5 Diskussion
5.6 Auswirkungen von Grassilage- und Clostridienzulage auf die
5.6.2 Auswirkungen auf den Stickstoffstoffwechsel
Eine Auswirkung der Clostridienzulagen wurde in der Ammoniakkonzentration deutlich. Das Ersetzen des Heus in den Fermentern durch Grassilage K-01 bewirkte bei allen Clostridienzulagen im Versuchsverlauf einen Anstieg der Ammoniakkonzen-tration bis Tag 14. Anschließend erreichten die Werte wieder ihr Ausgangsniveau.
Wurde das Heu gegen die Grassilagen S-11 und S-05 ausgetauscht, bildeten sich bei Zulage von C. perfringens, 1 mL und C. botulinum, 1 mL zwei Plateaus; das erste höhere zwischen Tag 10 und 14, das zweite niedrigere zwischen Tag 15 und 18.
Ammoniak wird im Pansen unter anderem von Hyper Ammonia-producing Bacteria (HAB) produziert (RYCHLIK u. RUSSELL 2000). Im pyhsiologischen Pansenmilieu wird ihre Aktivität durch die Produktion hemmender Enzyme von proteolytischen Bakterien reguliert. Diese Proteolyten wurden durch die Verfütterung von Silagen mit erniedrigtem Reineiweißanteil beeinträchtigt (GRESNER 2011), wodurch die HAB einen Selektionsvorteil hatten und die Ammoniakkonzentration anstieg. Dieser Anstieg wurde im vorliegenden Versuch beobachtet (s. Abb 4.1 und 4.3). Des Weiteren stieg die Ammoniakkonzentration in den Versuchen durch die zusätzliche Clostridienzulage stärker an als bei alleiniger Zulage von Schadsilagen (+24,2 - +98,7 %). Ursächlich könnte der Einsatz von C. botulinum oder C. perfringens diesen Effekt hervorrufen, da sie mit den proteolytischen Bakterien um die Protein- bzw.
Aminosäurequelle konkurrieren (vergl. Abb. 5.1). Aber nicht nur eine Konkurrenz-situation ist denkbar, sondern auch eine direkte Hemmung anderer Pansenbakterien durch Bacteriocine, die von Clostridien gebildet werden. Handelte es sich bei den gehemmten Bakterien um proteolytische Bakterien, welche selbst hemmende Enzyme bilden, wäre auch in dieser Situation eine verstärkte Stoffwechselaktivität der HAB zu erklären. Eine Baceriocinbildung ist sowohl für C. botulinum (DINEEN et al. 2000) als auch für C. perfringens (MAHONY 1974; BRENNER et al. 1986;
SCHALCH et al. 1998) beschrieben. So hemmen Bacteriocine von C. perfringens einige Stämme von C. botulinum (BRENNER et al. 1986) und Bacteriocine von C. botulinum ebenfalls andere Stämme von C. botulinum (DINEEN et al. 2000).
Gegen welche weiteren Bakterien diese Bacteriocine wirken, geht aus der Literatur nicht hervor. Bacteriocine wirken allerdings typischerweise gegen artverwandte Bakterien (JACK et al. 1995). Fällt der clostridienbedingte Effekt weg, könnten sich die Proteolyten erholen und die Aktivität der HAB zurückdrängen, so dass die Ammoniakkonzentration wieder sinkt. Auch das wurde im Versuch beobachtet.
Vermutlich aber erst nach Absetzen der Schadgrassilagen kehrt die Bakterienpopulation zu Verhältnissen zurück, wie sie bereits in der Kontrollphase vorlagen; im Versuch sanken auch die Ammoniakkonzentrationen auf Werte der Kontrollphase.
Andererseits könnten C. perfringens und C. botulinum, die selbst proteolytisch aktiv sein können, an der Ammoniakproduktion beteiligt sein; der Ammoniakgehalt stieg bei Zulage von 1 mL Clostridien an und sank nach dem Absetzen der Clostridien wieder ab. Bis zum Absetzen der Silagezulage blieb die Ammoniakkonzentration bei den Schadsilagen aber erhöht, da diese per se wie von GRESNER (2011) beschrieben weiterhin die proteolytischen Bakterien unterdrückten.
Bereits nach Absetzen der Clostridien waren die originären Verhältnisse bei Einsatz der Kontrollsilage wieder hergestellt, da diese die Bakterienpopulation nicht in dem Maße wie die Schadsilagen beeinflusste. Ähnliches wurde bereits von GRESNER (2011) beim Vergleich der Ammoniakkonzentration bei Einsatz von Kontrollsilagen und Silagen mit vermindertem Reineiweißanteil festgestellt: hier erholte sich die Am-moniakkonzentration bei Einsatz der Kontrollsilage schneller als nach Einsatz der Schadsilagen.
Auch bei Zulage von C. botulinum, 2 mL bildeten sich zwei Plateaus. Hier war jedoch das erste (Tag 10 bis 14) deutlich niedriger als das zweite (Tag 15 bis 18).
Eine Erklärung hierfür stellt neben der Beeinträchtigung der Proteolyten eine zusätz-liche Hemmung der HAB durch die Zulage der doppelten Menge C. botulinum dar.
Hierdurch könnte der geringgradige Anstieg der Ammoniakproduktion bei dieser Zulage erklärt werden. Nach Absetzen der Clostridien erholten sich die HAB wieder und produzierten mehr Ammoniak; im Versuch kam es zu diesem Zeitpunkt zu einem stärkeren Anstieg der Ammoniakkonzentration (S-11: +27,3 %, S-05: +50,8 %, vergl.
Tab. 9.139). Erst nach Absetzen der Silage könnten sich auch die Proteolyten erholen und die Ammoniakgehalte sanken auf das Niveau der Kontrollphase (7 bis 9 mmol/L), wie es im Versuch beobachtet wurde (vergl. Abb. 5.2).
Konkurrierten die Clostridien hingegen durch ihre proteolytische Aktivität stärker mit den HAB um deren Energiequelle, wenn anstatt 1 mL C. botulinum 2 mL hinzu-gegeben wurden, könnte das ebenfalls den weniger starken Anstieg der Ammoniak-konzentration erklären. So bestände nach Absetzen der Clostridien möglicherweise keine Konkurrenz mehr für die HAB und die Ammoniakwerte stiegen wie beobachtet an.
Anders sahen die Auswirkungen bei Zulage von C. perfringens (2 mL) auf die Ammoniakkonzentration aus. An Tag 10 war ein Anstieg zu verzeichnen, bis Tag 19 verblieben die Konzentrationen auf einem Plateau. Der Anstieg der Ammoniak-konzentration nach Absetzen der Clostridien, der bei Zulage von C. botulinum, 2 mL beobachtet werden konnte, fehlte hier. Eine Erklärung hierfür könnte sein, dass die Beeinträchtigung der HAB durch C. perfringens größer ist als die durch C. botulinum Dadurch bleibt die Ammoniakkonzentration zwischen Tag 10 und 18 konstant- die HAB erleben nicht den starken Reboundeffekt wie bei Zulage von C. botulinum (vergl. Abb. 5.3). Geht man hingegen von der Theorie aus, dass die Veränderungen der Ammoniakkonzentration auf die proteolytische Aktivität der Clostridien zurückzu-führen war, gilt bei Zulage von 2 mL C. perfringens die Vermutung, dass hier eine größere Nahrungskonkurrenz für die HAB bestand. Diese erholten sich langsamer als nach Zulage von C. botulinum. Dennoch produzierte C. perfringens aber nicht so viel Ammoniak wie die HAB, daher stieg die Konzentration nicht an, sondern blieb konstant.
Bei einer verlängerten Clostridienzulage von neun Tagen stieg die Ammoniak-konzentration bei K-01 nicht an. S-11 verhielt sich bei 1 mL und bei 2 mL Clostridien-zulage identisch. Ab Tag 10 stieg die Konzentration erstmals stark an (S-11, 1 mL:
+54,3 %, S-05: +73,7 %). Ein weiterer kleinerer Anstieg erfolgte vier Tage später (S-11, 1 mL: +6,37 %, S-05: +4,06 %). Erst ab Tag 16 sank die Konzentration wieder ab. Eine Erklärung für den Anstieg der Bildung von Ammoniak könnte auch hier in einer Umstrukturierung der Bakterienpopulation liegen. Durch die Hemmung proteo-lytischer Bakterien werden weniger Enzyme produziert, welche die HAB hemmen. Da kontinuierlich weiter Clostridien zugeführt werden, sinkt die Ammoniakkonzentration erst gegen Ende der Clostrdienzulage ab. Zieht man die Eigenproduktion von Am-moniak durch die Clostridien als Erklärung heran, würde sich auch hiermit der An-stieg der Ammoniakkonzentration während der Clostridienzulage erklären lassen.
Nach Absetzen der Silage erreichten die Ammoniakkonzentrationen bei Gabe von S-05 und S-11 bei allen Clostridienzulagen wieder gemeinsam mit K-01 Ammoniak-gehalte der Kontrollphase.
Eine Kombination der Clostridien mit den Schadsilagen führte zu einer höheren Ammoniakkonzentration als die Kombination mit der Kontrollsilage (S-05 > S-11 >
K-01). Die mittleren prozentualen Veränderungen der Ammoniakkonzentration der Schadsilagen im Verhältnis zu K-01 bei allen Clostridienzulagen sind in Tab. 4.11 aufgeführt.
Abb. 5.1: Mögliche Gründe für die Beeinflussung der Ammoniakkonzentration in der Fermenterflüssigkeit durch Schadgrassilage- und Clostridienzulagen:
Herabgesetzte Aktivität, bzw. verringerte Ammoniakkonzentration in der Fermenterflüssigkeit
Stärker herabgesetze Aktivität, bzw. stärker verringerte Ammoniakkonzentration in der Fermenterflüssigkeit Gesteigerte Aktivität, bzw. höhere Ammoniakkonzentration in der Fermenterflüssigkeit
Stärker gesteigerte Aktivität, bzw. weiter erhöhte Ammoniakkonzentration in der Fermenterflüssigkeit Leicht herabgesetzte Aktivität, bzw. leicht verringerte Ammoniakkonzentration in der Fermenterflüssigkeit
= gleich bleibende Aktivität, bzw. gleich bleibende Ammoniakkonzentration in der Fermenterflüssigkeit S-11, C. perfringens S-11, C. botulinum S-05, C. perfringens S-05, C. botulinum Schadsilagenzulage-
mikrobiell nicht nutzbare N-Verbindungen
Proteolytische Bakterien
HAB NH3
Clostridienzulage (1 mL C. botulinum/ 1 mL
C. perfringens)
Proteolytische Bakterien
HAB
Absetzen der Clostridien
Proteolytische Bakterien
HAB
Absetzen der Schadsilage
Proteolytische Bakterien
HAB Proteolytische
Bakterien
HAB
Hemmende Enzyme Hemmende
Enzyme
Hemmende Enzyme
Hemmende Enzyme
Hemmende Enzyme
NH3
NH3 NH3
-10 30 70
%
- 81
-Abb. 5.2: Mögliche Gründe für die Beeinflussung der Ammoniakkonzentration in der Fermenterflüssigkeit durch Schadgrassilage- und Clostridienzulagen:
Herabgesetzte Aktivität, bzw. verringerte Ammoniakkonzentration in der Fermenterflüssigkeit
Stärker herabgesetze Aktivität, bzw. stärker verringerte Ammoniakkonzentration in der Fermenterflüssigkeit Gesteigerte Aktivität, bzw. höhere Ammoniakkonzentration in der Fermenterflüssigkeit
Stärker gesteigerte Aktivität, bzw. weiter erhöhte Ammoniakkonzentration in der Fermenterflüssigkeit Leicht herabgesetzte Aktivität, bzw. leicht verringerte Ammoniakkonzentration in der Fermenterflüssigkeit
= gleich bleibende Aktivität, bzw. gleich bleibende Ammoniakkonzentration in der Fermenterflüssigkeit S-11 S-05
Proteolytische Bakterien
HAB
Clostridienzulage (2 mL C. botulinum)
Proteolytische Bakterien
HAB
NH3 =
Absetzen der Clostridien
Proteolytische Bakterien
HAB
Absetzen der Schadsilage
Proteolytische Bakterien
HAB
NH3
Proteolytische Bakterien
HAB
NH3
Hemmende Enzyme
Hemmende Enzyme
Hemmende Enzyme
Hemmende Enzyme
Hemmende Enzyme
NH3
mikrobiell nicht nutzbare N-Verbindungen
-10 30 70
%
- 82
-Abb. 5.3: Mögliche Gründe für die Beeinflussung der Ammoniakkonzentration in der Fermenterflüssigkeit durch Schadgrassilage- und Clostridienzulagen:
Herabgesetzte Aktivität, bzw. verringerte Ammoniakkonzentration in der Fermenterflüssigkeit
Stärker herabgesetze Aktivität, bzw. stärker verringerte Ammoniakkonzentration in der Fermenterflüssigkeit Gesteigerte Aktivität, bzw. höhere Ammoniakkonzentration in der Fermenterflüssigkeit
Stärker gesteigerte Aktivität, bzw. weiter erhöhte Ammoniakkonzentration in der Fermenterflüssigkeit Leicht herabgesetzte Aktivität, bzw. leicht verringerte Ammoniakkonzentration in der Fermenterflüssigkeit
= gleich bleibende Aktivität, bzw. gleich bleibende Ammoniakkonzentration in der Fermenterflüssigkeit S-11 S-05
Proteolytische Bakterien
HAB
NH3
Clostridienzulage (2 mL C. perfringens)
Proteolytische Bakterien
HAB
Absetzen der Clostridien
Proteolytische Bakterien
HAB
NH3 =
Absetzen der Schadsilage
Proteolytische Bakterien
HAB
NH3
Proteolytische Bakterien
HAB
Hemmende Enzyme Hemmende
Enzyme
Hemmende Enzyme
Hemmende Enzyme Hemmende
Enzyme
NH3 = mikrobiell nicht nutzbare
N-Verbindungen
-10 30 70
%
- 83
-In der Literatur gibt es keinen Hinweis auf die Zugehörigkeit von C. botulinum und C. perfringens zur Gruppe der HAB, wie es für andere Clostridienstämme wie zum Beispiel Clostridium aminophilum (RYCHLIK u. RUSSELL 2000; ANDERSON et al.
2010) oder Clostridium sticklandii (RYCHLIK u. RUSSELL 2000; FLYTHE u. KAGAN 2010) beschrieben ist. Allerdings produzieren C. botulinum, Typ C und C. perfringens Typ B Ammoniak (WERNER 1972; WERNER et al. 1973; SEIFERT et al. 1981). Im Vergleich zur alleinigen Silagezulage war die Ammoniakkonzentration bei Kombination mit Clostridien deutlich erhöht. Bei der Grassilage K-01 betrug die Erhöhung während Tag 10 - 14 zwischen 70 % und 100 % während von Tag 15 bis 18 kein Unterschied bestand. Diese Erhöhung konnte demnach allein auf die Clostridienzulage zurückgeführt werden. Bei den beiden Schadsilagen war der Einfluss der Clostridien hingegen auch an Tag 15 bis 18 vorhanden. Diese Beobachtung stützt die Vermutung, dass die Bakterienpopulation durch die Kombination aus Schadsilage und Clostridien stärker gestört wurde und erst nach Absetzen der schadhaften Silage wieder zu ihren natürlichen Verhältnissen zurückkehren konnte. Es fiel auf, dass die Ammoniakkonzentration bei Zulage von 1 mL bei beiden Clostridienarten und allen Silagen um 20 % bis 30 % höher lag als bei Zulage von 2 mL (bei K-01 hauptsächlich zwischen Tag 10 und 14, bei den Schadsilagen auch zwischen Tag 15 und 18). Ein Grund hierfür könnte die oben bereits erwähnte Beeinträchtigung der HAB durch die erhöhte Anzahl Clostridien sein.
5.6.2.2 Fettsäuren des Stickstoffstoffwechsels
Ein Einfluss durch die Clostridienzulage konnte während des Versuchsverlaufs weder auf die Produktion der i-Butter- noch auf die der i-Valeriansäure beobachtet werden.
Im Vergleich der kombinierten Zulage von Silage und Clostridien mit der Silagezulage zeigten sich keine gravierenden Veränderungen durch die verschie-denen Clostridienzulagen.
Da die i-Säuren ebenso wie Ammoniak bei der Proteolyse anfallen, wäre hier neben der erhöhten Ammoniakkonzentration eine Steigerung der Produktion von i-Butter- und i-Valeriansäure zu erwarten gewesen (vergl. LUMPP 2011). Geht man davon aus, dass die Clostridien selbst die Erhöhung der Ammoniakkonzentration produzierten, erklärt das den fehlenden Anstieg der i-Säuren, denn C. botulinum Typ C und C. perfringens Typ B sind nicht an deren Produktion beteiligt. Aber auch eine Verdrängung anderer Bakterien könnte zu diesem Produktionsschema führen.
Clostridien könnten Bakterien hemmen, sei es durch Nahrungskonkrrenz oder direkte Hemmung durch Bacteriocine, die tendentiell eher die Aminosäuren abbauen, aus denen die i-Säuren nicht hergestellt werden. Diese werden nur aus den Aminosäuren Valin und Leucin gebildet (OTAGAKI et al. 1955; DEHORITY et al. 1958). Die übrigen Aminosäuren werden zu anderen Fettsäuren abgebaut (vergl. GRESNER 2011).
5.6.2.3 Bakterieller Proteingehalt
Ein Einfluss durch die Clostridien auf den Proteingehalt im Kompartiment 1 konnte im Versuchsverlauf nicht festgestellt werden. Im Gegenteil blieb der Wert, der im flüssigen RuSiTec-Inhalt gemessen wurde, während des gesamten Versuchs stabil.
Demnach kam es wahrscheinlich auch durch die Silagezulage nicht zu einer Zu- oder Abnahme der Bakterienzahl in der Fermenterflüssigkeit.
Beim Vergleich des Proteingehalts bei Einsatz einer Kombination aus Silage und Clostridien mit der reinen Silagegabe zeigte sich der Proteingehalt bei Kombinations-zulage prozentual höher (s. Tab. 4.6). Außerdem erhöhte die Verdopplung der Clostridienmenge den prozentualen Unterschied noch weiter. Ein möglicher Erklä-rungsansatz könnte eine Störung der Protozoen sein. Bei deren Zugrundegehen würde Protein frei, welches dann in der Proteinmessung erscheinen würde (s.
GRESNER 2011). Gründe für ein Absterben von Pansenprotozoen durch Clostridien sind in der Literatur nicht zu finden. Setzt man allerdings voraus, dass ein Überleben oder sogar eine Vermehrung von Clostridien in Protozoen möglich ist, könnten ihre Auswirkungen auf die Wirtszelle mit denen von Salmonella übereinstimmen. GAZE et al. (2003) beschrieb das Zugrundegehen von Acanthamoeba polyphaga durch Störung der Osmoregulation nach Besiedlung mit Salmonellen in kontraktilen Vakuolen oder Futtervakuolen (vergl. Kap. 2.4.4.2). Dieser Ablauf könnte auch auf Pansenprotozoen zutreffen, ist in der Literatur allerdings bisher nicht beschrieben worden. Eine zweite Möglichkeit zur Beeinträchtigung der Protozoen durch Clos-tridien besteht durch die Wirkung des gebildeten Toxins. STÄNDER (2007) disku-tierte die Möglichkeit, dass BoNT an SNARE-Proteinen von Protozoen (Tetrahymena pyriformis als Modellorganismus) wirken können und somit die Zelle beeinträchtigen.
Beweisen konnte STÄNDER (2007) diese Theorie durch seine Versuche allerdings nicht. Er vermutete, dass die eingesetzte Neurotoxinkonzentration zu niedrig war, um einen Einfluss auf Tetrahymena pyriformis auszuüben.
Durch den vorliegenden Versuch kann keine Aussage über ein mögliches protozoales Absterben getroffen werden. Die Clostridienzulage beeinträchtigte die Vitalität der Protozoen im RuSiTec nicht, aber eine Zählung wurde nicht vorgenommen, so dass es nicht möglich ist zu sagen, ob die Protozoen zur Erhöhung des Proteins führten.