Einfluss von Rifampicin auf die Pharmakokinetik und pulmonale Verteilung von Clarithromycin nach simultaner und verzögerter
Verabreichung bei gesunden Fohlen
INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
– Doctor medicinae veterinariae – (Dr. med. vet.)
vorgelegt von Lena Spieckermann
Preetz / Plön
Hannover 2014
Hannover
1. Gutachterin: Dr. Dr. habil. Monica Venner, Ph.D, Dipl. of ECIEM Klinik für Pferde
2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. M. Kietzmann
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie, Tierärztliche Hochschule Hannover
Tag der mündlichen Prüfung: 28.04.2014
Meiner Familie –
Danke für alles
1 Einleitung
... 12 Literaturübersicht
... 32.1 Rhodococcus equi-Pneumonie ... 3
2.2 Therapie der Rhodococcose und die verwendeten Antibiotika 5 2.3 Transportmechanismen ... 11
3 Material und Methoden
... 173.1 Probanden ... 17
3.1.1 Haltungsbedingungen der Fohlen ... 17
3.1.2 Einschlusskriterien ... 17
3.2 Methoden ... 18
3.2.1 Untersuchung der Fohlen ... 18
3.2.1.1 Allgemeine und spezielle Untersuchung ... 18
3.2.1.2 Bestimmung der Blutleukozytenzahl ... 18
3.2.1.3 Sonographische Untersuchung der Lunge ... 19
3.2.2 Wiegen der Fohlen ... 19
3.3 Studiendesign ... 19
3.3.1 Allgemeiner Aufbau der Studie ... 19
3.3.1.1 Untersuchung und Wiegen der Fohlen ... 21
3.3.1.2 Verabreichung der Antibiotika ... 21
3.3.1.3 Blutentnahmen und bronchoalveoläre Lavage ... 22
3.3.2 Blutprobenentnahme für die Bestimmung der Konzentrationen ... von Rifampicin, Clarithromycin und deren Metabolite im Plasma .... 23
3.3.3 Bronchoalveoläre Lavage ... 26
3.4 Analytische Untersuchung der Proben ... 28
3.4.1 Aufbewahrung und Aufarbeitung der Proben ... 28
3.4.1.1 Herstellung der Stamm- und Arbeitslösungen ... 28
3.4.1.2 Ansatz und Aufarbeitung der Kalibratoren und ... Qualitätskontrollen ... 29
3.4.1.3 Aufbereitung der Plasmaproben, der bronchoalveolären ... Zellen (BALC) und des BAL-Überstandes ... 31
3.4.2 Flüssigkeitschromatographie (LC) mit nachgeschalteter ... Tandemmassenspektroskopie (MS/MS-System) ... 32
3.4.3 Bestimmung des Volumens der pulmonary epithelial ... lining fluid (PELF) ... 34
3.4.3.1 Berechnung der Arzneimittelkonzentration in der PELF ... 35
3.4.4 Berechnung der Arzneimittelkonzentration in den BALC ... 36
3.4.5 Bestimmung und statistische Auswertung der pharmako- ... kinetischen Parameter ... 37
4 Ergebnisse
... 39 4.1 Nebenwirkungen durch die Antibiotika ... 39 4.2 Differenzialzellbild der BALC ... 39 4.3 Volumen der zurückgewonnenen broncho- ...alveolären Lavageflüssigkeit (BALF) sowie der PELF ... 39 4.4 Konzentrationen der Antibiotika und ihrer Metabolite ...
im Plasma ... 40 4.4.1 Konzentrationen von Clarithromycin und 14-OH-Clarithromycin ...
im Plasma nach intravenöser Gabe ... 40 4.4.2 Konzentrationen von Clarithromycin und 14-OH-Clarithromycin ...
im Plasma nach Monotherapie ... 41 4.4.3 Konzentrationen von Clarithromycin und 14-OH-Clarithromycin ...
im Plasma nach kombinierter Gabe mit Rifampicin ...
bei zeitgleicher Applikation ... 43 4.4.4 Konzentrationen von Clarithromycin und 14-OH-Clarithromycin ...
im Plasma nach kombinierter Gabe mit Rifampicin ...
bei zeitversetzter Applikation ... 45 4.4.5 Konzentrationen von Rifampicin und 25-O-Desacetylrifampicin ...
im Plasma nach kombinierter Gabe mit Clarithromycin ...
bei zeitgleicher Applikation ... 50 4.4.6 Konzentrationen von Rifampicin und 25-O-Desacetylrifampicin ...
im Plasma nach kombinierter Gabe mit Clarithromycin ...
bei zeitversetzterApplikation ... 53
4.5 Konzentrationen der Antibiotika und ihrer Metabolite ...
in der PELF ... 56 4.5.1 Konzentrationen von Clarithromycin und 14-OH-Clarithromycin ...
in der PELF nach Monotherapie ... 56 4.5.2 Konzentrationen von Clarithromycin und 14-OH-Clarithromycin ...
in der PELF nach kombinierter Gabe mit Rifampicin ...
bei zeitgleicher Applikation ... 56 4.5.3 Konzentrationen von Clarithromycin und 14-OH-Clarithromycin ...
in der PELF nach kombinierter Gabe mit Rifampicin ...
bei zeitversetzter Applikation ... 57 4.5.4 Konzentrationen von Rifampicin und 25-O-Desacetylrifampicin ...
in der PELF nach kombinierter Gabe mit Clarithromycin ...
bei zeitgleicher Applikation ... 59 4.5.5 Konzentrationen von Rifampicin und 25-O-Desacetylrifampicin ...
in der PELF nach kombinierter Gabe mit Clarithromycin ...
bei zeitversetzter Applikation ... 60 4.6 Konzentrationen der Antibiotika und ihrer Metabolite ...
in den BALC ... 62 4.6.1 Konzentrationen von Clarithromycin und 14-OH-Clarithromycin ...
in den BALC nach Monotherapie ... 62 4.6.2 Konzentrationen von Clarithromycin und 14-OH-Clarithromycin ...
in den BALC nach kombinierter Gabe mit Rifampicin ...
bei zeitgleicher Applikation ... 62
4.6.3 Konzentrationen von Clarithromycin und 14-OH-Clarithromycin ...
in den BALC nach kombinierter Gabe mit Rifampicin ...
bei zeitversetzter Applikation ... 63
4.6.4 Konzentrationen von Rifampicin und 25-O-Desacetylrifampicin ... in den BALC nach kombinierter Gabe mit Clarithromycin ... bei zeitgleicher Applikation ... 65
4.6.5 Konzentrationen von Rifampicin und 25-O-Desacetylrifampicin ... in den BALC nach kombinierter Gabe mit Clarithromycin ... bei zeitversetzter Applikation ... 66
4.7 Ratios ... 67
4.7.1 CPELF/CPlasma12h ... 67
4.7.1.1 Clarithromycin und 14-OH-Clarithromycin ... 67
4.7.1.2 Rifampicin und 25-O-Desacetylrifampicin ... 69
4.7.2 CBALC/CPlasma12h ... 71
4.7.2.1 Clarithromycin und 14-OH-Clarithromycin ... 71
4.7.2.2 Rifampicin und 25-O-Desacetylrifampicin ... 73
4.7.3 CBALC/CPELF... 74
4.7.3.1 Clarithromycin und 14-OH-Clarithromycin ... 74
4.7.3.2 Rifampicin und 25-O-Desacetylrifampicin ... 77
4.8 Konzentrationen von Cholesterol und 4ß-Hydroxycholesterol sowie deren Ratio ... 78
5 Diskussion
... 815.1 Probanden ... 81
5.2 Studiendesign ... 82
5.3 Nebenwirkungen von Clarithromycin und Rifampicin ... 83
5.4 Auswertungen der Zellzahl, der bronchoalveolären Flüssig- ... keit, der pulmonary epithelial lining fluid und der Zell- ... differenzierung ... 83
5.5 Konzentrationen von Clarithromycin und ... 14-OH-Clarithromycin im Plasma von Fohlen ... 84
5.6 Konzentrationen von Rifampicin und ... 25-O-Desacetylrifampicin im Plasma von Fohlen ... 88
5.7 Verteilung und pulmonale Penetration der ... Antibiotika und ihrer Metabolite ... 89
5.7.1 Distribution und pulmonale Penetration von Clarithromycin ... und 14-OH-Clarithromycin nach Monotherapie ... 89
5.7.2 Distribution und pulmonale Penetration von Clarithromycin ... und 14-OH-Clarithromycin nach Kombinationstherapie ... 90
5.7.3 Distribution und pulmonale Penetration von Rifampicin ... und 25-O-Desacetylrifampicin nach Kombinationstherapie ... 92
5.7.4 Einfluss von Rifampicin auf Clarithromycin nach kombinierter ... Gabe bei zeitgleicher und zeitversetzter Applikation ... 93
5.7.5 Einfluss von Clarithromycin auf Rifampicin nach kombinierter ...
Gabe bei zeitgleicher und zeitversetzter Applikation ... 94
5.8 Schlussfolgerungen ... 95
6 Zusammenfassung
... 977 Summary
... 998 Literaturverzeichnis
... 1019 Anhang
... 120Abbildungsverzeichnis
... 164Tabellenverzeichnis
... 169Danksagung
... 178Abkürzungsverzeichnis
Abb Abbildung
ABC ATP-binding cassette
ACN Acetonitril
ad us. vet. ad usum veterinarium (zum tierärztlichen Gebrauch)
ATP Adenosintriphosphat
AMPs Antimicrobial Peptides (antimikrobielle Peptide) AUC area under the curve (Gesamtkonzentration des
Arzneistoffes im Organismus)
BAL Bronchoalveoläre Lavage
BALF bronchoalevoläre Lavageflüssigkeit BALC bronchoalveoläre Lavage Zellen BCRP breast cancer resistance protein b. i. d. bis in die (zweimal am Tag)
bzw. beziehungsweise
°C Grad Celsius
C Konzentration
ca. circa (ungefähr)
Ca Calcium
Cav durchschnittliche Plasmakonzentration über einen Zeitraum von 12 Stunden
CLR Clarithromycin
cm Zentimeter
Cmax Maximalkonzentration
Cmin Minimalkonzentration
CYP3A4 Cytochrom P450 3A4 Enzym
DEFA1 Defensin alpha 1
DNA Desoxyribonukleinsäure
eCATH1 horse cathelicidin
EDTA Ethylendiamintetraacetat
EHV Equines Herpes Virus
et al. et alii (und andere)
g Gramm
GLP good laboratory practice
GZ Gigazelle
HEK human embryonic kidney
HPLC high performance liquid chromatographie (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie )
IE internationale Einheiten
i. v. intravenös
kg Kilogramm
LC-MS/MS Flüssigkeitschromatographie mit nachgeschalteter Tandem-Massenspektrometrie
mg Milligramm
Mg Magnesium
MHz Megaherz
MHK90 Minimale Hemmstoffkonzentration, bei der 90% der Erreger abgetötet werden
ml Milliliter
mM Millimolar
MS Massenspektrometrie
M. tuberculosis Mycobacterium tuberculosis
m/z Masse-zu-Ladung-Verhältnis
μg Mikrogramm
μl Mikroliter
ng Nanogramm
OATPs organic anion-transporting peptides
PAE postantibiotische Effekte
PAR Peak-Area-Ratio
PELF Pulmonary Epithelial Lining Fluid
P-gp P-glycoprotein, ABCB1
pH potentia Hydrogenii (Stärke des Wasserstoffs)
p. o. per os
PBS phosphate buffered saline
PXR pregnane X receptor
QK Qualitätskontrolle
RIF Rifampicin
R. equi Rhodococcus equi
RNA Ribonukleinsäure
S. zooepidemicus Streptococcus zooepidemicus
SLC Solute Carrier
s. o. siehe oben
Tab. Tabelle
Tmax Zeit bis zum Erreichen der Maximalkonzentration
t1/2 Eliminationshalbwertszeit
U Umdrehungen
u. a. unter anderem
Urea Harnstoff
V Volumen V. jugularis Vena jugularis
Z Zelle
4ß-OH-Cholesterol 4beta-Hydroxycholesterol 14-OH-Clarithromycin 14-Hydroxyclarithromycin
Einleitung 1
In der Fohlenaufzucht führen Durchfall- und Atemwegserkrankungen immer wieder zu großen Verlusten. Aufgrund einer sehr hohen Morbidität sowie Mortalität spielt die durch Rhodococcus equi (R. equi) verursachte Pneumonie eine bedeutende wirtschaftliche Rolle und führt unbehandelt häufig zu Todesfällen bei Fohlen.
R. equi ist ein gram positives, fakultativ intrazelluläres Bakterium und der häufigste Erreger von schweren bis tödlichen Pneumonien beim Fohlen. Die höchste Krankheitsrate liegt in einem Alter zwischen zwei und zwölf Wochen, die Fohlen erkranken allerdings bis zu einem Alter von sechs bis sieben Monaten. Das als Rhodococcose bezeichnete Krankheitsbild äußert sich vornehmlich als abszedierende chronische Bronchopneumonie, seltener kann sich auch eine ulzerative Enteritis sowie Lymphadenitis entwickeln (JOHNSON et al., 1983). Die Erkrankung kann sporadisch auftreten, zeigt sich aber vor allem auf Gestüten endemisch mit einer Morbiditätsrate von 5 bis 17 % und einer Mortalitätsrate von 40 bis 80 %.
Das Bakterium ist in der Lage, der Abwehr durch die körpereigenen Makrophagen zu widerstehen und so der Immunantwort des Wirtes zu entgehen. Nach der Phagozytose durch die Alveolarmakrophagen verhindert R. equi die Fusion von Phagosom und Lysosom, wodurch sich der Erreger weiter vermehren und die Makrophagen zerstören kann (HONDALUS u. MOSSER, 1994). Dadurch kommt es zur Freisetzung von weiteren Pathogenen. Die Therapie der Wahl ist eine Kombination aus Rifampicin (RIF) und einem Makrolidantibiotikum, bedingt durch die Eigenschaften beider Medikamente in die Makrophagen einzudringen und intrazelluläre Erreger abzutöten. Durch die Anwendung von Rifampicin zusammen mit Erythromycin konnte in den 80er Jahren die Überlebensrate von an Pneumonie erkrankten Fohlen um bis zu 80 % erhöht werden (HILLIDGE, 1987; SWEENEY et al., 1987). Mittlerweile wurde Erythromycin aufgrund seiner Nebenwirkungen größtenteils durch neuere Makrolide wie Azithromycin, Tulathromycin und Clarithromycin (CLR) abgelöst.
Es ist bekannt, dass Rifampicin ein potenter Induktor metabolischer Enzyme und von Transportproteinen ist und die Wirkung anderer Medikamente abschwächen, aber auch verstärken kann. Bei kurzzeitiger, kombinierter Gabe von Clarithromycin mit Rifampicin beim Fohlen in therapeutischen Dosen kommt es gegenüber einer Monotherapie mit Clarithromycin zu einer Minderung der Konzentration des Clarithromycins im Plasma sowie in den Zellen der bronchoalveolären Lavage (BALC) und in der pulmonary epithelial lining fluid (PELF). Diese verminderte Konzentration ist vor allem auf die Reduktion der Bioverfügbarkeit von Clarithromycin zurückzuführen (PETERS et al., 2012). Bei chronischer Gabe mit Rifampicin verringert sich die Bioverfügbarkeit um bis zu 90 %, so dass die minimale Hemmstoffkonzentration (MHK) im Plasma für R. equi nicht mehr erreicht wird (PETERS et al., 2011).
Es ist in der Antibiotikatherapie von erheblicher Bedeutung, dass die minimale Hemmstoffkonzentration überschritten wird, um ein Abtöten der Bakterien und somit eine möglichst erfolgreiche Behandlung zu gewährleisten. Bei Lungenerkrankungen, die durch intrazelluläre Erreger verursacht werden, spielt die Konzentration der Antibiotika vor allem in den BALC eine Rolle, da sich der Erreger vorwiegend in diesem Kompartiment aufhält. Aber auch die Konzentrationen im Blut sind von Bedeutung, da es möglicherweise zu einer Streuung der Erreger über die Blutbahn in andere Organe oder in die Gelenke kommen kann. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, zu untersuchen, ob die Bioverfügbarkeit von Clarithromycin erhalten bleibt, wenn das Fohlen das Clarithromycin bei der Kombinationstherapie um vier Stunden zeitversetzt zum Rifampicin oral verabreicht bekommt. Sollte sich zeigen, dass es weiterhin zu einer drastischen Abnahme der Konzentrationen von Clarithromycin im Plasma, vor allem aber in den BALC kommt, müsste die Kombination von Rifampicin mit Clarithromycin in der Therapie der Rhodococcose überdacht werden.
Literaturübersicht 2
2.1 Rhodococcus equi-Pneumonie
R. equi ist ein weltweit ubiquitär vorkommender Keim, der sich vor allem im Boden befindet (BARTON u. HUGHES, 1984; TAKAI et al., 1986) und über die Luft übertragen wird. Die Infektion der Fohlen findet häufig bereits in den ersten Lebenswochen statt, indem diese den Erreger als Aerosol aufnehmen (MARTENS et al., 1982; COHEN et al., 2013). Die frühere Annahme, dass sich die Fohlen durch Koprophagie infizieren, konnte von PRESCOTT et al. (1980) durch orale Infektionsversuche nicht bestätigt werden. Die Luft in den Ställen und Paddocks ist durch infektiösen Nasenausfluss und fäkalen Staub kontaminiert und die Fohlen selber geben virulente R. equi-Isolate mit der Atemluft ab (MUSCATELLO et al., 2006). Indem Fohlen das eigene infizierte Sputum hochhusten und nachfolgend abschlucken, gelangt der Erreger in den Darmtrakt, ist in der Lage sich dort zu vermehren und wird mit dem Kot wieder ausgeschieden (BARTON u. HUGHES, 1984). Auch in frisch ausgeschiedenem Fohlenkot ist der Erreger in der Lage, sich zu vermehren (HUGHES u. SULAIMAN, 1987). TAKAI et al. (1991) zeigen, dass das Umfeld endemisch betroffener Zuchtbetriebe stark mit virulentem R. equi kontaminiert ist, während die Umgebung auf Gestüten ohne R.- equi-Vorgeschichte nur leichte Verunreinigungen aufweist.
Die Pneumonie, verursacht durch R. equi, tritt sowohl sporadisch, als auch endemisch auf vielen Gestüten auf und kann zu hohen wirtschaftlichen Verlusten führen. Dabei besteht eine Beziehung zwischen der Tierdichte auf den Gestüten und der Erkrankungsrate (COHEN et al., 2005), und die Prävalenz liegt bei bis zu 21 % (MUSCATELLO et al., 2006). Ein rechtzeitiger Therapiebeginn wird häufig erschwert, da chronisch erkrankte Fohlen die Lungenveränderungen sehr gut kompensieren können (GIGUÈRE u. PRESCOTT, 1997) und über einen langen Zeitraum klinisch unauffällig bleiben. Außerdem lassen sich die klinischen Symptome einer chronischen Rhodococcose nicht von denen anderer Lungenerkrankungen unterscheiden. Daher wird gerade in endemisch betroffenen Gebieten und Gestüten ein gezieltes Fohlenmonitoring empfohlen, welches unter anderem aus regelmäßigen
klinischen Untersuchungen, Bestimmung der Blutleukozytenzahl und einer ultrasonographischen und/oder röntgenologischen Untersuchung der Lunge besteht (COHEN et al., 2000). Die Fohlen erkranken bis zu einem Alter von sieben Monaten, wobei es im Alter von vier bis zwölf Wochen vermehrt zu Todesfällen kommt.
Frühe Anzeichen einer Erkrankung können erhöhte Atemfrequenz oder mildes Fieber sein (FALCON et al., 1985). Die akute Form äußert sich durch verminderten Appetit, Lethargie, erhöhte Atemfrequenz und pumpende Atmung. Husten und muköser bis purulenter Nasenausfluss treten sporadisch auf (GIGUÈRE u. PRESCOTT, 1997).
Die typische Manifestation von R. equi ist eine chronische pyogranulomatöse Bronchopneumonie, die durch Abszessbildung in der Lunge gekennzeichnet ist (ZINK et al., 1986). Diese Abszesse können solitär oder auch zahlreich in verschiedenen Regionen der Lunge anzufinden sein. Extrapulmonale Symptome treten selten auf. Es zeigen sich zusätzlich zu den Veränderungen in der Lunge Polysonivitiden, mesenteriale Lymphadenitiden oder Enteritiden (JOHNSON et al., 1983; CHAFFIN u. MARTENS, 1997). Bei der seltener auftretenden subakuten Form versterben die Fohlen plötzlich oder fallen mit akuter Atemnot auf. Sie zeigen eine stark erhöhte Atemfrequenz, weit geblähte Nüstern, pumpende Atmung, Fieber bis zu 41,5°C und häufig versterben diese Fohlen trotz einer sofortigen und aggressiven Behandlung (GIGUÈRE u. PRESCOTT, 1997). Auf Organebene äußert sich die subakute Form als interstitielle Pneumonie mit miliaren, pyogranulomatösen Veränderungen der Lunge (MARTENS et al., 1982). Adulte Pferde erkranken in der Regel nicht an einer Rhodococcose, sie können den Erreger allerdings im Gastrointestinaltrakt tragen und scheiden ihn somit auch aus (BARTON u. HUGHES, 1984).
2.2 Therapie der Rhodococcose und die verwendeten Antibiotika
Für die Therapie der Rhodococcose stehen nur wenige Wirkstoffe zur Verfügung, da die meisten Arzneimittel, die in vitro wirksam sind in vivo keinen Behandlungserfolg zeigen. Obwohl viele Antibiotika, unter anderem Ampicillin, Gentamicin und Penicillin in vitro gegen R. equi Wirkung zeigen (WOOLCOCK u. MUTIMER, 1980;
PRESCOTT u. NICHOLSON, 1984), verstarben 17 von 17 Fohlen an einer Rhodococcose trotz einer Behandlung mit sensibel eingestuftem Gentamicin in Kombination mit Penicillin (SWEENEY et al., 1987). Eine erfolgreiche Behandlung hängt von der Nutzung lipophiler antimikrobieller Wirkstoffe ab, die in der Lage sind, in die Makrophagen oder neutrophilen Granulozyten zu penetrieren, in denen der Organismus überlebt um auf diese Weise die intrazellulären Erreger abzutöten.
Seit über 30 Jahren stellt die Kombination von Rifampicin und einem Makrolidantibiotikum die Standardtherapie für die Behandlung der Rhodococcose dar. Die Wirkungsweise der Makrolide ist überwiegend bakteriostatisch, kann jedoch abhängig von verschiedenen Faktoren auch bakterizid sein. Makrolide binden reversibel an einen Rezeptor an der bakteriellen 50S-Ribosomen-Untereinheit und inhibieren die RNA-abhängige Proteinbiosynthese.
Bei oral applizierten Medikamenten wird die Bioverfügbarkeit sowohl durch unvollständige gastrointestinale Resorption als auch durch präsystemischen Metabolismus in der Darmschleimhaut und der Leber („first-pass-Effekt“) vermindert.
Die Arzneistoffe werden nach der oralen Aufnahme im Darm resorbiert und ein Teil wird schon in den Enterozyten biotransformiert. Ein weiterer Anteil wird über das Pfortadersystem zur Leber transportiert, wo weitere Anteile der Muttersubstanz metabolisiert werden. Der unveränderte Rest wird über die Galle zurück in den Darm transportiert und unterliegt dem enterohepatischen Kreislauf. Nur ein gewisser Teil des oral verabreichten Arzneistoffes gelangt unverändert aus dem Darm in den Blutkreislauf, wird auf diese Weise systemisch verfügbar und kann seine Wirkung entfalten.
Die Metabolisierung der Arzneistoffe in der Leber erfolgt in zwei Reaktionsschritten.
Die Phase-I-Reaktion katalysiert die Einführung funktioneller Gruppen, wodurch der Ausgangsstoff sowohl inaktiviert, als auch in einen aktiven Metaboliten umgewandelt werden kann. Makrolide erhalten in diesem Schritt ihren basischen Charakter, wodurch sie sich in sauren Kompartimenten wie Lysosomen und Phagosomen anreichern können. In der Phase-II-Reaktion entstehen durch Konjugation polare, gut wasserlösliche aber unwirksame Metabolite, die schneller renal und biliär ausgeschieden werden können. Das für die erste Reaktion entscheidende Enzym ist Cytochrom P450 (CYP). Beim Menschen sind bisher 57 unterschiedliche CYP-P450- Gene identifiziert worden, die in Genfamilien (18), Subfamilien (43) und innerhalb dieser in entsprechende Isoformen unterteilt sind. Mit 30 % des CYP-Gehaltes ist CYP3A4 das wichtigste Cytochrom P450-Enzym und 60 % aller therapeutisch eingesetzten Arzneistoffe sind CYP3A4-Substrate (WRIGHTON u. STEVENS, 1992;
SPATZENEGGER u. JAEGER, 1995).
Bei intrazellulären Erregern reicht es nicht aus, dass ein Antibiotikum eine gute Bioverfügbarkeit aufweist und eine hohe Konzentration im Blut erreicht, sondern es muss auch in die Zellen eindringen können, um das Bakterium dort abzutöten. Die MHK (minimale Hemmstoffkonzentration) muss in der Umgebung der Bakterien erreicht werden - im Falle von Lungenerkrankungen in den Bronchial- und Alveolarepithelien, in der PELF und bei intrazellulären Erregern wie R. equi auch in den BALC. Demnach sind die Konzentrationen des Antibiotikums vor allem in diesen Lungenkompartimenten von Bedeutung. Erstmalig konnte EGGERS (2011) Rifampicin und seinen Metaboliten 25-O-Desacetylrifampicin in den Lungen- kompartimenten von Fohlen nachweisen. Dabei reichert sich der Metabolit gegenüber der Muttersubstanz in der Lunge an, so dass die Konzentration von 25-O- Desacetylrifampicin in den BALC 25fach über der von Rifampicin liegt. Beide Substanzen erreichen die MHK90 (minimale Hemmstoffkonzentration, bei der 90 % der Erreger abgetötet werden) von 0,5 µg/ml (JACKS et al., 2003). Auch Makrolide penetrieren in die Lungenkompartimente und erreichen beim Menschen Konzentrationen weit über denen im Plasma (BALC > PELF > Plasma)(CONTE et al., 1995). Ebenso kommt es beim Fohlen zu einer deutlichen Anreicherung von
Clarithromycin sowie dessen Metaboliten 14-OH-Clarithromycin in den BALC (WOMBLE et al., 2006; PETERS et al., 2011; PETERS et al., 2012).
Erythromycin wurde als erstes Makrolidantibiotikum in der Therapie der Rhodococcose schon 1981 eingesetzt. Zusammen mit Rifampicin verabreicht erhöhte es die Überlebensrate erkrankter Fohlen von 20 auf bis zu 80 % (HILLIDGE, 1987). Der Einsatz von Erythromycin ist allerdings mit Nebenwirkungen verbunden, sowohl für die Fohlen als auch für die Mutterstuten. Bei diesen besteht durch Aufnahme mit dem Futter die Gefahr der Entwicklung einer tödlich verlaufenden Colitis (GUSTAFSSON et al., 1997; BÅVERUD et al., 1998) und bei den Fohlen kann es zur Entwicklung von transienten Durchfällen, Hyperthermie und Atemnot kommen (STRATTON-PHELPS et al., 2000). Des Weiteren hat Erythromycin nur eine geringe und variable orale Bioverfügbarkeit und muss den Fohlen daher bis zu viermal täglich verabreicht werden (LAKRITZ et al., 2000).
Tulathromycin ist ein halbsynthetisches Makrolidantibiotikum und gehört zu den Triamiliden. Es ist für die Behandlung von Atemwegserkrankungen bei Rindern und Schweinen auf dem Markt und wird den Fohlen in der Rhodococcustherapie mit einer Dosierung von 2,5 mg/kg einmal wöchentlich in die lange Sitzbeinmuskulatur injiziert.
Das Tulathromycin weist ein hohes Verteilungsvolumen auf (NOWAKOWSKI et al., 2004) und hat eine lange Eliminationshalbwertszeit (BENCHAOUI et al., 2004;
VENNER et al., 2010). Mit der angegebenen Dosierung wird ein hoher Wirkspiegel erreicht und wie andere Makrolide auch (RODVOLD et al., 2003), reichert sich das Tulathromycin in der PELF und den BALC an, so dass in diesen Kompartimenten ein Vielfaches der Plasmakonzentration erreicht wird (VENNER et al., 2010). 2010 wurden erstmals MHK-Werte für Tulathromycin gegenüber R. equi bestimmt (CARLSON et al., 2010a). Dabei wurden sehr hohe Werte festgestellt (MHK90 von ≥ 64 µg/ml), so dass Tulathromycin mit Konzentrationen von < 1,5 µg/ml in Plasma, BALC und PELF 192 Stunden nach 6wöchiger Applikation als unwirksam gegenüber R. equi angesehen werden muss (VENNER et al., 2010). Als Nebenwirkungen der Tulathromycintherapie beim Fohlen zeigen sich leichte Schwellungen im Injektionsbereich sowie selbstlimitierender Durchfall (VENNER et al., 2007).
Azithromycin wird ebenfalls halbsynthetisch hergestellt und gehört zu der Gruppe der Azalide. Mit 38 bis 56 % weist es eine höhere Bioverfügbarkeit auf als Erythromycin (JACKS et al., 2001; DAVIS et al., 2002) und kann aufgrund einer Halbwertszeit von 16 bis 20 Stunden einmal täglich verabreicht werden (JACKS et al., 2001; DAVIS et al., 2002). Während JACKS et al. (2001) bei der i.v.-Applikation milde Neben- wirkungen wie Gähnen, Zittern, Ataxie sowie Schwäche und über den oralen Applikationsweg keine Nebenwirkungen feststellten, beobachteten DAVIS et al., (2002) über keine der beiden Applikationsrouten unerwünschte Nebenwirkungen. Die MHK90 von Azithromycin wird von CARLSON et al. (2010a) mit 2 µg/ml angegeben.
Clarithromycin, ein halbsynthetisches Derivat von Erythromycin, weist wie alle Makrolide einen lipophilen Charakter sowie eine gute Gewebepenetration auf und erreicht hohe intrazelluläre Konzentrationen (ANDERSON et al., 1988; HARDY et al., 1992). Die Bioverfügbarkeit von Clarithromycin liegt beim Fohlen mit 57,3 ± 12 % (WOMBLE et al., 2006) deutlich über der von Azithromycin 39 ± 20 % (DAVIS et al., 2002). Clarithromycin reichert sich in der PELF und den BALC an und erreicht bei therapeutischer Gabe einen Wert über der MHK90, welche bei 0,12 µg/ml liegt (JACKS et al., 2003; CARLSON et al., 2010a). Nach sechs Tagen oraler Monotherapie gesunder Fohlen in therapeutischen Dosen finden sich in der PELF 30fach höhere Konzentrationen und in den BALC bis zu 700fach höhere Konzentrationen von Clarithromycin im Vergleich zu den Konzentrationen im Plasma (PETERS et al., 2011).
Die Kombination von Rifampicin mit Clarithromycin ist der mit Azithromycin sowohl in vitro als auch in vivo überlegen. Clarithromycin zeigt in vitro eine achtfach bessere Aktivität gegenüber R. equi als Azithromycin (JACKS et al., 2003) und auch in vivo hat sich Clarithromycin in einer klinischen Studie als geringfügig überlegen erwiesen, insbesondere bei Fohlen mit schweren radiologischen Veränderungen in der Lunge (GIGUÈRE et al., 2004). Bei einigen Fohlen wurde als Nebenwirkung von Clarithromycin selbstlimitierender Durchfall festgestellt, der bei einer Behandlung mit Azithromycin ebenso beobachtet wurde (GIGUÈRE et al., 2004).
Vorangegangene Studien haben gezeigt, dass Rifampicin einen deutlichen Einfluss auf die Pharmakokinetik von Clarithromycin hat, wenn beide Medikamente zusammen verabreicht werden. Es zeigen sich unter anderem deutliche Konzentrationsverluste des Clarithromycins sowohl im Plasma als auch in den Lungenkompartimenten. Bei der Comedikation mit Rifampicin über einen Zeitraum von 11 Tagen in therapeutischen Dosen bleibt die Eliminationsrate des Clarithromycins unbeeinflusst, die Konzentration von 14-Hydroxyclarithromycin (14- OH-Clarithromycin) steigt um etwa ein Siebenfaches an und die metabolische Ratio sinkt von 2,56 ± 0,97 in der Monotherapie auf 0,33 ± 0,09 in der Kombinationstherapie. Clarithromycin penetriert signifikant besser in die PELF, was durch eine erhöhte PELF/Plasma-Ratio deutlich wird. Durch einen Anstieg der 4beta- Hydroxycholesterol (4ß-OH-Cholesterol)/Cholesterol-Ratio von 0,68 ± 0,34 auf 1,05 ± 0,4 wird die Induktion der systemischen metabolischen Aktivität durch Rifampicin gezeigt (PETERS et al., 2011). In einer folgenden Kurzzeit-Studie, in der Rifampicin und Clarithromycin über zweieinhalb Tage zweimal täglich verabreicht werden, zeigen PETERS et al. (2012), dass die Verteilung von Rifampicin durch gleichzeitige Applikation von Clarithromycin nicht beeinflusst wird. Einzig der stärker polare Metabolit 25-O-Desacetylrifampicin weist geringere Konzentrationen im Plasma auf, die aber nicht als signifikant eingestuft werden. Rifampicin erreicht maximale Plasmakonzentrationen von 7,93 bis 19,5 µg/ml und die terminale Halbwertszeit liegt bei 9,48 bis 19,8 h. Die Konzentrationen des Clarithromycins werden in ähnlichem Maße wie in der Langzeitstudie verringert, die Bioverfügbarkeit sinkt gegenüber der Monotherapie um bis zu 70 %, während die terminale Halbwertszeit und die metabolische Ratio unverändert bleiben.
Bei der Kombinationstherapie wird eine Dosierung von 10 mg/kg Rifampicin (CASTRO et al., 1986) und 7,5 mg/kg Clarithromycin (JACKS et al., 2002) zweimal täglich oral über einen Zeitraum von vier bis neun Wochen empfohlen (GIGUÈRE et al., 2011b). PRESCOTT und SWEENEY (1985) berichteten sogar von Behandlungsdauern von bis zu fünf Monaten. Es wird aber in jedem Fall empfohlen, die Behandlung solange fortzuführen, bis die klinischen Symptome zurückgegangen sind und ultrasonographisch oder röntgenologisch keine Abszesse mehr dargestellt
werden können (PRESCOTT u. SWEENEY, 1985; PILTZ, 2004).
Clarithromycin wird – wie Rifampicin durch das CYP450-System zu seinem aktiven Metaboliten 14-OH-Clarithromycin abgebaut. Über die Hälfte aller Arzneistoffe werden über die CYP3A4-Subfamilie verstoffwechselt, so dass sich klinisch relevante Interaktionen bei gleichzeitiger Verabreichung mehrerer Substanzen ergeben können. Viele Makrolide, unter anderem Clarithromycin, hemmen dieses Enzymsystem. Dagegen stellt Rifampicin beim Menschen einen Induktor dar (HEIMARK et al., 1987) und unterliegt selber einer Autoinduktion, so dass es seinen eigenen Abbau beschleunigt (ADACHI et al., 1985; NIEMI et al., 2003).
Rifampicin ist ein humanmedizinisches Ansamycin-Antibiotikum zur Behandlung der Tuberkulose mit bakterizider Wirkung gegenüber proliferierenden Keimen. Es hemmt die bakterielle RNA-Polymerase, auf diese Weise spezifisch die Transkription der Bakterien-DNA und damit die Proteinsynthese. Über diesen Mechanismus kommt das Bakterienwachstum zum Erliegen. Das Wirkspektrum umfasst Mykobakterien, grampositive Keime wie Staphylokokken, einige gramnegative Erreger und auch intrazelluläre Bakterien wie R. equi (MANDELL, 1983). Dabei sollte keine Monotherapie erfolgen, da es zu einer raschen Resistenzentwicklung aufgrund einer Einstufenresistenz kommen kann (TSUKAMURA, 1972; TELENTI et al., 1993).
Rifampicin weist beim Menschen eine hohe orale Bioverfügbarkeit auf und die Metabolisierung in den ebenfalls aktiven Hauptmetaboliten 25-O-Desacetylrifampicin (ACOCELLA, 1978) erfolgt durch das Cytochrom P450-Ezymsystem (CYP3A4) in Darm und Leber.
Als Alternative zu Antibiotika in der Rhodococcustherapie wurde das In-vitro- Potential von antimicrobial peptides (antimikrobielle Peptide, AMPs) untersucht (SCHLUSSELHUBER et al., 2012). Es wurden die equinen Proteine DEFA1 (Defensin alpha 1) und eCATH1 (horse cathelicidin) in ihrer Wirkung gegen R. equi und mit diesem häufig assoziierten Erregern Klebsiella pneumoniae und Streptococcus equi ssp. zooepidemicus (S. zooepidemicus) getestet. Das Wachstum der gram-positiven Keime R. equi und S. zooepidemicus wird sowohl durch DEFA1
und eCATH1 gehemmt, während die gramnegativen Klebsiellen sich nur durch eCATH1 hemmen lassen. Interessanterweise wird eine synergistische Wirkung bei der Kombination von Rifampicin mit eCATH1 beobachtet. Das lässt vermuten, dass AMPs ein Mittel zur Verbesserung der klassischen Antibiotikawirkung und eine Lösung für das Problem mit dem Anstieg der multidrug-resistenten Krankheitserreger sein könnten. Für eine Aussagekraft in der Praxis müssen weitere Versuche folgen.
2.3 Transportmechanismen
Der Mechanismus, über den sich die Makrolide in der Lunge anreichern, ist bis heute nicht vollständig geklärt. Die pharmakokinetischen Abläufe wie Absorption, Distribution, Metabolisierung und Exkretion unterliegen komplizierten Regulationsmechanismen und werden von verschiedenen Faktoren beeinflusst.
Einen Weg stellt die passive Diffusion der basischen Medikamente ins saure Milieu der Makrophagen dar (FIETTA et al., 1997). In dem sauren Milieu ionisiert der zuvor neutrale Arzneistoff und kann nicht mehr durch die Membran zurück diffundieren.
Diese Ionenfalle kann aber bei BALC/Plasma-Gradienten des Clarithromycins von 50 - 100:1 und der deutlichen Anreicherung in der PELF (PETERS et al., 2011) nicht die einzige Erklärung sein. Heute ist bekannt, dass zahlreiche Medikamente mit Hilfe von Transportproteinen in die unterschiedlichen Kompartimente gelangen. Die unidirektionale Penetration von Medikamenten aus dem Blut ins Lungenepithel und von dort weiter über die PELF in die BALC wird unter anderem durch Interaktionen mit sogenannten Multidrug-Transportern vermittelt. Die zwei Superfamilien der membranständigen Transportproteine sind die ABC (ATP-binding- cassette)-Transporter und die SLC (solute carrier)-Transporter. Durch diese Transportproteine werden Absorption, Verteilung und Exkretion verschiedener Arzneistoffe beeinflusst und es kann zu positiven wie negativen Arzneimittelinteraktionen kommen. ABC-Transporter transportieren die Substrate unter Hydrolyse von ATP entgegen eines Konzentrationsgradienten energieabhängig über biologische Membranen (LANGMANN et al., 2003; VASILIOU et al., 2009). Ein sehr gut untersuchter Efflux-Transporter der ABC-Superfamilie ist das P-glycoprotein
(P-gp, ABCB1), welches durch das MDR1-Gen codiert wird und zu den Multidrug- resistance Proteinen gehört. Das Phänomen der multidrug-resistance rührt daher, dass zum Beispiel Tumorzellen eine Resistenz gegenüber Arzneistoffen entwickeln, indem sie zu einer Überexpression von Effluxtransportern führen. Die verabreichten Medikamente werden somit vermehrt aus der Zelle hinaus geschleust und die therapeutischen Wirkstoffspiegel werden nicht mehr erreicht (JURANKA et al., 1989;
VAN DER DEEN et al., 2005). ABCB1 wird im Wesentlichen an der apikale Seite von Epithelzellen verschiedener Organe exprimiert, welche im Körper eine exkretorische und/oder Barrierefunktion haben, wie z.B. Dünndarm, Leber, Lunge und Blut-Hirn- Schranke (FOJO et al., 1987; NISHIMURA u. NAITO, 2005). TYDÉN et al. (2009) konnten die Expression des Transporters beim Pferd im proximalen Duodenum, in der Niere, in der Leber und an der Lymphozytenmembran nachweisen, beim Fohlen wurde ABCB1 in der Lunge anhand von Bronchialbioptaten (PETERS et al., 2011) und in BALC nachgewiesen (VENNER et al., 2010).
Rifampicin ist ein bekannter Induktor der Genexpression von ABC-Transportern und es ist weiterhin bekannt, dass Clarithromycin ein Substrat von ABCB1 ist (SUZUKI et al., 2003). Bei chronischer Gabe von Clarithromycin zusammen mit Rifampicin zweimal täglich in therapeutischen Dosen über einen Zeitraum von 11 Tagen bei Fohlen sinkt die Bioverfügbarkeit des Clarithromycins um 90 % und erreicht nur noch subtherapeutische Plasmakonzentrationen (PETERS et al., 2011). Die geringere Bioverfügbarkeit geht nicht mit einem entsprechenden Anstieg der Metaboliten- konzentration im Plasma einher, ist aber auch mit einer Abnahme der Konzentration von Clarithromycin und 14-OH-Clarithromycin in der PELF und den BALC assoziiert.
Bei kurzzeitiger Applikation beider Medikamente über einen Zeitraum von 2,5 Tagen kommt es zu einem Verlust der Bioverfügbarkeit um 70 % (PETERS et al., 2012).
Wie bei der chronischen Studie sinken die Konzentrationen nach kurzzeitiger Applikation auch in der PELF und den BALC und die Bildung des Metaboliten ist nicht äquivalent zum Abfall der Bioverfügbarkeit der Muttersubstanz.
Es existieren verschiedene Mechanismen, über die Rifampicin die Pharmakokinetik anderer, coadministrierter Arzneimittel beeinflussen kann. Einerseits kann das
Rifampicin arzneimittelmetabolisierende Enzyme wie CYP3A4 induzieren oder aber die Expression von Transportproteinen wie ABCB1 im Darm verstärken (BENEDETTI, 1995; GREINER et al., 1999; WESTPHAL et al., 2000).
Rifampicin reguliert CYP3A4 auf Transkriptionsebene und ist der stärkste Induktor der Enzymexpression, sowohl in vivo als auch in vitro (HEIMARK et al., 1987;
SCHUETZ et al., 1993; KOCAREK et al., 1995). Rifampicin ist ein Prototyp-Ligand für den Transkriptionsfaktor nuclear Pregnan-X-Rezeptor (PXR), welcher die Expression des CYP3A4-Genes in Leber und Darm reguliert. Ein Arzneistoff (Medikament A, in diesem Fall Rifampicin) interagiert mit PXR, woraufhin dieser an den CYP3A4-Promoter bindet und die Bildung des Enzyms CYP3A4 induziert. Durch die gesteigerte Bildung von CYP3A4 kommt es nun zu einem beschleunigten Metabolismus des coadministrierten Arzneistoffes (Medikament B, hier Clarithromycin), welcher ein Substrat von CYP3A4 ist. Der Ablauf ist schematisch in Abb. 1 dargestellt.
Med. A PXR
Med. B Promotor
Rifampicin
Leber, Darm
OH - Clarithromycin
Cyclosporin Erythromycin
CYP 3A4 Gen Enzym
CYP 3A4
Med. B
Abb. 1 CYP3A4-Induktion durch PXR; modifiziert nach WILLSON u. KLIEWER, 2002
Med. A: Rifampicin; Med. B: Clarithromycin; PXR: Pregnan X- Rezeptor OH-Med. B: 14-OH-Clarithromycin; OH-: Hydroxylgruppe
CYP3A4 wird beim Menschen sowohl in der Leber als auch im Darm gebildet. Der Proteingehalt von CYP3A4 ist nach VON RICHTER et al. (2004) im Darm um ein dreifaches höher als in der Leber und dies spielt eine Rolle bei der Variabilität und der verringerten oralen Bioverfügbarkeit von vielen CYP3A4-Substraten. Auch eine veränderte Expression von ABCB1 hat einen Einfluss auf die Bioverfügbarkeit und kann diese durch verstärkte Bildung verringern. Beim Menschen induziert Rifampicin nach multiplen Gaben sowohl ABCB1 im Darm (in vitro) als auch CYP3A4 in Leber und Darm (in vivo und in vitro)(KOLARS et al., 1992; GOODWIN et al., 1999; GEICK et al., 2001; HASLAM et al., 2008). ABCB1 wird beim Menschen unter anderem in der apikalen Membran humaner Enterozyten exprimiert (THIEBAUT et al., 1987) und
fungiert als Effluxtransporter, der resorbierte Substanzen zurück ins Darmlumen transportiert (HSING et al., 1992). Durch Induktion des Transporters kommt es zu einer vermehrten Ausscheidung der Arzneimittel und im Falle der gesteigerten Bildung von CYP3A4 erhöht sich die Metabolisierungsrate der coadministrierten Stoffe, wenn sie Substrat dieses Enzyms sind.
Während beim Pferd nach Verabreichung von Rifampicin über fünf Tage noch keine vermehrte Enzymaktivität nachgewiesen werden konnte (BURROWS et al., 1992), stellt sich beim Menschen nach sieben Tagen die maximale Induktion von CYP3A4 ein (NIEMI et al., 2003). Im Gegensatz zur Induktion bei langfristiger Gabe äußern sich einzelne Gaben von Rifampicin in einer Inhibition von ABCB1, wie Studien an der Blut-Hirn-Schranke bei Mäusen und der Leber bei Menschen zeigten (FARDEL et al., 1995; ZONG u. POLLACK, 2003). Auf diesem Weg kann es zu erhöhten intrazellulären Konzentrationen von Substraten wie Clarithromycin kommen, da deren Efflux vermindert wird. ZONG und POLLACK (2003) vermuten, dass dieser inhibitorische Effekt auch bei Langzeitgaben auftritt, aber durch die zeitgleich stattfindende Induktion überlagert wird.
Obwohl Clarithromycin ein Substrat von ABCB1 im Darm ist und dessen Expression durch Rifampicin erhöht wird, scheint ein erhöhter Efflux nicht ursächlich für die verminderte Bioverfügbarkeit von Clarithromycin bei kombinierter Gabe zu sein.
Nach zwei Tagen ist eine verstärkte Ausbildung der intestinalen Effluxtransporter durch Rifampicin als eher unwahrscheinlich zu betrachten, und trotzdem kommt es in der Clarithromycin-Rifampicin kombinierten Kurzzeitstudie an Fohlen zu einem drastischen Verlust der Bioverfügbarkeit von Clarithromycin (PETERS et al., 2012).
PETERS et al. (2011) zeigen auch, dass es bei einer langfristigen Gabe von Rifampicin bei Fohlen nicht zu der erwarteten Induktion der Effluxtransporter ABCB1 und ABCC2 in der Lunge kommt, und auch der Pregnan X-Rezeptor (PXR) ist nicht signifikant hochreguliert. Bis heute ist nicht bekannt, wie es zu der starken Abnahme der Bioverfügbarkeit von Clarithromycin bei Coadministration mit Rifampicin kommt, aber die oben genannten Ergebnisse lassen die Überlegung zu, dass die Ursache in intestinalen, basolateral gelegenen Effluxtransporten (wie z.B. ABCC3) zu finden ist.
Sollten bei gemeinsamer Gabe von Clarithromycin und Rifampicin über den benötigten Therapiezeitraum von sechs Wochen die Konzentrationen des Clarithromycins wie im Plasma auch in der PELF und den BALC so stark fallen, dass sie unter die MHK90 von R. equi sinken, ist eine Kombinationstherapie der beiden Substanzen zu überdenken.
Material und Methoden 3
3.1 Probanden
Die zwölf an der Studie teilnehmenden Fohlen stammten von einem Warmblut- Gestüt, auf welchem die Untersuchungen auch durchgeführt wurden. Es wurden sieben gesunde Hengste und fünf gesunde Stuten in einem Alter zwischen 51 und 67 Tagen und einem Gewicht von 91 bis 151 kg in die Studie einbezogen. (Tab. 5 im Anhang). Bei der Studie handelte es sich um einen Tierversuch, der vom Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern in Rostock unter dem Aktenzeichen 7221.3-1.1-080/12 genehmigt worden ist.
3.1.1 Haltungsbedingungen der Fohlen
Die Fohlen wurden die ersten sieben bis zehn Lebenstage zusammen mit ihren Mutterstuten in Einzelboxen aufgestallt. Daran anschließend erfolgte die Unterbringung von zehn bis zwölf Stuten mit ihren Fohlen gemeinsam in Laufställen, die mit Stroh eingestreut wurden und einen angrenzenden, frei zugänglichen, befestigten Paddock besitzen. Zweimal täglich wurden die Pferde mittels Gras- Maissilage-Mischfutter gefüttert, welches zusätzlich mit Hafer und Mineralfutter angereichert war. Jederzeit bestand freier Zugang zu Selbsttränken, Salzlecksteinen und Heuraufen. Alle Pferde des Bestandes wurden regelmäßig gegen das Equine Herpesvirus 1 und 4 (EHV1 und 4) sowie Influenza und Tetanus geimpft. Des Weiteren erfolgte in regelmäßigen Abständen eine Entwurmung mit wechselnden Präparaten und Wirkstoffen.
3.1.2 Einschlusskriterien
Um in die Studie aufgenommen zu werden, mussten die Fohlen zum Studienbeginn klinisch allgemein- sowie sonographisch lungengesund sein und durften in den letzten 14 Tagen vor Studienbeginn keine antibiotische Behandlung erhalten haben.
3.2 Methoden
3.2.1 Untersuchung der Fohlen
3.2.1.1 Allgemeine und spezielle Untersuchung
Eine Allgemeinuntersuchung sowie eine spezielle Untersuchung des Respirationstraktes fanden von der Geburt an bis zum Absetzen einmal wöchentlich statt. Dabei wurden Allgemeinzustand, Ernährungszustand, Haltung und Verhalten betrachtet und die Gelenke auf vermehrte Füllung beobachtet. Der Nabel wurde palpiert und dabei zusätzlich auf das Vorliegen eines Nabelbruches geachtet. Des Weiteren erfolgten die Messung der Rektaltemperatur sowie die Palpation der Mandibularlymphknoten. Die Lunge wurde auf beiden Seiten, die Trachea an mehreren Punkten auskultiert und der Grad der physiologischen Atemgeräusche bzw. das Auftreten von Nebengeräuschen wie Rasseln oder Giemen beurteilt. Das Vorhandensein und die Qualität von Nasenausfluss (serös, mukös, purulent) wurden dokumentiert.
3.2.1.2 Bestimmung der Blutleukozytenzahl
Zusätzlich zu den oben genannten Untersuchungen wurde den Fohlen einmal in der Woche Blut aus der Vena jugularis (V. jugularis) entnommen, um in diesem den Gehalt der Leukozyten zu bestimmen. Die Blutentnahme erfolgte mittels Kanüle (BD MicrolanceTM, 1,2mm x 40mm, Becton Dickinson, Drogheda, Irland) direkt in ein EDTA-Röhrchen (EDTA K, 4 ml, Sarstedt AG, Nümbrecht, Deutschland). Zur Schonung der Venen wurden wöchentlich die rechte und die linke V. jugularis alternierend punktiert. Für die Messung der Leukozytenzahl/μl diente ein Hämatologiegerät (Sysmex KX-21N, Sysmex Deutschland GmbH, Hamburg, Deutschland), welches die Anzahl der Leukozyten durch Widerstandsmessung bestimmte.
3.2.1.3 Sonographische Untersuchung der Lunge
Vor Beginn der Studie sowie vor jeder Kinetik wurde die Lunge der Fohlen ultrasonographisch untersucht. Analog zur vorangegangenen Dissertation von BLOCK (2010) wurde das Verfahren identisch durchgeführt. Bei keinem der Fohlen konnten zu Beginn der Studie pathologische Befunde der Lunge nachgewiesen werden.
3.2.2 Wiegen der Fohlen
Jedes Fohlen wurde zu Beginn der Studie sowie einmal wöchentlich gewogen. Die verwendete Waage („Die mobile Pferdewaage“, Deutschland) wurde in einem Untersuchungsstand für Pferde aufgebaut und das Fohlen über die Waage geführt.
Dabei befand sich die Mutterstute in einem separaten Untersuchungsstand direkt neben dem Fohlen, so dass dieses ruhig auf der Waage zum Stehen kam. Die auf diese Weise bestimmten Gewichte dienten der genauen Dosierung der verabreichten Antibiotika sowie der Narkotika für die bronchoalveoläre Lavage (BAL).
3.3 Studiendesign
3.3.1 Allgemeiner Aufbau der Studie
Bei dieser Studie handelte es sich um eine prospektive, kontrollierte, randomisierte, vier-armige, cross over Studie, die für jedes Fohlen insgesamt 37 Tage dauerte und in vier Behandlungsprotokolle (A-D) aufgeteilt war. Die zwölf Fohlen wurden in zwei Gruppen (Sequenz eins und Sequenz zwei) zu je sechs Fohlen aufgeteilt, die um eine Woche versetzt starteten. In Sequenz eins folgten die Behandlungen der Reihenfolge A-B-C-D und die Fohlen in Sequenz zwei haben die Reihenfolge A-B-D- C durchlaufen. Behandlung A beinhaltete die einmalige intravenöse Gabe von Clarithromycin, mit anschließender Blutentnahme zu festgesetzten Zeitpunkten.
Während der Behandlung B erhielten die Fohlen über 5,5 Tage im 12-stündigen
Abstand Clarithromycin als Monotherapie oral, während der Behandlung C wurden Rifampicin und Clarithromycin zeitgleich zweimal täglich über einen Zeitraum von 13,5 Tagen per os verabreicht und während der Behandlung D erhielten die Fohlen das Rifampicin vier Stunden nach dem Clarithromycin. Beide Medikamente wurden den Fohlen auch in diesem Behandlungsprotokoll zweimal täglich über 13,5 Tage per os eingegeben. Nach der letzten Medikamentenapplikation erfolgten in jedem Behandlungsprotokoll Blutentnahmen in bestimmten Zeitabständen und 12 Stunden nach der letzten Medikamentengabe wurde, außer im Behandlungsprotokoll A, eine BAL durchgeführt. Zwischen den einzelnen Behandlungen gab es keine Washout- Phasen, sondern sie schlossen direkt aneinander an. Einzig die orale Clarithromycinmonotherapie fand mindestens 48 Stunden und höchstens sieben Tage nach der intravenösen Applikation statt. Der Ablauf der Studie ist schematisch in Abb. 2 dargestellt.
BAL
Kinetik 0-48h Kinetik 0-24h Kinetik 0-24h Kinetik 0-24h
Sequenz 2 BAL BAL
Behandlung A Behandlung B Behandlung D Behandlung C
clarithromycin 2 × 7,5 mg/kg KGW/d p.o.
rifampicin 2 × 10 mg/kg KGW/d p.o.
clarithromycin 1 × 7,5 mg/kg KGW i.v.
BAL
Kinetik 0-48h Kinetik 0-24h Kinetik 0-24h
Sequenz 1
BAL BAL
Behandlung A Behandlung B Behandlung C Behandlung D
Kinetik 0-24h Sa So Mo Di Mi Do Fr Sa So Mo Di Mi Do Fr Sa So Mo Di Mi Do Fr Sa So Mo Di Mi Do Fr Sa So Mo Di Mi Do Fr Sa So 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37
Sa So Mo Di Mi Do Fr Sa So Mo Di Mi Do Fr Sa So Mo Di Mi Do Fr Sa So Mo Di Mi Do Fr Sa So Mo Di Mi Do Fr Sa S 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37
Abb. 2 Studienablauf; die Achse ist eine Zeitachse in Tagen
3.3.1.1 Untersuchung und Wiegen der Fohlen
In die Studie wurden nur gesunde und mindestens zwei Wochen nicht vorbehandelte Fohlen aufgenommen. Die allgemeine sowie die spezielle Untersuchung der Fohlen, die sonographische Untersuchung der Lunge, die Bestimmung der Blutleukozytenzahl sowie das Wiegen der Fohlen erfolgte wie unter 3.2.1 beschrieben. Diese Untersuchungen wurden sowohl vor Beginn der Studie als auch einmal wöchentlich im weiteren Verlauf durchgeführt. Das erste Wiegen der Fohlen erfolgte vor Beginn der Studie und darauffolgend einmal pro Woche. Bei anstehender Kinetik wurde das Wiegen ein bis zwei Tage vor dem Start der Kinetik durchgeführt.
3.3.1.2 Verabreichung der Antibiotika
Behandlung A
Für die intravenöse Verabreichung des Clarithromycins (7,5 mg/kg Clarithromycin Martindale Pharma® 500 mg Pulver zur Herstellung eines Injektionslösungskonzentrates) wurde nach Herstellerangaben eine gebrauchsfertige Infusionslösung hergestellt und diese den Fohlen über einen Zeitraum von fünf bis sieben Minuten, über einen mittels Braunüle gelegten venösen Zugang in der V. jugularis infundiert.
Behandlung B, C und D
Bei der alleinigen Verabreichung (Behandlung B) von Clarithromycin (Clarithromycin – 1 A Pharma® 500 mg Filmtablette, 1A Pharma, Magdeburg, Deutschland) erhielten die Fohlen 7,5 mg/kg um 7:00 Uhr und um 19:00 Uhr p. o.. Die entsprechende Dosierung für jedes Fohlen wurde einzeln in einer 60 ml Spritze (Soft Ject® Katheter, 60 ml, Henke Sass Wolf, Tuttlingen, Deutschland) in einer geringen Menge Wasser suspendiert und dem Fohlen direkt ins leere Maul appliziert. Dabei fixierte ein Helfer
das Fohlen und hielt den Kopf leicht nach oben, bis das gesamte Medikament abgeschluckt war. Für die Kombinationstherapie (Behandlung C und D) wurde das Rifampicin (Eremfat® 600 mg, RIEMSER Arzneimittel AG, Greifswald – Insel Riems - Deutschland) in einer Dosierung von 10 mg/kg auf die gleiche Weise gelöst wie das Clarithromycin. Die Applikation beider Antibiotika erfolgte in separaten Spritzen. Je nach Behandlung erhielten die Fohlen die Medikamente zeitgleich um 7:00 Uhr und 19:00 Uhr p.o. (Behandlung C) oder das Rifampicin vier Stunden nach dem Clarithromycin um 11:00 Uhr und um 23:00 Uhr (Behandlung D). Da an den Tagen der Blutentnahmen (Kinetiken) die BAL 12 Stunden nach der letzten morgendlichen Clarithromycinapplikation erfolgen musste, wurden die Zeitpunkte der Medikamentengabe drei Tage vor der BAL dahingehend langsam nach hinten verschoben, so dass die sechs Fohlen am Abend vor der BAL ihre Medikamente jeweils um 19:00 Uhr, 20:00 Uhr, 21:00 Uhr, 22:00 Uhr, 23:00 Uhr und 24:00 Uhr erhielten, und in Behandlung D das Rifampicin jeweils noch 4 Stunden später gegeben wurde.
3.3.1.3 Blutentnahmen und bronchoalveoläre Lavage
Behandlung A
Die Stuten und ihre Fohlen wurden am Tag der Kinetik in Einzelboxen gestellt.
Mittels einer Braunüle wurde ein Zugang zur V. jugularis gelegt und direkt nach der ersten Blutentnahme wurde die Infusionslösung angeschlossen. Im direkten Anschluss an diese begannen die weiteren Blutentnahmen über einen Zeitraum von 48 Stunden zu festgesetzten Zeitpunkten. Der venöse Zugang wurde nach 12 Stunden entfernt, so dass alle noch folgenden Blutentnahmen durch direkte Punktion der V. jugularis stattfanden. Nach Beendigung dieser Kinetik wurden die Stuten und Fohlen zurück in den Laufstall gebracht, eine BAL war nicht vorgesehen.
Behandlung B, C und D
Am Vorabend der Kinetiken wurden die Stuten mit ihren Fohlen in Einzelboxen gebracht. Eine Stunde vor Beginn der jeweiligen Kinetik erhielten die Fohlen mittels Braunüle einen venösen Zugang in die rechte oder linke V. jugularis. Direkt vor und nach der letzten morgendlichen Medikamentengabe um sieben, acht, neun, zehn, elf bzw. zwölf Uhr sind von den Fohlen Blutproben zu festgelegten Zeitpunkten über einen Zeitraum von 24 Stunden entnommen worden. 12 Stunden nach der morgendlichen Medikamentengabe wurde die BAL durchgeführt und nach dieser die Braunüle entfernt. Alle weiteren Blutentnahmen erfolgten über direkte Punktion der V. jugularis. Nach Abschluss der 24-stündigen Kinetik wurden die Stuten mit ihren Fohlen wieder zurück in den Laufstall gebracht.
3.3.2 Blutprobenentnahme für die Bestimmung der Konzentrationen von Rifampicin, Clarithromycin und deren Metabolite im Plasma
Eine Stunde vor Beginn jeder Kinetik wurde den Fohlen mit einer Braunüle (Braunüle MT® Luer Lock Braun Melsungen AG, Melsungen/Deutschland) ein venöser Zugang in die rechte oder linke V. jugularis gelegt und in den nachfolgenden Kinetiken abwechselnd die jeweils andere Halsseite verwendet. Über einen Zeitraum von 48 (Behandlung A) bzw. 24 (Behandlung B, C und D) Stunden wurden zu festgelegten Zeitpunkten jeweils 16 ml Blut entnommen. Ein Zeitplan exemplarisch für eine Kinetik in Behandlung C ist der Tab. 1 zu entnehmen. Die erste Blutentnahme erfolgte unmittelbar vor der letzten Medikamentengabe mittels einer 20 ml Spritze (Injekt®
Luer Solo 20 ml, B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland) und aufgesetzter Kanüle (BD MicrolanceTM, 1,2 mm x 40 mm, Becton Dickinson, Drogheda, Irland). Die ersten drei bis vier Milliliter Blut wurden verworfen, bevor die 16 ml entnommen und sofort in vier beschriftete Lithium-Heparin-Röhrchen (Li- Heparin, 4 ml, Sarstedt AG, Nümbrecht, Deutschland) umgefüllt wurden.
Daran schloss sich unvermittelt eine Zentrifugation bei 2100 U/min für 10 Minuten an (Hettich Zentrifuge Universal 32, Hettich Lab Technology, Tuttlingen,
Deutschland) und das daraufhin überstehende Plasma wurde in vier beschriftete Cryo-Röhrchen (Cryo‘s, PP, 2 ml, Greiner BIO-ONE GmbH, Frickenhausen, Deutschland) pipettiert. Es erfolgte nach jeder Blutentnahme die Spülung der Braunüle mit fünf Milliliter einer heparinhaltigen Natriumchloridlösung [20.000 IE Natrium-Heparin (Heparin-Natrium Braun, 25.000IE/5ml, B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland)] in 500 ml Natriumchloridlösung (Isotonische Natriumchlorid Lösung ad us. vet. - Für Tiere -, B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland). Die Plasmaproben in den Cryo-Röhrchen wurden bei -20°C weggefroren und am Ende der jeweiligen Kinetik auf Trockeneis zum Labor der Klinischen Pharmakologie der Ernst-Moritz-Arndt-Universität in Greifswald transportiert. Dort erfolgte die Lagerung bis zur analytischen Bestimmung der Arzneistoffkonzentrationen bei -80°C.
Tab. 1 Zeitpunkte der Blutentnahmen für Kinetik C und D zur Bestimmung der Konzentrationen von Rifampicin (RIF), Clarithromycin (CLR) und deren Metabolite im Plasma.
Zeit nach Applikation (h) Entnahmezeitpunkt
0 1
Applikation von CLR / CLR+RIF
0,33 2
0,66 3
1 4
1,5 5
2 6
2,5 7
3 8
3,5 9
4 (+ evtl. RIF) 10
4,33 11
4,66 12
5 13
5,5 14
6 15
6,5 16
7 17
8 18
10 19
12 + BAL 20
16 21
20 22
24 23
BAL: bronchoalveoläre Lavage
3.3.3 Bronchoalveoläre Lavage
12 Stunden nach der letzten Arzneimittelgabe erfolgte bei jedem Fohlen eine Bronchoalveoläre Lavage. Um diesen Zeitabstand zu gewährleisten, wurde die Medikamentengabe drei Tage vor der BAL langsam nach hinten verschoben, bis die sechs durchzuführenden BALs stündlich versetzt nacheinander stattfinden konnten.
Das erste Fohlen erhielt somit am Abend zuvor und am Morgen der Kinetik die Medikamente um 19:00 und 7:00 Uhr, die BAL fand um 19 Uhr statt, Fohlen zwei erhielt die Medikamente um 20:00 und 08:00 Uhr, die BAL erfolgte um 20:00 Uhr, Fohlen drei wurde um 21:00 und 09:00 Uhr behandelt mit durchgeführter BAL um 21:00. Auf diese Weise wurden auch die weiteren drei Fohlen zeitlich abgestimmt, so dass das letzte Fohlen der Gruppe (Fohlen sechs) um 24:00 Uhr und 12 Uhr die Medikamente erhielt und seine BAL um 24 Uhr stattfand. Die Fohlen in Behandlung D haben das Rifampicin jeweils vier Stunden nach dem Clarithromycin erhalten.
Die BAL erfolgte in Allgemeinanästhesie. Dafür wurden die Probanden in der Box mit 0,8 – 1,2 mg/kg Xylazin (Xylazin 2 %®, Riemser Arzneimittel AG, Greifswald – Insel Riems, Deutschland) sediert und noch drei bis vier Minuten bei der Mutter belassen, bis die Sedierung Wirkung zeigte. Danach führte man die Fohlen aus der Box und mittels 2,2 – 3,2 mg/kg Ketamin (Ursotamin® 100 mg/ml, Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Deutschland) i. v. und 0,1 - 0,2 mg/kg Diazepam (Diazepam® 10 mg Rotexmedica, 5 Ampullen zu 2 ml, Rotexmedica GmbH, Trittau, Deutschland) i. v.
erhielten sie die Allgemeinanästhesie. Die Lagerung erfolgte auf einer Schaumstoff- matte in Brustlage, wobei beide Thoraxseiten durch Futtersäcke stabilisiert waren.
Eine Hilfsperson saß neben dem Fohlen auf einem der Säcke und fixierte den Kopf des Fohlens. Das flexible Endoskop (endoskopische Videoeinheit Tel Pack, Video- endoskop 138XX, Typ SG22-140, Karl Storz GmbH u. Co. KG, Tuttlingen, Außendurchmesser: 0,9 cm, Länge: 140 cm) wurde an eine Lichtquelle inklusive Bildschirm (Xenon 1000, Karl Storz GmbH u. Co. KG, Tuttlingen) angeschlossen und durch die vorher gesäuberte rechte Nüster eingeführt. Es wurde soweit vor- geschoben, bis es sich in einem nach dorsal gerichtetem Bronchus der zweiten Generation eingekeilt hatte und diesen somit abdichtete. Daraufhin erfolgte die
Instillation von vier Aliquoten PBS [phosphate buffered saline, (Dulbecco’s PBS (1 x) without Ca u. Mg, PAA Laboratories GmbH, Pasching, Österreich)] zu je 100 ml und sofortiges sanftes Aspirieren der einzelnen Fraktionen. Das PBS war zuvor in mit Nummern versehene 100 ml Spritzen (100 ml BD PlastipakTM, Becton Dickinson, Drogheda, Irland) gefüllt und auf 37°C erwärmt worden. Jede Spritze wurde langsam durch den Arbeitskanal des Endoskops in die Lunge entleert und 20 ml Luft hinterher gegeben, um die gesamte Flüssigkeit aus dem Arbeitskanal zu spülen. Im Anschluss erfolgte die Aspiration zur Rückgewinnung der Spülflüssigkeit. Mit jeder der vier Spritzen wurde identisch verfahren, wobei die erste zurückgewonnene Fraktion nach Bestimmung des Volumens verworfen wurde. In ihr werden zum größten Teil nicht repräsentative Zellen der Bronchialschleimhaut vermutet, die für eine weitere Auswertung nicht dienlich sind. Das Volumen der restlichen drei zurückgewonnen Fraktionen wurde vereint und das Gesamtvolumen bestimmt. Dann erfolgte eine Filtration der Flüssigkeit durch zwei Lagen Mull (Beesana Mullkompressen® 10 x10 cm, 12-fach, Karl Beese GmbH u. Co. KG, Barsbüttel, Deutschland) um grobe Schleimflocken zu entfernen. Die aufgefangene Flüssigkeit wurde gleichmäßig in die benötigte Menge 50 ml Falkonröhrchen (BD FalconTM, BD Drogheda, Ireland) verteilt und bei 4°C und 125 x g für 10 Minuten zentrifugiert. Der auf diese Weise gewonnene BAL-Überstand wurde abpipettiert, in einem frischen Falkonröhrchen vereint und aus diesem jeweils 1,5 ml in vier Cryo-Röhrchen überführt. Der restliche Überstand wurde verworfen. Vor Ort erfolgte die Lagerung der Proben bei -20°C und nach dem Transport auf Trockeneis zum Labor der Klinischen Pharmakologie der Ernst-Moritz-Arndt-Universität in Greifswald wurden sie bei -80°C gefroren gelagert.
Die verbliebenen Zellpellets wurden in insgesamt 15 ml PBS resuspendiert, in einem frischen Falkonröhrchen vereinigt und erneut bei 4°C und 125 x g für zehn Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt, verworfen und das Zellpellet in zehn ml PBS aufgenommen. Aus dieser Suspension wurden zehn µl für die Zellzählung in der Neubauer Zählkammer (Karl Hecht, Sondheim, Deutschland) genutzt und weitere zehn µl dienten der Anfertigung von zwei Zellausstrichen. Diese wurden durch die Autorin im Labor der Klinik für Pferde der Tierärztlichen Hochschule Hannover nach May-Grünwald gefärbt und mikroskopisch mittels 100er Ölobjektiv untersucht. Das
Vorgehen diente der Bestimmung der prozentualen Anteile der enthaltenen Makrophagen, Lymphozyten, Mastzellen und Granulozyten. Das Falkonröhrchen wurde erneut zu gleichen Bedingungen zentrifugiert, der Überstand abgesaugt und verworfen. Das verbliebene Zellpellet wurde in 6,76 ml eiskaltem PBS resuspendiert und zu gleichen Teilen auf vier beschriftete Cryo-Röhrchen verteilt. Diese bronchoalveolären Lavagezellen wurden wie die Überstände bei -20°C weggefroren und nach Ankunft in der Pharmakologie in Greifswald bis zur weiteren Analyse bei -80°C gelagert.
3.4 Analytische Untersuchung der Proben
Im Plasma, in den BAL-Überständen und den Zellen der bronchoalveolären Lavage (BALC) wurden die Arzneistoffkonzentrationen bestimmt. Dafür diente eine validierte Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit nachgeschalteter Tandem- Massenspektrometrie (LC-MS/MS) (OSWALD et al. 2011) im GLP-zertifizierten analytischen Labor der Abteilung für Klinische Pharmakologie der Ernst-Moritz-Arndt- Universität Greifswald. Es wurden sowohl die Konzentrationen von Clarithromycin und Rifampicin bestimmt, als auch von deren aktiven Metaboliten 14-OH- Clarithromycin und 25-O-Desacetylrifampicin. Die Bestimmung des Cholesterols und seines Hauptmetabolien 4ß-Hydroxycholesterol im Plasma für die Messung der metabolischen Induktion erfolgte im externen Labor für spezielle Lipiddiagnostik, Institut für klinische Chemie und klinische Pharmakologie in Bonn.
3.4.1 Aufbewahrung und Aufarbeitung der Proben 3.4.1.1 Herstellung der Stamm- und Arbeitslösungen
Die Stammlösungen dienten der Herstellung der täglich neu zu verwendenden Arbeitslösungen und hatten eine Konzentration von 20 µg/ml. Es wurde für jeden Analyten eine Stammlösung hergestellt, indem jeweils zwei mg Clarithromycin,
Rifampicin oder 25-O-Desacetylrifampicin in 100 ml einer Ammoniumacetat- Acetonitril (ACN)-Lösung (1+1, v/v) gelöst wurden. Auf gleiche Weise erfolgte die Herstellung der Stammlösung des internen Standards Roxithromycin. Die Haltbarkeit dieser Lösungen beträgt bei -20°C vier Wochen.
Die Arbeitslösungen wurden für die Herstellung der Kalibrationsgeraden und Qualitätskontrollen verwendet und täglich frisch hergestellt. Aus der jeweiligen Stammlösung wurden je drei Arbeitslösungen unterschiedlicher Konzentrationen für Clarithromycin, Rifampicin und 25-O-Desacetylrifampicin hergestellt, indem schrittweise eine 1:10 Verdünnung der Stammlösung mit einer 50 mM Ammoniumacetat-Lösung durchgeführt wurde. Auf diese Weise entstanden Arbeitslösungen mit den Konzentrationen von 2 µg/ml, 200 ng/ml und 20 ng/ml. Für den internen Standard Roxithromycin erfolgte eine einmalige Verdünnung der Stammlösung mit Ammoniumacetat-Lösung (50mM) im Verhältnis 1:100, so dass eine Arbeitslösung mit der Konzentration von 200 ng/ml entstand. Die Zugabe des internen Standards Roxithromycin zu den zu untersuchenden Proben ermöglichte die Beurteilung der Vollständigkeit der Extraktion und diente der Konzentrationsberechnung der zu bestimmenden Substanzen. Die Arbeitslösungen weisen bei 4°C eine Haltbarkeit von einer Woche auf. Die 50 mM Ammoniumacetat- Lösung wurde durch Lösung von 1,93 g Ammoniumacetat in 500 ml Wasser hergestellt und der pH-Wert auf 5,5 eingestellt. Die Herstellung der Zitronensäure- Lösung (1 %, m/m) erfolgte durch Lösung von 1 g Zitronensäure in 100 ml Wasser.
3.4.1.2 Ansatz und Aufarbeitung der Kalibratoren und Qualitätskontrollen
Um die Konzentrationen der zu bestimmenden Substanz berechnen zu können, wurden Kalibrationsgeraden benötigt, die durch die Analyse einer Substanz in definierter Konzentration erstellt wurden. Diese Kalibratoren wurden hergestellt, indem einer der biologischen Matrix entsprechenden oder dieser zumindest nachempfundenen Lösung der bekannte Arzneistoff in ansteigenden Konzentrationen zugegeben wurde. Als jeweilige biologische Leermatrix für die hier
zu untersuchenden Proben Fohlenplasma, BAL-Überstand und BAL-Zellsuspensionsproben diente entsprechend humanes Plasma, BAL-Puffer (Dulbecco´s PBS) sowie BAL-Zellimitat [HEK294-Zellen (human embryonic kidney)].
Aus den entsprechenden Arbeitslösungen von Clarithromycin, Rifampicin und 25-O- Desacetylrifampicin sind jeweils elf Kalibratoren in einem Konzentrationsbereich von 0,5 bis 1.000 ng/ml (0,5, 1, 2,5, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1.000) hergestellt worden und diese sowie ein Leerwert mit dem internem Standard dienten der Herstellung der Kalibrationsgeraden.
200 µl Humanplasma (Leermatrix) wurden mit der für die oben genannten Konzentrationen der Kalibratoren benötigten Menge der Arbeitslösungen versetzt.
Diese gespickten Leermatrixproben wurden mit 25 µl der Arbeitslösung des internen Standards, 25 µl Zitronensäure-Lösung (1%) und 400 µl eiskaltem ACN versetzt und intensiv gemischt. Die Proben wurden anschließend für 10 Minuten bei 14.900 U/min zentrifugiert und im Anschluss für 15 Minuten mittels Vakuumzentrifugation eingeengt. Der klare Zentrifugationsüberstand wurde in ein HPLC (high performance liquid chromatographie)-Probengefäß überführt und konnte nun der Messung zugefügt werden.
Die Herstellung der Kalibratoren und Qualitätskontrollproben für die Matrizen BAL- Puffer und BAL-Zelllysat erfolgte ähnlich wie die Plasmaproben. 200 µl BAL-Puffer oder Zelllysat (HEK-Zellen in PBS als Leermatrix) wurden mit der für die oben genannten Konzentrationen der Kalibratoren benötigten Menge der Arbeitslösungen versetzt und analog zu den Plasmaproben mit der Arbeitslösung des internen Standards, Zitronensäure-Lösung und ACN intensiv vermischt. Die Zelllysat-Proben wurden anschließen für fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, darauf folgte eine Inkubation im Ultraschallbad für fünf Minuten. Sowohl der BAL-Puffer als auch das Zelllysat wurden im nächsten Schritt für 10 Minuten bei 14.900 U/min zentrifugiert und im Anschluss für 15 Minuten mittels Vakuumzentrifugation eingeengt. Der klare Zentrifugationsüberstand wurde in ein HPLC-Probengefäß überführt und der Messung zugeführt.
