FRET-Messungen an hybridisierten Oligonukleotiden

Für FRET-Messungen am Oligonukleotid-Doppelstrang wurde nun der in Abschnitt 3.1 beschriebene, mit Atto665 an Thymin 5, 15 oder 25 markierte Oligonukleotid-strang mit seinem komplementären (5'-TATAGAATAATGGATAAAGATAGAAAGT-GA-3') Strang, welcher am 5'-Ende mit TAMRA markiert war, hybridisiert (siehe Ab-bildung 3.3).

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3.2. FRET-Messungen an hybridisierten Oligonukleotiden

Abbildung 3.3: Schema der Hybridisierung des mit Atto665 markierten (rote Krei-se) Oligonukleotidstrangs und dessen mit TAMRA markierten (grüne Quadrate) komplementären Oligonukleotidstrangs. Diese Anordnung führt bei Donoranregung zu einem Energietransfer zwischen Donor und Akzeptor, dessen Ezienz von der Position des Atto665 am Oli-gonukleotid abhängig ist.

Bei TAMRA handelt es sich um einen für die Oligonukleotidmarkierung gängigen Farb-sto. Dieser Farbsto ist in Verbindung mit den gewünschten Oligonukleotiden erwerb-bar.

Für die Hybridisierung wurde das Atto665-Oligonukleotid und das TAMRA-Oligonu-kleotid in PBS-Puer gelöst und bei einer anfänglichen Temperatur von 75^◦C, welche innerhalb von vier Stunden durch eine linear abfallende Heizkurve auf Raumtemperatur gesenkt wurde, inkubiert.

Um die FRET-Ezienz zwischen TAMRA und Atto665 zu ermitteln, wurde die Kon-zentration der dafür angesetzten Lösungen (TAMRA-Oligonukleotid, TAMRA-Oligonu-kleotid-Atto665(5), Atto665(15) und TAMRA-Oligonukleotid-Atto665(25) in PBS-Puer) über Absorptionsmessungen auf exakt denselben Wert ge-bracht. Fluoreszenzspektren der Lösungen wurden unter Anregung bei 557 nm aufge-nommen. In Abbildung 3.4 sind die Fluoreszenzsspektren der erwähnten rigiden Dop-pelstränge und der Einzelstränge Oligonukleotid-Atto665 und TAMRA-Oligonukleotid dargestellt.

Die Fluoreszenzspektren in PBS-Puer zeigen die für TAMRA und Atto665 typischen Banden, mit dem Fluoreszenzmaximum von TAMRA bei 584 nm und dem von At-to665 bei 687 nm. Abhängig von der Länge der Nukleotidkette wurden unterschiedlich stark ausgeprägte Donor- und Akzeptorintensitäten gemessen. Die Anzahl an Nukleoti-den zwischen Donor und Akzeptor variierte zwischen 5, 15 und 25. Je nach Position des

3. FRET-Experimente an Systemen mit wohldeniertem Abstand

Abbildung 3.4: Darstellung von Fluoreszenzspektren des Atto665 markierten, hybridi-sierten Oligonukleotids (rot) und des TAMRA markierten, hybridisier-ten Oligonukleotids (grün). Auÿerdem sind Fluoreszenzspektren des mit beiden Farbstoen markierten Oligonukleotiddoppelstrangs (gelb) gezeigt. Der an Position 5 mit Atto665 markierte Oligonukleotiddop-pelstrang (dünne Linie), der an Position 15 (mittel dicke Linie) und der an Position 25 (dicke Linie) markierte sind zu sehen. Die Linienstärke wurde entsprechend der Stärke des Energietransfers ausgewählt.

Atto665 am Oligonukleotid werden damit über die Donorintensitäten (nach Gleichung 2.10) unterschiedliche FRET-Ezienzen erhalten. Für das an Position 5 markierte Oli-gonukleotid ist durch die Hybridisierung mit dem TAMRA-OliOli-gonukleotid ein schwacher Energietransfer zu sehen, die Fluoreszenzintensität des TAMRA sinkt nur um 26%. Dies entspricht einem Energietransfer von 26%. In diesem Fall sind die beiden Farbstoe am weitesten voneinander entfernt. Der eektivste Energietransfer ndet zwischen TAMRA und Atto665 an Position 25 statt (94%), gefolgt von Atto665 an Position 15 (59%).

Der Försterradius von TAMRA und Atto665 wurde mit einer Fluoreszenzquantenaus-beute von TAMRA von 0,58 und einem Absorptionskoezienten von Atto665 von 160000 M⁻¹cm⁻¹ zu 7,1 nm bestimmt. Mittels Försterradius und den Energietransferezienzen wurde der Abstand r zwischen den beiden Farbstomolekülen berechnet. Dieser konn-te mit dem Abstand r⁰ verglichen werden. Dabei handelt es sich um den aufgrund der bekannten Basenanzahl zwischen Donor und Akzeptor und der bekannten Länge der Linker der Farbstoe abgeschätzten Abstand zwischen den Farbstoen. Die auf diesem Wege ermittelten Abstände r und r⁰ sind in Tabelle 3.2 zusammen gefasst.

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3.2. FRET-Messungen an hybridisierten Oligonukleotiden

Tabelle 3.2: Auistung der je nach Position des Atto665 beobachteten FRET-Ezienz und dem daraus bestimmten Abstandrzwischen Donor und Akzeptor. Im Vergleich dazu ist r⁰ aufgelistet, der anhand der Basenanzahl und Linker-länge abgeschätzte Abstand.

Der Abstand r(TAMRA-Oligonukleotid-Atto665(5)) ist um 0,8 nm kleiner,r (TAMRA-Oligonukleotid-Atto665(15)) um 0,8 nm gröÿer und r(TAMRA-Oligonukleotid-Atto665 (25)) um 2 nm gröÿer als der entsprechende Abstandr⁰. Bei der Abschätzung des r⁰ wur-de von einem parallel an das Helixenwur-de wur-des Oligonukleotids sich anlagernwur-des TAMRA ausgegangen. In Lösung wird aufgrund des exiblen Linkers eine Verteilung von Abstän-den beobachtet. Der gewählte Abstand ist jedoch nach Neubauer et al., Vamosi et al. und Norman et al. der wahrscheinlichste.^[99101] Da auch der Linker zwischen Atto665 und Thymin exibel und vermutlich parallel zur Helixachse des Oligonukleotids angelagert ist,^[100] wird die Verteilung der mittleren Abstände breiter. Er kann sich in parallel oder orthogonal zu TAMRA anlagern. Es werden dementsprechend durch Wechselwirkungen der Farbstoe mit den Basen und dem Phosphatrückrat gewisse Farbstoanordnungen bevorzugt. Die relative Lage zwischen den Farbstoen kann durch FRET-Messungen di-rekt ermittelt werden (r-Bestimmung). Die gröÿte Abweichung für den kleinsten Abstand kommt allerdings hauptsächlich durch Ungenauigkeiten der FRET-Ezienzbestimmung für sehr groÿe (hier 94%) Ezienzen zu Stande, da hier Abstände r < R₀/2 = 3,9 nm vorliegen.

Eine mögliche Fehlerquelle für einen zu niedrig detektierten Energietransfer und damit für einen als zu groÿ bestimmten Abstand r, wäre unvollständige Hybridisierung. Um diesen Fehler auszuschlieÿen, wurden am Beispiel des an Position 25 markierten Oligo-nukleotids Hybridisierungen von TAMRA-Oligonukleotid und Atto665-Oligonukleotid in verschiedenen Konzentrationen durchgeführt. TAMRA-Oligonukleotid/Atto665-Oli-gonukleotid wurde im Verhältnis 1/0,55, 1/1 und 1/1,7 hybridisiert. Fluoreszenzspek-tren zeigten im Vergleich zur 1/1-Mischung eine um 45% niedrigere FRET-Ezienz der 1/0,55-Mischung. Die Ezienz für die 1/1,7-Mischung entspricht der der 1/1-Mischung.

Dies lässt auf vollständige Hybridisierung schlieÿen und erklärt somit nicht den zu gering gemessenen Energietransfer.

3. FRET-Experimente an Systemen mit wohldeniertem Abstand