Bestimmung der Diusionskoezienten über die FRET-Methode . 77

6. Ergebnisse der Dyaden- Einzelmolekülexperimente 75

6.1.1. Bestimmung der Diusionskoezienten über die FRET-Methode . 77

Im Folgenden wird die zeitliche Entwicklung der im PDI- (561 nm Anregung, Detektion zwischen 594 und 646 nm) und FRET-Kanal (561 nm Anregung, Detektion zwischen 672 und 712 nm) gemessenen Fluoreszenzintensitäten nach der Photospaltung beschrieben.

Aus dieser Beobachtung können Diusionskoezienten bestimmt werden.

Für die durch sinkenden FRET ermittelten Diusionskoezienten wird ein Modell be-nutzt, in welchem sich beide Fluorophore zu Beginn des Experimentes (t=0) am selben Ort benden. Nach UV-Bestrahlung trennen sie sich durch separierte, freie Diusion.

Die Diusion erfolgt hier allerdings so langsam, dass weiterhin Energietransfer besteht, dieser aber mit der Zeit schwächer wird. Auf diesen Überlegungen basierend, ist die Wahrscheinlichkeit P, dass zwei Moleküle mit Diusionskoezienten D₁ und D₂ mit einem Abstand r nach einer bestimmten Zeit t zu nden sind, gegeben durch:^[115]

P(r, t, D) = 1

mit D=D₁+D₂. Dies liefert eine Energieübertragungsezienz η von η(t, D) =

Z ∞

r=0

P(r, t, D)·E(r, R₀)dr (6.2)

6. Ergebnisse der Dyaden- Einzelmolekülexperimente

mit der FRET-Ezienz E(r, R₀). Die normierten Donor- und Akzeptorintensitäten I_D und I_A können über

I_D = 1−η(t, D) (6.3)

I_A= 0,8·η(t, D) + 0,2 (6.4) bestimmt werden.

Die Akzeptorintensität resultiert nicht ausschlieÿlich aus der Donoranregung und fol-gendem FRET. Der Akzeptor TDI kann durch 561 nm ebenfalls angeregt werden. Auf-grund des Anteils der direkten Anregung wird in Gleichung 6.4 der Wert 0,2 addiert. Mit Hilfe der Gleichungen 6.1 bis 6.4 können nun Diusionskoezienten einzelner Molekü-le abgeschätzt werden. Für diese Diusionskoezienten wird angenommen, dass beide Spaltungsprodukte aufgrund ihrer ähnlichen Gröÿe den gleichen Diusionskoezienten haben.

Zunächst wurden die Positionen der einzelnen Fluorophore bestimmt (wie in Kapitel 2.6.3 beschrieben) und in den einzelnen Bildern einander zugeordnet. Danach folgte aus den Zuordnungen der drei Kanäle mittels einer weiteren Matlab-Routine die Erstellung der Intensitätszeitspuren. Es wurden aus den drei Kanälen drei parallel verlaufende Bil-derserien mit den Intensitätszeitspuren sämtlicher Fluorophore erhalten. Die Zeitspuren, in denen eine FRET-Änderung zu sehen war, wurden exportiert. Eine Methode zur wei-teren Auswertung der Daten bestand nun darin, die einzelnen Zeitspuren in eine weitere Matlab-Routine einzulesen, mittels welcher sich die einzelnen Diusionskoezienten über 6.3 und 6.4 bestimmen lieÿen. Diese Methode wird im Folgenden Anpassung einzelner Moleküle genannt. Die andere Möglichkeit bestand darin, die einzelnen Zeitspuren mit-tels Origin zu glätten (Glätten nach Savitzky-Golay über 20 Punkte mit einem Polynom 2. Ordnung). Die geglätteten Intensitätsspuren wurden normiert und addiert und konn-ten ebenso in die Matlab-Routine eingelesen werden, mit der daraufhin der gemittelte Diusionskoezient ermittelt wurde. Diese Methode wird im Folgenden Anpassung ei-nes Ensembles von Molekülen genannt.

Die Anpassung eines Ensembles von Molekülen liefert einen Durchschnittsdiusionsko-ezienten. Die Diusionskoezienten, die über Anpassung einzelner Moleküle erhalten werden, liefern eine Verteilung von Diusionskoezienten. Aus der Verteilung von Dif-fusionskoezienten wurde die kumulative Häugkeitsverteilung F(D) erstellt und diese mit der Fehlerfunktion erf analysiert:

6.1. Messung von sehr kleinen Diusionskoezienten (PAT in PBMA)

Dies ergab die Standardabweichung σ und den Erwartungswert µ. Der Erwartungswert wurde als mittlerer Diusionskoezient verwendet.

Typische Intensitätszeitspuren einzelner Moleküle sind in Abbildung 6.1 dargestellt. Es

Abbildung 6.1: Zeitliche Entwicklung von Einzelmolekül-FRET-Ezienzen bei 39,5 ^◦C; Vier typische Intensitätszeitspuren von FRET-Donor (Grün) und FRET-Akzeptor (Blau) nach der Photospaltung. Die Zeitspuren wurden nach den Gleichungen 6.3 und 6.4 angenähert.

ist zu erkennen, dass sofort nach der Photospaltung und dem hiermit verbundenen Bin-dungsbruch, beide Bruchstücke noch nahe beieinander sind und eektiver FRET weiter-hin statt ndet. Mit der Zeit wächst die Wahrscheinlichkeit, dass sich der Abstand der Chromophore untereinander vergröÿert, womit ein sinkender Energietransfer einhergeht.

Damit erfolgt ein Intensitätszuwachs im PDI-Kanal und eine Intensitätserniedrigung im FRET-Kanal. Da der Abstand der Fluorophore als sechste Potenz in die FRET-Ezienz mit eingeht, sind FRET-Änderungen hauptsächlich im Bereich des Försterradius sensi-tiv. Dieser Punkt ist bei den hier gezeigten Daten zwischen ca. 50 und 120 s zu sehen.

Die zeitliche Entwicklung von Durchschnittszeitspuren ist in Abbildung 6.2 dargestellt.

Es sind hier beispielhaft Daten bei sechs verschiedenen Temperaturen gezeigt, welche

6. Ergebnisse der Dyaden- Einzelmolekülexperimente

ebenfalls mit den Gleichungen 6.3 und 6.4 angenähert wurden. Hierbei kann die zeitliche Verschiebung des Zeitpunkts erkannt werden, an dem der Abstand zwischen PDI und TDI die Länge des Försterradius erreicht hat.

Mit dem vorgestellten Modell konnten die Daten relativ gut angeglichen werden, wie die gezeigten Fit-Kurven in den Abbildungen 6.1 und 6.2 belegen. Die Streuung der über mehrere Moleküle gemittelten Zeitspuren liegt wie erwartet unter derjenigen der Einzel-moleküle. Dies kann am Beispiel von 39,5 ^◦C erkannt werden (vergleiche die Zeitspuren der Abbildung 6.1 mit der Zeitspur von 39,5 ^◦C in Abbildung 6.2). Die vor allem in Abbildung 6.2 zu sehenden Abweichungen der FRET-Fit-Kurve von den Datenpunkten hängen vermutlich damit zusammen, dass PDI auf TDI uoreszenzlöschend wirkt. Bei einem Fluoreszenzensembleexperiment zeigte sich, dass die Intensität von TDI durch Kopplung an PDI um 30% geringer ist. Dies hat zur Folge, dass nach Trennung der Farbstoe die TDI-Intensität ansteigt und damit auch die Intensität im FRET-Kanal, wobei ebenfalls die Abnahme der Intensität aufgrund des geringer werdenden Energie-transfers stattndet. Dementsprechend beträgt die FRET-Intensität unmittelbar nach der Bestrahlung nicht 100%, wie in Abbildung 6.1 und 6.2 dargestellt. Die Abnahme des FRET innerhalb des Experiments ist somit weniger ausgeprägt als in Gleichung 6.4 angenommen und die Fit-Kurve der FRET-Daten, die sich aus der optimalen Anpassung der Fit-Kurve der PDI-Daten ergibt, deckt sich daher weniger gut mit den Daten.

In Abbildung 6.3 sind die über Anpassung einzelner Moleküle und Anpassung eines Ensembles von Molekülen ermittelten Diusionskoezienten gegen die Temperatur auf-getragen. Wie erwartet, sind Diusionskoezienten von1·10⁻¹⁷m²/s bis1·10⁻²¹ m²/s zugänglich. Die Diusionsgeschwindigkeit nimmt mit steigender Temperatur zu. Diese Temperaturabhängigkeit wird in Kapitel 6.1.2 diskutiert. Der mittlere Diusionskoezi-ent nach Anpassung einzelner Moleküle ist je etwas niedriger als der DiusionskoeziDiusionskoezi-ent, welcher über die Anpassung eines Ensembles von Molekülen erhalten wird. Dies lässt sich auf die Vernachlässigung der später bzw. langsamer auseinander diundierenden Dyaden bei der Anpassung eines Ensembles von Molekülen zurück führen. Die Ver-nachlässigung tritt bei der Addition der normierten Einzelzeitspuren für diese Methode auf. Es wird angenommen, dass während des Beobachtungszeitraums kein Photoblei-chen der PDI-Fluorophore stattndet. Bleicht jedoch ein PDI-Chromophor kurze Zeit nach der Photospaltung, so sinkt der Intensitätsbeitrag dieses Moleküls auf Null. Spä-ter bzw. langsamer auseinander diundierende Dyaden tragen dann ausschlieÿlich zum Ausgleich dieser Intensitätserniedrigung bei und bewirken keine sichtbare Erhöhung der PDI-Gesamtintensität. Diese Dyaden werden bei der Anpassung einzelner Moleküle und anschlieÿender Bestimmung des mittleren Diusionskoezienten berücksichtigt.

6.1. Messung von sehr kleinen Diusionskoezienten (PAT in PBMA)

Abbildung 6.2: Gemittelte Zeitspuren zu verschiedenen Temperaturen. Grüne Kreise entsprechen der PDI-Intensität nach der Spaltung, blaue Quadrate der FRET-Kanal-Intensität. Die Zeitspuren wurden nach den Gleichungen 6.3 und 6.4 angenähert.

6. Ergebnisse der Dyaden- Einzelmolekülexperimente

Abbildung 6.3: Temperaturabhängige Diusionskoezienten ermittelt über die FRET-Ezienz. Als blaue Quadrate sind Diusionskoezienten dar-gestellt, die über Anpassung eines Ensembles von Molekülen ermittelt wurden, als leere Dreiecke dieD, welche als mittlere Diusionskoezi-enten durch Anpassung einzelner Moleküle und anschlieÿender kumu-lativer Häugkeitsverteilung erhalten wurden. Die Fehlerbalken geben die Standardabweichung der jeweiligen Messwerte wider.

Um zu klären, welche Auswertemethode verwendet werden sollte, ist zum einen die Gröÿe der Dierenz der über beide Methoden ermittelten Diusionskoezienten zu betrachten.

Der Unterschied der beiden Methoden ist für10⁻²¹ m/s² ≤D≤10⁻¹⁹ m/s² gering und liegt im Bereich der Streuung der Werte (siehe Abbildung 6.3). Für Diusionskoezi-enten mit einem Wert von 10⁻¹⁹ m/s² ≤ D ≤ 10⁻¹⁷ m/s² ist die Dierenz gröÿer. Die Wahl der Auswertemethode ist demnach vor allem im Bereich der schnelleren Diusion entscheidend.

Zum anderen sind Kontrollexperimente in Betracht zu ziehen, aus denen hervorging, dass ein kleiner Teil der Dyaden auch ohne UV-Licht gespalteten wurde. Hierfür wurde die PAT-Dyaden in mikromolarer Konzentration in einen PBMA-Film eingebettet und

6.1. Messung von sehr kleinen Diusionskoezienten (PAT in PBMA)

mit einem 532 nm-Laser unter Weitfeldanregung bestrahlt (ca. 1,7 kW/cm²). Die beob-achteten Fluoreszenzintensitäten, die im PDI- und FRET-Kanal detektiert wurden, sind in Abbildung 6.4 gezeigt.

Abbildung 6.4: Ensembleexperiment im Polymerlm zur Untersuchung der Spaltung der Dyade PAT durch einen 532 nm Laser. Links sind die zeitli-chen Verläufe der Fluoreszenzintensitäten in den PDI- und FRET-Kanälen bei verschiedenen Temperaturen dargestellt. Die Daten aus dem FRET-Kanal wurden zur besseren Übersicht monoexponentiell angenähert. Rechts ist die Auftragung von ln([T DI]/c₀)gegen die Zeit erkennbar. Aus den Steigungen können die Bleichrate und die Diusi-onsraten ermittelt werden.

6. Ergebnisse der Dyaden- Einzelmolekülexperimente

Um sinkenden FRET von TDI-Bleichen zu unterscheiden, wurde zunächst bei Raumtem-peratur (keine Diusion innerhalb weniger Minuten) bestrahlt. Es ist eine Verringerung der FRET-Intensität über 4000 s zu erkennen (Abbildung 6.4, links), dabei handelt es sich um Photobleichen der TDI-Fluorophore. Aufgrund dieses Bleichens steigt die PDI-Intensität, wobei PDI ebenfalls Photobleichen unterliegt und daher nur ein gerin-ger Anstieg der Intensität zu verzeichnen ist. Es wurden ebenso Messungen bei 40 und 53 ^◦C durchgeführt. Bei 40 ^◦C sinkt die Intensität im FRET-Kanal deutlich schneller als bei Raumtemperatur. Unter der Annahme, dass die Bleichrate nicht signikant von der Temperatur abhängt, ndet also zusätzlich zum Photobleichen der TDI-Fluorophore eine Spaltung der Dyade mit darauf folgender getrennter Diusion der PDI- und TDI-Moleküle statt. Bei 53^◦C wird aufgrund der im Vergleich zu 40^◦C schnelleren Diusions-geschwindigkeit ein wiederum schnellerer Intensitätsabfall im FRET-Kanal beobachtet.

Für die Bestimmung der Geschwindigkeitskonstante des TDI-Bleichensk_b, wurde anhand eines Geschwindigkeitsgesetzes erster Ordnung, ln([T DI]/c₀)gegen die Zeit aufgetragen (siehe Abbildung 6.4, rechts). Die Steigung lieferte k_b = 0,0006 s⁻¹. Es konnte eine Geschwindigkeitskonstanten k_{dif f} deniert werden, welche die Spaltung und Auseinan-derdiusion der Farbstoe berücksichtigt. Über

d[T DI]

dt = (−k_b−k_{dif f})[T DI] (6.6) konnten k_{dif f}(40 ^◦C) = 0,0017 s⁻¹ und k_{dif f}(50 ^◦C) = 0,004 s⁻¹ erhalten werden. Über das 3D-Verschiebungsquadrat < x² >= 6Dt und mit dem Försterradius lässt sich ab-schätzen, welchen Fehler eine Spaltung der Dyade durch die grüne Anregungswellenlänge (ohne UV-Belichtung) bewirkt. Bei 40^◦C ergab sich hierfür ein Wert von 1,3·10⁻²⁰m²/s, bei 50 ^◦C erhält man 3,1·10⁻²⁰ m²/s. Die so ermittelten Werte liegen jeweils fast eine Gröÿenordnung unterhalb der mittels FRET ermittelten Diusionskoezienten durch Anpassung eines Ensembles von Molekülen. Es kann der Schluss gezogen werden, dass die durchschnittlich später gespaltenen Dyaden nicht durch die UV-Bestrahlung sondern durch den grünen Laser gespalten werden. Bei der Auswertemethode Anpassung eines Ensembles von Molekülen werden diese Dyaden vernachlässigt. Daher ist diese Methode zur Bestimmung der durchschnittlichen Diusionskoezienten die zu favorisierende.

Beide Trends lassen sich auch aus ersten Einzelmolekülexperimenten ohne UV-Bestrah-lung beobachten: 1. es werden durch den grünen Laser weniger Dyaden gespalten als mit UV-Licht und 2. die durchschnittliche Spaltung tritt später auf. In zukünftigen Ver-suchen könnten durch eine gröÿere Anzahl von Einzelmolekülexperimenten ohne UV-Bestrahlung auch quantitative Aussagen möglich werden.

6.1. Messung von sehr kleinen Diusionskoezienten (PAT in PBMA)

6.1.2. Bestimmung des Diusionskoezienten über Langzeit-Einzelmolekülverfolgung und Vergleich mit den

FRET-Ergebnissen

Um die mittels FRET-Analyse bestimmten Diusionskoezienten mit der üblicherweise genutzten Methode der Einzelmolekülverfolgung vergleichen zu können, wurden PDI-CO2Et-Moleküle in nanomolarer Konzentration in einen 0,3 µm dünnen PBMA14500-Film eingebracht. Diese Experimente wurden in einem Temperaturbereich von 22 ^◦C bis 65 ^◦C durchgeführt. Je nach zu erwartendem Diusionskoezientenbereich wurde auch hier die Wartezeit zwischen den einzelnen Aufnahmen variiert: für Messungen zwischen 22 ^◦C und 43 ^◦C betrug diese 15 s, für die Messung bei 45 ^◦C 10 s und Messungen zwischen 47 ^◦C und 65 ^◦C enthielten eine Wartezeit von 5 s zwischen den einzelnen Bildern.

Die Lokalisationsgenauigkeit des verwendeten Weitfeldmikroskop-Aufbaus wurde von B.

Flier mit PDI als Fluorophor in Polymerlmen auf etwa 8 nm abgeschätzt.^[114] Die-ser Wert hängt jedoch von der LaDie-serwellenlänge und dem S/R-Verhältnis jeder Probe ab und kann nur als Richtwert angesehen werden. Es wird mittlerweile von Lokalisa-tionsgenauigkeiten von 1,5 nm berichtet. Eine Möglichkeit, dies zu erreichen bestünde in TIRF-Beleuchtung (total internal reexion) gewesen. Damit können Fluorophore an der Glas-Polymer-Grenzäche bis etwa 100 nm innerhalb des Polymerlms detektiert werden. Es müsste allerdings für Lokalisationsgenauigkeiten von 1,5 nm die Rotations-diusion so schnell sein, dass die verschiedenen Dipolorientierungen ausgemittelt werden würden.^[64] In einigen der hier untersuchten Systeme insbesondere bei Temperaturen na-he des Glasübergangs ist eine solcna-he Ausmittelung von Orientierungen nicht gegeben.

Je nach Belichtungszeit bzw. Wartezeit zwischen den Aufnahmen wurde über das 2-dimensionale mittlere Verschiebungsquadrat < x² >= 4Dt und die Lokalisationsgenau-igkeit von 8 nm ein Diusionskoezient berechnet, welcher der kleinstmöglich messbare ist. Ohne Wartezeit und mit einer Belichtungszeit von 0,5 s wären Diusionskoezienten kleiner 2,7·10⁻¹⁷ m²/s (Grenzdiusionskoezient D_G) nicht zugänglich. Da allerdings dieser Diusionsbereich und die Grenze des über Verfolgungsexperimente zugänglichen Bereiches von Interesse waren, wurde die Möglichkeit der Wartezeit ausgenutzt. Die Länge der Wartezeit ist jedoch limitiert. Mit einer Filmlänge von 500 Bildern und 15 s Wartezeit betrugen die Messzeiten bereits 125 Minuten. Aufgrund der Tatsache, dass der Diusionskoezient invers proportional von der Zeitdauer zwischen den Bildern ab-hängt, wären für D_G = 1·10⁻¹⁹ m²/s bereits etwa 22 Stunden Messzeit erforderlich. Für eine Zeit von 5 s zwischen den einzelnen Bildern (0,5 s Belichtungszeit + 4,5 s War-tezeit) beträgt der Grenzdiusionskoezient D_G(5 s) = 3,2·10⁻¹⁸ m²/s, für 10 s (0,5 s Belichtungszeit + 9,5 s Wartezeit) ist D_G(10 s) = 1,6·10⁻¹⁸ m²/s und für 15 s (0,5 s

6. Ergebnisse der Dyaden- Einzelmolekülexperimente

(a) (b)

Abbildung 6.5: a) Verteilungen von Diusionskoezienten aus Einzelmolekülverfol-gungsexperimenten des PDI (Grün) und aus der FRET-Methode der Fragmente nach der Photospaltung (Blau), b) kumulative Auftragung der selben Diusionskoezienten und Anpassung mit der Verteilungs-funktion F.

Belichtungszeit + 14,5 s Wartezeit) beträgtD_G(15 s) = 1,1·10⁻¹⁸m²/s (siehe Abbildung 6.6).

Für die Auswertung der Einzelmolekülverfolgungs-Experimente wurden die Positionen der Fluorophore in den einzelnen Bildern einander zugeordnet (wie in Kapitel 2.6.3 be-schrieben), über die Schrittlängenverteilung für verschiedene Zeitabstände folgten die mittleren Verschiebungsquadrate, daraus wurden die Diusionskoezienten der einzel-nen Fluorophore erhalten. Die Verteilung der einzeleinzel-nen Diusionskoezienten ist in Ab-bildung 6.5 beispielhaft für 40 ^◦C zu sehen. Die Diusionskoezienten des PDI-CO2Et, über Einzelmolekülverfolgung bestimmt, sind im Histogramm grün dargestellt. Die Dif-fusionskoezienten des Einzelmolekül-FRET-Experiments (Anpassung einzelner Mole-küle) sind zum Vergleich gezeigt (blaue Balken). Die beiden Datensätze lassen sich als ku-mulative Häugkeiten auftragen und mit der VerteilungsfunktionF(D)(siehe Gleichung 6.5) anpassen. Daraus werden die mittleren Diusionskoezienten als Erwartungswerte und die Standardabweichungen bestimmt.

Im Gegensatz zu der mittels FRET bestimmten Verteilung besitzt die für PDI-CO2Et über Langzeitaufnahmen mit Einzelmolekülverfolgung bei 40 ^◦C bestimmte Verteilung der Diusionskoezienten, einen höheren Wert (D = 5,6·10⁻¹⁹ m²/s). Desweiteren ist die Verteilung der Diusionskoezienten über Einzelmolekülverfolgung im Vergleich zu der mittels FRET bestimmten breiter (Standardabweichung von± 3,0·10⁻²⁰m²/s) und reicht von D = 6,3·10⁻¹⁸ m²/s hin zu negativen Werten, die auf statistische

Unge-86

6.1. Messung von sehr kleinen Diusionskoezienten (PAT in PBMA)

nauigkeiten der MSD-Analyse zurück zu führen sind. Die Breite der Verteilung kann fälschlicherweise leicht als Heterogenität in der molekularen Bewegung interpretiert wer-den. Jedoch zeigt der Vergleich mit dem in diesem Bereich genaueren FRET-Ansatz, dass die Diusionskoezienten um 9,0·10⁻²⁰ m²/s mit einer Standardabweichung von± 1,8·10⁻²¹ m²/s angesiedelt sind. Dies lässt darauf schlieÿen, dass unter den gewählten Bedingungen die Bewegung im Polymer noch homogen ist. Die Breite der Verteilung der Einzelmolekülverfolgung ist zum groÿen Teil auf Positionierungsungenauigkeiten zurück zu führen.

Der Grund für die höhere Genauigkeit der FRET-Messungen bei der Bestimmung von sehr kleinen Diusionskoezienten liegt in verschiedenen Vorteilen dieser Methode im Vergleich zur Einzelmolekülverfolgung. Diese Vorteile können durch Betrachtung des mittleren Verschiebungsquadrats DG ∝ ^x_t²^G verdeutlicht werden. Erstens entspricht der Abstand x_G dem Försterradius und hängt nicht von der Lokalisationsgenauigkeit ab.

Sie wird damit nicht durch das Signal-zu-Rausch-Verhältnis beeinusst. Solange genü-gend Intensität vom FRET-Donor und FRET-Akzeptor detektiert werden kann, können Informationen über den FRET erhalten werden. Des Weiteren vergröÿern Positionie-rungsfehler, welche auf Instabilitäten der Probenposition zurückzuführen sind, nicht x_G und daher nicht DG. Da FRET-Ezienzen nur vom relativen Abstand von Donor und Akzeptor abhängen, nicht aber von deren absoluten Koordinaten, ist diese Methode nicht empndlich gegenüber Drifts der Probe, solange die einzelnen Dyaden und Frag-mente von Bild zu Bild einander zugeordnet werden können. Ein weiterer Vorteil der FRET-Methode besteht darin, dass das Signal-zu-Rausch-Verhältnis nicht wesentlich die Empndlichkeit der Messung limitiert. Somit ist die Verwendung niedrigerer Anre-gungsintensitäten möglich, wodurch die Wahrscheinlichkeit von Photobleichen der Farb-stoe verringert wird. Die niedrigeren Anregungsintensitäten und die Unempndlichkeit gegenüber der Verschiebung der Probenposition, erlauben also eine signikant gröÿere Detektionszeit t und damit die Messung eines niedrigeren Wertes D_G.

Weitere Messdaten von PDI in PBMA14500 und die bereits beschriebenen Diusionsko-ezienten der FRET-Experimente sind in Abbildung 6.6 gegen die Temperatur aufgetra-gen. Diese Abbildung enthält alle Ergebnisse der PDI-Einzelmolekülverfolgung sowie der FRET-Experimente, welche über die zwei beschriebenen Methoden ausgewertet wurden.

Des Weiteren sind der Glasübergang bei 29 ^◦C des reinen Polymers sowie die Diusi-onsgrenzwerte D_G, die je nach Wartezeit zwischen den aufgenommenen Bildern möglich sind, eingetragen.

6. Ergebnisse der Dyaden- Einzelmolekülexperimente

Abbildung 6.6: Temperaturabhängige Diusionskoezienten, von PDI anhand von Langzeit-Einzelmolekülverfolgung (grüne Kreise) bestimmt und ermit-telt über FRET-Ezienz (Blau). Als blaue Quadrate sind Diusions-koezienten, die über die Anpassung eines Ensembles von Molekülen ermittelt wurden gezeigt und als leere Dreiecke dieD, welche anhand einer Verteilungsfunktion Funktion über die mittels der Anpassung einzelner Moleküle ermittelten Verteilung von Diusionskoezienten berechnet wurden. Bei diesen Werten sind die zugehörigen Standard-abweichungen angegeben. Es sind die ermittelten Grenzdiusionsko-ezienten D_G für 0,5 s, 5 s, 10 s und 15 s eingetragen. Zu sehen ist auÿerdem der VFTH-Fit (Schwarz).

Der untere Grenzwert der Diusionskoezienten über Einzelmolekülverfolgung liegt im gleichen Bereich wie der obere Grenzwert der FRET-Methode. Mit einer Erhöhung der Zeitauösung könnten mit der FRET-Methode höher liegende Grenzwerte erreicht wer-den. Sie ist zum einen durch die Dauer des UV-Pulses und zum anderen durch die CCD-Kamera beschränkt. Die UV-Bestrahlung dauert bei diesem Aufbau 2 s. Innerhalb dieser Zeit können die Moleküle eine bestimmte Strecke diundieren. Wenn der Diusionskoef-zient hoch ist, ist am Ende der Bestrahlung ein Abstand erreicht, der keinen Energie-transfer mehr zulässt. Um dies zu verbessern, könnte eine kurzer Laserpuls verwendet

6.1. Messung von sehr kleinen Diusionskoezienten (PAT in PBMA)

werden. Die Auslesegeschwindigkeit der CCD-Kamera wäre dann jedoch der limitieren-de Faktor. Die FRET-Metholimitieren-de ist somit besonlimitieren-ders für limitieren-den Bereich unterhalb von 10⁻¹⁸ m²/s geeignet, da die einfacher umzusetzenden Einzelmolekülverfolgungs-Experimente dort nicht durchgeführt werden können. Die beiden Methoden ergänzen sich also und ein erweiterter Messbereich der FRET-Methode hin zu höheren Diusionskoezienten wird nicht benötigt.

Die Daten aus Abbildung 6.6 wurden mit der Vogel-Fulcher-Tammann-Hesse-Gleichung angepasst. Durch diese Annäherung

lässt sich die materialabhängige Konstante B (8200 Jmol⁻¹/8,3145 Jmol⁻¹·K = 986 K) ablesen, welche den typischen Literaturwerten entspricht.^[116] Zudem ist der Übergang der Einzelmolekülverfolgungs- und der FRET-Methoden zur Diusionskoezientenbe-stimmung zu sehen. Auÿerdem können anhand der Annäherung die Grenzwerte der genannten Methoden veriziert werden. Wie aus Abbildung 6.6 ersichtlich, scheint die FRET-Methode für einen Bereich unterhalb von 2·10⁻¹⁹ m²/s geeignet zu sein, während Einzelmolekülverfolgung die Methode der Wahl für D≥2·10⁻¹⁸ m²/s darstellt. In dem Zwischenbereich scheint mit keiner der beiden Methoden eine genaue Diusionskoe-zientenbestimmung möglich. Bei der Methode der Einzelmolekülverfolgung entspricht der Grenzwert gut den Vorüberlegungen und der eingezeichneten Grenze D_G(15 s). Die FRET-Methode scheint in der Praxis einen um eine Gröÿenordnung eingeschränkteren Gültigkeitsbereich zu besitzen, als in den Vorüberlegungen angenommen.

Betrachtet man Vor- und Nachteile der beiden Methoden, ist zu vermerken, dass Mes-sungen mit einer Dauer von über 100 Minuten nötig waren, um genügend Bewegung zur Auswertung der Einzelmolekülverfolgung zu erhalten, während für die FRET-Messungen nur wenige Minuten benötigt wurden. Des Weiteren handelt es sich bei der FRET-Methode um eine direkte 3D-FRET-Methode, während es sich bei der Einzelmolekülverfolgung um eine 2D-Methode handelt. Dass dabei eine 2D-Projektion einer 3D-Bewegung

Im Dokument Synthese, Charakterisierung und Anwendungen photospaltbarer Fluoreszenzfarbstoff-Dyaden mit intramolekularer Energieübertragung (Seite 85-100)