Fluoreszenzexperimente im Ensemble erfordern keine spezischen Anforderungen an die verwendeten Farbstoe. Sie müssen lediglich im vorgesehenen Lösungsmittel löslich sein und im gewünschten Wellenlängenbereich absorbieren und uoreszieren. Wenn die Fluo-rophore direkt an die zu untersuchende Probe gekoppelt werden sollen, ist es von Vorteil, wenn kommerziell erhältliche Farbstoe auch als reaktive Derivate erhältlich sind.
Fluorophore für die Einzelmolekülmikroskopie und -spektroskopie müssen jedoch höhe-ren Ansprüchen Genüge leisten. So sind hohe Absorptionsquerschnitte, hohe Photostabi-litäten und hohe Quantenausbeuten unabdingbar. Nur mit diesen Eigenschaften können die Farbstoe über einen längeren Zeitraum eine hohe Anzahl an Photonen emittieren.
Dies ist nötig, um möglichst viele Informationen über die Farbstoe und deren Umge-bung gewinnen zu können.
Es wurden in dieser Arbeit apolare und polare Farbstoe verwendet. Erstere wurden für materialwissenschaftliche Fragestellungen in apolaren Polymersystemen eingesetzt. Diese Fragestellungen wurden mittels einzelmolekülmikroskopischen Experimenten untersucht und erforderten daher Fluorophore, die für die Einzelmolekülmikroskopie geeignet sind.
Die polaren Farbstoe wurden für Oligonukleotidexperimente verwendet. Hierfür wurden Fluoreszenzexperimente im Ensemble durchgeführt. Im Folgenden wird nun zunächst auf die apolaren und im Anschluss auf die polaren verwendeten Fluoreszenzfarbstoe eingegangen.
2.3.1. Verwendete apolare Fluoreszenzfarbstoe
Als apolare Farbstoe fanden ein Perylendiimid- (PDI), ein Terrylendiimid- (TDI) und ein Pyrrolopyrrolcyanin-Derivat (PPCy) Verwendung. Die Strukturformeln der jeweili-gen Derivate sind in Abbildung 2.4 aufgeführt.
In der homologen Reihe der Rylen-Farbstoe tritt mit zunehmender Länge des π -Sys-tems eine bathochrome Verschiebung in den Absorptions- und Fluoreszenzspektren ein und es steigen die Absorptionskoezienten der 0-0-Übergänge. Die Quantenausbeute nimmt jedoch mit zunehmender Länge desπ-Systems aufgrund des abnehmenden Ener-gieunterschiedes zwischen S1und S0 (Energielückengesetz) ab.[25]Das PDI- und das
TDI-12
2.3. Verwendete Fluoreszenzfarbstoe
Abbildung 2.4: Verwendete apolare Farbstoderivate Perylendiimid (PDI), Terrylen-diimid (TDI) und Pyrrolopyrrolcyanin (PPCy).
Grundgerüst der hier verwendeten Derivate besitzen an der peri-Position je eine Dicar-boximidgruppe und an der bay-Position je einen Isooctylphenoxyrest. Die Substituenten bestimmen die Löslichkeit und optischen Eigenschaften der Grundgerüste. Sowohl durch die Dicarboximidgruppen als auch durch die Isooctylphenoxygruppen wird die Löslich-keit der Farbstoe gesteigert. Durch die Dicarboximidgruppe wird auÿerdem eine höhere chemische und photochemische Stabilität erreicht.[26,27] Im Gegensatz dazu tragen die Isooctylphenoxygruppen dazu bei, dass die einzelnen Farbstomoleküle durch ππ -Wech-selwirkung nicht aggregieren.[28]Auÿerdem bewirken sie eine Abschirmung vor Radikalen und Sauersto. Sie wirken zudem elektronenschiebend, was zu einer bathochromen Ver-schiebung der Spektren führt. Des Weiteren entsteht durch die Isooctylphenoxygruppen eine leichte Verdrehung des sonst planaren Kerns. Die photophysikalischen
Eigenschaf-2. Grundlagen
ten von Rylenen, vor allem Rylendiimiden, sind auÿergewöhnlich gut, sodass diese sich als Farbstoe in der Einzelmolekülmikroskopie etabliert haben.[17,29,30] PDI und TDI wurden hier entweder als Carbonsäuren (R1=CO2H) oder als Ethylester (R1=CO2Et) verwendet. Im Folgenden ist mit PDI und TDI der jeweilige Chromophor bezeichnet, spezische Strukturen wie die Carbonsäure des PDI (PDI-CO2H) werden explizit er-wähnt.
Fluoreszenzfarbstoe im (nahen) Infrarot (720 - 1400 nm) sind aufgrund des relativ kleinen Energieunterschieds zwischen S1 und S0 selten. Eine Farbstoklasse in diesem Spektralbereich stellen die Pyrrolopyrrolcyanine (PPCy) dar.[31] Es handelt sich hierbei um ein von den Diketopyrrolopyrrolen abgewandeltes Grundgerüst, das als doppelter BF2 -Komplex vorliegt. Die Borkomplexe zeigen schmale Absorptionsbanden und hohe Fluoreszenzquantenausbeuten.[32] Bei PPCy-Farbstoen handelt es sich um zwei über Pyrrolringe kreuzkonjugierte Monomethinfarbstoe. Die optischen Eigenschaften ent-sprechen denen von Cyaninfarbstoen. Die Löslichkeit des verwendeten PPCy-Derivates ist durch die langen Alkylketten erhöht. PPCy wurde in dieser Arbeit entweder als Car-bonsäure (R2=CO2H) oder als Säurechlorid (R2=COCl) verwendet, wobei mit PPCy im Folgenden der Chromophor bezeichnet wird und spezische Strukturen explizit erwähnt werden.
Mit PPCy-Derivaten wurden ebenso bereits Einzelmolekülexperimente durchgeführt.
Der an beiden Enden mit tert-butyl-Gruppen substituierte symmetrische Fluo-rophor wurde in einen Polymethylacrylat-Film eingebettet. Es zeigte sich, dass PPCy-Moleküle unter diesen Bedingungen relativ stabil sind und recht hohe mittlere Photo-nenzahlen besitzen.[33]
2.3.2. Verwendete polare Farbstoe
Es sind mittlerweile auch wasserlösliche PDI-, TDI- und PPCy-Derivate bekannt, die in biologischen Systemen Verwendung nden.[3439] Die Fluoreszenzquantenausbeute von PDI, TDI und PPCy ist in wässrigen Systemen allerdings erheblich niedriger. Als polare Farbstoe fanden daher in dieser Arbeit typische wasserlösliche wie Tetramethylrhoda-min (TAMRA), Cyanin 3B (Cy3B), RhodaTetramethylrhoda-min B (RhB), RhodaTetramethylrhoda-min 6G (Rh6G) und Atto665 Verwendung. Die Strukturformeln von vier der Fluorophore sind in Abbildung 2.5 gezeigt.
Die Strukturformel von Atto665 ist nicht veröentlicht, bekannt ist allerdings, dass es sich um ein einfach positiv geladenes Carborhodamin handelt. Nach Angabe der Herstel-lerrma ATTO-TEC besitzt Atto665 eine starke Absorption (= 160000 M−1cm−1), eine für den Wellenlängenbereich auÿergewöhnlich hohe Fluoreszenzquantenausbeute von 0,6 und eine hohe thermische und photochemische Stabilität.
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2.3. Verwendete Fluoreszenzfarbstoe
Abbildung 2.5: Verwendete polare Farbstoe Tetramethylrhodamin (TAMRA), Rho-damin B (RhB), RhoRho-damin 6G (Rh6G) und Cy3B, ein verbrückter Cyaninfarbsto.
Tetramethylrhodamin (TAMRA), Rhodamin B (RhB), Rhodamin 6G (Rh6G) gehören zu den Xanthenfarbstoen. Bei Xanthenen handelt es sich um Triarylmethin-Farbstoe, die über ein Sauerstoatom verbrückt sind. Rhodamine besitzen auÿerdem zwei Ami-nogruppen als Elektronendonor und -akzeptor. Durch Mesomerie tauschen Donor und Akzeptor ihre Rollen aus. Die hier verwendeten Rhodamine unterscheiden sich in den Resten an den Stickstoatomen. Bei TAMRA handelt es sich um Dimethylaminogrup-pen, bei RhB je um Diethylaminogruppen und bei Rh6G um Ethylaminogruppen. Die Carboxyphenylgruppe ist nur schwach in das konjugierte π-System involviert, da sie aus sterischen Gründen fast senkrecht zum Xanthen steht. Rhodamine besitzen hohe Absorptionskoezienten (≈ 80000 M−1cm−1) und hohe Quantenausbeuten (Rh6G in Ethanol 0,95, RhB in Ethanol 0,54).
Bei Cy3B handelt es sich um einen Polymethinfarbsto. Polymethinfarbstoe sind kon-jugierte Systeme, in denen ein Elektronenakzeptor durch eine ungeradzahlige Kette von Methingruppen mit einem Elektronendonor verbunden ist. Durch Mesomerie tauschen auch hier Donor und Akzeptor ihre Rollen aus. Cy3B ist die verbrückte Variante zu Cy3. Cy3 kann viele Konformationen einnehmen. Durch die Beweglichkeit existieren viele Rotations- und Translationsmoden der Vibration. Dies führt zu einem
Energiever-2. Grundlagen
lust durch strahlungslose Prozesse und damit zu einer niedrigen Quantenausbeute von 0,04.[40] Durch das Rückgrat von Cy3B ist die Konformation im Grund- und angeregten Zustand starr und es wird eine Quantenausbeute von 0,67 erreicht.[41]
Die polaren Farbstoe verfügen über eine geringere Photostabilität als die verwendeten apolaren Farbstoe und sind daher nur teilweise für Einzelmolekülmessungen verwend-bar.