Clarithromycin und Rifampicin Distribution und pulmonale Penetration nach kurzzeitiger Gabe beim Fohlen

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Tierärztliche Hochschule Hannover

Clarithromycin und Rifampicin -

Distribution und pulmonale Penetration nach kurzzeitiger Gabe

beim Fohlen

INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin

der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.)

vorgelegt von Karen Eggers

Hamburg

Hannover 2011

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Wissenschaftliche Betreuung: PD Dr. Monica Venner PhD, Dipl. ECEIM Klinik für Pferde

1. Gutachterin: PD Dr. Monica Venner, PhD, Dipl. ECEIM Klinik für Pferde

2. Gutachter: Prof. Dr. W. Bäumer, Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie

Tag der mündlichen Prüfung 10.11.2011

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Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung

... 1

2 Literaturübersicht

... 4

3 Material und Methoden

... 13

3.1 Probanden ... 13

3.1.1 Allgemeine Bedingungen ... 13

3.1.2 Einschlussbedingungen ... 13

3.2 Methoden ... 14

3.2.1 Untersuchung der Fohlen ... 14

3.2.1.1 Allgemeinuntersuchung ... 14

3.2.1.2 Bestimmung der Leukozytenzahl im Blut ... 14

3.2.1.3 Sonographische Untersuchung der Lunge ... 15

3.2.2 Wiegen der Fohlen ... 15

3.2.3 Studiendesign... 15

3.2.3.1 Ablauf der Studie ... 16

3.2.3.1.1 Untersuchung und Wiegen der Fohlen ... 16

3.2.3.1.2 Applikation der Antibiotika ... 16

3.2.3.1.3 Blutentnahmen und Bronchoalveoläre Lavage (BAL) .... 17

3.2.3.2 Blutprobenentnahme für die Bestimmung der Konzentration von Rifampicin und/oder Clarithromycin und der Blutchemie im Plasma . ... 18

3.2.3.3 Bronchoalveoläre Lavage (BAL) ... 20

3.3 Bestimmung der Arzneistoffkonzentration im Plasma, im BAL-Überstand und in den Zellen der bronchoalveolären Lavage ... 22

3.3.1 Probenaufarbeitung ... 23

3.3.1.1 Ansatz der Stamm- und Arbeitslösungen ... 23

3.3.1.2 Ansatz und Aufarbeitung der Kalibratoren und Qualitätskontrollen ... 23

3.3.1.3 Aufbereitung der Plasmaproben, des BAL-Überstandes und der BAL-Zellsuspension ... 24

3.3.2 Flüssigkeitschromatographie (LC) mit nachgeschalteter Tandem- Massenspektroskopie (MS/MS-System) ... 25

(4)

Inhaltsverzeichnis

3.3.3 Berechnung der Arzneistoffkonzentrationen in den BALC ... 26

3.3.4 Bestimmung des Volumens der PELF ... 27

3.3.5 Berechnung der Arzneistoffkonzentrationen in der PELF ... 28

3.3.6 Bestimmung pharmakokinetischer Parameter ... 28

4 Ergebnisse

... 30

4.1 Auftreten von Nebenwirkungen ... 30

4.2 Volumen der zurückgewonnenen bronchoalveolären Lavage Flüssigkeit (BALF) und der PELF ... 30

4.3 Differenzialzellbild der BALC in der BALF ... 31

4.4 Konzentrationen der Antibiotika und ihrer Metabolite im Plasma ... 31

4.4.1 Konzentrationen von Clarithromycin und 14-OH-Clarithromycin nach Monotherapie ... 31

4.4.2 Konzentrationen von Clarithromycin und 14-OH-Clarithromycin nach Kombinationstherapie ... 32

4.4.3 Konzentrationen von Rifampicin und 25-O-Desacetylrifampicin nach Monotherapie ... 38

4.4.4 Konzentrationen von Rifampicin und 25-O-Desacetylrifampicin nach Kombinationstherapie ... 39

4.5 Konzentrationen der Antibiotika und ihrer Metabolite in der PELF ... 44

4.5.2 Konzentrationen von Clarithromycin und 14-OH-Clarithromycin nach Kombinationstherapie ... 44

4.6 Konzentrationen der Antibiotika und ihrer Metabolite in den BALC ... 50

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Inhaltsverzeichnis

4.6.2 Konzentrationen von Clarithromycin und 14-OH-Clarithromycin nach

Kombinationstherapie ... 50

4.7 Ratios………...…..…...…...……...………..…………...…...56

4.7.1 CPELF/CPlasma12h ... 56

4.7.1.1 Clarithromycin und 14-OH-Clarithromycin ... 56

4.7.1.2 Rifampicin und 25-O-Desacetylrifampicin ... 58

4.7.2 CBALC/CPlasma12h ... 59

4.7.3 CBALC/CPELF ... 61

4.8 Blutchemische Parameter ... 63

5 Diskussion

... 65

5.1 Probanden ... 65

5.2 Auftreten von Nebenwirkungen ... 65

5.3 Auswertung der Zellzahl der BALF und Zelldifferenzierung ... 66

5.4 Distribution und pulmonale Penetration der Antibiotika und ihrer Metabolite ... 66

5.4.1 Distribution und pulmonale Penetration von Clarithromycin und 14-OH- Clarithromycin nach Monotherapie ... 67

5.4.2 Distribution und pulmonale Penetration von Rifampicin und 25-O- Desacetylrifampicin nach Monotherapie ... 71

5.4.3 Einfluss von Rifampicin auf Clarithromycin nach Kombinationstherapie ... 73

5.4.4 Einfluss von Clarithromycin auf Rifampicin nach Kombinationstherapie ... 77

5.5 Schlussfolgerung ... 77

6 Zusammenfassung

... 79

(6)

Inhaltsverzeichnis

7 Summary

... 82

8 Literaturverzeichnis

... 85

9 Anhang

... 103

Abbildungsverzeichnis

... 135

Tabellenverzeichnis

... 138

Danksagung

... 142

(7)

Abkürzungsverzeichnis

AB Antibiotikum

Abb. Abbildung

ABC ATP-binding cassette

AP Alkalische Phosphatase

AST Aspartat-Aminotransferase

ATP Adenosintriphosphat

AUC area under the curve (Gesamtkonzentration

des Arzneistoffes im Organismus)

BAL Bronchoalveoläre Lavage

BALC bronchoalveoläre Lavage Zellen

BC Blutchemie

b. i. d. bis in die (zweimal am Tag)

BP Blutprobe

bzw. beziehungsweise

C Clarithromycin

Ca Calcium

ca. circa (ungefähr)

Cav durchschnittliche Plasmakonzentration über

einen Zeitraum von 12 Stunden

Cl Chlorid

cm Zentimeter

Cmax Maximalkonzentration

Cmin Minimalkonzentration

Crea Kreatinin

CYP3A4 Cytochrom P450 3A4 Enzymsystem

DNA Desoxyribonukleinsäure

EDTA Ethylendiamintetraacetat

EHV Equines Herpes Virus

et al. et alii (und andere)

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GGT Gamma-Glutamyl-Transferase

GLDH Glutamat-Dehydrogenase

GLP good laboratory practice

GZ Gigazelle

HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

ICR Intercostalraum

i. d. R. in der Regel

i. v. intravenös

K Kalium

kg Kilogramm

LC-MS/MS Flüssigkeitschromatographie mit nachge-

schalteter Tandem-Massenspektroskopie

LDH Lactatdehydrogenase

LVL Landesveterinär- und Untersuchungsamt

mg Milligramm

MHz Megaherz

MHK90 Minimale Hemmkonzentration, bei der 90%

der Erreger abgetötet werden

MIC minimal inhibitory concentration

mM Millimol/Liter

mmol Millimol

MS Massenspektroskopie

M. tuberculosis Mycobacterium tuberculosis

m/z Masse-zu-Ladung-Verhältnis

µg Mikrogramm

µl Mikroliter

Na Natrium

ng Nanogramm

OATP organic anion transporting polypeptide

PELF Pulmonary Epithelial Lining Fluid

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pH potentia Hydrogenii (Stärke des Wasser-

stoffs)

p. o. per os

PBS phosphate buffered saline

PXR pregnane X receptor

QK Qualitätskontrolle

R Rifampicin

R. equi Rhodococcus equi

RNA Ribonukleinsäure

SDS Natriumdodecylsulfat

s. i. d. semel in die (einmal am Tag)

SLC Solute Carrier

s. o. siehe oben

Tab. Tabelle

THP-1 Zelllinie human acute monocytic leukemia cell line

tmax Zeit bis zum Erreichen der Maximal-

konzentration

t1/2 Eliminationshalbwertszeit

U Units

u. a. unter anderem

Urea Harnstoff

V Volumen

Z Zelle

z. B. zum Beispiel

ZS Zellsuspension

14-OH-Clarithromycin 14-Hydroxyclarithromycin

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Einleitung

1 Einleitung

Rhodococcus equi (R. equi), der grampositive, fakultativ intrazelluläre bakterielle Erreger der Rhodokokkose, stellt eine der häufigsten Ursachen von schweren, oft lebensbedrohlichen chronisch-abszedierenden Bronchopneumonien beim Fohlen im Alter von ein bis sechs Monaten dar. Weltweit sind 5 % aller Todesfälle beim Fohlen auf diese Erkrankung zurück zu führen.

Die R. equi-Pneumonie tritt sowohl sporadisch als auch auf vielen Gestüten endemisch auf. Die Krankheit zeigt eine hohe Morbidität (40–80 %) und Mortalität (28–41 %). Selbst eine mindestens vier Wochen dauernde, kostenaufwändige antibiotische Therapie bietet keine Garantie für das Überleben des Fohlens (CHAFFIN u. MARTENS 1997; TAKAI 1997; GIGUÈRE 2010). Da erkrankte Fohlen den zunehmenden Verlust ihrer Lungenfunktion lange gut kompensieren, fallen sie i. d. R. erst durch klinische Symptome auf, wenn ein großer Bereich der Lunge bereits eitrig verändert ist. Hinweisende Symptome sind erhöhte Atemfrequenz, Dyspnoe, Lethargie, Nasenausfluss, Husten und Fieber bis 41,5 °C. Diese Symptome sind nicht von denen durch andere Erreger verursachten Lungenentzündungen zu unterscheiden. Des Weiteren sind nur bestimmte Antibiotika gegen R. equi wirksam, weshalb eine adäquate antibiotische Behandlung der Rhodokokkose häufig zu spät erfolgt.

Die Wahl der Antibiotika leitet sich durch die besonderen Erregereigenschaften von R. equi ab. R. equi ist genetisch eng verwandt mit dem Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), dem Erreger der humanen Tuberkulose (RAHMAN et al. 2003).

Ebenso wie dieses Bakterium gelangt R. equi durch Phagozytose in die Makrophagen und entzieht sich dort der Immunantwort des Wirtes. In der Folge kommt es zur intrazellulären Vermehrung von R. equi in den Makrophagen und zur Lyse der Zelle (ZINK et al. 1987; TOYOOKA et al. 2005). Die Wirksamkeit eines bei dieser Infektion eingesetzten Antibiotikums ist von einer ausreichenden intrazellulären Konzentration am Infektionsort abhängig. Viele Antibiotika, die in vitro gegen R. equi wirksam sind, zeigen in vivo keinen Erfolg, da das Antibiotikum die alveolären Makrophagen und die veränderten Lungenbereiche samt eitrigem,

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Einleitung

viskösem Material überwinden muss, um den intrazellulär gelegenen Erreger abzutöten.

Die Kombination eines Makrolidantibiotikums mit Rifampicin, einem humanmedizinischen Ansamycin-Antibiotikum zur Behandlung der Tuberkulose, stellt seit ca. 30 Jahren die Standardtherapie zur Bekämpfung von R. equi dar. Der Grund hierfür ist zum einen ihr synergistischer Effekt in vitro und in vivo, zum anderen verringert die kombinierte Gabe die Entstehung von Resistenzen (PRESCOTT u.

NICHOLSON 1984; NORDMANN u. RONCO 1992). Erythromycin war das erste kombiniert eingesetzte Makrolidantibiotikum und steigerte die Überlebensrate der Fohlen von 20 % auf fast 90 % (HILLIDGE 1987). Aufgrund seiner therapielimitierenden Nebenwirkungen sowie dem vermehrten Auftreten von Resistenzen wurde es jedoch mittlerweile durch andere Makrolide ersetzt. Hierzu zählen Azithromycin, Tulathromycin und Clarithromycin. Diese drei Makrolide weisen gegenüber Erythromycin geringere Nebenwirkungen, eine bessere Bioverfügbarkeit sowie eine verlängerte Halbwertszeit und ein größeres Verteilungsvolumen beim Fohlen auf (JACKS et al. 2001; JACKS et al. 2002; LAKRITZ u. WILSON 2002;

VENNER et al. 2007).

Clarithromycin zeigt sich gegenüber den anderen oben erwähnten Makroliden sowohl in vitro (JACKS et al. 2003; CARLSON et al. 2010) als auch in Kombination mit Rifampicin in vivo (GIGUÈRE et al. 2004) bei der Abtötung von R. equi überlegen. Empfohlen wird die orale Gabe von Clarithromycin alle 12 Stunden mit einer Dosierung von 7,5 mg/kg Körpergewicht in Kombination mit Rifampicin (10 mg/kg p. o., b. i. d) (WOMBLE et al. 2006; BLOCK 2010).

Makrolidantibiotika, darunter auch Clarithromycin, erreichen beim Fohlen und Menschen während einer Monotherapie vielfach höhere Konzentrationen in der Pulmonary Epithelial Lining Fluid (PELF) und in den bronchoalveolären Lavage Zellen (BALC) im Vergleich zum Plasma (CONTE et al. 1996; WOMBLE et al. 2006;

VENNER et al. 2010). Über welchen Weg dieser Wirkstoff an seinen Wirkort gelangt, ist nicht bekannt. Der Konzentrationsgradient lässt allerdings vermuten, dass nicht nur passive Vorgänge an seinen Transport beteiligt sind.

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Einleitung

Rifampicin ist bekannt für seine Interaktionen mit verschiedenen Arzneimitteln. Es kann deren pharmakokinetische Eigenschaften und die daraus resultierende Pharmakodynamik stark verändern und ihre Wirkung in einigen Fällen sogar ganz aufheben (ACOCELLA u. CONTI 1980; NIEMI et al. 2003). Auf welche Weise dies geschieht, ist noch nicht in jedem Fall vollständig geklärt.

Bisher ist nicht bekannt, ob oder inwieweit Rifampicin in der Anfangsphase einer Kombinationstherapie mit Clarithromycin dessen Pharmakokinetik und somit dessen Konzentration und Wirksamkeit im Lungengewebe von Fohlen beeinflusst. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Pharmakokinetik von Clarithromycin und Rifampicin nach fünfmaliger alleiniger Gabe und nach dessen fünfmaliger Kombinationstherapie beim Fohlen zu untersuchen.

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Literaturübersicht

2 Literaturübersicht

Die lokalen Konzentrationen eines Arzneistoffes am Ort der Infektion sind bei der Auswahl eines Antibiotikums in Bezug auf seine Pharmakokinetik und seine pharmakodynamischen Wirkungen von entscheidender Bedeutung. Für extrazelluläre Erreger ist es ausschlaggebend, dass das Antibiotikum im Blut eine auf den Erreger bezogene minimale Hemmkonzentration (MHK) während der meisten Zeit des Dosierungsintervalls innehat (DRUSANO 1988). Aus praktischen Gründen wird diese Plasmakonzentration auch häufig bei einer antibiotischen Therapie von intrazellulären Erregern wie zum Beispiel R. equi angegeben. Diese Plasmakonzentration stellt einen wichtigen Parameter für die Absorption des Arzneimittels dar. Allerdings kann die Konzentration im Plasma stark von der Konzentration im Gewebe abweichen, so dass keine Aussage über die erreichte Konzentration am Ort der Infektion möglich ist (DRUSANO 2005). Daher spiegeln bei intrazellulären Infektionen wie der R. equi-Pneumonie die Antibiotikakonzentrationen am Infektionsort, nämlich in den bronchoalveolären Lavage Zellen (BALC) und der Pulmonary Epithelial Lining Fluid (PELF), die antimikrobielle Aktivität des gewählten Antibiotikums exakter wider (DRUSANO 2005; KIEM u. SCHENTAG 2008). Schon bei der Diagnosestellung dieser schwerwiegenden chronisch-abszedierenden Bronchopneumonie ist bei einem Großteil der erkrankten Fohlen ein großer Bereich der Lunge verändert. Aus diesem Grund müssen die gewählten Antibiotika bereits in der Anfangsphase einer Therapie schnellstmöglich die erforderliche minimale Hemmkonzentration (MHK), bei der 90 % der Isolate von R. equi gehemmt werden (MHK90), erreichen. Nur dann können sie diesen Erreger rasch abtöten und seine weitere Vermehrung unterbinden. Für Clarithromycin liegt die In-vitro-MHK90 bei 0,12 µg/ml, für Erythromycin bei 0,50 µg/ml, für Azithromycin bei 1,0 µg/ml, für Tulathromycin bei >64 µg/ml, und für Rifampicin wird sie mit ≤0,50 µg/ml angegeben (CARLSON et al. 2010).

Rifampicin ist ein semisynthetisches Derivat von Rifamycin B und gehört zur Gruppe der Ansamycinantibiotika. Es wirkt bakterizid durch die Hemmung der bakteriellen DNA-abhängigen RNA-Polymerase (LOBO u. MANDELL 1972). Seine

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Literaturübersicht

antimikrobielle Aktivität erstreckt sich neben M. tuberculosis und R. equi vor allem auf grampositive Keime wie Staphylococcus aureus (S. aureus) und einige gramnegative Erreger. In den Enterozyten und Hepatozyten wird Rifampicin durch das CYP3A4-Enzymsystem zu einem Teil metabolisiert. Hierbei entsteht unter anderem sein ebenfalls antimikrobiell wirksamer polarer Hauptmetabolit, das 25-O-Desacetylrifampicin. Rifampicin kann in eitrige Abszesse und Makrophagen eindringen und intrazelluläre Krankheitserreger abtöten (GROSSET 1980; ZIGLAM et al. 2002). Beim Menschen werden nach einmaliger Gabe von 600 mg Rifampicin in den bronchoalveolären Zellen 16fach höhere Konzentrationen im Vergleich zum Plasma erreicht (ZIGLAM et al. 2002). Andere Autoren allerdings konnten keinen signifikanten Unterschied zwischen der intrazellulären Konzentration in der Lunge und der Plasmakonzentration feststellen (CONTE et al. 2004). Über die Verteilung von Rifampicin in das Lungengewebe von Pferden und Fohlen gibt es bisher keine Erkenntnisse.

Clarithromycin ist ein semisynthetisches Derivat von Erythromycin und unterscheidet sich von diesem durch die Methylierung einer Hydroxylgruppe an Position sechs des 14-gliedrigen Lactonringes. Es wirkt bakteriostatisch durch eine reversible Bindung an die 50S-Untereinheit bakterieller Ribosomen und verhindert so deren Proteinsynthese. Dieses Makrolid entfaltet seine antimikrobielle Aktivität gegen diverse, vor allem grampositive Erreger und ist wirksam gegen intrazellulär wachsende Bakterien (COHEN et al. 1992; ALVAREZ-ELCORO u. ENZLER 1999).

Beim Fohlen zeigt es eine vergleichsweise hohe orale Bioverfügbarkeit von 57,3 ± 12,0 % (WOMBLE et al. 2006) (Erythromycin 36,4 ± 26,0 % (LAKRITZ et al. 2000)) und deutlich seltenere und weniger schwere Nebenwirkungen im Vergleich zu Erythromycin (GIGUÈRE et al. 2004). Diese Eigenschaften qualifizieren Clarithromycin u. a. als neueres Makrolid bei seinem Einsatz zur Therapie der Rhodokokkose. Verantwortlich für die Metabolisierung von Clarithromycin ist, wie beim Rifampicin, das CYP3A4-Enzym (SUZUKI et al. 2003). Sein Hauptmetabolit, das 14-Hydroxyclarithromycin (14-OH-Clarithromycin), besitzt ebenfalls antimikrobielle Aktivität (CONTE et al. 1995). Phagozyten zeigen in vitro eine ungesättigte Aufnahme von Clarithromycin, und beim Menschen und Fohlen

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Literaturübersicht

akkumuliert es nach multiplen Gaben in der PELF und den BALC (HONEYBOURNE et al. 1994; CONTE et al. 1996; BOSNAR et al. 2005; WOMBLE et al. 2006; BLOCK 2010). Beim Fohlen konnten die höchsten Konzentrationen in den BALC gezeigt werden, gefolgt von den Konzentrationen in der PELF und den niedrigsten Konzentrationen im Plasma (WOMBLE et al. 2006; SUAREZ-MIER et al. 2007;

BLOCK 2010).

Rifampicin und Clarithromycin müssen nach peroraler Gabe vor dem Erreichen ihres intrazellulären Wirkortes mehrere Barrieren passieren. Nach der Aufnahme gelangen die Stoffe in den Darm, penetrieren über dessen Basalmembran die Enterozyten und werden über die Pfortader (Vena portae) zur Leber transportiert, die nun passiert wird. Anschließend unterliegt ein Teil dem enterohepatischen Kreislauf (KENNY u.

STRATES 1981; WILLIAMS u. SEFTON 1993; LAKRITZ u. WILSON 2002). Mit dem Blutstrom erreichen diese Antibiotika und ihre aktiven Metaboliten unter anderem ihren Wirkort die Lunge. Hier durchdringen sie die Endothelmembran samt Basalmembran und anschließend die Membran der Bronchial- bzw.

Alveolarepithelzellen, um die PELF zu erreichen. Aus diesem extrazellulären Lungenkompartiment penetrieren sie die Membran der Alveolarmakrophagen, um sich hier intrazellulär anzureichern (MANDELL u. COLEMAN 2001).

Die Arzneistoffabsorption, -distribution und –elimination stellen komplexe Prozesse dar, die von verschiedenen Faktoren beeinflusst werden. In der Vergangenheit wurde angenommen, dass diese Vorgänge hauptsächlich durch passive Diffusion erfolgen.

Die passive Diffusion ist überwiegend abhängig von der Membranpermeabilität und den physikochemischen Eigenschaften der Arzneistoffe wie Lipidlöslichkeit und Molekulargewicht. Heute ist bekannt, dass Arzneistoffe unter anderem mithilfe von Transportproteinen in die unterschiedlichen Kompartimente gelangen. Wichtig für diese transportervermittelte Arzneistoffverteilung im Gewebe ist das dynamische Zusammenspiel zwischen Uptake- und Efflux-Transportproteinen an epithelialen Zellen, da sie den Übertritt ihrer jeweiligen Substrate über die Zellmembran verhindern oder erleichtern können (HO u. KIM 2005). Welche Transportroteine bei dem Übertritt von Arzneistoffen in die intra- und extrazellulären Lungenkompartimente unterstützend wirken können, ist in Abb. 1 dargestellt.

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Literaturübersicht

Arzneistoff ABCB1-Transporter

metabolisierter Arzneistoff OATP-Transporter (vermutete Lokalisation) Abb. 1: Möglicher Weg von Arzneistoffen nach oraler Gabe über den Darm bis in die

Lungenkompartimente; PELF: Pulmonary Epithelial Lining Fluid; BALC:

bronchoalveoläre Lavage Zelle

Das ABCB1-Transportprotein (P-Glykoprotein, P-gp) ist einer der am besten untersuchten Efflux-Transporter. Es gehört zur Superfamilie der ATP-binding cassette (ABC)-Transporter. Diese setzt sich aus unterschiedlichen Transmembran- Proteinen zusammen, die Arzneistoffe energieabhängig über biologische Membranen aus dem Zellinneren hinaus transportieren (Efflux-Transport) und in fast allen Geweben des Körpers vorkommen (VAN DER DEEN et al. 2005). ABCB1 wird im Wesentlichen an der apikalen Seite von Epithelzellen verschiedener Organe

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Literaturübersicht

exprimiert, welche im Körper eine exkretorische und/oder eine Barriere-Funktion innehaben, wie z. B. Leber, Darm, Niere und Blut-Hirn-Schranke (THIEBAUT et al.

1987; ZONG u. POLLACK 2003). Die Expression dieses Efflux-Transporters in jenen Geweben in Zusammenhang mit der Absorption, der Verteilung und der Elimination eines Substrates verdeutlicht die Schutzfunktion von ABCB1 gegenüber vermeintlich toxischen Substanzen. ABCB1 vermindert so z. B. die Verteilung von Antibiotika im Körper und fördert ihre Elimination (ZONG u. POLLACK 2003). Beim Pferd konnte seine Expression an der apikalen Membran von Enterozyten, in der Leber, der Niere und an der Lymphozytenmembran gezeigt werden (NATALINI u. LINARDI 2006;

TYDÉN et al. 2009). Beim Fohlen wurde die Expression von ABCB1 an Bronchialbioptaten und bronchoalveolären Zellen belegt (HÖHENSTEIGER 2005;

BLOCK 2010; VENNER et al. 2010). In der Lunge des Menschen wird dieser Auswärtstransporter an Bronchial- und Alveolarepithelzellen ebenfalls apikal exprimiert. In der Membran von Alveolarmakrophagen konnte er mit variabler Expression nachgewiesen werden (CAMPBELL et al. 2003; VAN DER DEEN et al.

2005). Aufgrund der apikalen Expression von ABCB1 in der Lunge wird angenommen, dass dieses Membranprotein hier eine Rolle im Transport von Arzneistoffen vom Interstitium zum Lumen spielt. Seine genaue Funktion in der Lunge ist allerdings bis heute nicht bekannt (VAN DER DEEN et al. 2005).

Rifampicin und Makrolidantibiotika wie Clarithromycin und Azithromycin sind beim Menschen u. a. als Substrate von verschiedenen ABC-Transportern bekannt, zu denen auch ABCB1 gehört (WESTPHAL 2000; PACHOT et al. 2003).

Im Gegensatz zu den Efflux-Transportern vermitteln Uptake-Transporter die Aufnahme von Arzneistoffen und Xenobiotika in das Zellinnere. Sie werden durch die Superfamilie der Solute Carrier (SLC)–Transporter repräsentiert, in der die organic anion transporting polypeptide (OATP, SLCO) eine Familie darstellen. Beim Menschen sind sie in Geweben, die für die Absorption, Verteilung und Metabolisierung von Arzneimitteln verantwortlich sind, weit verbreitet (z. B. Darm, Leber, Niere) (TAMAI et al. 2000; HAGENBUCH u. GUI 2008; KÖNIG 2011). Über ihre Verteilung im Gewebe, ihre Funktionen und ihre Substratspezifitäten ist wenig bekannt (BOSQUILLON 2010). In der Rinderlunge konnte das Vorkommen von

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Literaturübersicht

Oatp1a2 gezeigt werden. Dieses bovine Oatp1a2 weist eine große Sequenzhomologie zum humanen OATP1A2 auf (GEYER et al. 2004). Beim Hund konnte die Expression von Oatp1b4 in der Leber gezeigt werden. Es weist eine funktionelle Homologie zum humanen OATP1B1 und OATP1B3 auf (GUI u.

HAGENBUCH 2010). OATP1A2 und OATP2B1 wurden an der apikalen Membran humaner Enterozyten nachgewiesen (GLAESER et al. 2007). Aufgrund ihrer Lokalisation können sie ihre Substrate aus dem Darmlumen in die Enterozyten transportieren. In der Lunge des Menschen konnte u.a. die Expression von OATP1A2, OATP2A1, OATP2B1 gezeigt werden (TAMAI et al. 2000; KULLAK- UBLICK et al. 2001). Beim Pferd wurde Oatp2b1 u. a. in der Lunge, im Gehirn und in der Leber nachgewiesen (BROWN et al. 2007).

Rifampicin ist bekannt für seine Interaktionen mit koadministrierten Arzneimitteln. So wurde z. B. Clarithromycin über mehrere Tage an Fohlen verabreicht (7,5 mg/kg p.o., b.i.d.). Die Applikation erfolgte sowohl als Monotherapie als auch in Kombination mit Rifampicin (10 mg/kg p. o., b .i. d). Anschließend wurde die Konzentration von Clarithromycin im Plasma, in der PELF und den BALC bestimmt. Dabei konnte 12 Stunden nach der letzten Arzneimittelgabe der Kombinationstherapie ein Rückgang der Clarithromycinkonzentration um jeweils mehr als 90 % in allen drei genannten Kompartimenten im Vergleich zur Monotherapie festgestellt werden. Die Konzentration des Metaboliten betrug sowohl im Plasma als auch in der Lunge noch durchschnittlich ein Drittel des Wertes im Vergleich zur Monotherapie (BLOCK 2010).

Eine Verminderung der Konzentration von Clarithromycin im Plasma um 87 % im Vergleich zur alleinigen Gabe konnte auch beim Menschen nach einer mehrwöchigen Kombinationstherapie von Clarithromycin (500 mg p. o., b .i. d.) und Rifampicin (600 mg p .o., s. i. d.) gezeigt werden. Die Konzentration von 14-OH- Clarithromycin im Plasma veränderte sich dagegen nicht (WALLACE et al. 1995).

Für die Verminderung der Konzentration von Medikamenten wie Clarithromycin, die mit Rifampicin über einen längeren Zeitraum gemeinsam verabreicht werden, sind verschiedene Mechanismen wie die Induktion von arzneimittelmetabolisierenden Enzymen (v. a. CYP3A4) im Darm und in der Leber und/oder Arzneimitteltransportern (v. a. ABCB1) durch Rifampicin verantwortlich zu machen

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Literaturübersicht

(BENEDETTI 1995; GREINER et al. 1999; LIN 2003). Beim Menschen wurde gezeigt, dass Rifampicin nach multiplen Gaben über eine Aktivierung des orphan nuclear receptors pregnane X receptor (PXR) sowohl CYP3A4 in der Leber (in vitro und in vivo) als auch ABCB1 im Darm (in vitro) induziert (GOODWIN et al. 1999;

GEICK et al. 2001). Die auf diese Weise durch Rifampicin gesteigerte Genexpression führt im Falle von CYP3A4 zu einer gesteigerten Metabolisierung, im Falle von ABCB1 zu einem vermehrten Efflux-Transport von Substraten (z. B. aus dem Enterozyten in das Darmlumen) (FROMM 2004). Beim Menschen wird die maximale Induktion von CYP3A4 durch Rifampicin nach ungefähr einer Woche erreicht (NIEMI et al. 2003; YAMAMOTO et al. 2004). Beim Pferd wird bei einer Therapiedauer von weniger als fünf Tagen keine gesteigerte Aktivität der Leberenzyme beobachtet (BURROWS et al. 1992a; DOWLING 2007). Clarithromycin ist im Gegensatz zu Rifampicin ein starker Inhibitor des CYP3A4-Enzymes beim Menschen, indem es dessen katalytische Aktivität senkt (WESTPHAL 2000).

Rifampicin und Clarithromycin sind Substrate dieses Enzymes (BACIEWICZ et al.

2008; DAVIES u. NUERMBERGER 2008).

Während eine langfristige Verabreichung von Rifampicin zur Induktion von ABCB1 an humanen Enterozyten führt (s. o.), kommt es nach kurzzeitiger Gabe von Rifampicin zur Inhibition von ABCB1. Dies konnte an der Blut-Hirn-Schranke und in der Leber bei Ratten und Menschen nachgewiesen werden (FARDEL et al. 1995;

ZONG u. POLLACK 2003; OSWALD et al. 2006). Diese Inhibition wird mit einer direkten Interaktion von Rifampicin an einer Bindungsstelle des ABCB1-Proteins in Verbindung gebracht (FARDEL et al. 1995). Durch diese Interaktion kann es den Efflux von Substraten wie Clarithromycin verhindern und dessen intrazelluläre Konzentration erhöhen. Auch bei multiplen Gaben wird dieser inhibitorische Effekt vermutet, womöglich jedoch durch die zeitgleich vorhandene Induktion überlagert (ZONG u. POLLACK 2003).

Gleichzeitig ist Rifampicin ein Substrat von OATP1B1 und OATP1B3 an der basolateralen Membran humaner Hepatozyten (TIRONA et al. 2003; HO u. KIM 2005). Weiterhin konnte seine inhibitorische Eigenschaft in Bezug auf verschiedene OATPs in der Leber an Ratten (Oatp1b1 (FATTINGER et al. 2000)) und beim

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Literaturübersicht

Menschen (OATP1B1, OATP1B3, OATP2B1, OATP1A2 (VAVRICKA et al. 2002)) gezeigt werden. Durch diese Inhibition kann Rifampicin die Aufnahme von Substraten in die Zelle vermindern bzw. dessen extrazelluläre Konzentrationen erhöhen.

Makrolide interagieren ebenfalls mit Aufnahmetransportern der OATP-Familie und werden als Substrate einiger dieser Uptake-Proteine vermutet (SEITHEL et al. 2007;

GARVER et al. 2008).

Folglich können bei gleichzeitiger Applikation von Substraten (wie Clarithromycin) und Inhibitoren (wie Rifampicin) von Transportproteinen Interaktionen zwischen den Substanzen auftreten. Häufig sind solche Wechselwirkungen entscheidend für das Ausmaß und die Richtung der Arzneistoffverteilung im Gewebe.

Sollten Rifampicin und Clarithromycin auch in der Fohlenlunge Substrate von ABCB1 sein, würden die beiden bei einer Kombinationstherapie um diesen Auswärtstransporter konkurrieren. Durch die gleichzeitige Inhibition dieses Membrantransporters durch Rifampicin auf apikaler Seite des Bronchial- bzw.

Alveolarepithels würde ein Übertritt von Clarithromycin in die PELF behindert werden und sich dessen Konzentration hier entsprechend verringern. Folglich würde sich auch die intrazelluläre Konzentration in den Alveolarmakrophagen im Vergleich zur Monotherapie verringern.

Die Akkumulation von Rifampicin und Clarithromycin in der PELF und den BALC kann, neben dem Efflux-Transporter ABCB1, auch von der Expression von Uptake- Transportern der OATP-Familie in den genannten Lungenkompartimenten beim Fohlen abhängig sein. Sollten OATPs auf der basolateralen Seite der Bronchial- bzw.

Alveolarepithelmembran und auf der Alveolarmakrophagenmembran beim Fohlen exprimiert werden, kann die intrazelluläre Konzentration von Clarithromycin aufgrund der Inhibition dieser Uptake-Transporter durch Rifampicin vermindert werden. Auf diese Weise würde sich (zusätzlich) die Konzentration von Clarithromycin in der PELF und dementsprechend auch in den BALC vermindern.

Die Inhibition von ABCB1 und/oder OATPs durch Rifampicin in der Fohlenlunge kann somit in der Frühphase einer Kombinationstherapie einer R. equi-Pneumonie zu subtherapeutischen Konzentrationen dieses Makrolides in der Lunge führen. Wird zu

(22)

Literaturübersicht

diesem Zeitpunkt die In-vitro-MHK90 von Clarithromycin sowohl in der PELF als auch in den BALC nicht erreicht, muss eine kombinierte Behandlung der Rhodokokkose mit Rifampicin und Clarithromycin in den derzeitig geltenden Dosierungen aus pharmakokinetischer Sicht überdacht werden.

Aufgrund der hohen Morbidität und der hohen Mortalität in der Fohlenpopulation bei fehlender, verspäteter oder unzureichender Therapie sowie der eingeschränkten Auswahl an effektiven Antibiotika und der fortschreitenden Resistenzentwicklung ist die Optimierung der Therapie der Rhodokokkose unabdingbar.

In der vorliegenden Studie wurde bei gesunden Fohlen das Plasmakonzentrations- Zeitverhältnis und die Verteilung von Rifampicin und Clarithromycin sowie deren aktiver Metabolite 25-O-Desacetylrifampicin und 14-OH-Clarithromycin nach fünfmaliger Gabe in der PELF und den BALC untersucht. Besonderes Augenmerk ist dabei auf mögliche gegenseitige Beeinflussungen oder Wechselwirkungen der beiden Medikamente bei kombinierter Gabe gelegt worden.

(23)

Material und Methode

3 Material und Methoden

3.1 Probanden

Neun gesunde Fohlen, davon sechs weibliche und drei männliche, im Alter von 6-10 Wochen und einem Gewicht von 102-167 kg, wurden in die Studie eingeschlossen (Tab. 6 im Anhang). Alle Fohlen stammten von einem deutschen Gestüt, auf dem die Untersuchungen auch durchgeführt wurden. Bei der Studie handelt es sich um einen genehmigungspflichtigen Tierversuch, der vom Landesveterinär- und Lebensmitteluntersuchungsamt (LVL) Mecklenburg-Vorpommerns unter dem Aktenzeichen LADDF MV/TSD/7221.3-1.1.-066/08 genehmigt worden ist.

3.1.1 Allgemeine Bedingungen

Die Fohlen verbrachten ihre ersten Lebenstage zusammen mit ihren Müttern in Einzelboxen. Nach durchschnittlich sieben Tagen wurden sie mit neun weiteren Stuten-Fohlen-Paaren in Laufställen untergebracht. Diese waren mit Stroh eingestreut und sind mit einem frei zugänglichen Betonpaddock ausgestattet gewesen. Alle Pferde hatten freien Zugang zu Wasser und Heu. Einmal täglich erfolgte eine Fütterung mit einem Mais-Grassilage-Mischfutter, welches mit Hafer und Mineralfutter angereichert war.

Die Stuten sind periodisch gegen das equine Herpesvirus 1 und 4 (EHV 1 und 4), Influenzavirus und Tetanus geimpft, und alle Pferde sind regelmäßig entwurmt worden.

3.1.2 Einschlussbedingungen

Um an dieser Studie teilzunehmen, mussten die Fohlen klinisch allgemein und sonographisch lungengesund sein und durften in den vier vorherigen Wochen nicht mit Antibiotika behandelt worden sein. Die Leukozytenzahl durfte den Wert von 13.000 Zellen/µl Blut nicht überschreiten.

(24)

3.2 Methoden

3.2.1 Untersuchung der Fohlen

Von Geburt an bis nach der Studie wurden die Fohlen einmal wöchentlich einer Allgemeinuntersuchung inklusive spezieller Untersuchung des Respirationstraktes unterzogen. Zusätzlich wurde ebenfalls wöchentlich die Blutleukozytenzahl bestimmt und eine ultrasonographische Untersuchung der Lunge durchgeführt.

3.2.1.1 Allgemeinuntersuchung

Bei der Allgemeinuntersuchung wurden die Haltung, das Verhalten und der Ernährungszustand der Fohlen beobachtet. Desweiteren wurde auf vermehrte Gelenkfüllung, Verletzungen, Nabelveränderungen, Husten und die Kotkonsistenz geachtet. Die rektale Körpertemperatur sowie die Größe der mandibulären Lymphknoten wurden bestimmt. Das Vorhandensein von Nasenausfluss (serös, mukös, purulent) wurde dokumentiert.

Bei der stethoskopischen Auskultation der rechten und linken Lungenseite und der Trachea wurde der Grad der physiologischen Atemgeräusche bzw. das Auftreten von Nebengeräuschen wie Rasseln und Giemen über jeweils mindestens zwei Atemzüge beurteilt.

3.2.1.2 Bestimmung der Leukozytenzahl im Blut

Im Rahmen der wöchentlichen klinischen Untersuchung wurde den Fohlen aus der rechten oder linken Vena jugularis (V. jugularis) mit Hilfe einer Kanüle (BD Microlance^TM, 1,2 mm x 40 mm, Becton Dickinson, Drogheda, Irland) Blut entnommen und in einem EDTA-Kalium-Probenröhrchen (EDTA K, 4 ml, Sarstedt AG, Nümbrecht, Deutschland) aufgefangen. Zur Untersuchung der Leukozytenzahl diente ein automatischer Hämatologie-Analysator (Sysmex KX-21N, Sysmex Deutschland GmbH, Hamburg, Deutschland), welcher die Anzahl der Leukozyten pro Mikroliter Blut durch eine Widerstandsmessung bestimmte.

(25)

3.2.1.3 Sonographische Untersuchung der Lunge

Von jedem Fohlen wurde vor Beginn der Studie sowie vor und nach jeder Kinetik eine ultrasonographische Untersuchung der Lunge durchgeführt. Für diese Untersuchung wurde ein transportables Ultraschallgerät (Tringa Linear, Esaote Piemedical, Maastricht, Niederlande) mit einem Linearschallkopf mit einer Frequenz von 7,5 MHz, einer Länge von 7,5 cm und einer Breite von 2 cm verwendet. Der transcutane Ultraschall-Untersuchungsbereich erstreckte sich auf beide Thoraxseiten vom 15. bis zum 4. Intercostalraum (ICR). Zur Entfettung und somit für eine bessere Ankopplung wurde der Bereich des Lungenfeldes mit Alkohol (Isopropylalkohol, 2- Propanol, 99,5 %, Rebo-Pharm, Bochholt, Deutschland) eingesprüht. Keines der neun Fohlen zeigte zu Beginn der Studie pathologische Lungenbefunde.

3.2.2 Wiegen der Fohlen

Jedes Fohlen wurde zu Beginn der Studie und vor jedem neuen Studienabschnitt gewogen. In einem Untersuchungsstand für Pferde wurde eine portable Waage („Die mobile Pferdewaage“, Deutschland) aufgestellt. Die Mutterstute befand sich in einem daneben stehenden separaten Untersuchungsstand, während das Fohlen alleine auf der Waage stand. Die so bestimmten Gewichte dienten der genauen Dosierung der verabreichten Antibiotika sowie der Medikamente zur Allgemeinanästhesie bei der Bronchoalveolären Lavage (BAL).

3.2.3 Studiendesign

Bei dieser Studie handelte es sich um eine offene randomisierte dreiarmige Cross- Over-Studie. Sie dauerte für jedes Fohlen 33 Tage. Während der 1. bzw. 2. bzw. 3.

Kinetik wurde jedem Fohlen fünfmal an drei aufeinander folgenden Tagen im 12- stündigen Abstand Rifampicin (10 mg/kg; Rifa^®600 Dragees, Grünenthal GmbH, Aachen, Deutschland) bzw. Clarithromycin (7,5 mg/kg; Klacid Saft Forte^®, 250 mg/5ml, Abbott GmbH & Co. KG, Wiesbaden, Deutschland) bzw. die entsprechenden Kombination von Rifampicin (10 mg/kg) und Clarithromycin (7,5 mg/kg) p. o. verabreicht. Nach der letzten Applikation erfolgten in bestimmten Zeitabständen Blutentnahmen, und 12 Stunden später wurde eine BAL durchgeführt.

Danach schloss sich eine Wash-Out-Phase von 12 Tagen an (Abb. 2).

(26)

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 d

1. AM-Applikation 2. AM-Applikation 3. AM-Applikation

Wash-Out

2. BAL

BAL: Broncholaveoläre Lavage; AM: Arzneimittel

3. BAL

Wash-Out 1. BAL

Abb. 2: Studiendesign (die Achse ist eine Zeitachse in Tagen)

3.2.3.1 Ablauf der Studie

3.2.3.1.1 Untersuchung und Wiegen der Fohlen

Tag 0 und Tag 5, Tag 14 und Tag 19, Tag 28 und Tag 33

Vor Beginn der Studie wurde die Krankengeschichte jedes Fohlens studiert.

Anschließend wurden die Fohlen, ebenso wie vor und am Ende jeder weiteren Kinetik, einer Allgemeinuntersuchung, einer speziellen Untersuchung des Respirationstraktes und einer sonographischen Untersuchung der Lunge unterzogen (siehe 3.2.1). Desweiteren wurde die Leukozytenzahl im Blut bestimmt. Das Wiegen der Fohlen erfolgte unmittelbar vor jeder Kinetik.

3.2.3.1.2 Applikation der Antibiotika

Tag 1 bis 3, Tag 15 bis 17, Tag 29 bis 31

Die Fohlen bekamen zweimal täglich, um 07:00 Uhr und um 19:00 Uhr, Rifampicin bzw. Clarithromycin bzw. die entsprechende Kombination von Rifampicin und

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Clarithromycin oral mit einer 60 ml Spritze (Soft Ject^® Katheter, 60 ml, Henke Sass Wolf, Tuttlingen, Deutschland) verabreicht. Alle Fohlen hatten vorher freien Zugang zu Heu und Muttermilch. Für die Medikamentengabe wurde das Clarithromycin nach Anweisung des Herstellers zubereitet. Das Rifampicin wurde mit einem Mörser zerkleinert, und durch Zugabe von 30 ml Wasser ist eine Suspension mit der Konzentration 60 mg/ml Rifampicin hergestellt worden. Für die kombinierte Gabe von Rifampicin und Clarithromycin wurden diese beiden dementsprechend in einer Mischspritze aufgezogen. Während der Medikamentenapplikation wurde das Fohlen von zwei Hilfspersonen je am Kopf und am Schweif fixiert. Die Applikation erfolgte in das leere Maul, während der Kopf leicht nach oben gehalten worden ist. Das Fohlen wurde solange fixiert, bis der Spritzeninhalt komplett abgeschluckt wurde.

Im Verlauf des 2. Tages sind die Fohlen mit ihren Müttern in Einzelboxen umgestellt worden.

3.2.3.1.3 Blutentnahmen und Bronchoalveoläre Lavage (BAL) Tag 3 bis 5, Tag 17 bis 19 und Tag 31 bis 33

Am jeweils dritten Tag jeder Kinetik wurde den Fohlen morgens mit einer Braunüle ein venöser Zugang in die rechte oder linke V. jugularis gelegt (siehe 3.3.2.). Nach der nun folgenden letzten Medikamentengabe um 07:00 Uhr sind von den Fohlen Blutproben in bestimmten zeitlichen Abständen über die Braunüle genommen worden (Tab. 2). 12 Stunden nach der letzten Arzneimittelgabe wurde eine BAL durchgeführt (siehe 3.3.3.). Nach der letzten abendlichen Blutentnahme wurde der Katheter aus der Vene entfernt. Alle weiteren Blutentnahmen bis 48 Stunden nach der letzten Medikamentengabe erfolgten über eine direkte Punktion der V. jugularis.

Im Verlauf des vierten Studientages wurden die Pferde wieder in ihre Laufställe gebracht.

Die zeitliche Studienübersicht ist am Beispiel der 1. Kinetik in Tab. 1 wiedergegeben.

Die 2. und 3. Kinetik schlossen sich mit dem gleichen Ablauf an die Wash-Out-Phase an.

(28)

Tab. 1: Studienübersicht am Beispiel der 1. Kinetik

Kinetik Tag 07:00h 07:00 –

19:00h 19:00h 23:00h

1

1–2

Applikation von R / C / R + C

-

3

BPBC

10 BPAB-Konz.

BPAB-Konz.

BAL

BPAB-Konz.

4 BPAB-Konz. - BPAB-Konz. -

5 BPAB-Konz.

Wash-Out 6–14

R: Rifampicin; C: Clarithromycin; R+C: Rifampicin und Clarithromycin;

AB: Antibiotikum; BPBC: Blutprobe für die Biochemie; BPAB-Konz.: Blutprobe für die Bestimmung der Antibiotika-Konzentration; BAL: Bronchoalveoläre Lavage;

Konz.: Konzentration

3.2.3.2 Blutprobenentnahme für die Bestimmung der Konzentration von Rifampicin und/oder Clarithromycin und der Blutchemie im Plasma Vor der letzen Medikamentengabe, am 3. Tag jeder Kinetik, wurde den Fohlen ein venöser Zugang (Braunüle MT^® Luer Lock, Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland) in die rechte oder linke V. jugularis gelegt, über den an diesem Tag alle Blutentnahmen erfolgten. Der Katheter wurde nach der 13. Blutprobe, ca. 16 Stunden nach seiner Legung, entfernt. Alle nun folgenden Blutentnahmen geschahen über die direkte Punktion einer V. jugularis. Ein Zeitplan der Blutentnahmen ist der Tab. 2 zu entnehmen.

Die erste Blutentnahme erfolgte unmittelbar vor der letzten Medikamentengabe.

Hierfür wurde eine 20 ml Spritze (Injekt^® Luer Solo 20 ml, B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland) mit aufgesetzter Kanüle (BD Microlance^TM, 1,2 mm x 40 mm, Becton Dickinson, Drogheda, Irland) verwendet. 10 ml Blut sind entnommen und anschließend verworfen worden. Daraufhin wurden 20 ml Blut

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gewonnen, welche sofort in fünf schon bereitstehende und beschriftete Lithium- Heparin-Probenröhrchen (Li-Heparin, 4 ml, Sarstedt AG, Nümbrecht, Deutschland) aufgeteilt worden sind. Eine dieser Plasmaproben diente der Bestimmung der blutchemischen Parameter, die vier weiteren wurden für die Bestimmung der Konzentration der jeweils verabreichten Antibiotika im Plasma verwendet. Alle folgenden Blutprobenentnahmen erfolgten in gleicher Weise, allerdings wurden nur 16 ml Blut entnommen und anschließend auf vier Lithium-Heparin-Probenröhrchen verteilt.

Die Blutproben sind sofort für 10 Minuten bei 2100 U/min zentrifugiert worden (Hettich Zentrifuge Universal 32, Hettrich Lab Technology, Tuttlingen, Deutschland).

Anschließend wurde das Plasma abpippetiert und in vier bzw. bei der ersten Blutentnahme fünf beschriftete Cryo-Röhrchen (Cryo‘s, PP, 2 ml, Greiner BIO-ONE GmbH, Frickenhausen, Deutschland) aufgeteilt. Die Plasmaproben wurden bis zur Analyse bei -80 °C eingefroren. Am Ende der Studie wurden die Plasmaproben auf Trockeneis gesammelt zum Labor der Ernst-Moritz-Arndt-Universität in Greifswald transportiert. Hier erfolgte die Bestimmung der Arzneistoffkonzentrationen im Plasma. Die Plasmaproben zur Bestimmung der blutchemischen Parameter wurden bis zur Analyse bei -20 °C gelagert und dann zusammen in einer mit Kühlakkus ausgestatteten Styroporkiste zum Labor der Klinik für Pferde der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover gebracht. Hier wurden diese Proben durch die Autorin mit Hilfe der Trockenchemie auf folgende Parameter untersucht: Harnstoff (Urea) (Vitros^® DT60 II Modul für UREA, Ortho-Clinical Diagnostics GmbH, Neckargemünd, Deutschland), Creatinin (Crea) und Gamma-Glutamyl-Transferase (GGT) (Vitros^® DTSC II Modul für AP, AST, Ca, CREA, LDH, GGT, Ortho-Clinical Diagnostics GmbH, Neckargemünd, Deutschland). Die Elektrolyte Natrium (Na), ionisiertes Calcium (Ca), Kalium (K) und Chlorid (Cl) wurden bestimmt (Radiometer^® ABL800 Flex, Radiometer GmbH, Willich, Deutschland). Mit Hilfe der Nasschemie wurde der Gehalt der Glutamat-Dehydrogenase (GLDH) (Eppendorf Photometer PCP 6121 für GLDH, Netheler & Heinz GmbH, Hamburg, Deutschland) im Plasma bestimmt.

(30)

Tab. 2: Zeitpunkte der Blutentnahmen an Tag 3–5, Tag 17–19 und Tag 31–33 zur Bestimmung der Konzentration von Rifampicin (R) oder Clarithromycin (C) oder Rifampicin und Clarithromycin (R + C) im Plasma

Geringgradige zeitliche Unterschiede bei den einzelnen Blutabnahmen wurden bei der Berechnung der pharmakokinetischen Parameter berücksichtigt

Zeit (h nach Applikation) Entnahmezeitpunkt

0 1

0,33 2

0,66 3

1 4

1,5 5

2 6

2,5 7

3 8

4 9

6 10

8 11

12 + BAL 12

16 13

24 14

36 15

48 16

BAL: Bronchoalveoläre Lavage 3.2.3.3 Bronchoalveoläre Lavage (BAL)

12 Stunden nach der letzten Arzneimittelgabe jeder Kinetik wurde jedes Fohlen einer BAL unterzogen. Bei jedem Fohlen wurden also dementsprechend drei BALs (Tag 3, Tag 17, Tag 31) durchgeführt. Sie dienten der Bestimmung der Konzentration von Rifampicin und/oder Clarithromycin im BAL-Überstand und in den bronchoalveolären Lavage Zellen (BALC).

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Die Probanden wurden zur Durchführung der BAL in Allgemeinanästhesie gelegt.

Hierfür wurden sie mit 0,8 mg/kg Xylazin (Xylazin 2 %^®, Riemser Arzneimittel AG, Greifswald-Insel Riems, Deutschland) intravenös (i. v.) sediert und drei bis fünf Minuten später mit 2,2 mg/kg Ketamin (Ursotamin^® 100 mg/ml, Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Deutschland) i. v. und 0,2 mg/kg Diazepam (Diazepam^® 10 mg Rotexmedica, 5 Ampullen zu 2 ml, Rotexmedica GmbH, Trittau, Deutschland) i. v. in Narkose gelegt. Daraufhin wurden sie auf einer Schaumstoffmatte mit Hilfe von Sandsäcken in Brustlage gebracht.

Die BAL erfolgte durch ein flexibles Endoskop (endoskopische Videoeinheit Tel Pack, Videoendoskop 138XX, Typ SG22-140, Außendurchmesser: 0,9 cm, Länge:

140 cm, Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Deutschland), welches an eine Lichtquelle angeschlossen war (Xenon 1000, Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Deutschland). Die BAL fand bei jedem Fohlen abwechselnd in der rechten und linken Lungenseite statt. Die entsprechende Nüsternseite wurde mit einem Tupfer gereinigt und das Endoskop unter Sichtkontrolle über diese durch den ventralen Nasengang eingeführt. Es wurde soweit vorgeschoben, bis es in einem nach dorsal orientierten Bronchus der zweiten Generation eingekeilt war und diesen somit abdichtete. Nun erfolgten vier Spülvorgänge mit jeweils 100 ml ca. 37 °C warmer phosphatgepufferter Salzlösung (phosphate buffered saline, PBS) (Dulbecco’s PBS (1 x) without Ca &

Mg, PAA Laboratories GmbH, Pasching, Österreich). Hierfür wurden vier 100 ml Spritzen (100 ml BD PlastipakTM, Becton Dickinson, Drogheda, Irland) mit je 100 ml PBS gefüllt und numerisch beschriftet. Der gesamte Inhalt der ersten Spritze wurde über den Arbeitskanal eingegeben, gefolgt von der Instillation von 20 ml Luft und der sofortigen manuellen Aspiration der Spülflüssigkeit. Mit den anderen drei Spritzen wurde sofort folgend ebenso verfahren. Nach Bestimmung des Volumens wurde die erste Fraktion der aspirierten Flüssigkeit verworfen, da hier zu einem großen Anteil nicht repräsentative Zellen aus den Bronchien vermutet wurden.

Die Menge der letzten drei Spritzen wurde vereinigt und das Gesamtvolumen bestimmt. Dieses wurde durch zwei Lagen Mull (Beesana Mullkompressen^® 10 x10 cm, 12-fach, Karl Beese GmbH & Co. KG, Barsbüttel, Deutschland) filtriert, in 50 ml Falcon-Röhrchen (BD Falcon™ Conical Tubes, Becton Dickinson, Drogheda,

(32)

Irland) aufgefangen und die Menge gleichmäßig in diesen verteilt. Die Nativlösung wurde bei 4 °C und 400 x g für 10 Minuten zentrifugiert (Hettich Zentrifuge Universal 32, Hettrich Lab Technology, Tuttlingen, Deutschland). Die Überstände wurden dekantiert und vereint. Hiervon sind acht Portionen (je 1,5–2,0 ml) in acht beschriftete Cryo-Röhrchen (Cryo`s, PP, 2 ml, Greiner BIO-ONE GmbH, Frickenhausen, Deutschland) überführt worden. Dieser BAL-Überstand wurde bis zum nächsten Tag bei -20 °C gelagert und anschließend bei -80 °C eingefroren.

Der restliche Überstand wurde verworfen. Das verbliebene Zellpellet wurde mit 20 ml frischer PBS resuspendiert und unter identischen Bedingungen (4 °C, 400 x g,10 min) zentrifugiert. Hiervon wurde der Überstand ebenfalls verworfen und die vorhandenen Zellen mit 10 ml frischer PBS gewaschen. Aus dieser Suspension sind zwei Objektträger-Zellausstriche zur Zelldifferenzierung angefertigt worden. Sie wurden luftgetrocknet und später durch die Autorin im Labor der Klinik für Pferde der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover nach May-Grünwald gefärbt. Mit Hilfe der Ölimmersion und einer 100er Vergrößerung wurde mikroskopisch der prozentuale Anteil der alveolären Makrophagen, der Lymphozyten, der Mastzellen und der neutrophilen Granulozyten bestimmt.

Die noch verbliebene Zellpellet-Suspension wurde erneut unter identischen Bedingungen zentrifugiert und der Überstand verworfen. Zu den Zellen wurden 6,76 ml PBS hinzugefügt und vermischt. Hiervon sind 1,74 ml in vier beschriftete Cryo-Röhrchen pippetiert worden. Diese wurden bis zum nächsten Tag bei -20 °C gelagert und anschließend bei -80 °C eingefroren. Sie stellten die bronchoalveolären Zellsuspensionen (BAL-Zellsuspensionen) dar und enthielten die BALC. Die Cryo- Röhrchen aller BALs (BAL-Überstand und die BAL-Zellsuspension) wurden zusammen mit den Plasmaproben auf Trockeneis gesammelt zum Labor der Ernst-

Moritz-Arndt-Universität in Greifswald transportiert und dort bis zur Analyse bei -80 °C gelagert.

3.3 Bestimmung der Arzneistoffkonzentration im Plasma, im BAL-Überstand und in den Zellen der bronchoalveolären Lavage

Die Bestimmung der Konzentrationen von Clarithromycin, dessen aktivem Metaboliten 14-Hydroxyclarithromycin (14-OH-Clarithromycin) sowie Rifampicin und

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dessen aktivem Metaboliten 25-O-Desacetylrifampicin erfolgte mit Hilfe einer validierten Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit nachgeschalteter Tandem- Massenspektrometrie (LC-MS/MS) (OSWALD et al. 2011) im GLP-zertifizierten analytischen Labor der Abteilung für Klinische Pharmakologie der Ernst-Moritz-Arndt- Universität Greifswald.

3.3.1 Probenaufarbeitung

3.3.1.1 Ansatz der Stamm- und Arbeitslösungen

Zur Erstellung von Kalibriergeraden und Qualitätskontrollproben wurden Stamm- und Arbeitslösungen mit verschiedenen, bekannten Konzentrationen der zu ermittelnden Analyten hergestellt. Die Verwendung eines internen Standards, hier Roxithromycin, ermöglichte die Beurteilung der Vollständigkeit der Extraktion und die Konzentrationsberechnung der zu bestimmenden Substanz. Roxithromycin ist mit Clarithromycin chemisch verwandt und besitzt ähnliche Eigenschaften bei der Extraktion, der chromatographischen Trennung und der Detektion.

Es wurde jeweils eine Stammlösung für Clarithromycin, Rifampicin, 25-O-Desacetylrifampicin und Roxithromycin mit einer Konzentration von 20 µg/ml

durch die Zugabe von je 2 mg des entsprechenden Analyten in 100 ml einer Ammoniumacetat-Acetonitril-Lösung hergestellt. Aus der entsprechenden Stammlösung bzw. der nächstfolgend produzierten Arbeitslösung und einer Ammoniumacetat-Lösung (50 mM, 1+9) wurden jeweils drei Arbeitslösungen für Clarithromycin, Rifampicin und 25-Desacetylrifampicin mit den Konzentrationen 2 µg/ml, 200 ng/ml und 20 ng/ml angefertigt. Für den internen Standard Roxithromycin sind zwei Arbeitslösungen (2 µg/ml und 200 ng/ml) durch die Verdünnung mit einer Ammoniumacetat-Lösung (50 mM, 1+9 und 1+99) angefertigt worden.

3.3.1.2 Ansatz und Aufarbeitung der Kalibratoren und Qualitätskontrollen

Zur Berechnung der Konzentration der zu bestimmenden Substanzen benötigte man eine Kalibrationsgerade, welche die Substanz in definierten Konzentrationen enthält.

Kalibratoren werden hergestellt, indem einer der biologischen Matrix entsprechenden

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Lösung ansteigende Konzentrationen der bekannten Arzneistoffe zugesetzt werden.

Als jeweils biologische Leermatrix für die hier zu untersuchenden Fohlenplasma-, BAL-Überstand- und BAL-Zellsuspensionsproben diente humanes Plasma, BAL- Puffer (Dubelloco PBS-Puffer) und BAL-Zellimitat (humane Monozyten der THP-1 Zelllinie). Aus den entsprechenden Arbeitslösungen von Clarithromycin, Rifampicin und 25-Desacetylrifampicin sind jeweils sieben (2,5-25 ng/ml für den unteren Konzentrationsbereich) und sechs (25-250 ng/ml für den oberen Konzentrationsbereich) Kalibratoren hergestellt worden. Kalibratoren und Originalproben wurden einem identischen Prozedere der Probenaufbereitung und LC-MS/MS-Vermessung unterzogen. Die unbekannte Konzentration der Probandenprobe ließ sich anschließend anhand der nach linearer Regression erhaltenen Kalibrationsgeraden berechnen.

Die Zuverlässigkeit der ermittelten Messwerte wurde während aller Messungen mittels der Analyse von Qualitätskontrollproben (QK) sichergestellt. QK stellen Proben dar, welche den Arzneistoff im unteren (hier 5, 10 und 25 ng/ml) und oberen (hier 50, 100 und 250 ng/ml) Konzentrationsbereich enthalten. Diese definierten QK wurden in eine Analysereihe eingefügt und unter den gleichen Bedingungen wie die Probandenproben analysiert.

3.3.1.3 Aufbereitung der Plasmaproben, des BAL-Überstandes und der BAL- Zellsuspension

Alle Proben sind unverdünnt bis zur Verarbeitung bei -80°C gelagert worden. Am Tag der Probenbearbeitung wurden die entsprechenden Messproben bei Raumtemperatur aufgetaut und wie folgt weiterverarbeitet:

Zur Aufbereitung des Pferdeplasmas, des BAL-Überstands und der BAL- Zellsuspension wurde eine Flüssig-Flüssigextraktion durchgeführt. Bei der BAL- Zellsuspension wurde initial ein Lyseschritt vollzogen. Hierfür sind 0,2 ml dieser Probe nach Verdünnung mit BAL-Puffer (1+9 und 1+39) mit 25 µl einer 2 %igen SDS (Natriumdodecylsulfat) Lösung versetzt und fünf Minuten bei Raumtemperatur im Ultraschallbad inkubiert worden. Anschließend sind je 0,2 ml aller Proben (Plasma, BAL-Überstand, BAL-Zellsuspension) unverdünnt und verdünnt (mit Leerwertplasma, BAL-Puffer oder Zelllysat (1+9)) mit 0,3 ml Ammoniumacetat-Lösung (50 mM, pH

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5,5), jeweils 25 µl einer Arbeitslösung der internen Standards und 50 µl einer 0,2 % igen Natriumazid-Lösung versetzt und intensiv gemischt worden. Die anschließende Extraktion erfolgte im Horizontalschüttler nach Zugabe von 5 ml tertiärem Butylmethylether und einer 1 % igen Butylhydroxytoluol-Lösung. Dabei gelangten die Analyten in Abhängigkeit ihrer lipophilen Eigenschaften in unterschiedlichem Ausmaß aus der Plasmaphase in die Etherphase. Anschließend wurden die Probenröhrchen zentrifugiert (2 min, 4000 U/min), die organische Phase abgehoben und diese bei Raumtemperatur im Luftstrom bis zur Trockne eingedampft. Die eingetrocknete Substanz wurde in 100 µl einer Mischung aus Acetonitril und 0,1 % iger Ameisensäure (1+2) aufgenommen und in Probengefäße überführt.

3.3.2 Flüssigkeitschromatographie (LC) mit nachgeschalteter Tandem- Massenspektroskopie (MS/MS-System)

Die analytische Untersuchung der Proben wurden mit dem HPLC-System Agilent 1100 (Agilent Technologies, Waldbronn, Deutschland), welches an das Tandem- Massenspektrometer MDS Sciex API 4000 (AB Sciex, Darmstadt, Deutschland) unter Nutzung des Turbolon^® Interface gekoppelt war, durchgeführt.

Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (high performance liquid chromatography, HPLC) ist ein Verfahren der Säulen-Flüssigkeitschromatographie.

Durch Verteilung zwischen einer ruhenden stationären Phase (Trennsäule) und einer sich bewegenden mobilen Phase (Eluationsgemisch) werden einzelne Substanzen eines Substanzgemisches voneinander getrennt. In diesem Fall wurde die Probenflüssigkeit isokratisch mittels einer flüssigen Phase (45 % Ammoniumacetat- Puffer (25 mM, pH 4) und 55 % Acetonitril) mit einer Flussrate von 200 µl über die stationäre Phase (XTerra MS, 100 x 2,1 mm, 3,0 µm, Waters, Milford, USA) transportiert. Vor der auf 40 °C temperierten Trennsäule befand sich zusätzlich ein 0,5 µm Mikrofilter (PEEK, Supelco, Bellefonte, USA), um partikuläre Verunreinigungen abzufangen. Zwischen Pumpe und Trennsäule befand sich ein auf 10 °C gekühlter Probengeber, aus dem die Proben mit einem Probenvolumen von 5 µl über das chromatographische System injiziert wurden.

(36)

Gemäß ihrer unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften verließen die Analyten die analytische Säule zu unterschiedlichen Zeitpunkten, jeweils abhängig von der Wechselwirkung zwischen der mobilen Phase und der stationären Phase.

Die anschließende Detektion der Substanzen erfolgte im MS/MS-System, in der zu Beginn die Probenflüssigkeiten in den gasförmigen Zustand überführt wurden. Die Massenspektrometrie (MS) ist eine Analysetechnik zur Bestimmung der Molekülmasse freier Ionen im Hochvakuum. Sie beruht auf der Möglichkeit, Ionen nach ihrem Masse-zu-Ladung-Verhältnis (m/z) aufzutrennen. Um die Selektivität zu erhöhen, besteht das MS/MS-System aus zwei hintereinander geschalteten Massenspektrometern (Tandem MS), wobei das Erste die Muttersubstanz und das Zweite dessen spezifisches Ionenprodukt ermittelt.

Clarithromycin, Rifampicin, 25-O-Desacetylrifampicin, 14-OH-Clarithromycin und der interne Standard Roxithromycin wurden anhand ihrer unterschiedlichen Massenübergänge nach Ionisation und Fragmentierung der Mutterionen in die substanzspezifischen Tochterionen im positiven Ionisationsmodus detektiert.

Folgende m/z Übergänge wurden zur Quantifizierung verwendet: Clarithromycin:

748,5  590,1; Rifampicin: 821,1  789,2; 25-O-Desacetylrifampicin: 779,1  747,1; Roxithromycin: 837,3  679,2; 14-OH-Clarithromycin; 764,1  606,1.

Alle Chromatogramme wurden nach der internen Standardmethode über die jeweiligen Peakflächen ausgewertet. Die Berechnung der Konzentrationen erfolgte über die entsprechenden Peakflächen-Verhältnisse zwischen Analyt und dem internen Standard mit 1/x gewichteter linearer Regression online mit der validierten Software „Analyst 1.4“ (AB Sciex, Darmstadt, Deutschland). Da 14-OH- Clarithromycin nicht käuflich zu erwerben war, erfolgte die Konzentrationsbestimmung dieses Metaboliten in den Proben indirekt anhand der Kalibrationsgeraden für Clarithromycin unter Anwendung des Korrekturfaktors 1,687, welcher zuvor anhand der Muttersubstanz bestimmt wurde.

3.3.3 Berechnung der Arzneistoffkonzentrationen in den BALC

Die bei der BAL gewonnene Zellsuspension enthielt neben den BALC auch eine bestimmte Menge an frischem PBS. Daher spiegeln die bei der LC-MS/MS erhaltenen Konzentrationen der Analyten in der Zellsuspension nicht die

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Konzentrationen in den BALC alleine wieder. Diese Konzentration in den BALC ist allerdings entscheidend für die Aussage einer intrazellulären Konzentration der Arzneimittel. Dazu wurden folgende Berechnungsschritte angesetzt:

Zur Berechnung der Konzentration in den BALC in ng pro Gigazelle (CBALC(ng/GZ)) benötigte man die Konzentration des Arzneimittels in der Zellsuspension (CAM ZS) in ng pro ml und die Anzahl der gezählten Zellen (Z) pro ml, bezogen auf 1 Gigazelle:

Um die Arzneimittelkonzentration in den BALC mit den Arzneimittelkonzentrationen im Plasma und der Pulmonary Epithelial Lining Fluid (PELF) vergleichen zu können, erfolgte die Umrechnung auf eine Konzentration in ng pro ml. Hierfür wurde angenommen, dass bronchoalveoläre Zellen von Fohlen ein Volumen von 1,20 ml/GZ einnehmen (JACKS et al. 2001):

3.3.4 Bestimmung des Volumens der PELF

Die Ermittlung des Volumens der PELF erfolgte nach der Berechnung von RENNARD et al. (1986) auf Grundlage der Harnstoffbestimmung in Plasma und Spülflüssigkeit. Diese Methode beruht darauf, dass die Harnstoffkonzentrationen im Plasma und PELF gleich sind, da Harnstoff frei diffundiert. Durch Abnahme der Harnstoffkonzentration in der BAL-Flüssigkeit lässt sich der Verdünnungsfaktor für die PELF bestimmen und daraus das Volumen berechnen.

Die Harnstoffbestimmung im Plasma und der BAL-Flüssigkeit wurde im Labor der Klinik für kleine Klauentiere (Leitung Herr Prof. M. Ganther) an der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover durchgeführt.

Daraufhin ließ sich das Volumen der PELF rechnerisch bestimmen:

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V: Volumen; PELF: Pulmonary Epithelial Lining Fluid; Urea: Harnstoff; BALF:

bronchoalveoläre Lavage Flüssigkeit

3.3.5 Berechnung der Arzneistoffkonzentrationen in der PELF

Die Konzentration von Clarithromycin, 14-OH-Clarithromycin, Rifampicin und 25-O- Desacetylrifampicin in der PELF erfolgte wie folgt rechnerisch:

C: Konzentration des jeweiligen Arzneimittels; PELF: Pulmonary Epithelial Lining Fluid; V: Volumen; BALF: bronchoalveoläre Lavage-Flüssigkeit

3.3.6 Bestimmung pharmakokinetischer Parameter

Die ermittelten Konzentrationen der eingesetzten Antibiotika wurden in einer Konzentrations-Zeit-Kurve aufgetragen und verschiedene Parameter aus deren Verläufen berechnet. Die maximale (Cmax) und minimale (Cmin) Arzneistoff- konzentration und die Zeit bis zum Erreichen der maximalen Arzneistoff- konzentration (tmax) wurden aus der Konzentrations-Zeit-Kurve abgelesen.

Die Berechnung der Gesamtfläche unter der Konzentrations-Zeit-Kurve („area under the curve“, AUC) als Maß für die Gesamtkonzentration des Arzneistoffes im Organismus erfolgte mit der Trapezregel, wobei jeweils die Trapezfläche zwischen zwei Messpunkten bestimmt wurde.

Die Berechnung der durchschnittlichen Plasmakonzentration über den Zeitraum von 12 Stunden (Cav) erfolgt auf Grundlage der AUC0-12h, welche durch das Dosierungsintervall (12 Stunden) dividiert wurde.

Die Eliminationshalbwertszeit (t1/2) gibt die Zeit an, in der die Konzentration des Antibiotikums auf die Hälfte seines ursprünglichen Wertes abgesunken ist. Sie wurde mit Hilfe der Eliminationskonstanten bestimmt, welche aus der Steigung einer logarithmisch dargestellten Konzentrations-Zeit-Geraden berechnet wurde.

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Aus allen enthaltenen Einzelwerten dieser pharmakokinetischen Parameter wurden die Mittelwerte und die Standardabweichungen berechnet.

Die statistische Auswertung erfolgte mit Hilfe des WILCOXON-Tests, wobei die Unterschiede zwischen den Kinetiken mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p≤0,05 als signifikant angesehen wurden.

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Ergebnisse

4 Ergebnisse

4.1 Auftreten von Nebenwirkungen

Keines der an dieser Studie beteiligten Fohlen zeigte während der Studie und in den Tagen danach unerwünschte Arzneimittelwirkungen. Die durchgeführten BALs hatten keinerlei negative Auswirkungen auf die Fohlen. Ebenso konnten bei den Mutterstuten im Verlauf der Studie keine Beeinträchtigungen festgestellt werden.

Bei der chromatographischen Untersuchung der PELF und der BALC stellten sich die Proben von Fohlen Nr. 5 nach der Monotherapie mit Clarithromycin als verunreinigt heraus und konnten nicht verwendet werden. Um die Konzentrationen von Clarithromycin und seinem Metaboliten in den Lungenkompartimenten der Fohlen nach dieser Monotherapie statistisch mit denen nach der Kombinationstherapie in Beziehung zu setzten, fließen in diese beiden Kinetiken in vergleichender Betrachtung nur die Daten von acht Fohlen (n=8; ohne Nr. 5) ein. Alle weiteren Untersuchungen der Plasma- und BALF-Proben beinhalten die Daten aller neun Fohlen (n=9).

4.2 Volumen der zurückgewonnenen bronchoalveolären Lavage Flüssigkeit (BALF) und der PELF

Die Volumina der zurückgewonnen BALF der BALs zeigten keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Therapieformen.

Nach der Eingabe von 4 x 100 ml PBS-Lösung sind nach der Monotherapie mit Clarithromycin zwischen 190 und 306 ml Gesamtmenge an BALF zurückgewonnen worden. Dies entspricht einem durchschnittlichen Anteil von 60,4 ± 9,49 % der instillierten PBS-Lösung. Nach der Monotherapie mit Rifampicin lag das zurückgewonnene Gesamtvolumen von acht Fohlen bei 141 bis 301 ml (58,3 ± 13,6 %). Von einem Fohlen (Nr. 8) wurde nach der Eingabe von 400 ml ein geringes Volumen zurückgewonnen. Durch die Eingabe von zusätzlichen 100 ml PBS-Lösung (Gesamtmenge 5 x 100 ml) betrug das Gesamtvolumen für dieses Fohlen 126 ml (25,2 %) und die erste Fraktion wurde hier nicht verworfen. Nach der Kombinationstherapie mit Clarithromycin und Rifampicin variierte das