot- oder Silagereste mit Sporen kontaminiert ist, kann demnach zu einem Übertrag in die Milch führen (WEIßBACH 2004).

Eine Impfung landwirtschaftlicher Nutztiere ist möglich und in gefährdeten Gebieten essentiell. Eine wichtige Prophylaxemaßnahme stellt ein verbessertes Management dar, um Kontamination von Weideflächen und Futtermitteln zu verhindern und die Futterqualität zu verbessern (KEHLER u. SCHOLZ 1996).

Ein Nachweis von Clostridien kann mittels PCR erfolgen. Entwickelt wurde diese molekulargenetische Technik von LINDSTRÖM et al. (2001a).

2.4.1.1 Eintragsquellen von Clostridium botulinum und anderen Clostridien in die Wiederkäuerration

Eine Eintragsquelle von C. botulinum in die Wiederkäuerration ist die Kontamination von Futtermitteln mit sporenhaltigen Kadavern von Kleinnagern und Wildtieren, die u.

a. von Erntemaschinen verpresst wurden (GALEY et al. 2000; WEIßBACH 2004), oder von mit Erde verunreinigten Grobfuttermitteln (BÖHNEL u. GESSLER 2004;

WEIßBACH 2004). Auch in Bioabfällen (BÖHNEL u. LUBE 2000) und Kompost- proben (SCHIMMEL 2002) wurden Toxine gefunden. Dabei wurde Typ B Botulismus dem Einsatz mangelhaft silierter Heulage zugeschrieben (SCHIMMEL 2002), trat aber auch nach Verwendung von Biertreber auf (BREUKINK et al. 1978).

Typ C Botulismus wurde nach Verfütterung von Futtermitteln diagnostiziert, die Kadaver oder Geflügelmist enthielten, die mit dem Bakterium oder Toxin belastet waren. Diese Form führte zu Hemmung der Pansenmotorik, Erniedrigung des Schwanztonus und Festliegen, wahrscheinlich ausgelöst durch Tetraparese (JEAN et al. 1995). Typ D Botulismus stand in Verdacht, durch die Aufnahme von Knochen toter Tiere hervorgerufen worden zu sein (ROCKE et al. 2008).

Die Aufrechterhaltung des Kreislaufs von C. botulinum wird der landwirtschaftlichen Nutzung zugeschrieben. Keime werden mit dem Kot ausgeschieden, über Gülle und Einstreu auf die Felder gebracht und können somit in pflanzliche Futtermittel gelangen. KALZENDORF (2004) beschrieb eine geringere Clostridienbelastung in Grassilagen nach Einsatz eines mineralischen Düngers als nach Güllebedüngung.

Ein Vorkommen von C. botulinum ist im Kot gesunder Haustierbestände durchaus üblich (NOTERMANS et al. 1978), wobei saisonale Schwankungen bestehen. Im Sommer wurden < 1,5 Sporen/g nachgewiesen, im Winter > 4 Sporen/g. Als Grund hierfür wird eine vermehrte Silagefütterung im Winter vermutet. Silage kann auf die oben beschriebenen Wege verunreinigt werden. Vorhandene Sporen gelangen so in die Mieten, ihr Auskeimen wird durch anaerobes Milieu begünstigt. Eine Vermehrung von C. botulinum ist ab einem pH-Wert von > 4,5 und einer Wasseraktivität > 0,985 (TS < 25 %) möglich (MEYER u. COENEN 2002). Nitratarme Ausgangsmaterialien be-günstigten dies, da die fehlenden nitrosen Gase ihre hemmende Wirkung nicht ausüben konnten (POLIP 2001). HAAGSMA und TER LAAK (1979) wiesen 10⁴ Keime/g in toxinhaltiger Grassilage nach, die bei Rindern Typ B-Botulismus auslöste. Ähnliche Fälle wurden in verschiedenen Ländern beschrieben (HAAGSMA u. TER LAAK 1979; ABBITT et al. 1984; DIVERS et al. 1986; POPOFF u.

LECOANET 1987; HOGG et al. 1990; JEAN et al. 1995; YERUHAM et al. 2003).

Eine Zusammenfassung der möglichen Vektoren für den Eintrag von Clostridien in Futtermittel ist in Tab. 2.5 aufgeführt.

Tab. 2.5: Mögliche Vektoren für den Eintrag von Clostridien in Futtermittel

Matrix Clostridienart Autor/Jahr

Gülle C. botulinum KALZENDORF 2004

C. botulinum Typ C und D NEILL et al. 1989 Geflügelmist

C. botulinum Typ C JEAN et al. 1995 Kadaver C. botulinum Typ C GALEY et al. 2000;

WEIßBACH 2004 Knochen toter Tiere C. botulinum Typ D ROCKE 2008

Erde C. botulinum BÖHNEL u. GESSLER

2004; WEIßBACH 2004 Bioabfälle C. botulinum Typ A, B, C, D,

E

BÖHNEL u. LUBE 2000

Kompost C. botulinum SCHIMMEL 2002

Biertreber C. botulinum Typ B BREUKINK et al. 1978 Mangelhafte

Silierung

C. botulinum Typ B SCHIMMEL 2002

2.4.1.2 Das Botulinumtoxin

Das Botulinumtoxin besteht aus zwei Untereinheiten. Die α-Einheit ist ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 140 bis 167 kDa (KRIEGLSTEIN 1990). Mittels Proteasen erfolgt eine Aktivierung des Toxins durch Spaltung in eine leichte Kette mit einem Molekulargewicht von 50 kDa und eine schwere Kette mit 100 kDa (DASGUPTA u. SUGIYAMA 1972). Die Ketten sind über Disulfidbrücken miteinander verbunden (DASGUPTA 1981). Eine Ausnahme bildet das Neurotoxin A, welches wahrscheinlich über Fe²⁺-Ionen verbunden wird (BHATTACHARYYA et al. 1988;

BHATTACHARYYA u. SUGIYAMA 1989). Bei der ß-Einheit handelt es sich um eine nichttoxische Komponente (SUGIYAMA 1980). OHISHI et al. (1977) testeten die Toxine von C. botulinum Typ A, B und F. Es stellte sich heraus, dass das Vorläufertoxin (Progenitortoxin)- ein Komplex aus toxischer und nicht-toxischer Komponente- eine höhere orale Toxizität bei Mäusen aufwies als die dissoziierte toxische Komponente. Die dissoziierte toxische Komponente war im Gegenteil sogar stark anfällig für Säuren und proteolytische Enzyme (KITAMURA et al. 1969; OHISHI u. SAKAGUCHI 1975). Die erhöhte Resistenz des Progenitortoxins wurde der nicht- toxischen Komponente zugesprochen, durch deren Bindung der toxische Anteil vor Zerstörung im Verdauungstrakt geschützt war (OHISHI et al. 1977).

KOZAKI u. NOTERMANS (1980) zeigten aber auch, dass die hochmolekulare Fraktion (L=large) der aufgereinigten Toxintypen B (B-L) und C (C-L) im Panseninhalt deutlich stabiler war als die Fraktion mittlerer Molekulargröße (M=medium) beider Toxine (B-M und C-M). Die Ergebnisse hinsichtlich der Stabilität des Toxintyps B entsprachen den Beobachtungen, dass B-L im Magensaft der Ratte stabiler war als B-M (SUGII et al. 1977). Bei Mäusen wies B-L nach oraler Verabreichung eine tausendfach höhere Toxizität auf als B-M (OHISHI et al. 1977). Nach Inkubation mit Pansensaft war bei B-L eine deutliche Zunahme der Toxizität zu beobachten, wohin-

gegen B-M nur minimal toxischer wurde. Die Steigerung der Toxizität bei B-L wurde proteolytischen Enzymen im Panseninhalt zugeschrieben (KOZAKI u. NOTERMANS 1980). Daher sind diese bei Intoxikationen des Rindes von besonderer Bedeutung (KOZAKI u. NOTERMANS 1980).

KOZAKI u. NOTERMANS (1980) folgerten aus den Untersuchungen von ALLISON et al. (1976), dass eine Intoxikation beim Wiederkäuer nur dann auftritt, wenn die auf- genommene Toxinmenge das Abbauvermögen des Pansens überschreitet. So wirkte auch beispielsweise die subkutane Applikation einer Botulinumtoxin Typ D Aufberei- tung bereits in einer Dosierung von 0,00025 mL/kg KGW letal, während die orale Gabe der hundertfachen Dosis (0,025 mL/kg KGW) überlebt wurde (SIMMONS u.

TAMMEMAGI 1964; ALLISON et al. 1976).

Nach oraler Aufnahme ist das Schicksal der Toxine im Pansen von Interesse. Im gesunden Pansensaft wurde eine Inaktivierung von C. botulinum Toxin Typ C sowohl bei Rindern als auch bei Schafen nachgewiesen (ALLISON et al. 1976). Hierbei wurde einem Schaf und einem Rind aus einer Pansenfistel Panseninhalt entnommen. Die Tiere wurden mit Luzernehäckseln, bzw. Luzerneheu gefüttert. Die Pansensaft-proben wurden 16 bis 18 Stunden nach der Fütterung in isolierte Flaschen gefüllt. Nach der Filterung durch eine doppelte Schicht Mullbinde wurde der Pansensaft in ein Polypropylenröhrchen mit Gummistopfen gefüllt und mit CO2

begast. Eine Nadel im Gummistopfen leitete das entstehende Gas ab. Das Botulinumtoxin Typ C wurde in einem Verhältnis 1:50 (Vol./Vol.) dem Pansensaft zugesetzt. Die Toxizität der Lösung wurde im Mäuseversuch überprüft. In Abhängigkeit von der Dosis wurde das Toxin nach 30 Min. bis vier Stunden Inkubationsdauer vollständig inaktiviert. Hierfür waren augenscheinlich Pansenbakterien verantwortlich, welche die Botulinumtoxine abbauten; zellfreier Pansensaft zeigte keine inaktivierende Wirkung und Fraktionen, die neben Protozoen nur wenige Bakterien enthielten, hatten einen deutlich geringeren inaktivierenden Effekt. Diese Fraktionen wurden durch Zentrifugation mit 500 xg für 5 Min., bzw.

20000 xg für 10 Min. hergestellt (ALLISON et al. 1976). Die Pansenbakterien verfügen demnach über proteolytische Enzyme, da es sich beim BoNT um ein Protein handelt. Dieses Ergebnis stimmt mit der Erkenntnis überein, dass proteolytische Enzyme im Pansen nicht frei sondern zellassoziiert sind (BLACKBURN 1968). Während des Abbauprozesses wurde die Gasproduktion gesteigert. Bei einem erhöhten Angebot anderer Proteine vermuten ALLISON et al.

(1976) eine Verringerung des Toxinabbaus.

2.4.1.3 Clostridium botulinum im Verdauungstrakt

Angaben zur möglichen Vermehrung von C. botulinum (Typ B) und zur Toxinbildung im Magen-Darm-Trakt des Rindes sind widersprüchlich. Während Untersuchungen durch HAAGSMA und TER LAAK (1978b) keine Hinweise auf eine Vermehrung und Toxinbildung in vivo lieferten, schlossen NOTERMANS et al. (1978) diese Möglich- keit nicht aus: Bei Verfütterung kontaminierten Malzes (6x10⁵-10⁶ C. botulinum Typ B-Keime/g) an Rinder wurden Clostridiengehalte in Panseninhalt und Faeces von 10⁵-10⁷ Keime/g erreicht. Nach Absetzen der Malzfütterung ließen sich die

Clostridien noch mindestens zehn Tage im Panseninhalt und acht Wochen in den Faeces nachweisen.

Eine Beeinträchtigung der Protozoen kann ebenso eine Etablierung von Clostridien im Pansen ermöglichen. Bei einem Vergleich von faunierten und defaunierten Rindern stellte OZUTSUMI (2005) mittels PCR-Analyse fest, dass im defaunierten Pansen C. botulinum und verwandte Arten (36 %) dominierten, während im faunier- ten Pansen eher Bacteroides und Prevotella (34,4 %) anzutreffen waren.

2.4.1.4 Auswirkung von Clostridium botulinum auf die Pansenprotozoen

Im Zusammenhang mit der Erkrankung Botulismus wird der protozoären Fauna eine bedeutende Funktion zugesprochen (STÄNDER et al. 2009): einerseits regulieren sie indirekt und direkt die mikrobielle Flora, andererseits wird bei ihnen die Zielstruktur der BoNTs vermutet, die sogenannten SNARE-Proteine (soluble N-ethylmaleimide- sensitive-factor attachment receptor; STÄNDER et al. 2009). Diese Proteine befinden sich auf der Vesikeloberfläche und dem entsprechenden Ziel-Organell vieler Zellen (CHEN u. SCHELLER 2001). Die SNARE-Kombinationen sind sehr spezifisch. Eine besondere Bedeutung haben sie bei der Freisetzung von Neurotransmittern: sie sind nötig, damit die Vesikel mit der Membran verschmelzen und eine Pore bilden. Das Botulinumtoxin beispielsweise spaltet hydrolytisch das SNAP-25-Protein, welches in der präsynaptischen Membran liegt. Somit wird das erregende System durch die Verhinderung der Freisetzung der Transmitter blockiert (SCHIAVO et al. 1997).

STÄNDER (2009) wies deutliche Unterschiede in der mikrobiellen Flora und Fauna des Vormagens zwischen BoNT-positiven und BoNT-negativen Tieren nach (s.

Tab. 2.6). Ungeklärt ist geblieben, ob es sich dabei um Ursache, Folge oder Begleit- erscheinung handelt. Demnach könnte eine durch C. botulinum verursachte Ver- schiebung der Bakterienpopulation, sowie die Beeinflussung der protozoären Fauna zu Veränderungen der Pansenfermentation führen. Ein linearer Zusammen-hang zwischen Protozoen und dem Nachweis der BoNTs konnte allerdings nicht darge- stellt werden. Auch Auswirkungen auf die Fermentation konnten mit den durchge- führten Untersuchungen nicht festgestellt werden.

Tab. 2.6: Unterschiede der ruminalen Flora und Fauna im Pansensaft zwischen BoNT-positiven und BoNT-negativen Tieren (STÄNDER et al. 2009) Ruminale Flora und Fauna BoNT-positiv¹ BoNT-negativ¹

Dasytricha spp. 2,13 3,05

Epidinium spp. 4,25 2,49

Ophryoscolex spp. 1,00² 1,18

Dasytricha spp. 1,00² 3,03

Eubacteria 8,05 8,45

C. lituseburense-Gruppe 1,00 2,81

Lactobacillus/Enterococcus 7,34 6,30

Desulfobacterales 7,08 4,31

Gammaproteobacteria 6,81 5,52

1: Angabe der Protozoenkonzentrationen (Mittelwerte) in log10 Zellzahl/mL Pansensaft; Angabe der Bakterienkonzentrationen (Mittelwerte) in log10 Zellzahl/mL Pansensaft

2: nicht nachweisbar (entspricht: Bakterien < 10⁵/mL Pansensaft

2.4.2 Clostridium perfringens

Clostridium perfringens führt zu Enterotoxämien bei Schafen, Ziegen, Rindern, Schweinen, Pferden und anderen Haustieren (AL-KHATIB 1968). Zahlreiche Studien wiesen die Toxine dieses Bakteriums im Darm verschiedener Tierarten nach (MITSCHERLICH et al. 1953; SCHOFIELD 1955; BEER et al. 1968). In diesem Zusammenhang werden die Toxintypen A, B, C, D und E verdächtigt Erkrankungen auszulösen, die dann zu enormen wirtschaftlichen Schäden führen können. Fälle des Hemorrhagic bowel syndrome konnten im Iran auf C. perfringens zurückgeführt werden (TAJIK et al. 2010). Kleinere Mengen von C. perfringens kommen natürl- icherweise im Darmtrakt vor. Erst durch fehlerhafte Fütterung ändern sich die Bedingungen im Darm derart, dass eine Vermehrung mit krankmachenden Folgen für das Wirtstier möglich ist (BALDWIN 1959).

2.4.2.1 Clostridium perfringens im Pansen

BULLEN et al. (1953) bewiesen in einem Inokulationsversuch, dass C. perfringens Typ D zu 90 % im Pansensaft abgetötet wird. Dennoch erfolgte auch im Pansen ein Nachweis (VANCE 1967), wobei es sich hierbei nicht um erkrankte Tiere handelte und nicht ausgeschlossen werden konnte, dass es postmortal zu einem Reflux von Dünndarmingesta infolge einer Relaxation des Pylorussphincters kam (ROEDER et al. 1987). ALLISON et al. (1975) fanden im Panseninhalt adulter Schafe Gehalte unter 10² C. perfringens/g. Durch Getreidefütterung stiegen die Gehalte auf 10⁵ C. perfringens/g an. Welche Auswirkungen diese ‚Verbesserung’ der Lebensum- stände für C. perfringens auf die Pansenfermentation hatte, blieb aber unbeant- wortet.

Bei Kälbern kann eine Dysfunktion des Schlundrinnenreflexes zu größeren Mengen Milch im Pansen führen und somit den Nährboden für C. perfringens bilden. Dabei soll Typ A in der Ätiologie eine besondere Rolle spielen, da er bei 2-21 Tage alten Kälbern mit Pansen- und Labmagentympanie, Abomasitis und Ulzerationen im Lab- magen nachgewiesen wurde (ROEDER et al. 1987). Beim Übertritt des Erregers in den Labmagen könnte dieser dann das Krankheitsbild hervorrufen.

2.4.3 Escherichia coli

Escherichia coli ist ein gramnegatives, fakultativ anaerob wachsendes Stäbchen, welches üblicherweise im Verdauungstrakt von Säugetieren anzutreffen ist. Es gibt eine Vielzahl von Stämmen, die sowohl Bestandteil der Normalflora als auch wichtige Krankheitserreger sein können (ROLLE u. MAYR 2002).

2.4.3.1 Vorkommen von Escherichia coli im Verdauungstrakt

Auf Heubasis gefütterte Tiere zeigten im Verhältnis zur Gesamtpopulation insgesamt relativ wenig coliforme Bakterien im Pansen, wobei es sich hauptsächlich um E. coli handelte. Aerobacter aerogenes oder Aerobacter cloacae wurden seltener nachge- wiesen, obwohl diese im Wesentlichen auf Pflanzen vorkommen (MANN et al. 1954) und mit der Nahrung aufgenommen werden. E. coli kann regelmäßig aus dem Pansen isoliert werden, kommt dort aber nicht in großer Anzahl vor, weshalb es sich nicht um ein „echtes“ Pansenbakterium handelt (vergl. Kap. 2.3). MANN et al.

beschrieben 1954 ein Vorkommen von 10³-10⁶ lebenden E. coli/mL Pansensaft.

Diese Erkenntnis bestätigte sich für den Pansen von Kälbern (MACKAY u. OXFORD 1954). Die coliforme Population belief sich auf 10⁴-10⁶ Coliforme/g Panseninhalt.

GRAUKE et al. (2002) stellten fest, dass das Bakterium im distalen Darmtrakt beherbergt wird und nur geringe Zeit in Vormagen, Labmagen oder Duodenum persistiert. Hierbei wurde es durch getreidereiche Rationen begünstigt, dass ruminale By-Pass Kohlenhydrate im Dickdarm der Fermentation zur Verfügung standen (CALLAWAY et al. 2008). Rinder, die getreidereich gefüttert wurden, schieden deut- lich mehr E. coli aus als mit Grünfutter gefütterte Tiere. Zudem zeigte sich, dass die ausgeschiedenen E. coli säureresistenter waren (DIEZ-GONZALES et al. 1998).

Wurde die Ration von Getreide auf Heu umgestellt, sank die Zahl innerhalb von fünf Tagen um das 1000fache. Ein chemischer oder mechanischer Aufschluss des Getreides führte zu einem Anstieg der Menge ausgeschiedener E. coli (GILBERT et al. 2005). Besonders Gerstenfütterung erhöhte die Ausscheidung (DARGATZ et al.

1997; BUCHKO et al. 2000a).

Die natürliche Besiedlung des Pansens mit E. coli ist auch für den Menschen von Bedeutung, weil dieser ein Reservoir für menschliche Pathogene bilden kann. E. coli O157:H7 ist ein Pathogen, das im Pansen beherbergt wird und beim Menschen schwere hämmorrhagische Colitiden auslöst (GRAUKE et al. 2002). Rinder stellen hier die Hauptinfektionsquelle dar (GANSHEROFF u. O`BRIEN 2000). Bis zu 30 % aller Rinder sind symptomlose Träger von E.coli O157:H7 (STANFORD et al. 2005;

REINSTEIN et al. 2007; CALLAWAY et al. 2008). Auch hier korrelierte die Form der Fütterung mit dem Ausmaß der Ausscheidung über den Kot. DEPENBUSCH et al.

(2008) wiesen nach, dass Stiere, die nach Kornfütterung positiv auf E. coli O157:H7 getestet wurden 21 % mehr fäkale Stärke aufwiesen als negativ getestete Tiere.

Fasten förderte die Kolonisation von E. coli O157:H7, vermutlich da hier die Gehalte an flüchtigen Fettsäuren im Pansen absanken (CALLAWAY et al. 2003). HARMON et al. (1999) stellte hingegen fest, dass eine Hungerperiode zwar den Gehalt an flüchtigen Fettsäuren reduzierte, dies aber keinen Einfluss auf die Ausscheidung von E. coli O157:H7 hatte.

2.4.3.2 Limitierende Faktoren für das Wachstum von Escherichia coli im Pansen

Das Milieu im Pansen bietet E. coli in Bezug auf obligate Anaerobiose, pH-Wert, sowie Temperatur akzeptable Lebensbedingungen. Wie ruminale Bakterien stellen auch E. coli nur geringe Ansprüche an ihre Umgebung (BRYANT 1959). Dennoch gibt es Limitierungsfaktoren, wie

1. eine ungenügende Zahl aufgenommener E. coli, die sich gegen die originäre Flora durchsetzen muss

2. Unvermögen Nährstoffe aus dem Pansensaft oder dem Futter aufzunehmen 3. Inhibitoren wie antibiotisch wirksame Stoffe, Fermentationsprodukte oder

Kohlendioxid

4. Lysis durch Bakteriophagen

HOLLOWELL und WOLIN (1965) haben diese möglichen Limitierungsfaktoren experimentell überprüft. Ihnen erschien die Möglichkeit, dass E. coli unzureichend Nährstoffe für das Wachstum im Pansen aufnehmen kann am wahrscheinlichsten, da es weder Stärke noch Cellulose fermentiert und von anderen Organismen keine ausreichenden Mengen an freien Zuckern produziert werden. Andererseits ist es in der Lage Ammoniak zu nutzen. Experimentell wurde die These durch Zugabe von Lactose zur normalen Ration in einem in vitro-System getestet, konnte aber nicht bestätigt werden. Auch WALLACE et al. (1989) vermuteten einen Vorteil für Bakterien, die sich für gewöhnlich nicht im Pansen ansiedeln können, durch Zugabe von langsam metabolisierbaren Zuckern und Zuckerderivaten. Sie überprüften in vivo die Möglichkeit durch Zugabe von Sorbitol eine Ansiedlung von E. coli im Pansen von Schafen zu ermöglichen, da Sorbitol ein rasches kulturelles Wachstum im Medium mit Zusatz von 20 % Pansensaft bei pH 7,0 förderte (WALLACE et al. 1989).

Allerdings führte die E. coli-Inkubation bei Schafen mit Sorbitolzugabe in den Pansen nicht nur nicht zu Wachstum, sondern nicht einmal zu längerem Überleben der Bakterien (WALLACE et al. 1989).

Auch eine höhere Inokulation führte nicht zur Etablierung von E. coli (HOLLOWELL u. WOLIN 1965). Hier wurde der Grund ebenfalls in den flüchtigen Fettsäuren, die sich physiologischerweise im Pansen akkumulieren, vermutet. Es zeigte sich eine pH-Abhängigkeit der Wirkung: die hemmende Wirkung isolierter Fettsäuren auf

E. coli trat erst bei niedrigem pH-Wert auf (WOLIN 1969). Eine adäquate Hemmung erfolgte zwischen pH 6,0 und 6,5; ab pH 7 war kein Effekt mehr zu erkennen. Dies wird durch BERGEIM (1940) unterstützt, der feststellte, dass Essigsäure in einer Konzentration von 0,2 mol/L bei pH 6,5 kein Wachstum von E. coli hemmen konnte, wogegen bereits eine Konzentration von 0,05 mol/L bei pH 6,25 Wirkung zeigte.

Waren die Konzentrationen an flüchtigen Fettsäuren höher und der pH-Wert nie- driger, wirkten sie sogar toxisch auf die Bakterien. Auch andere Autoren sehen die Ursache der Hemmung des Bakterienwachstums durch kontinuierliche Nahrungs- zufuhr bei den flüchtigen Fettsäuren, die einen bakteriziden und bakteriostatischen Effekt haben (WINSLOW u. LOCKRIDGE 1906; LEVINE u. FELLERS 1940). Wie BERGEIM (1940) wiesen auch LEVINE und FELLERS (1940) im Besonderen auf den toxischen Effekt von Essigsäure hin. Dass dieser Effekt nicht ausschließlich auf die Hydrogenion-Aktivität zurückgeführt werden konnte, begründeten LEVINE und FELLERS (1940) damit, dass Essigsäure bei höherem pH-Wert (pH 4,5) bakterizider wirkte als Salzsäure bei niedrigerem pH (pH 4,0). Einige Autoren führten als Grund für die Toxizität das undissoziierte Molekül an (WINSLOW u. LOCKRIDGE 1906;

WOLF u. SHUNK 1921). In einer Studie zum Überleben von E. coli in Schweine- abfällen wurden mittels anaerober Bakterien flüchtige Fettsäuren produziert. Die Inhibition des Bakteriums wurde bei verschiedenen pH-Werten ausgetestet. Es stellte sich heraus, dass die hemmende Wirkung bei pH 4 größer war als bei pH ≥ 5 (HENRY et al. 1983).

Eine pH- und flüchtige-Fettsäurenabhängige Wirkung wurde auch auf Streptococcus bovis, einem originären Pansenbakterium, getestet. Es wurde wesentlich weniger beeinflusst. Zwar fiel die Anzahl der Kokken bei Senkung des pH-Werts ab, aber lediglich auf 70 % im Vergleich zum Versuchsaufbau mit Abwesenheit von flüchtigen Fettsäuren. Diverse andere ruminale Spezies verhielten sich vergleichbar (WALLACE et al. 1989, keine weiteren Angaben). Der Grund hierfür könnte darin liegen, dass E. coli über einen konstanten intracellulären pH-Wert verfügt, der sich nicht dem äußeren Milieu anpassen kann. Bei ungünstigen Bedingungen von pH- Wert und flüchtigen Fettsäuren kam es allerdings zu Energieauskopplung bei E. coli und Akkumulation von Anionen der flüchtigen Fettsäuren. Sc. bovis beispielsweise war weniger anfällig für Veränderungen des Milieus, da sich der intracelluläre pH- Wert den Bedingungen anpassen konnte (RASMUSSEN et al. 1993).

HOLLOWELL und WOLIN (1965) kamen zu dem Schluss, dass der Hauptgrund für mangelhaftes Wachstum ein Inhibitor im Pansensaft sein muss, da E. coli nach Inokulation mit zellfreiem Pansensaft keinerlei Wachstum zeigte. Diese Inhibitoren ließen sich partiell durch Autoklavieren hemmen.

Auch in anderen Studien war die Summe der flüchtigen Fettsäuren nicht korreliert mit der Ausscheidung von E. coli (GILBERT et al. 2005). Daher stehen eher gram- positive Bakterien des Pansens unter Verdacht niedermolekulare Peptide oder Kom- ponenten mit bakteriziden Eigenschaften zu produzieren (JACK et al. 1995;

KALMOKOFF u. TEATHER 1997). Verantwortlich für die reduzierte Zahl an ausge- schiedenen E. coli bei Heufütterung könnten allerdings auch im Grünfutter enthaltene Tannine und Phenole sein (CALLAWAY et al. 2008).

Aber nicht nur Überleben und Vermehren wurden unter physiologischen Umständen im Pansen gehemmt, sondern auch eine Plasmidübertragung zwischen verschie- denen E. coli-Stämmen (SMITH 1975), welche eine wichtige Strategie zur Steigerung

der Überlebensfähigkeit darstellt. Ohne Nahrungskarenz kam es auch bei größerer Anzahl an Empfängern und Donatoren zu keiner Übertragung, weder zwischen verschiedenen E. coli-Stämmen, noch zwischen E. coli und Salmonella-Spezies.

Während einer Hungerperiode zeigten GRAU und BROWNLIE (1968) hingegen eine Vermehrung von E. coli im Pansen auf das 2000fache. Eine anschließende Wieder- aufnahme der Fütterung ließ die Anzahl erneut ansteigen. Nach sieben Tagen war kein Nachweis im Pansensaft mehr möglich. In einer Studie mit adulten Schafen, welche direkt mit E. coli-Stämmen ruminal inokuliert wurden, konnte SMITH (1975) die Übertragung eines R-Faktors mit Antibiotikaresistenz zwischen E. coli-Stämmen sowie eine Vermehrung lediglich nach einer Hungerphase von mindestens 24 Stunden nachweisen. 1977 bewies SMITH diese Übertragung unter gleichen Bedingungen auch von E. coli auf Salmonella-Spezies. Nach weniger als 48 h Nahrungskarenz vermehrten sich sowohl E. coli als auch die Salmonellen, so dass eine ausreichend große Anzahl erreicht werden konnte, um einen Transfer des R-Faktors zu erreichen.

Generell ist die Ausscheidung mit dem Kot nach Inokulation von E. coli in den Pansen von Rindern bei Kälbern höher als bei ausgewachsenen Tieren (CRAY u.

MOON 1995), da letztere über ein voll ausgebildetes Vormagensystem verfügen, in dem durch entsprechende pH-Werte und Konzentrationen an flüchtigen Fettsäuren eine Vermehrung und somit eine längere Ausscheidung verhindert werden. Die Gesundheit wurde weder von erwachsenen Tieren noch von Kälbern durch die experimentelle orale Infektion mit E. coli beeinträchtigt (CRAY u. MOON 1995).

Aber auch Protozoen sorgen für eine Limitierung von E. coli im Pansen. Bereits innerhalb einer Stunde nach Ingestion von E. coli konnten WALLIS und COLEMAN (1967) kein lebensfähiges Bakterium mehr in den Protozoen in vitro nachweisen.

2.4.3.3 Überleben von Escherichia coli und anderen coliformen Keimen in Protozoen

Um Infektionen bei Wiederkäuern auslösen zu können, muss E. coli die Magenpassage überleben. Unter physiologischen Umständen wird die Anzahl von E. coli von den im Pansen habitierten Protozoen limitiert. BARKER et al. (1999) zeigten, dass ein Überleben und Vermehren von E. coli in Futtervakuolen von Acanthamoeba polyphaga, einem ubiquitär vorkommenden Einzeller, möglich ist. Der normale digestive Cyclus der meisten Amoeben dauert eine bis vier Stunden, bevor das verdaute Material ausgeschieden wird (KWAN 1973). SCHLIMME et al. (1997) zeigten, dass nach der Fütterung von Wasseramoeben über 90 % der ausge- schiedenen Partikel lebensfähige E. coli enthielt. Eine hohe Bakteriendichte und das Vorhandensein von vielen Vakuolen förderte das Überleben der E. coli. Ein Grund hierfür lag in der schnelleren Eliminierung der Vakuolen, wenn viele von ihnen vorhanden waren (NILSSON 1972). Bevor über die Lysosomen eine Verdauung der Bakterien vollzogen werden konnte, wurden diese bereits wieder ausgeschieden.

KING et al. beschrieb 1988 das Überleben von coliformen Keimen in Wasser- protozoen während der Chlorierung. Frei lebende Bakterein wurden während des Versuchs innerhalb einer Minute bei einem Chlorgehalt von ≥1 mg/L inaktiviert. Nach

der Aufnahme durch die Amoeben steigerte sich die Widerstandskraft auf das 30- bis 120-fache, auch nach Verdopplung der bakterizid wirkenden Dosis. Worauf die Überlebensfähigkeit der Bakterien basiert, ist hierbei unklar. Es kam allerdings zur Bakterienanreicherung in den Protozoen, entweder durch freigesetzte Nährstoffe in den Nahrungsvakuolen oder Vermehrung in den Protozoen (FIELDS et al. 1984;

KING u. SHOTTS 1988). Auch in Pansenprotozoen war ein Überleben von E. coli möglich. COLEMAN (1967) detektierte nach 30 Min. Inkubationszeit 12,3 % lebens- fähige E. coli. Die durchschnittliche Überlebenszeit dieses Bakteriums betrug fünf Minuten.

2.4.4 Salmonella spp.

Salmonellen gehören zur Familie der Enterobacteriaceae und sind gramnegative, fakultativ anaerobe Stäbchen. Sie kommen weltweit bei Menschen und Tieren sowie ubiquitär in der Umwelt vor. Infektionsquellen stellen Ausscheidungen von erkrankten oder infizierten Individuen, sowie verunreinigtes Oberflächenwasser dar.

2.4.4.1 Vorkommen von Salmonella spp. beim Wiederkäuer

McEVOY et al. 2003 zeigte zum Vorkommen von Salmonella spp. in Pansen und Faeces von Rindern in beiden Medien eine Prävalenz von 2 %. Hierbei kam Salmonella Dublin mit 72 % am häufigsten vor, gefolgt von Salmonella Typhimurium und Salmonella enterica in 14 % der Fälle, vorwiegend in den Monaten August bis September.

Andere Studien zeigten eine höhere Prävalenz der Salmonellen im Pansen (0,3 %) als in Faeces (0,08 %; GRAU u. BROWNLIE 1968; VAN DONKERSGOED et al.

1999). Eine höhere Prävalenz im Pansen von Schlachttieren ließ sich mit Nahrungs- karenz und Stress, die auf dem Transport zum Schlachthof auftraten, erklären (MATTILA et al. 1988). Salmonellen wurden durchgehend im Pansensaft von Tieren nachgewiesen bei denen ein pH-Wert > 7 vorlag. Hier war auch die Produktion der flüchtigen Fettsäuren herabgesetzt; gleiches beeinflusste auch im Mäusedarm (MEYNELL 1963) und in Hühnern (BARNES et al. 1979) das Überleben von Salmo- nellen. Ein weiterer Grund könnte aber auch der Mangel an Nährstoffen für die Sal- monellen nach einer Hungerphase sein. GRAU und BROWNLIE (1968) ver- öffentlichten hierzu eine Studie, in der die Prävalenz nach einer Steigerung der Hungerphase von 24 auf 72 Stunden von 4 auf 30 % anstieg.

2.4.4.2 Überleben von Salmonella spp. in den Protozoen

Es ist bekannt (WILLIAMS u. COLEMAN 1992; DEHORITY 2003), dass die protozoäre Fauna des Pansens Bakterien aufnimmt und diese dort auch eine gewisse Zeit verweilen können (vergl. Kap. 2.2.3 Bakterien als Nahrung der Protozoen). Man ging davon aus, dass Bakterien in den Vakuolen der Protozoen verdaut werden. Studien zu Salmonellen zeigten aber, dass diese generell in Proto-

zoen überleben (KING et al. 1988; GAZE et al. 2003) und sich vermehren können (TEZCAN-MERDOL et al. 2004); speziell auch in Pansenprotozoen (RASMUSSEN et al. 2005).

Der Grad der Aufnahme der Salmonellen durch Protozoen hängt vom Salmonellen- serovar ab. TEZCAN-MERDOL et al. beschrieben 2004 eine bevorzugte Aufnahme von Salmonella Dublin im Vergleich zu Salmonella Typhimurium durch alle Isolate von Acanthamoeba, einer im Wasser und Intestinum des Menschen habitierten Amöbe. In welche Vakuolen die Bakterien im Einzeller aufgenommen wurden, blieb allerdings ungeklärt. Es konnte lediglich festgestellt werden, dass die Vakuolen, in denen sich die Bakterien befanden und replizierten, membrangebunden waren. Bei einer verlängerten Inkubationsdauer von Protozoen und Bakterien veränderten die Wirtszellen ihre Form, enzystierten sich oder lysierten. GAZE et al. (2003) beobachteten in ihren Studien zu Interaktionen zwischen Salmonella Typhimurium und dem Einzeller Acanthamoeba polyphaga das Entstehen großer kontraktiler Vakuolen, deren Bakterienfüllung auf intrazelluläre Vermehrung der Salmonellen hinwies. Zwar kam es nur in 1:100-1000 Zellen zum Eintritt der Bakterien in die kontraktilen Vakuolen, diese zeigten jedoch eine stärkere Vermehrung innerhalb der Zelle im Vergleich zu den externen Salmonellen. Gemessen wurde das Wachstum mit Hilfe der GFP-Expression (green fluorescent protein) der markierten Salmonellen.

Es traten keine Bakterien frei im Cytoplasma auf und es lag auch keine Assoziierung zur Vakuolenmembran vor. GAZE et al. (2003) vermuteten, dass die Salmonellen durch eine Pore während des Flüssigkeitsausstoßes in die Einzeller gelangten, da bei der Möglichkeit eines aktiven Eintritts die Infektionsrate wesentlich höher liegen würde. Da es in diesen kontraktilen Vakuolen der Amöben keinen bekannten Mechanismus gibt Bakterien zu töten, gingen GAZE et al. (2003) davon aus, dass die Salmonellen, nachdem die Osmoregulation der Zelle gestört war und sie lysiert wurde oder ein natürlicher Tod von Acanthamoeba polyphaga auftrat, freigesetzt wurden. Sie könnten auch mit den kontraktilen Vakuolen während der Enzystierung ausgeschieden werden, da in Cysten keine funktionsfähigen kontraktilen Vakuolen vorhanden waren. Eventuell wurde auch die Osmoregulation durch die unnatürliche Füllung mit Bakterien beeinträchtigt, wodurch eine Passage in den Futtervakuolen überlebt wurde. Ein Wachstum in den Futtervakuolen konnte hingegen nicht beobachtet werden, wie es für Legionella pneumophila der Fall war, die den natürlichen digestiven Cyclus von Acanthamoeba polyphaga beeinflusste.

DELAFUENTE et al. (2010) beschrieb eine geringe Überlebensrate von Salmonella enterica nach Aufnahme durch das Pansenprotozoon Ent. caudatum (0,0017 %).

Im Pansen findet nicht nur ein Überleben und Vermehren von Salmonellen statt, sondern auch eine Plasmidübertragung. So wurde der Transfer von Resistenzgenen bereits 1975 und 1977 von SMITH beschrieben. Hierbei schienen die Protozoen des Pansens eine wesentliche Rolle zu spielen. McCUDDIN et al. (2006) beobachteten während ihrer Studien zum Gentransfer zwischen Klebsiellen und Salmonellen in den ruminalen Protozoen einen Austausch von Antibiotikaresistenz. Während Salmo- nellen bis zur Lyse der Protozoen überleben konnten und anschließend freigesetzt wurden, war den Klebsiellen ein längeres Überleben in den Vakuolen nicht möglich.

Wahrscheinlich wurde der Genaustausch zwischen diesem protozoenresistenten

Empfänger und dem protozoensensitiven Donor durch Stress durch die ruminalen Protozoen und einer enormen Füllung der Vakuolen mit Bakterien begünstigt.

Aber nicht nur ein Genaustausch soll in den Protozoen möglich sein, sondern auch eine Steigerung der Pathogenität und Invasivität (RASMUSSEN et al. 2005). Diese Studien zeigten, dass die Pathogenität bestimmter Salmonellenstämme nach ihrem Aufenthalt in den Futtervakuolen der Protozoen gesteigert war. Er vermutete, dass während dieses Aufenthalts Invasionsgene hyperaktiviert wurden. Nach der Lyse der Protozoen wurden dann die hyperinvasiven Salmonellen im Labmagen frei und konnten so den Dünndarm erreichen. Unterblieb ein Kontakt mit Protozoen, verlief das Krankheitsbild wesentlich milder (RASMUSSEN et al. 2005).

2.4.4.3 Limitierende Faktoren für Salmonella spp. im Pansen

GRAU und BROWNLIE fanden 1965 Salmonella spp. im Pansen von 45 % gesunden Rindern kurz nach der Schlachtung. 1967 stellten sie in einer weiteren Studie fest, dass das Schicksal von Salmonellen im Pansen von der Futteraufnahme vor und nach der Inokulation abhing. So wurden die Salmonellen in Rindern, die mit mindestens 6,8 kg Luzerneheu oder Gras durchgehend gefüttert wurden, schnell eliminiert und waren selbst im Kot nur gelegentlich nachweisbar. Als einen Grund hierfür benannten sie, wie LEVINE u. FELLERS (1940) und HOLLOWELL u. WOLIN (1965) auch schon für die Hemmung von E. coli im Pansen, den hohen Anteil an Fettsäuren und den niedrigen pH im Vormagen der Tiere und verwiesen auf andere Studien (BERGEIM et al. 1941; WOLIN 1969). Der bakterizide Effekt der flüchtigen Fettsäuren ist für eine Vielzahl von Bakterien bewiesen. HENTGES beobachtete 1967 eine Inhibition des Wachstums von Shigellen, wenn sie gemeinsam mit Klebsiellen angezüchtet wurden. FRETER beobachtete 1962 ähnliche Verhältnisse zwischen E. coli, Aerobacter, Proteus und Shigella. Er führte diesen Effekt auf den Wettbewerb um fermentierbare Kohlenhydrate zurück. HENTGES (1967) schloss das allerdings in seinen Versuchen aus, in dem er das Medium mit diesen anreicherte.

Als auslösende Faktoren identifizierte er Ameisen- und Essigsäure, die beide metabolische Produkte von Klebsiella sind. In einer weiteren Studie stellte HENTGES 1967 fest, dass der hemmende Effekt der Fettsäuren pH-abhängig war.

Säuerte man eine Lösung aus flüchtigen Fettsäuren künstlich mit HCl an, stieg die Toxizität für Shigella. Ab pH 6 war ein deutlicher antibakterizider Effekt zu beobachten. Nach 24 Stunden Inkubation kam es bei pH 6 zu einer Vervierfachung der Bakterienpopulation, bei pH 7 zu einem 9000-fachen Anstieg. Bei pH 5,5 halbierte sich die lebensfähige Shigella-Population. Derselbe Versuchsaufbau ohne Essig- und Ameisensäure zeigte lediglich bei pH 5,5 einen bakteriziden Effekt, der auf Hydrogenionen zurückgeführt wurde. Auch durch Studien von MEYNELL (1963) und BOHNHOFF et al. (1964) wird diese Theorie bestätigt. Sie fanden heraus, dass die Faeces von Mäusen das Salmonellenwachstum inhibierte. Aus diesem Material konnten auch flüchtige Fettsäuren isoliert werden, die in vitro die Salmonellen hemmten. Wurde hingegen die physiologische Bakterienflora durch Antibiotika abgetötet, sank der Gehalt an Fettsäuren, wogegen pH-Wert und Oxidations- Reduktionspotential anstiegen. Unter diesen Umständen war die Vermehrung von Salmonellen möglich. Nach vorheriger Streptomycinbehandlung kam es zu keiner