Photophysik eines Fluorophors

Bei Fluorophoren handelt es sich um Fluoreszenzfarbstomoleküle. Sie haben die Fähig-keit, nach ihrer Anregung Licht zu emittieren. Dies wird als Fluoreszenz bezeichnet und entsteht durch die Relaxation eines Fluorophors aus einem angeregten Zustand unter Emission von Photonen.

Elektronische Übergänge in höhere Zustände innerhalb eines Fluorophors entstehen durch die Wechselwirkung zwischen elektromagnetischer Strahlung (Licht) und Mate-rie. Übergangswahrscheinlichkeiten in angeregte Zustände hängen von der Gröÿe und Richtung des Übergangsdipolmoments (ÜDM) des Fluorophors ab. Das anregende Licht wird optimal absorbiert, wenn das ÜDM parallel zur elektrischen Feldrichtung des an-regenden Lichtes liegt. Das ÜDM ist ein Maÿ für die Stärke eines Übergangs. Es ist eine Gröÿe, die nur vom jeweiligen Molekül und dem konkret betrachteten Übergang abhängig ist. Die energetische Beschreibung der Fluoreszenz sowie weiterer Prozesse, die in einem Fluorophor ablaufen, können durch ein Jablonski-Diagramm erfolgen (siehe Abbildung 2.1). Das hier abgebildete Jablonski-Diagramm besteht aus den Singulettzu-ständen S0, S1 und SN und den Triplettzuständen T1 und TN. Auÿerdem sind die an die elektronischen Zustände koppelnden Schwingungszustände v dargestellt.

Bei Raumtemperatur ist bei einem Molekül nach Boltzmann der elektronische und vi-bronische Grundzustand S0,0 nahezu komplett besetzt. Durch Absorption eines Photons geeigneter Wellenlänge mit der entsprechenden Energie E = hν (h ist das Plancksche Wirkungsquantum, ν die Frequenz) gelangt das Molekül hauptsächlich in die höheren Schwingungszustände (v 6= 0) der angeregten elektronischen Zuständen S1 oder SN. Elektronische Übergänge sind aufgrund der unterschiedlichen Masse von Elektronen und Atomkernen um etwa zwei bis drei Gröÿenordnungen schneller als Kernschwingungen.

Gemäÿ der Born-Oppenheimer-Näherung kann damit der Kernabstand während eines elektronisches Übergangs als konstant betrachtet werden. Der Übergang von S0 in einen höheren Singulettzustand ndet daher in denjenigen Schwingungszustand statt, dessen Wellenfunktion am besten mit der des S0,0 überlappt (Frank-Condon-Prinzip).

2. Grundlagen

Abbildung 2.1: Jablonski-Energiediagramm eines Chromophors. Dargestellt sind die elektronischen Singulettzustände S0, S1 und SN und die Triplettzustän-de T1 und TN, sowie die vibronischen Zustände v. Die elektronischen und vibronischen Übergänge wie Absorption (mit der Absorptionsrate k_Abs), Vibrationsrelaxation (mit der Rate k_{V R}), interne Umwandlung (mit der Ratek_IC), Fluoreszenz (mit der Ratek_{F l}), Inter System Cros-sing (mit der Rate kISC) und die Phosphoreszenz (mit der Rate kP h) sind erkennbar.

Die Anregungswahrscheinlichkeitp_exeines Chromophors ist proportional zur Anregungs-intensität I (für Intensitäten kleiner der Sättigungsintensität) und zum molekularen Absorptionsquerschnitt σ:

p_ex =σ I

hν (2.1)

Nach Anregung eines Moleküls kann es über verschiedene Zerfallskanäle wieder in den Grundzustand zurückkehren:

Durch Schwingungsrelaxation (vibrational relaxation, VR;k_{V R}=10¹⁴ - 10¹² s⁻¹) gelangt das Molekül in den entsprechenden schwingungsfreien elektronischen Zustand (SN,ν=0).

Bendet es sich da-raufhin im elektronischen Zustand SN >1, geht es strahlungslos durch interne Umwandlung (internal conversion, IC) in den S1 über (k_IC = 10¹⁴ - 10¹² s⁻¹).

Mögliche Zerfallswege aus dem S1 sind strahlungslos über IC in den S0 (k_IC = 10¹¹ - 10⁶ s⁻¹), strahlungslos in den T1 über Inter System Crossing (k_ISC = 10⁹ - 10⁶ s⁻¹) oder, unter Aussendung von Photonen, durch Fluoreszenz in den S0 (k_{F l} = 10⁹ - 10⁸ s⁻¹). ISC ist ein spinverbotener Übergang (aufgrund der Spin-Auswahlregel ∆S = 0), der durch

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2.1. Photophysik eines Fluorophors

Spin-Bahn-Kopplung allerdings mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit möglich wird. Die zwei möglichen Relaxationsprozesse aus dem Triplettzustand T1 sind Phosphoreszenz (k_{P h} = 10³ - 10⁻² s⁻¹) und strahlungslose Relaxation (k_ISC = 10³ - 10⁻² s⁻¹) in den S0. Aus dem S1 und dem T1 sind auÿerdem Photoreaktionen zu Produktmolekülen und Löschprozesse möglich. Bei Löschprozessen kann die Energie auf ein weiteres Molekül, den Quencher, übertragen werden.

Gemäÿ der Kasha-Regel sind Emissionsspektren weitgehend unabhängig von der Anre-gungswellenlänge. Dem Übergang in einen höher angeregten Zustand durch Einstrahlung von Photonen, folgt normalerweise eine strahlungslose Desaktivierung in den S1,0. Nach dem Energielückengesetz ist die Rate des Übergangs von S2 nach S1 gröÿer (k_IC = 10¹⁴ - 10¹² s⁻¹) als die von S1 nach S0 (k_{F l} = 10⁹ - 10⁸ s⁻¹), somit läuft die strahlungslose Desaktivierung in den S1 schneller ab. Ein Fluoreszenzspektrum ist auÿerdem oft spie-gelsymmetrisch zum Absorptionsspektrum, da die Schwingungsenergien im angeregten Zustand und Grundzustand oft gleich sind. Das Fluoreszenzspektrum ist allerdings im Vergleich zum Absorptionsspektrum stets zu gröÿeren Wellenlängen verschoben. Die-se Verschiebung hat ihre Ursache in der Dierenz der S0,0 → S1,x - und S1,0 → S0,x -Übergänge und wird Stokes-Shift genannt. Beim optischen Übergang der Fluoreszenz wird weniger Energie frei, als bei der Absorption aufgenommen wird. Der Energiever-lust entsteht zum einen durch der Absorption folgenden Schwingungsrelaxation in den Schwingungsgrundzustand. Weitere Energieverluste entstehen durch die Besetzung hö-her angeregter Schwingungszustände durch die Emission. Der Stokes-Shift ist wichtig für die Fluoreszenzmikroskopie, da dadurch das Emissionslicht vom Anregungslicht durch Filter getrennt werden kann.

Die Fluoreszenzquantenausbeute φF l ist ein Maÿ dafür, wie ezient ein Molekül seine Anregungsenergie durch Fluoreszenz verliert. Sie gibt das Verhältnis der in Form von Fluoreszenz emittierten Photonen zu den absorbierten Photonen an:

φ_{F l}= Anzahl emittierter Photonen

Anzahl absorbierter Photonen = k_{F l}

k_{F l}+k_nr (2.2) In k_nr sind alle strahlungslosen Relaxationsprozesse des S1 zusammengefasst:

k_nr =k_IC +k_ISC+k_q (2.3)

kq entspricht der Fluoreszenzlöschung durch Wechselwirkung mit anderen Molekülen.

Um Quantenausbeuten nahe eins zu erhalten, muss die Ezienz der strahlungslosen Relaxationsprozesse nahe null sein.

2. Grundlagen

2.1.1. Löschen der Fluoreszenz

Wird die Fluoreszenzintensität einer Probe durch Wechselwirkung mit benachbarten Molekülen reduziert, spricht man von Fluoreszenzquenchen oder Fluoreszenzlöschung. Es existiert eine groÿe Bandbreite von Mechanismen, durch welche die Fluoreszenz gelöscht wird. Dabei kann es sich z.B. um molekulare Umlagerung, Elektronentransfer, Spin-Bahn-Kopplungen, ISC oder Energietransfer (siehe Abschnitt 2.2, als besonderen Fall) handeln.

Die Löschmechanismen lassen sich in dynamisches und statisches Quenchen einteilen.

Die dynamische Fluoreszenzlöschung entsteht, wenn ein Fluorophor mit einem anderen Molekül, dem Quencher, in Lösung zusammenstöÿt. Durch den Kontakt wird der ange-regte Fluorophor in den Grundzustand überführt, ohne zuvor ein Photon ausgesandt zu haben. Die Abnahme der Fluoreszenzintensität mit der Quencherkonzentration ist über die Stern-Volmer-Gleichung beschrieben:

I₀

I = 1 +K_D[Q] = 1 +k_qτ_{F l}[Q] (2.4) Es stellt dabei I0 die Fluoreszenzintensität in Abwesenheit des Quenchers, I die Fluo-reszenzintensität in Anwesenheit des Quenchers,K_D die Stern-Volmer-Quenchkonstante, [Q]die Konzentration des Quenchers, k_q die bimolekulare Quenchkonstante undτ_{F l} die Lebenszeit des Fluorophors in Abwesenheit des Quenchers dar.

Fluorophore können auÿerdem nichtuoreszierende Komplexe mit Quenchern ausbilden.

Dieser Prozess wird als statisches Fluoreszenzlöschen bezeichnet. Der Vorgang ndet be-reits im Grundzustand statt und hängt nicht von der Diusion und damit von moleku-laren Zusammenstöÿen ab. Als Quencher fungieren zum Beispiel Sauersto und Amine.