Synthese, Charakterisierung und Anwendungen photospaltbarer Fluoreszenzfarbstoff-Dyaden mit intramolekularer Energieübertragung

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Synthese, Charakterisierung und Anwendungen photospaltbarer Fluoreszenzfarbsto-Dyaden mit

intramolekularer Energieübertragung

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften

(Dr.rer.nat.)

vorgelegt von

Maren Dill

an der Universität Konstanz

Mathematisch-Naturwissenschaftliche Sektion Fachbereich Chemie

Tag der mündlichen Prüfung: 01.08.2014 1. Referent: Jun. Prof. Dr. Dominik Wöll

2. Referentin: Prof. Dr. Karin Hauser

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Dank

Diese Arbeit entstand im Zeitraum von Februar 2010 bis Dezember 2013 am Fachbereich Chemie der Universität Konstanz in der Arbeitsgruppe von Herrn Dr. D. Wöll.

Mein besonderer Dank gilt Dominik Wöll, für das interessante und äuÿerst vielseitige Thema und seine ausgezeichnete Betreuung und Unterstützung während der gesamten Zeit.

Frau Prof. Dr. Karin Hauser danke ich sehr für die Übernahme des Zweitgutachtens.

Bei Dr. Malte Drescher bedanke ich mich sehr für die spontane Übernahme des Prü- fungsvorsitzes.

Prof. Dr. Andreas Zumbusch möchte ich für die lehrreichen Diskussionen innerhalb der Seminare danken, wie auch für die groÿzügige Bereitstellung sämtlicher Labore und Arbeitsgeräte.

Bei Bernhard Conrads bedanke ich mich für das Schreiben der Labview-Programme und PC-Hilfestellungen aller Art. Andrea Niederwieser danke ich für ihre geduldige Einfüh- rung in die HPLC und die stete Hilfe dabei. Moritz Baier danke ich für die Bereitstellung des TDI, ohne welches die Dyadensynthese viele Wochen länger gedauert hätte.

Bei Beate möchte ich mich für die Einführung in die Weitfeldmikroskopie und besonders für die gute Zusammenarbeit bedanken. Martin danke ich vor allem für wissenschaftliche Diskussionen, die kurz vor Deadlines stattfanden. Simon danke ich für die schöne Zeit in seinem Labor. Meinen liebsten Master- bzw. Bachelorstudenten Joni und Dave danke ich für die witzige Zeit während ihren Arbeiten und ihren Beiträgen zu dieser Arbeit. Meinen Bürokollegen danke ich ich für die angenehme Atmosphäre und deren Hilfsbereitschaft.

Allen ehemaligen und aktuellen Mitgliedern der Arbeitsgruppen Wöll und Zumbusch möchte ich für den guten Zusammenhalt und die stete Unterstützung danken.

Ein groÿer Dank gilt meinen Freunden, denjenigen, die seit unserer Jugend an meiner Seite sind und denjenigen, die mit mir in Konstanz durch das Studium gegangen sind oder erst später dazu kamen, dafür, dass die für einen entspannten Ausgleich gesorgt haben.

Meiner Familie danke ich, dass sie mir mein Studium ermöglicht und mich immer un- terstützt hat.

Neli danke ich dafür, dass er an mich geglaubt hat und immer für mich da war.

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Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung 1

2. Grundlagen 5

2.1. Photophysik eines Fluorophors . . . 5

2.1.1. Löschen der Fluoreszenz . . . 8

2.2. Förster-Resonanz-Energie-Transfer . . . 8

2.3. Verwendete Fluoreszenzfarbstoe . . . 12

2.3.1. Verwendete apolare Fluoreszenzfarbstoe . . . 12

2.3.2. Verwendete polare Farbstoe . . . 14

2.4. Photolabile Linker . . . 16

2.4.1. Mechanismen der Linkerspaltung . . . 17

2.5. Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie . . . 20

2.5.1. Aufbau eines Weitfelduoreszenzmikroskops . . . 21

2.5.2. Kombination aus Anregungswellenlängen und Emissionslter . . . 22

2.5.3. Räumliche Auösung . . . 23

2.5.4. Lokalisierung von Fluorophoren . . . 24

2.5.5. Hochaufgelöste Mikroskopie . . . 25

2.6. Diusion in Polymeren . . . 27

2.6.1. Viskosität . . . 28

2.6.2. Diusion . . . 29

2.6.3. Bestimmung von Diusionskoezienten mittels Schrittlängenana- lyse . . . 30

2.6.4. Beobachtung von Rotation . . . 31

2.6.5. Verwendete Polymersysteme . . . 32

3. FRET-Experimente an Systemen mit wohldeniertem Abstand 35 3.1. Wahl des Oligonukleotids und der Farbstoe . . . 36

3.2. FRET-Messungen an hybridisierten Oligonukleotiden . . . 38

3.3. FRET-Messungen am Oligonukleotideinzelstrang . . . 42

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Inhaltsverzeichnis

4. Synthesewege der untersuchten Dyaden 45

4.1. Synthese der Perylendiimidcarbonsäure (PDI-CO2H) . . . 45

4.2. Synthese der Pyrrolopyrrolcyanin-Cumarin-Perylendiimid-Dyade (SCP) . 47 4.3. Synthese der Perylendiimid-Methylphenacyl-Terrylendiimid-Dyade (PAT) 48 4.4. Synthese der Perylendiimid-Methylphenacyl-Pyrrolopyrrolcyanin-Dyade (PAS) . . . 52

5. Ergebnisse der Dyaden-Ensembleexperimente 53 5.1. Methodisches zum Bestrahlungsexperiment . . . 53

5.1.1. Aufbau . . . 53

5.1.2. Aktinometrie mit Azobenzol . . . 54

5.2. Ensembleexperimente der SCP-Dyade . . . 56

5.2.1. Photophysikalische Farbsto- und Dyadeneigenschaften . . . 56

5.2.2. Spaltungsexperimente . . . 64

5.3. Ensembleexperimente der PAS-Dyade . . . 66

5.4. Ensembleexperimente der PAT-Dyade . . . 69

6. Ergebnisse der Dyaden- Einzelmolekülexperimente 75 6.1. Messung von sehr kleinen Diusionskoezienten (PAT in PBMA) . . . . 76

6.1.1. Bestimmung der Diusionskoezienten über die FRET-Methode . 77 6.1.2. Bestimmung des Diusionskoezienten über Langzeit-Einzelmo- lekülverfolgung und Vergleich mit den FRET-Ergebnissen . . . 85

6.2. Ergebnisse der unabhängigen Einzelmolekülverfolgung (PAT in PEA) . . 92

6.3. Vorexperimente zum Einsatz der Dyaden in der hochaufgelösten Mikro- skopie . . . 94

6.3.1. Photophysik der Dyade in Polystyrol . . . 96

6.3.2. Eignung der Dyade zur hochauösenden Mikroskopie . . . 103

7. Zusammenfassung 107 8. Experimenteller Teil 111 8.1. Verwendete Apparaturen . . . 111

8.1.1. NMR-Spektrometer . . . 111

8.1.2. Massen-Spektrometer . . . 111

8.1.3. UV/Vis-Spektrometer . . . 111

IV

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Inhaltsverzeichnis

8.1.4. Fluoreszenzspektrometer . . . 111

8.1.5. Apparaturen zur UV-Bestrahlung . . . 112

8.1.6. HPLC . . . 112

8.1.7. AFM . . . 112

8.2. Präparation der Oligonukleotidproben . . . 113

8.2.1. Hybridisierung . . . 113

8.2.2. Cy3B-Markierung am C5'-Ende des Oligonukleotids . . . 114

8.3. Probenpräparation für Einzelmolekülmessungen . . . 114

8.4. Heiztisch für Polymerlme . . . 115

8.5. Synthesen . . . 115

8.5.1. Allgemein . . . 115

8.5.2. PDI-Synthese . . . 116

8.5.3. Synthese von TDI-CO2Et . . . 121

8.5.4. Synthese der SCP-Dyade . . . 122

8.5.5. Synthese der PAT-Dyade . . . 125

8.5.6. Synthese der PAS-Dyade . . . 132

A. Abkürzungen und physikalische Gröÿen 135

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1. Einleitung

Energieübertragungsprozesse spielen sowohl in der Natur als auch in der Forschung eine wichtige Rolle. Panzen nutzen Lichtsammelkomplexe zur Energieübertragung, wobei das Licht gesammelt und zu den Reaktionszentren der Photosynthese weitergeleitet wird.

An diesen Zentren erfolgt eine Ladungstrennung, die letztendlich zur Reduktion von Koh- lensto und der Entwicklung von Sauersto führt. In der Forschung werden Energieüber- tragungen zum einen zur Nachbildung dieses Prozesses (künstliche Photosynthese),^[18]

zum anderen aber auch zur Messung von Abständen im Nanometerbereich genutzt. Zur Untersuchung von Energieübertragungen dienen häug Fluoreszenzfarbsto-Dyaden als Modellsysteme. Sie sind von Interesse, da sie die kleinste Einheit von Lichtsammelkom- plexen darstellen. Es wurden bereits zahlreiche Dyaden synthetisiert und die Energie- übertragung zwischen den Farbstoen wurde untersucht. Dies geschah sowohl anhand von Ensemble-,^[9] als auch Einzelmolekülexperimenten.^[1014]

In dieser Arbeit wurden neue, photospaltbare Fluoreszenzfarbsto-Dyaden entwickelt.

Der Fokus liegt dabei in der Anwendung für materialwissenschaftliche Fragestellungen.

Bei den hier verwendeten Fluoreszenzfarbsto-Dyaden handelt es sich um ein System aus zwei Fluoreszenzfarbstoen, die über einen photolabilen Linker verbunden sind. Mittels einer durch UV-Licht induzierten Photoreaktion kann der Linker gespalten werden. Die Grundlagen von photolabilen Linkern sind in Kapitel 2.4 genauer erklärt. Die Farbstof- fe der Dyade sind so gewählt, dass zwischen ihnen Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) auftreten kann. Die Theorie des FRET wird in Kapitel 2.2 beschrieben. Durch Energieübertragung von FRET-Donor auf -Akzeptor wird bei Anregung des Donors eine Emission des Akzeptors beobachtet. Die Ezienz dieses Phänomens hängt stark vom Abstand der beiden Farbstomoleküle zueinander ab. In der Dyade liegen die beiden Farbstoe so nah beieinander, dass eine quantitative Energieübertragung stattndet.

Schematisch ist solch eine Dyade in Abbildung 1.1 dargestellt.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden zuerst mehrere Dyaden synthetisiert und auf ihre photophysikalischen Eigenschaften wie Energieübertragung von FRET-Donor auf -Akzeptor, der Försterradius und die Eektivität der Abspaltung untersucht (siehe Kapitel 5).

Durch die quantitative Energieübertragung bei intakten Dyaden emittiert ausschlieÿ- lich der Akzeptor. Dies wurde in Fluoreszenzensembleexperimenten zur Untersuchung der Eektivität der Abspaltung genutzt. Anschlieÿend wurden die Dyaden in unter-

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1. Einleitung

Abbildung 1.1: Schema der photospaltbaren Fluoreszenzfarbsto-Dyaden mit intramolekularer Energieübertragung. Eine Dyade besteht aus einem FRET-Donor und einem FRET-Akzeptor, wobei diese Einheiten über einen photolabilen Linker verknüpft werden. Nach Anregung des Do- nors emittiert in Folge des FRET der Akzeptor.

schiedliche Polymerlme eingebettet und darin als Sonden verwendet.

Entscheidend für die Untersuchungen in Polymerlmen ist die Verwendung der Einzel- moleküluoreszenz-Mikroskopie. Dies ist eine Fluoreszenzmikroskopietechnik, mit der es möglich ist, einzelne Farbstomoleküle zu untersuchen. Dabei können mehrere einzelne Moleküle parallel erfasst werden. Die Funktionsweise und der Aufbau eines entsprechenden Mikroskops sind in Kapitel 2.5 dargestellt. Generell stellt die Einzelmoleküluo- reszenz-Mikroskopie ein wichtiges Instrument dar, um Strukturen und Dynamiken in biologischen und materialwissenschaftlichen Systemen zu untersuchen.^[1517] Zur Beob- achtung von Diusion werden die Positionen von isolierten, uoreszierenden Molekülen bestimmt. Anschlieÿend können die Positionen eines Moleküls in Bilderserien einander zugeordnet werden.^[18] Dieses Verfahren liefert Diusionskoezienten und zusätzlich eine Einsicht in die Art der Bewegung. Auÿerdem kann durch die Analyse der Verteilung von Diusionskoezienten räumliche und dynamische Heterogenität visualisiert werden.

In der Regel sind Heterogenitäten in Ensemblemessungen nicht nachzuweisen.

Im Rahmen dieser Arbeit konnte eine Methode zur Bestimmung von Diusionskoezi- enten entwickelte werden, die auf dem Energietransfer zwischen den beiden Farbstoen einer Dyade beruht. Die Ergebnisse hierzu sind in Kapitel 6.1 aufgeführt. Eingebettet in einen hochviskosen Polymerlm diundieren die Farbstoe zunächst in Form der Dyade gemeinsam. Durch die Spaltung des Linkers mit UV-Licht trennen sich die Farbstoe und diundieren getrennt voneinander weiter. Durch diese diusionsbedingte Abstands-

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vergröÿerung nimmt der Energietransfer ab. Dies kann anhand der Donor- und Ak- zeptoruoreszenz verfolgt werden, sodass sich daraus die Geschwindigkeit der Moleküle bestimmen lässt. Diese Art der Diusionskoezienten-Bestimmung ermöglicht es, Werte zu ermitteln, die im Vergleich zu bisherigen Verfahren um drei Gröÿenordnungen kleiner sind. Damit wird die Beobachtung von Diusion in hochviskosen Polymeren mittels Fluoreszenzmikroskopie zugänglich.

Neben der Diusionskoezienten-Bestimmung konnte der zunächst quantitative FRET der Dyaden auch in der hochaufgelösten Mikroskopie genutzt werden. Mit Hilfe von hoch- aufgelöster Mikroskopie können Strukturen unterhalb des Beugungslimits ( 300 nm) dargestellt werden. In Kapitel 2.5.3 wird zunächst genauer auf die Auösung eines Fluo- reszenzmikroskops eingegangen und dann in Kapitel 2.5.5 auf die Funktionsweise von Me- thoden der hochaufgelösten Mikroskopie. Die hochaufgelöste Mikroskopie liefert bei jet- zigem Forschungsstand hauptsächlich detaillierte Einblicke in biologische Systeme.^[19,20]

Die dafür entwickelten Farbstosysteme sind in polarer Umgebung löslich. Für materialwissenschaftliche Fragestellungen, besonders für apolare Systeme, sind kaum uoreszenzmikroskopische Methoden zur Darstellung hochaufgelöster Strukturen verfügbar.

Basierend auf der hier entwickelten Methode könnte dies realisiert werden. Ihr liegt die Beobachtung des Ein- und Ausschaltens des FRET-Donors zu Grunde. Das Einschalten wird durch Bleichen des Akzeptors hervorgerufen und das Ausschalten durch anschlie- ÿendes Bleichen des Donors. Dadurch besteht die Möglichkeit, einzelne Farbstomoleküle einer dicht markierten Struktur zeitlich getrennt voneinander zu positionieren. Wenn die einzelnen Positionen anschlieÿend zusammengesetzt werden, entsteht ein hochaufgelös- tes Bild. Die Dyaden wurden hierfür in starre Polymerlme eingebettet und darin als Sonden für Vorversuche von hochaufgelösten Strukturen verwendet. Die Ergebnisse dazu werden in Kapitel 6.3 beschrieben.

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2. Grundlagen

2.1. Photophysik eines Fluorophors

Bei Fluorophoren handelt es sich um Fluoreszenzfarbstomoleküle. Sie haben die Fähig- keit, nach ihrer Anregung Licht zu emittieren. Dies wird als Fluoreszenz bezeichnet und entsteht durch die Relaxation eines Fluorophors aus einem angeregten Zustand unter Emission von Photonen.

Elektronische Übergänge in höhere Zustände innerhalb eines Fluorophors entstehen durch die Wechselwirkung zwischen elektromagnetischer Strahlung (Licht) und Mate- rie. Übergangswahrscheinlichkeiten in angeregte Zustände hängen von der Gröÿe und Richtung des Übergangsdipolmoments (ÜDM) des Fluorophors ab. Das anregende Licht wird optimal absorbiert, wenn das ÜDM parallel zur elektrischen Feldrichtung des an- regenden Lichtes liegt. Das ÜDM ist ein Maÿ für die Stärke eines Übergangs. Es ist eine Gröÿe, die nur vom jeweiligen Molekül und dem konkret betrachteten Übergang abhängig ist. Die energetische Beschreibung der Fluoreszenz sowie weiterer Prozesse, die in einem Fluorophor ablaufen, können durch ein Jablonski-Diagramm erfolgen (siehe Abbildung 2.1). Das hier abgebildete Jablonski-Diagramm besteht aus den Singulettzu- ständen S0, S1 und SN und den Triplettzuständen T1 und TN. Auÿerdem sind die an die elektronischen Zustände koppelnden Schwingungszustände v dargestellt.

Bei Raumtemperatur ist bei einem Molekül nach Boltzmann der elektronische und vi- bronische Grundzustand S0,0 nahezu komplett besetzt. Durch Absorption eines Photons geeigneter Wellenlänge mit der entsprechenden Energie E = hν (h ist das Plancksche Wirkungsquantum, ν die Frequenz) gelangt das Molekül hauptsächlich in die höheren Schwingungszustände (v 6= 0) der angeregten elektronischen Zuständen S1 oder SN. Elektronische Übergänge sind aufgrund der unterschiedlichen Masse von Elektronen und Atomkernen um etwa zwei bis drei Gröÿenordnungen schneller als Kernschwingungen.

Gemäÿ der Born-Oppenheimer-Näherung kann damit der Kernabstand während eines elektronisches Übergangs als konstant betrachtet werden. Der Übergang von S0 in einen höheren Singulettzustand ndet daher in denjenigen Schwingungszustand statt, dessen Wellenfunktion am besten mit der des S0,0 überlappt (Frank-Condon-Prinzip).

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2. Grundlagen

Abbildung 2.1: Jablonski-Energiediagramm eines Chromophors. Dargestellt sind die elektronischen Singulettzustände S0, S1 und SN und die Triplettzustän- de T1 und TN, sowie die vibronischen Zustände v. Die elektronischen und vibronischen Übergänge wie Absorption (mit der Absorptionsrate k_Abs), Vibrationsrelaxation (mit der Rate k_{V R}), interne Umwandlung (mit der Ratek_IC), Fluoreszenz (mit der Ratek_{F l}), Inter System Cros- sing (mit der Rate kISC) und die Phosphoreszenz (mit der Rate kP h) sind erkennbar.

Die Anregungswahrscheinlichkeitp_exeines Chromophors ist proportional zur Anregungs- intensität I (für Intensitäten kleiner der Sättigungsintensität) und zum molekularen Absorptionsquerschnitt σ:

p_ex =σ I

hν (2.1)

Nach Anregung eines Moleküls kann es über verschiedene Zerfallskanäle wieder in den Grundzustand zurückkehren:

Durch Schwingungsrelaxation (vibrational relaxation, VR;k_{V R}=10¹⁴ - 10¹² s⁻¹) gelangt das Molekül in den entsprechenden schwingungsfreien elektronischen Zustand (SN,ν=0).

Bendet es sich da-raufhin im elektronischen Zustand SN >1, geht es strahlungslos durch interne Umwandlung (internal conversion, IC) in den S1 über (k_IC = 10¹⁴ - 10¹² s⁻¹).

Mögliche Zerfallswege aus dem S1 sind strahlungslos über IC in den S0 (k_IC = 10¹¹ - 10⁶ s⁻¹), strahlungslos in den T1 über Inter System Crossing (k_ISC = 10⁹ - 10⁶ s⁻¹) oder, unter Aussendung von Photonen, durch Fluoreszenz in den S0 (k_{F l} = 10⁹ - 10⁸ s⁻¹). ISC ist ein spinverbotener Übergang (aufgrund der Spin-Auswahlregel ∆S = 0), der durch

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2.1. Photophysik eines Fluorophors

Spin-Bahn-Kopplung allerdings mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit möglich wird. Die zwei möglichen Relaxationsprozesse aus dem Triplettzustand T1 sind Phosphoreszenz (k_{P h} = 10³ - 10⁻² s⁻¹) und strahlungslose Relaxation (k_ISC = 10³ - 10⁻² s⁻¹) in den S0. Aus dem S1 und dem T1 sind auÿerdem Photoreaktionen zu Produktmolekülen und Löschprozesse möglich. Bei Löschprozessen kann die Energie auf ein weiteres Molekül, den Quencher, übertragen werden.

Gemäÿ der Kasha-Regel sind Emissionsspektren weitgehend unabhängig von der Anre- gungswellenlänge. Dem Übergang in einen höher angeregten Zustand durch Einstrahlung von Photonen, folgt normalerweise eine strahlungslose Desaktivierung in den S1,0. Nach dem Energielückengesetz ist die Rate des Übergangs von S2 nach S1 gröÿer (k_IC = 10¹⁴ - 10¹² s⁻¹) als die von S1 nach S0 (k_{F l} = 10⁹ - 10⁸ s⁻¹), somit läuft die strahlungslose Desaktivierung in den S1 schneller ab. Ein Fluoreszenzspektrum ist auÿerdem oft spie- gelsymmetrisch zum Absorptionsspektrum, da die Schwingungsenergien im angeregten Zustand und Grundzustand oft gleich sind. Das Fluoreszenzspektrum ist allerdings im Vergleich zum Absorptionsspektrum stets zu gröÿeren Wellenlängen verschoben. Die- se Verschiebung hat ihre Ursache in der Dierenz der S0,0 → S1,x - und S1,0 → S0,x - Übergänge und wird Stokes-Shift genannt. Beim optischen Übergang der Fluoreszenz wird weniger Energie frei, als bei der Absorption aufgenommen wird. Der Energiever- lust entsteht zum einen durch der Absorption folgenden Schwingungsrelaxation in den Schwingungsgrundzustand. Weitere Energieverluste entstehen durch die Besetzung hö- her angeregter Schwingungszustände durch die Emission. Der Stokes-Shift ist wichtig für die Fluoreszenzmikroskopie, da dadurch das Emissionslicht vom Anregungslicht durch Filter getrennt werden kann.

Die Fluoreszenzquantenausbeute φF l ist ein Maÿ dafür, wie ezient ein Molekül seine Anregungsenergie durch Fluoreszenz verliert. Sie gibt das Verhältnis der in Form von Fluoreszenz emittierten Photonen zu den absorbierten Photonen an:

φ_{F l}= Anzahl emittierter Photonen

Anzahl absorbierter Photonen = k_{F l}

k_{F l}+k_nr (2.2) In k_nr sind alle strahlungslosen Relaxationsprozesse des S1 zusammengefasst:

k_nr =k_IC +k_ISC+k_q (2.3)

kq entspricht der Fluoreszenzlöschung durch Wechselwirkung mit anderen Molekülen.

Um Quantenausbeuten nahe eins zu erhalten, muss die Ezienz der strahlungslosen Relaxationsprozesse nahe null sein.

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2. Grundlagen

2.1.1. Löschen der Fluoreszenz

Wird die Fluoreszenzintensität einer Probe durch Wechselwirkung mit benachbarten Molekülen reduziert, spricht man von Fluoreszenzquenchen oder Fluoreszenzlöschung. Es existiert eine groÿe Bandbreite von Mechanismen, durch welche die Fluoreszenz gelöscht wird. Dabei kann es sich z.B. um molekulare Umlagerung, Elektronentransfer, Spin- Bahn-Kopplungen, ISC oder Energietransfer (siehe Abschnitt 2.2, als besonderen Fall) handeln.

Die Löschmechanismen lassen sich in dynamisches und statisches Quenchen einteilen.

Die dynamische Fluoreszenzlöschung entsteht, wenn ein Fluorophor mit einem anderen Molekül, dem Quencher, in Lösung zusammenstöÿt. Durch den Kontakt wird der angeregte Fluorophor in den Grundzustand überführt, ohne zuvor ein Photon ausgesandt zu haben. Die Abnahme der Fluoreszenzintensität mit der Quencherkonzentration ist über die Stern-Volmer-Gleichung beschrieben:

I₀

I = 1 +K_D[Q] = 1 +k_qτ_{F l}[Q] (2.4) Es stellt dabei I0 die Fluoreszenzintensität in Abwesenheit des Quenchers, I die Fluo- reszenzintensität in Anwesenheit des Quenchers,K_D die Stern-Volmer-Quenchkonstante, [Q]die Konzentration des Quenchers, k_q die bimolekulare Quenchkonstante undτ_{F l} die Lebenszeit des Fluorophors in Abwesenheit des Quenchers dar.

Fluorophore können auÿerdem nichtuoreszierende Komplexe mit Quenchern ausbilden.

Dieser Prozess wird als statisches Fluoreszenzlöschen bezeichnet. Der Vorgang ndet bereits im Grundzustand statt und hängt nicht von der Diusion und damit von molekularen Zusammenstöÿen ab. Als Quencher fungieren zum Beispiel Sauersto und Amine.

2.2. Förster-Resonanz-Energie-Transfer

Als Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) bezeichnet man einen strahlungslosen Energietransfer zwischen zwei Chromophoren, der bei Abständen zwischen 1 und 10 nm auftritt. Hierbei gibt ein sich im angeregten Zustand bendender Donor (D)-Farbsto seine Energie an einen sich im Grundzustand bendenden Akzeptor (A) ab. Bei dem Akzeptor kann es sich um einen Fluorophor handeln oder auch um einen sogenann- ten Dunkelquencher, der strahlungslos desaktiviert wird. In der Abbildung 2.2 ist der Energietransfer mit seinen einzelnen Teilschritten schematisch dargestellt.

Nach Anregung des Donors folgt der Energietransfer (mit der Ratek_ET) und somit der strahlungslose Übergang des Donors aus dem S1 in den S0 und des Akzeptors aus dem S0

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2.2. Förster-Resonanz-Energie-Transfer

Abbildung 2.2: Darstellung der optischen Übergänge des FRET-Prozesses in einem modizierten Jablonski-Diagramm. Vereinfacht ist hier nur einer der möglichen Energietransferprozesse gezeigt.

in den S1. Nach dem Energietransfer folgt die Akzeptoremission oder der strahlungslose Übergang des Akzeptors in den Grundzustand. Beim Energietransfer gilt die Energieer- haltung. Die beteiligten Donor- und Akzeptorzustände müssen dieselbe Energiedierenz besitzen, damit die Übertragung stattndet.

Die Energieübertragung ndet durch Wechselwirkung der Übergangsdipolmomente von Donor und Akzeptor statt. Der oszillierende Übergangsdipol des Donors induziert eine Oszillation des Übergangsdipols des Akzeptors. Wenn beide dieselbe Resonanzfrequenz besitzen, kann Energie ausgetauscht werden. Die Energietransferrate kET ist daher proportional zum Übergangsdipolmoment. Durch quantenmechanische Betrachtung ergibt sich:^[21]

k_ET = 9(ln10)κ²φD

128π⁵n⁴r⁶N_Aτ_D · Z ∞

0

I_D(λ)_A(λ)(λ)⁴d(λ) (2.5) Hierbei ist κ der Orientierungsfaktor. Er spiegelt die relative Orientierung der Über- gangsdipolmomente zueinander wider. Unter Annahme der freien Rotation wird κ²=2/3 verwendet. φD ist die Donoruoreszenzquantenausbeute, n der Brechungsindex, r der Abstand der Dipole, τ_D die Fluoreszenzlebenszeit des Donors und N_A die Avogadro- Konstante. Das Integral wird als Überlappungsintegral bezeichnet, es beinhaltet das ächennormierte Donoremissionsspektrum I_D(λ)und den molaren dekadischen Absorp- tionskoezienten des Akzeptors _A(λ). Für einen ezienten Energietransfer sollte das Überlappungsintegral und damit die Überlappung des Fluoreszenz- und Absorptionss-

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2. Grundlagen

pektrums möglichst groÿ sein. Die Abhängigkeit von der spektralen Überlappung ist jedoch viel geringer, als die Abhängigkeit vom Abstand zwischen Donor und Akzeptor.

Eine entscheidende Gröÿe bei Abstandsmessungen ist der Försterradius R₀, der von den Absorptions- bzw. Emissionseigenschaften des beteiligten Donors und Akzeptors und dem Brechungsindex des Mediums abhängt. Er gibt an, bei welchem Abstand von Donor und Akzeptor genau die Hälfte der angeregten Donormoleküle ihre Energie auf die Akzeptormoleküle übertragen. R₀ wird bestimmt über:^[21]

R⁶₀ = 9(ln10)κ²φ_D 128π⁵n⁴N_A ·

Z ∞

0

I_D(λ)_A(λ)(λ)⁴d(λ) (2.6) Mit ihm kann auch die Energietransferrate ausgedrückt werden:^[21]

k_ET(r) = 1 τ_D

R₀ r

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(2.7) Typische Försterradien liegen im Bereich von 2 - 10 nm. Bei Abständen um R₀ führen Abstandsmessungen zu sehr starken Ezienzänderungen. Die Abhängigkeit der FRET- Ezienz vonR₀ ist in der Abbildung 2.3 dargestellt

Abbildung 2.3: Abhängigkeit der FRET-Ezienz von R₀.

Bei einem Abstand unterhalb vonR0/2 und oberhalb von 2R0 ist praktisch keine Ände- rung der Ezienz zu erkennen, während umR₀ die gröÿte Ezienzänderung zu messen ist. Die Förster-Paare werden bezüglich ihres Überlappungsintegrals so ausgesucht, dass sie empndlich auf die zu messenden Entfernungsvariationen reagieren. Die FRET-Ef- zienz hängt von der Energietransferrate und der Fluoreszenzlebensdauer des Donors ab:

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2.2. Förster-Resonanz-Energie-Transfer

E = k_ET τ_D⁻¹+kET

(2.8) Durch Kombination von 2.7 und 2.8 wird eine direkte Beziehung zwischen der FRET- Ezienz und dem Abstand r zwischen Donor und Akzeptor erhalten:

E = R⁶₀

r⁶+R⁶₀ (2.9)

Die FRET-Ezienz wird in der vorliegenden Arbeit aus der Fluoreszenzintensität des Donors in Ab- (I_D) und Anwesenheit (I_DA) des Akzeptors bestimmt.

E = 1− I_DA

I_D (2.10)

Die Anwendungen von FRET in chemischen und biologischen Systemen nden sich oft in der Untersuchung von Abständen.^[22,23] In den letzten 15 Jahren wurde FRET auch auf Einzelmolekülniveau beobachtet. Mit Einzelmolekül-FRET (single-molecule oder sm- FRET) kann man Einblicke in die Heterogenität des zu untersuchenden Systems erhalten.^[8]

Einzelmolekül-FRET-Experimente werden an Mikroskopen durchgeführt. Die Fluores- zenz des Donors und die des Akzeptors kann durch den Einsatz verschiedener Emissi- onslter separiert detektiert werden. Es stehen somit ein Donor- und ein Akzeptorde- tektionskanal zur Verfügung. In sm-FRET Experimenten wird E durch das Verhältnis der Donor- und Akzeptorintensität ermittelt:^[24]

E = I_A

γI_D +I_A (2.11)

IA und ID sind die Fluoreszenzintensitäten des Akzeptor- und Donorkanals. Durch den Korrekturfaktor γ = φ_Aη_A/φ_Dη_D wird der Unterschied in der Sensitivität des Systems gegenüber der D- und A-Fluoreszenz berücksichtigt. φ ist die Fluoreszenzquantenaus- beute der Fluorophore und η die Detektionsezienz des Systems für die Fluoreszenz von Donor und Akzeptor. Gleichung 2.11 ist allerdings nur gültig, wenn im Akzeptor- kanal keine Donoruoreszenz beobachtet werden kann und keine direkte Anregung des Akzeptors stattndet. Um diese Kreuzsignale zu berücksichtigen, kann die erweiterte Gleichung

E = I_{F RET}

γID+IF RET (2.12)

angewandt werden, mit I_{F RET} = I_A−βI_D −αI_A^Dir.^[24] Der Korrekturfaktor β berück- sichtigt die Donoruoreszenz im Akzeptorkanal. Der Korrekturfaktor α berücksichtigt

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2. Grundlagen

die direkte Anregung des Akzeptors und spiegelt das Verhältnis zwischen I_A, die über Donoranregung (in Abwesenheit des Donors) erhalten wird undI_A^Dir, die über direkte A- Anregung erhalten wird, wider. Der Korrekturfaktor γ variiert von Molekül zu Molekül und sollte für jedes Molekül ermittelt werden. Möglich ist die Bestimmung von γ von einzelnen FRET-Paaren, wenn der Akzeptor vor dem Donor bleicht.

2.3. Verwendete Fluoreszenzfarbstoe

Fluoreszenzexperimente im Ensemble erfordern keine spezischen Anforderungen an die verwendeten Farbstoe. Sie müssen lediglich im vorgesehenen Lösungsmittel löslich sein und im gewünschten Wellenlängenbereich absorbieren und uoreszieren. Wenn die Fluo- rophore direkt an die zu untersuchende Probe gekoppelt werden sollen, ist es von Vorteil, wenn kommerziell erhältliche Farbstoe auch als reaktive Derivate erhältlich sind.

Fluorophore für die Einzelmolekülmikroskopie und -spektroskopie müssen jedoch höhe- ren Ansprüchen Genüge leisten. So sind hohe Absorptionsquerschnitte, hohe Photostabi- litäten und hohe Quantenausbeuten unabdingbar. Nur mit diesen Eigenschaften können die Farbstoe über einen längeren Zeitraum eine hohe Anzahl an Photonen emittieren.

Dies ist nötig, um möglichst viele Informationen über die Farbstoe und deren Umge- bung gewinnen zu können.

Es wurden in dieser Arbeit apolare und polare Farbstoe verwendet. Erstere wurden für materialwissenschaftliche Fragestellungen in apolaren Polymersystemen eingesetzt. Diese Fragestellungen wurden mittels einzelmolekülmikroskopischen Experimenten untersucht und erforderten daher Fluorophore, die für die Einzelmolekülmikroskopie geeignet sind.

Die polaren Farbstoe wurden für Oligonukleotidexperimente verwendet. Hierfür wurden Fluoreszenzexperimente im Ensemble durchgeführt. Im Folgenden wird nun zunächst auf die apolaren und im Anschluss auf die polaren verwendeten Fluoreszenzfarbstoe eingegangen.

2.3.1. Verwendete apolare Fluoreszenzfarbstoe

Als apolare Farbstoe fanden ein Perylendiimid- (PDI), ein Terrylendiimid- (TDI) und ein Pyrrolopyrrolcyanin-Derivat (PPCy) Verwendung. Die Strukturformeln der jeweiligen Derivate sind in Abbildung 2.4 aufgeführt.

In der homologen Reihe der Rylen-Farbstoe tritt mit zunehmender Länge des π-Sys- tems eine bathochrome Verschiebung in den Absorptions- und Fluoreszenzspektren ein und es steigen die Absorptionskoezienten der 0-0-Übergänge. Die Quantenausbeute nimmt jedoch mit zunehmender Länge desπ-Systems aufgrund des abnehmenden Ener- gieunterschiedes zwischen S1und S0 (Energielückengesetz) ab.^[25]Das PDI- und das TDI-

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2.3. Verwendete Fluoreszenzfarbstoe

Abbildung 2.4: Verwendete apolare Farbstoderivate Perylendiimid (PDI), Terrylen- diimid (TDI) und Pyrrolopyrrolcyanin (PPCy).

Grundgerüst der hier verwendeten Derivate besitzen an der peri-Position je eine Dicar- boximidgruppe und an der bay-Position je einen Isooctylphenoxyrest. Die Substituenten bestimmen die Löslichkeit und optischen Eigenschaften der Grundgerüste. Sowohl durch die Dicarboximidgruppen als auch durch die Isooctylphenoxygruppen wird die Löslich- keit der Farbstoe gesteigert. Durch die Dicarboximidgruppe wird auÿerdem eine höhere chemische und photochemische Stabilität erreicht.^[26,27] Im Gegensatz dazu tragen die Isooctylphenoxygruppen dazu bei, dass die einzelnen Farbstomoleküle durch ππ-Wech- selwirkung nicht aggregieren.^[28]Auÿerdem bewirken sie eine Abschirmung vor Radikalen und Sauersto. Sie wirken zudem elektronenschiebend, was zu einer bathochromen Ver- schiebung der Spektren führt. Des Weiteren entsteht durch die Isooctylphenoxygruppen eine leichte Verdrehung des sonst planaren Kerns. Die photophysikalischen Eigenschaf-

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2. Grundlagen

ten von Rylenen, vor allem Rylendiimiden, sind auÿergewöhnlich gut, sodass diese sich als Farbstoe in der Einzelmolekülmikroskopie etabliert haben.^[17,29,30] PDI und TDI wurden hier entweder als Carbonsäuren (R1=CO2H) oder als Ethylester (R1=CO2Et) verwendet. Im Folgenden ist mit PDI und TDI der jeweilige Chromophor bezeichnet, spezische Strukturen wie die Carbonsäure des PDI (PDI-CO2H) werden explizit er- wähnt.

Fluoreszenzfarbstoe im (nahen) Infrarot (720 - 1400 nm) sind aufgrund des relativ kleinen Energieunterschieds zwischen S1 und S0 selten. Eine Farbstoklasse in diesem Spektralbereich stellen die Pyrrolopyrrolcyanine (PPCy) dar.^[31] Es handelt sich hierbei um ein von den Diketopyrrolopyrrolen abgewandeltes Grundgerüst, das als doppelter BF2 -Komplex vorliegt. Die Borkomplexe zeigen schmale Absorptionsbanden und hohe Fluoreszenzquantenausbeuten.^[32] Bei PPCy-Farbstoen handelt es sich um zwei über Pyrrolringe kreuzkonjugierte Monomethinfarbstoe. Die optischen Eigenschaften entsprechen denen von Cyaninfarbstoen. Die Löslichkeit des verwendeten PPCy-Derivates ist durch die langen Alkylketten erhöht. PPCy wurde in dieser Arbeit entweder als Car- bonsäure (R2=CO2H) oder als Säurechlorid (R2=COCl) verwendet, wobei mit PPCy im Folgenden der Chromophor bezeichnet wird und spezische Strukturen explizit erwähnt werden.

Mit PPCy-Derivaten wurden ebenso bereits Einzelmolekülexperimente durchgeführt.

Der an beiden Enden mit tert-butyl-Gruppen substituierte symmetrische PPCy-Fluo- rophor wurde in einen Polymethylacrylat-Film eingebettet. Es zeigte sich, dass PPCy- Moleküle unter diesen Bedingungen relativ stabil sind und recht hohe mittlere Photo- nenzahlen besitzen.^[33]

2.3.2. Verwendete polare Farbstoe

Es sind mittlerweile auch wasserlösliche PDI-, TDI- und PPCy-Derivate bekannt, die in biologischen Systemen Verwendung nden.^[3439] Die Fluoreszenzquantenausbeute von PDI, TDI und PPCy ist in wässrigen Systemen allerdings erheblich niedriger. Als polare Farbstoe fanden daher in dieser Arbeit typische wasserlösliche wie Tetramethylrhoda- min (TAMRA), Cyanin 3B (Cy3B), Rhodamin B (RhB), Rhodamin 6G (Rh6G) und Atto665 Verwendung. Die Strukturformeln von vier der Fluorophore sind in Abbildung 2.5 gezeigt.

Die Strukturformel von Atto665 ist nicht veröentlicht, bekannt ist allerdings, dass es sich um ein einfach positiv geladenes Carborhodamin handelt. Nach Angabe der Herstel- lerrma ATTO-TEC besitzt Atto665 eine starke Absorption (= 160000 M⁻¹cm⁻¹), eine für den Wellenlängenbereich auÿergewöhnlich hohe Fluoreszenzquantenausbeute von 0,6 und eine hohe thermische und photochemische Stabilität.

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2.3. Verwendete Fluoreszenzfarbstoe

Abbildung 2.5: Verwendete polare Farbstoe Tetramethylrhodamin (TAMRA), Rho- damin B (RhB), Rhodamin 6G (Rh6G) und Cy3B, ein verbrückter Cyaninfarbsto.

Tetramethylrhodamin (TAMRA), Rhodamin B (RhB), Rhodamin 6G (Rh6G) gehören zu den Xanthenfarbstoen. Bei Xanthenen handelt es sich um Triarylmethin-Farbstoe, die über ein Sauerstoatom verbrückt sind. Rhodamine besitzen auÿerdem zwei Ami- nogruppen als Elektronendonor und -akzeptor. Durch Mesomerie tauschen Donor und Akzeptor ihre Rollen aus. Die hier verwendeten Rhodamine unterscheiden sich in den Resten an den Stickstoatomen. Bei TAMRA handelt es sich um Dimethylaminogrup- pen, bei RhB je um Diethylaminogruppen und bei Rh6G um Ethylaminogruppen. Die Carboxyphenylgruppe ist nur schwach in das konjugierte π-System involviert, da sie aus sterischen Gründen fast senkrecht zum Xanthen steht. Rhodamine besitzen hohe Absorptionskoezienten (≈ 80000 M⁻¹cm⁻¹) und hohe Quantenausbeuten (Rh6G in Ethanol 0,95, RhB in Ethanol 0,54).

Bei Cy3B handelt es sich um einen Polymethinfarbsto. Polymethinfarbstoe sind konjugierte Systeme, in denen ein Elektronenakzeptor durch eine ungeradzahlige Kette von Methingruppen mit einem Elektronendonor verbunden ist. Durch Mesomerie tauschen auch hier Donor und Akzeptor ihre Rollen aus. Cy3B ist die verbrückte Variante zu Cy3. Cy3 kann viele Konformationen einnehmen. Durch die Beweglichkeit existieren viele Rotations- und Translationsmoden der Vibration. Dies führt zu einem Energiever-

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2. Grundlagen

lust durch strahlungslose Prozesse und damit zu einer niedrigen Quantenausbeute von 0,04.^[40] Durch das Rückgrat von Cy3B ist die Konformation im Grund- und angeregten Zustand starr und es wird eine Quantenausbeute von 0,67 erreicht.^[41]

Die polaren Farbstoe verfügen über eine geringere Photostabilität als die verwendeten apolaren Farbstoe und sind daher nur teilweise für Einzelmolekülmessungen verwend- bar.

2.4. Photolabile Linker

Spaltbare Linker ermöglichen es, Moleküle an der entsprechenden wohldenierten Stelle zu trennen. Anwendung nden spaltbare Linker unter anderem bei der Festphasensyn- these organischer Moleküle. Die Trennung kann durch Änderung der chemischen Bedin- gungen wie des pH-Werts oder durch Zugabe von Oxidations- oder Reduktionsmitteln erreicht werden. Photochemische Reaktionen erönen eine weitere Möglichkeit der Bin- dungsspaltung. Die so gespaltenen Linker werden photolabile Linker genannt. Die Linker können meist im UV-Bereich (zwischen 300 und 420 nm) angeregt werden. Ein Vorteil der Spaltung mittels Licht ist, dass sämtliche Linker zur selben Zeit aktiviert werden, da homogen in die Probe eingestrahlt werden kann. Durch die Verwendung von Lasern sind hohe Lichtdosen in sehr kurzer Zeit möglich. Damit ist dieser Prozess räumlich und zeitlich steuerbar.

Die Spaltungsquantenausbeute φ_cl beschreibt die Eektivität der Spaltung und ist de- niert als der Quotient aus der Anzahl der absorbierten, zur Spaltung führenden Photo- nen, und der absoluten Anzahl der insgesamt absorbierten Photonen:

φ_cl = Anzahl an Photonen, die zur Spaltung führen Gesamtzahl absorbierter Photonen

Durch Anregung der photolabilen Linker gelangen diese meist in den S1, woraufhin über unterschiedliche Mechanismen die photolytische Spaltung folgt. Die Spaltungsquanten- ausbeute wird durch möglicherweise auftretende Konkurrenzwege wie IC, ISC oder Fluo- reszenz herabgesetzt.

In dieser Arbeit fanden photolabile Linker zur Verbrückung von zwei Fluorophoren Ver- wendung. Ein Farbsto ist an der photolabilen Position angebracht, während ein zweiter Farbsto dauerhaft an den Linker gekoppelt ist. Es wurden die in Abbildung 2.6 dar- gestellten photolabilen Linker 6-Brom-4-(methylester)-7-hydroxycumarin (im Folgenden als Cumarin bezeichnet) und 2,5-Dimethylphenacylester (MPA) verwendet. Bei R1 und R2 handelt es sich um die Farbstoe, die an die photolabile Position angebracht wurden.

R und R3 stehen für die Farbstoe, die permanent mit dem Linker verknüpft bleiben. Das Konstrukt aus den zwei Farbstoen, die über eine photolabile Einheit verknüpft sind,

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2.4. Photolabile Linker

Abbildung 2.6: Photolabile Linker 6-Brom-4-(methylester)-7-hydroxycumarin (als Cu- marin bezeichnet) und 2,5-Dimethylphenacylester (MPA). Die Reste R und R3 stehen für permanent angebrachte Farbstomoleküle. Die Reste R1 und R2 stehen für Fluorophore an der photospaltbaren Po- sition.

wird Dyade genannt. Der Abspaltmechanismus und die Photochemie der photolabilen Gruppen ist in Abschnitt 2.4.1 erklärt.

2.4.1. Mechanismen der Linkerspaltung

Cumarin ist aufgrund hoher Absorptionskoezienten ( = 17600 M⁻¹cm⁻¹) und recht langwelliger Absorption (367 nm) gut als photolabile Einheit geeignet.^[42] Aufgrund sei- ner niedrigen Toxizität ndet Cumarin Verwendung in biologischen Systemen. Einge- führt wurde ein Cumarinderivat als photolabile Schutzgruppe 1984 von Givens et al.^[43]

Es wurden daraufhin eziente und langwellig anregbare Derivate entwickelt.^[4446] Fu- ruta et al. berichteten von (6-Brom-7-hydroxycumarin-4-yl)methyl und dessen sehr guten photochemischen und photophysikalischen Eigenschaften. Allerdings ist diese Verbin- dung in wässrigen Medien nur bei pH>7 löslich.^[47] Dieses Derivat wurde unter anderem als Schutzgruppe für Carbonsäuren in der organischen Synthese verwendet. Auch die Ab- sorptionswellenlänge ist abhängig von den Substituenten am Cumaringerüst und dadurch variierbar.^[42]Der Mechanismus der Abspaltung von (7-Methoxycumarin-4-yl)methyl-ge- schützten Säuren wurde 1999 von Schade et al. aufgeklärt.^[48] Es handelt sich dabei um eine lösungsmittelunterstütze Photoheterolyse, die den Cumarinylmethyl-Alkohol und die ungeschützte Verbindung liefert.

Der Mechanismus, übertragen auf das hier verwendete Cumarinderivat mit der ver- esterten Carbonsäure des PPCy an C7 und PDI an der photolabilen Position, ist in Abbildung 2.7 dargestellt. Nach Anregung bendet sich das Cumarin im S1, dieser entspricht einem nπ^∗ -Zustand oder im S2, der einem ππ^∗ -Zustand entspricht.^[49] Aus dem S2 erfolgt die Desaktivierung in den S1 (Kasha-Regel) und im Anschluss ndet wahr- scheinlich eine heterolytische Bindungsspaltung statt. Daraufhin folgt die Stabilisierung

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2. Grundlagen

Abbildung 2.7: Spaltungsmechanismus des Cumarinlinkers, erstellt nach Schade et al.^[48]

des Cuma-rinylmethylkations durch Reaktion mit Wasser (siehe Schmidt et al.^[50,51]).

Das PDI-CO⁻2 wird in diesem Schritt zur PDI-Carbonsäure protoniert.

Dimethylphenacyl ist eine der wenigen photolabilen Gruppen, welche in apolarer Umge- bung eingesetzt werden können. Die 2,5-Dimethylphenacylester liefern nach Belichtung um 300 nm die Carbonsäure (hier PDI-CO2H). Die Spaltung gelingt in apolaren Lö- sungsmitteln besser (in Benzol: φ_cl ≈ 0,2) als in polaren (in Methanol: φ_cl ≈ 0,1).^[52]

Die Photolyse der Dimethylphenacylester läuft mit hohen chemischen Ausbeuten ab (85 - 95%) und liefert die entsprechenden Säuren.^[53] Der Mechanismus der Abpaltung der 2,5-Dimethylphenacyl-Gruppen wurde 2001 von Zabadal et al. aufgeklärt.^[52] In Abbil-

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2.4. Photolabile Linker

dung 2.8 ist er anhand des in dieser Arbeit verwendeten Derivats dargestellt. An der Methylgruppe am C5 ist der FRET-Akzeptor über eine Esterverbindung angebunden und an der photospaltbaren Position bendet sich der FRET-Donor PDI.

Abbildung 2.8: Mechanismus der Spaltung des MPA-Linkers, erstellt nach Zabadal et al.^[52] In grau sind die in Methanol möglichen Schritte dargestellt.

Durch Anregung mittels UV-Licht gelangt das Derivat in den Singulettzustand, darauf folgt über ISC der Übergang in den Triplettzustand. Durch den intramolekularen Wasserstotransfer von der Methylgruppe auf die Ketogruppe durch eine Norrish-Typ- II-Reaktion wird das Enol im Triplettzustand ³E erhalten. Dieses und die zwei daraus folgenden Enole im Grundzustand E und Z konnten Zabadal et al. mittels Laserblitz- Photolyse identizieren.^[52] Die Photoenolisierung verläuft dabei sehr ezient (φ ≈ 1).

Z wird entweder, unter Verwendung von Methanol als Lösungsmittel, auf einem Ne- benreaktionsweg zu den zwei möglichen Produkten 1 und 2 oder durch eine 1,5-Was- serstoverschiebung zum Edukt umgewandelt. Aus der E-Konguration entsteht über Reketonisierung durch Protonentransfer 1 und die freie PDI-Carbonsäure. In Methanol würde aus dem Isomer E das Produkt 2 und die freie PDI-Carbonsäure entstehen.

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2. Grundlagen

2.5. Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie

Die Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie stellt eine hochsensitive Möglichkeit dar, die Dynamik einzelner Fluorophore zu beobachten und uoreszenzmarkierte Strukturen bildlich wiederzugeben. Zur Fluoreszenzmikroskopie einzelner Moleküle kann ein Weit- feldmikroskop oder ein konfokales Mikroskop herangezogen werden.^[21]Im Rahmen dieser Arbeit wurde jedoch ausschlieÿlich die Weitfeldmikroskopie verwendet.

Bei einem Weitfeldmikroskop (WFM) wird ein relativ groÿer Bereich der Probe zeitgleich beleuchtet (Durchmesser je nach Objektivvergröÿerung ca. 30µm). Mit Hilfe eines orts- auösenden Detektors (CCD-Kamera, engl. charge-coupled device) werden die sich in diesem Bereich bendenden Fluorophore abgebildet. Sind die Fluorophore hinreichend weit voneinander entfernt, lässt sich ihre Position mit eine Genauigkeit bestimmen, die über dem Beugungslimit liegt (siehe Abschnitt 2.5.4). Dies ist der entscheidende Faktor um die Weitfeldmikroskopie als Einzelmolekülmikroskopie-Methode zu nutzen. Durch die Aufnahme von Bilderserien kann die Dynamik vieler einzelner Fluorophore gleichzeitig beobachtet werden. So kann beispielsweise die Diusion der Fluorophore und darüber die Viskosität der Nanoumgebung bestimmt werden. Hierbei dienen die Farbstoe als Sonden.

Weitfeldmikroskope werden beispielsweise zur Beobachtung von Diusion in hochvisko- ser Umgebung genutzt.^[29,54]Weiterhin ist es damit möglich, farbstomarkierte Struktu- ren mit einer Genauigkeit von etwa 10 nm hochaufgelöst darzustellen. Vorraussetzungen und Methoden zur hochaufgelösten Mikrokopie sind in Kapitel 2.5.5 beschrieben. Die zeitliche Auösung ist durch den Detektor und die Anzahl ausgesendeter Photonen eines Fluorophors beschränkt. Bei der in dieser Arbeit verwendeten CCD-Kamera und den eingesetzten, apolaren Farbstoen liegt diese im Subsekundenbereich.

Der Vorteil der Einzelmolekülmikroskopie im Gegensatz zu Ensembleexperimenten liegt in der Beobachtung von Einzelmolekülereignissen, über die im Ensemble statistisch ge- mittelt wird. So werden nicht nur Mittelwerte erhalten, sondern Verteilungen bestimmt, durch die wiederum Heterogenitäten messbar sind. Auÿerdem liefern einzelne Molekü- le zusätzlich Informationen und molekulare Prozesse, die nicht extern synchronisierbar sind. So werden etwa Triplettübergänge zugänglich und seltene Ereignisse damit erfass- bar.

Im Folgenden werden der Aufbau des verwendeten Weitfeldmikroskops und die Kombina- tion aus verschiedenen Anregungslasern und Emissionsltern erläutert. Auÿerdem wird auf die Lokalisationsgenauigkeit des Aufbaus und auf die räumliche Auösung eingegangen. Dies sind wichtige Parameter für die hochaufgelöste Mikroskopie, die in Abschnitt 2.5.5 beschrieben wird. Weiterhin wird das Verfahren zur Bestimmung von Diusions- koezienten durch die Weitfeldmikroskopie erläutert.

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2.5. Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie

2.5.1. Aufbau eines Weitfelduoreszenzmikroskops

Der Aufbau des verwendeten Weitfelduoreszenzmikroskops ist in Abbildung 2.9 dargestellt.

Abbildung 2.9: Schematische Darstellung des genutzten Weitfelduoreszenzmikro- skops. In der linken Abbildung wird die Probe vom 561 nm Laser angeregt und das Filterrad lässt Fluoreszenz um 620 nm auf die CCD- Kamera treen, während in der rechten Abbildung der 658 nm Laser zur Anregung dient und im Filterrad der Filter für das Passieren der Fluoreszenz des Wellenlängenbereichs um 692 nm eingestellt ist.

Die Laserleistung eines 561 nm diodengepumpten Festkörperlasers (Cobolt Jive, 75 mW;

Abbildung 2.9 links) und eines 658-nm-Diodenlasers (Thorlabs, 80 mW; Abbildung 2.9 rechts) wurden mittels Graulter auf 20 mW (ca. 2,5 kW/cm²) reduziert, um zu schnel- les Photobleichen der Fluorophore zu verhindern. Die Strahlen wurden mit einem dichroitischen Spiegel (AHF, z 561 RDC) zusammen geführt und durch eine geschüttelte optische Faser (NA = 0,22 ± 0,02, Optronis, FVP 500550590, 0,5 mm Durchmesser) gelenkt. Durch das Schütteln der Faser werden Interferenzmuster im Bild vermieden und die Probe kann homogen beleuchtet werden. Das Ende der Glasfaser wurde über ein Ölimmersionsobjektiv (HCX PL APO 100x, NA = 1,4) auf eine Fläche mit einem Durchmesser von 30µm in die Probe abgebildet. Die Probe befand sich auf einem inver- sen Mikroskop (Leica DMI6000B). Die Emission dieser Fläche wurde mittels desselben Objektivs gesammelt und spektral vom Anregungslicht durch einen dichroitischen Spie- gel (AHF, z 561 660rpc) im Mikroskop getrennt. Das Licht wurde durch zwei weitere Objektive gelenkt (Nikon; 28 mm und 85 mm), damit wurde das Bild um einen Fak- tor von etwa drei vergröÿert (85 mm/28 mm ≈ 3) und auf die CCD-Kamera (Andor iXon) abgebildet. Die Gesamtvergröÿerung betrug somit 100·(85 mm/28 mm) = 304, mit einer Pixelkantenlänge der CCD-Kamera von 16 µm ergab dies 16000 nm/304 =

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2. Grundlagen

53 nm, die auf einen Pixel abgebildet wurden. Zwischen den beiden Objektiven bendet sich ein computergesteuertes Filterrad, welches unter anderem zwei Bandpasslter ent- hält (AHF, HC 620/52; Abbildung 2.9 links; AHF, HC 692/40; Abbildung 2.9 rechts).

Diese trennen die Fluoreszenz des gewünschten Fluorophors von der Fluoreszenz weiterer Chromophore und von restlich verbleibendem Laserlicht. Die Lasershutter und das Filterrad steuern das Anregungs- und Emissionslicht und werden mit einem Labview- Programm kontrolliert (siehe Abschnitt 2.5.2).

2.5.2. Kombination aus Anregungswellenlängen und Emissionslter

Das Prinzip der abwechselnden Verwendung zweier Laser mit der Kombination von zwei verschiedenen Emissionsltern beruht auf der alternierenden Laseranregung (ALEX).^[55]

Kapandis et al. nutzen allerdings ein konfokales Mikroskop mit zwei Avalanche-Photo- dioden als Detektoren und elektrooptische Modulatoren, die abwechselnd zwei Laser im Mikrosekundenbereich schalten.

In dieser Arbeit wurde die alternierende Anregung über computergesteuerte Shutter vor den Lasern realisiert. Auÿerdem konnte das Filterrad im Emissionsstrahlengang ebenfalls per Software gesteuert werden. Dadurch wurden Zyklen verschiedener optischer Einstel- lungen erhalten, die abwechselnd die Fluoreszenz des Donors und des Akzeptors und die FRET-Intensität detektieren lieÿen. Die Fluoreszenz des Donors PDI wurde durch Anregung mit 561 nm und dem Bandpasslter HC 620/52 im Emissionsstrahlengang (Donor-Kanal; s. Abbildung 2.10 (a)) aufgenommen. Für die Detektion der Akzeptor- uoreszenz (TDI bzw. PPCy) wurde die Probe mit 658 nm angeregt. Mit einem Band- passlter HC 692/40 wurde die Fluoreszenz selektiert (Akzeptor-Kanal; s. Abbildung 2.10 (b)). Um den FRET zu erfassen wurde der 561 nm Laser verwendet und dieser mit dem Bandpasslter HC 692/40 kombiniert (FRET-Kanal; s. Abbildung 2.10 (c)). Im FRET-Kanal wird jedoch zusätzlich etwas PDI-Fluoreszenz detektiert. Auÿerdem kann, je nach Akzeptorfarbsto, der Akzeptor auch direkt mit einer Wellenlänge von 561 nm angeregt werden.

Zusätzlich zur Laseranregung der Fluorophore kann die Probe mit UV-Licht bestrahlt werden. Hierzu wird das Glasfaserkabelende einer Quecksilberlampe (Lumatec, SUV- DC, 280 - 500 nm, ca. 6 W/cm²) 1 mm oberhalb der Probe positioniert, wie es in Abbildung 2.10 (d) dargestellt ist. Für die Messungen wurde folgende Reihenfolge der Einstellungen (a) bis (d) festgelegt und mit einer von B. Conrads geschriebenen Labview- Routine kontrolliert:

[a→b →c]→d→[a→b→c]_n

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(31)

Abbildung 2.10: Messzyklus der Laser- und Filtereinstellungen für die Dyaden am Weitfeldmikroskop zur Detektion der Donoruoreszenz (a), der Ak- zeptoruoreszenz (b) und der FRET-Intensität (c). Die Position der UV-Lampe ist in (d) gezeigt. Erstellt nach^[56].

Grün steht dabei für den Donor-, rot für den Akzeptor- und blau für den FRET-Kanal, violett für die UV-Bestrahlung. Die Länge n der Bilderserie nach UV-Bestrahlung vari- ierte je nach Viskosität der Probe von 300 bis 2100 Zyklen.

2.5.3. Räumliche Auösung

Bei der räumlichen Auösung eines Mikroskops handelt es sich um dessen Fähigkeit, Objekte räumlich getrennt voneinander zu unterscheiden. Die Auösungsgrenze ist die Distanz, bei der eine Unterscheidung gerade noch möglich ist. Bei Lichtmikroskopen ist diese Grenze durch den Wellencharakter des Lichts gegeben und durch dessen Beugung bestimmt. Dies wird als Beugungslimit bezeichnet und stellt den limitierenden Fak- tor der Auösung dar. Fluorophore, welche eine Gröÿe im Nanometer-Bereich besitzen, erscheinen beispielsweise aufgrund des Beugungslimits als Spots mit etwa 300 nm Durch- messer. Die Gröÿe des abgebildeten Spots hängt vom emittierten Wellenlängenbereich der Fluorophore ab.

Die Beschreibung der Abbildung eines punktförmigen Emitters durch das Detektionssys- tem ist die optische Transferfunktion (point spread function, PSF). Nach dem Rayleigh- Kriterium gelten zwei Punkte als aufgelöst, wenn sich deren PSF bei weniger als 80%

ihrer Intensität schneiden, genauer wenn die Position des zentralen Maximums des einen Beugungsscheibchens mit dem ersten Beugungsminimum des anderen Beugungsscheib- chens übereinstimmt. Nach Rayleigh ist die laterale Auösung durch

d_xy = 0,61λ

N A (2.13)

gegeben.^[57] In dieser Formel ist d_xy die minimale Entfernung zweier Lichtpunkte, die bei der Wellenlänge λ der abgestrahlten Fluoreszenz und der numerischen Apertur

(32)

2. Grundlagen

N A = n · sinα bestimmt werden kann. Hierbei ist n der Brechungsindex zwischen Objektiv und Deckglas und α der halbe Önungswinkel des Objektivs. Die Auösung ist dementsprechend ausschlieÿlich von der Emissionswellenlänge und der numerischen Apertur und somit vom verwendeten Objektiv abhängig. Unter optimalen Bedingungen beträgt die laterale Auösung von grün emittierenden Fluorophoren maximal 250 nm.

2.5.4. Lokalisierung von Fluorophoren

Das Maximum der PSF, und damit die wahrscheinlichste Position des Fluorophors, kann mit einer wesentlich höheren Genauigkeit als das Beugungslimit bestimmt werden. Die Voraussetzung dafür ist eine ausreichende räumliche Separation der Chromophore.

In lateraler Richtung wird die PSF durch eine Besselfunktion erster Gattung erster Ordnung beschrieben.^[58] Die eingeschlossene Fläche der Besselfunktion wird Beugungs- scheibchen genannt. Dessen Durchmesser entspricht d_xy aus Gleichung 2.13. Die PSF lässt sich in guter Näherung mit einem 2-dimensionalen Gauÿt annähern und das Ma- ximum dieser Intensitätsverteilung liefert somit die Position des Fluorophors.^[5961] Eine weitere, exaktere Methode, die PSF anzunähern ist die Abschätzung der maximalen Wahrscheinlichkeit (MLE, engl.: maximum likelihood estimation). Die Genauigkeit des Parameters Θ der PSF, mit der ein isoliertes, digital abgebildetes Molekül lokalisiert werden kann, ist nach Mortensen et al. gegeben durch:^[62]

∆Θ≥

√2

√ Np

i(Θ) (2.14)

Hier kannΘzum Beispiel eine Positionskoordinate sein und N ist die Anzahl der Photo- nen eines Signals. Die Funktion i(Θ)ist der Informationsgehalt eines einzelnen Photons und wird aus der PSF errechnet. Durch den Faktor√

2wird das Rauschen der üblicher- weise verwendeten CCD-Kamera berücksichtigt.

Die Lokalisationsgenauigkeit hängt vom Signal-zu-Rausch-Verhältnis (S/R) ab. Das S/R- Verhältnis wird durch die Pixelgröÿe beeinusst, und damit durch die Anzahl der Pixel des CCD-Chips, über die das Signal verteilt wird. Des Weiteren wird das S/R-Verhältnis durch die Ausleserate, die elektronische Verstärkung der Kamera, die Laserintensität und die Integrationszeit beeinusst. Das S/R-Verhältnis wird durch eine Vergröÿerung der Anzahl detektierter Photonen, der Anregungsintensität, der Markierungsdichte und das Fehlen uoreszierender Verunreinigungen verbessert. Auÿerdem trägt ein hoher Ab- sorptionsquerschnitt zu einer Maximierung des S/R-Verhältnis bei. Die Besetzung von Dunkelzuständen der Fluorophore würde zu einem niedrigeren S/R-Verhältnis führen.

Das Rauschen setzt sich aus Schrotrauschen, Autouoreszenz, unspezischen Markie- rungen, Farbstomolekülen, die nicht in der fokalen Ebene liegen, Rayleigh- und Ram-

24

(33)

anstreuung zusammen. Ab einer gewissen Laserintensität wird bei weiterer Erhöhung nur noch das Rauschen vergröÿert, nicht aber die Fluoreszenzintensität, da der S1 dann gesättigt ist. Es existiert dementsprechend ein optimales S/R-Verhältnis bezüglich der Laserintensität. Längere Integrationszeit verbessern zwar das S/R-Verhältnis, schnelle dynamische Prozesse können dann allerdings nicht mehr verfolgt werden. Für die Praxis bedeutet dies, dass geeignete Farbstoe, gereinigte Deckgläser und ausschlieÿlich hoch- reines Polymer verwendet werden sollten und der Brechungsindex von Probe, Glas und Immersionsöl möglichst identisch sein sollte.

Es wurde von Lokalisationsgenauigkeiten bis zu zwei Nanometern berichtet,^[63]jedoch ist in praxisrelevanten Systemen eher eine Genauigkeit von 10 nm realistisch. Es liegt meist kein optimales S/R-Verhältnis, aufgrund von Hintergrundsignalen oder durch bevorzugte Orientierung der Fluorophore in hochviskosen Systemen, vor.^[62,64]

2.5.5. Hochaufgelöste Mikroskopie

Als hochaufgelöste Mikroskopie bezeichnet man Lichtmikroskopietechniken, die Auö- sungen von Strukturen unterhalb des Beugungslimits liefern. Es gibt verschiedene Mög- lichkeiten, diese hohen Auösungen zu erreichen. Hierzu zählt zum Beispiel die STED (stimulated emission depletion)-Mikroskopie.^[65] Dies ist eine konfokale Technik, bei der die Probe abgerastert wird. Die hohe Auösung wird dabei durch Manipulation der eektiven Anregungsäche erreicht. Ein Laser mit Gauÿprol regt die Fluorophore beu- gungslimitiert an, ein weiterer mit einem Donutprol (STED-Laser) überführt einen Teil der angeregten Fluorophore durch stimulierte Emission in den Grundzustand. Aus- schlieÿlich die Fluorophore, die sich im Inneren des Donuts benden, bleiben angeregt und werden detektiert.

Eine weitere Möglichkeit, hohe Auösungen zu erreichen stellen die Lokalisationsmetho- den dar.^[66,67] Sie basieren auf Photoschalten der Fluorophore und deren Lokalisierung.

Hierzu gehören die Techniken STORM (stochastic optical reconstruction microscopy), dSTORM (direct stochastic optical reconstruction microscopy), PALM (photo activated localization microscopy) und FPALM (uorescence photo activation localization microscopy).[19,20,68,69] Diese Methode verwendet photoschaltbare Fluorophore, die in einer dicht markierten Probe stochastisch aktiviert und einzelnd lokalisiert werden können.

Die Auösung ist hier von der Dichte der Markierung und der Lokalisierungsgenauigkeit abhängig. Die Dichte ist hierbei viel gröÿer als die durch das Beugungslimit bedingte. Es können die einzelnen durch Photoschaltung aktivierten Fluorophore lokalisiert werden.

Das bedeutet, dass die Anzahl an zeitgleich emittierenden Fluorophoren wesentlich geringer sein muss als die tatsächliche Fluorophoranzahl. Die Fluorophore müssen so schaltbar sein, dass während einer Integrationszeit nur ein Fluorophor pro beugungslimitierter Re-

(34)

2. Grundlagen

gion emittiert. Dabei ist das Verhältnis der Anzahl an Fluorophoren im uoreszierenden Zustand N_an und Dunkelzustand N_aus entscheidend. Die Bedingung N_an N_aus muss erfüllt sein. N_an und N_aus bzw. k_an und k_aus sind von der Photophysik der Fluorophore abhängig. Die Fluorophore gehen mit der Rate k_aus in den Dunkelzustand und mit der Rate kan in den uoreszierenden Zustand über. Dabei muss kaus/kan = NT otal mit der GesamtuorophoranzahlN_{T otal} in der beugungslimitierten Region gelten.^[70]Dann über- lappen die PSF zweier uoreszierender Moleküle nicht und sie können einzeln lokalisiert werden.

Durch die Aufnahme mehrerer Bilder und die subsequente Lokalisation sämtlicher Fluo- rophore, kann durch Aufsummierung derer Positionen ein Gesamtbild konstruiert werden. Die Positionen der detektierten Fluorophore werden zu einem nichtbeugungsbe- grenzten Bild überlagert. Die Auösung hängt, wie bereits erwähnt, von der Fluoro- phordichte und der Lokalisationsgenauigkeit ab und liegt typischerweise zwischen 10 und 50 nm.^[71]

Der Abstand der Farbstoe muss dabei eng genug sein, um die entsprechende Struktur abbilden zu können. Als Maÿ für die nötige Farbstodichte kann das Nyquist-Kriterium herangezogen werden: Strukturen, die kleiner als der doppelte Farbstoabstand sind, sind nicht auösbar. Die kleinste auösbare Strukturgröÿe∆_{N yquist} ist gegeben durch

∆_{N yquist} = 2

N^1/d (2.15)

Dabei ist N die Anzahl an Markierungen pro Einheitsäche (2D) oder -volumen (3D) und d die Dimension der Struktur.^[72] Daraus resultieren für eine Bildauösung von 20 nm 10 Fluorophore pro µm beziehungsweise 1·10⁴ Fluorophore pro µm² oder 1·10⁶ Fluorophore proµm³.

Für die Photoschaltung existieren verschiedene Möglichkeiten. Bei PALM wird die Pro- be mit photoaktivierbaren uoreszierenden Proteinen dicht markiert. Am Anfang sind die meisten dieser Fluorophore im inaktiven Zustand. Eine kleine Anzahl der Farbstoe wird dann durch kurze Bestrahlung mit einem Aktivierungslaser stochastisch in einen aktivierten Zustand geschaltet. Die aktivierten Farbstoe uoreszieren daraufhin nach Laseranregung und werden so lange detektiert, bis sie alle entweder in den inaktiven Zu- stand zurückgekehrt sind oder photobleichen. Diese Schritte werden so lange wiederholt, bis genügend Positionen für die Rekonstruktion der entsprechenden Struktur lokalisiert wurden.

Bei STORM ndet die Aktivierung und Anregung ebenfalls mit zwei verschiedenen La- sern statt. Hier werden allerdings ein photoaktivierbares, organisches Aktivator-Reporter Farbstopaar, zum Beispiel Cy3-Cy5 sowie spezielle Reagenzien verwendet: Cy5 (Repor- ter) wird mit einem roten Laser zur Fluoreszenz angeregt und gleichzeitig in einen sta-

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2.6. Diusion in Polymeren

bilen Dunkelzustand versetzt. Durch einen grünen Laser ist es möglich, Cy5, der sich in räumlicher Nähe zu Cy3 (Aktivator) bendet, wieder zurück in den anregbaren Zustand zu versetzen. Es wird hierbei keine Fluoreszenz des Cy3 detektiert.

Die Methode dSTORM nutzt ebenso konventionelle Fluoreszenzfarbstoe. Es wird dabei jedoch kein Aktivatoruorophor benötigt. Durch Bestrahlung mit zwei Lasern unter- schiedlicher Wellenlänge kann der Fluorophor reversibel zwischen einem uoreszierenden und einem nichtuoreszierenden Zustand geschalten werden. Heilemann et al. konnten zeigen, dass Cy5 durch Bestrahlung mit 647 nm nach Emission in einen nichtuoreszierenden Zustand übergeht. Dabei ist die Geschwindigkeitskonstante des Ausschaltens linear von der Laserleistung abhängig. Mit dem zweiten Laser (514 nm) kann Cy5 daraufhin reaktiviert werden, wobei die Geschwindigkeitskonstante der Reaktivierung ebenfalls linear von der Laserleistung abhängig ist.^[20] Sie ist auÿerdem etwa 200-mal höher als bei STORM.

Eine Übertragung dieser Techniken auf apolare Systeme erfordert entsprechende apolare Farbstoe, die geeignetes Schaltverhalten zeigen. STED ist die erste Technik der hochaufgelösten Mikroskopie, die in den materialwissenschaftlichen Bereich Einzug ge- funden hat.^[71] Es wurden zum Beispiel Copolymernanostrukturen mit Atto647N als Farbsto untersucht.^[73] Berro et al. nutzten PALM, um die Verteilung von Photosäu- ren in einem Polymerlm zu untersuchen.^[74] Ebenfalls mit PALM konnten Aoki et al.

einzelne Rhodamin-funktionalisierte Polymethylbutylacrylat-Ketten superaufgelöst darstellen.^[75]Han et al. setzten ein schaltbares Fluorescein-Derivat ein, um Einblicke in den Phasenübergang eines Poly(Styrol-block-Ethylenoxid)diblockcopolymers zu erhalten.^[76]

2.6. Diusion in Polymeren

Polymere zählen zu den wichtigsten Materialien der heutigen Zeit. Ihre Eigenschaften wie etwa Härte und Flexibilität sind über die Monomerwahl und die Polymerisations- bedingungen einstellbar. Aus diesen und weiteren Gründen sind sie anderen Materialien oft überlegen. Die Beziehung zwischen Struktur, Dynamik und Polymereigenschaften ist jedoch nur teilweise aufgeklärt. Dieser Beziehung versuchen sich Wissenschaftler unter anderem über Experimente auf nano- bis mikroskopischer Ebene zu nähern. Ein wich- tiger Gegenstand der Untersuchungen ist der Glasübergang von Polymeren, der bisher durch keine Theorie vollständig erklärt werden kann.^[77] Ein möglicher Ansatz zur mo- dellhaften Beschreibung des Glasübergangs ist die Theorie des freien Volumens.

Am Glasübergang entsteht durch Temperaturerniedrigung aus einer Flüssigkeit ein Glas.

Beim Abkühlen einer glasbildenden Flüssigkeit liegt diese, ohne zu kristallisieren, vorerst als unterkühlte Flüssigkeit vor, bei Erreichen der Glasübergangstemperatur T_g wird

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2. Grundlagen

daraus ein amorpher Festkörper. Kinetisch betrachtet, handelt es sich bei T_g um den Punkt, ab dem die Atome und Moleküle nicht mehr die thermodynamisch günstigste Konguration einnehmen. In Abhängigkeit von der Abkühlrate kann T_g variieren. Die Denitionen für T_g sind daher unterschiedlich. Oft verwendet man die Temperatur, bei der eine Viskosität von 10¹² Pa·s erreicht ist.^[78]

Die Polymerdynamik bestimmt den Glasübergang. Es sind diese Dynamik betreend noch einige Fragen oen. Polymerdynamiken sind aufgrund der groÿen Längen- und Zeitskalen, auf denen sie stattnden, schwer zugänglich. In Kapitel 6.1 werden weitfeld- uoreszenzmikroskopische Methoden beschrieben, mit denen man Fragestellungen bzgl.

des T_g untersuchen kann.

In den folgenden Abschnitten wird nun zunächst auf Viskosität und Diusion innerhalb von Polymeren eingegangen. Es werden die Analyse der Rotation von Fluoreszenzsonden innerhalb von Polymeren beschrieben und die verwendeten Polymersysteme aufgezeigt.

2.6.1. Viskosität

Die Viskosität beschreibt die Zähüssigkeit von Substanzen. Mit steigender Temperatur T nimmt die Viskositätη von Flüssigkeiten ab. Die Abhängigkeit von T zeigt normalerweise Arrhenius-Verhalten:

η =η0 exp E_A

RT

(2.16) Hierbei sind η₀ eine Materialkonstante, R die Gaskonstante und E_A die Aktivierungs- energie. Bei der Aktivierungsenergie handelt es sich um die Energie, die Atome oder Moleküle benötigen, um eine andere Konguration einzunehmen. Für Flüssigkeiten, die Gläser ausbilden, ändert sich die Temperaturabhängigkeit nahe der Glasübergangstem- peraturTg. Hier kann die von Vogel, Fulcher, Tammann und Hesse aufgestellte (VFTH-) Gleichung herangezogen werden:^[7981]

η =η₀ exp B

T −T₀

(2.17) Der Parameter B ist eine meterialabhängige Konstante und T₀ ≈ T_g −50 K ist die Vogel-Temperatur. In üssigen Polymeren treten verschiedene Relaxationsprozesse der Polymerketten bzw. -segmente auf.^[82] Der Ausdruck Relaxation bezieht sich auf die molekulare Bewegung innerhalb einer gewissen Zeit, die benötigt wird, um auf äuÿere Veränderungen zu reagieren. Bei den stattndenden Relaxationsprozessen unterscheidet man zwei Arten von Prozessen, dieα- und dieβ-Relaxation. Dieβ-Relaxation entspricht den Bewegungen innerhalb von Polymersegmenten oder den Enden von Polymerketten.

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