Pharmakokinetik und Verteilung von Gamithromycin nach intravenöser
Injektion in Fohlen
INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
Vorgelegt von Tanja Randow
Kiel
Hannover 2015
1. Gutachterin: PD Dr. Monica Venner PhD, Dipl. ECEIM Klinik für Pferde
2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. M. Kietzmann
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie, Tierärztliche Hochschule Hannover
Tag der mündlichen Prüfung: 02.11.2015
Meiner Familie -
In Liebe und
Dankbarkeit
Inhalt
1 Einleitung ... 1
2 Literaturübersicht ... 3
2.1 Übersicht über die Rhodococcus equi-Pneumonie ... 3
2.1.1 Rhodococcus equi ... 3
2.1.2 Erkrankung durch R. equi ... 3
2.1.2.1 Pneumonie ... 3
2.1.2.2 Extrapulmonale Erkrankungen ... 5
2.1.3 Diagnose ... 5
2.2 Therapie der Rhodokokkose ... 6
2.2.2 Alternative Antibiotika ... 11
2.2.3 Begleitmaßnahmen ... 13
2.3 Allgemeines über Gamithromycin ... 13
2.4 Pharmakokinetik von Gamithromycin ... 15
2.4.1 Rind s.c./i.v. ... 15
2.4.2 Schwein s.c./i.v. ... 16
2.4.3 Broiler s.c./i.v. ... 17
2.4.4 Fohlen i.m... 18
2.5 Ziel der vorliegenden Arbeit ... 19
3 Material und Methode ... 21
3.1 Probanden ... 21
3.1.1 Haltungsbedingungen ... 21
3.1.2 Einschlusskriterien ... 21
3.2 Methoden ... 22
3.2.1 Untersuchung der Fohlen ... 22
3.2.1.1 Allgemeine und spezielle Untersuchung der Fohlen ... 22
3.2.1.2 Bestimmung der Blutleukozytenzahl ... 22
3.2.1.3 Ultrasonographische Untersuchung der Lunge ... 23
3.2.2 Wiegen der Fohlen ... 23
3.3 Studiendesign... 24
3.3.1 Ablauf der Studie ... 24
3.3.1.1 Untersuchung und Wiegen der Fohlen ... 24
3.3.1.2 Verabreichung des Antibiotikums ... 24
3.3.1.4 Blutprobenentnahme und bronchoalveoläre Lavage ... 25
3.3.2 Blutprobenentnahme zur Bestimmung der Konzentration von Gamithromycin und dessen Metaboliten ... 25
3.3.3 Bronchoalveoläre Lavage ... 26
3.4 Analytische Untersuchungen der Proben ... 28
3.4.1 Aufbewahrung und Aufarbeitung der Proben ... 28
3.4.1.1 Herstellung der Stamm- und Arbeitslösungen ... 28
3.4.1.2. Ansatz und Aufarbeitung der Kalibratoren und ... 29
3.4.1.3 Aufbereitung der Plasmaproben, der broncho-alveolären Zellen (BALC) und des BAL-Überstandes ... 30
3.4.2 Flüssigkeitschromatographie (LC) mit nachgeschalteter Tandemmassenspektroskopie (MS/MS-System) ... 31
3.4.3 Bestimmung des Volumens der pulmonary epithelial lining fluid (PELF) ... 34
3.4.3.1 Berechnung der Arzneimittelkonzentration in der PELF ... 35
3.4.4 Bestimmung der Arzneimittelkonzentration in den BALC ... 36
3.4.5 Bestimmung der pharmakokinetischen Parameter ... 37
4 Ergebnisse ... 38
4.1 Nebenwirkungen des Antibiotikums ... 38
4.2 Volumen der zurückgewonnenen bronchoalveolären Lavageflüssigkeit (BALF) und der PELF ... 38
4.3 Konzentration des Gamithromycins und dessen Metaboliten im Plasma ... 38
4.4 Konzentration des Gamithromycins und dessen Metaboliten in der PELF ... 42
4.5 Konzentration des Gamithromycins und dessen Metaboliten in den BALC ... 42
4.6 Verhältnisse... 42
4.6.1 CPELF/CPlasma24h ... 43
4.6.2 CBALC/CPlasma24h ... 43
4.6.3 CBALC/CPELF ... 43
5 Diskussion ... 44
5.1 Probanden ... 44
5.2 Studiendesign... 44
5.3 Nebenwirkungen von Gamithromycin ... 45
5.4 Auswertungen der Zellzahl, der bronchoalveolären Flüssigkeit und der pulmonary epithelial lining fluid ... 46
5.5 Konzentration von Gamithromycin im Plasma von Fohlen ... 47
5.6 Verteilung und pulmonale Penetration von Gamithromycin ... 49
5.6.1 Konzentration in PELF ... 50
5.6.2 Konzentration in BALC ... 51
5.7 Unterschiede Gamithromycin und Declad-Gamithromycin ... 52
5.8 Betrachtung der Konzentration von Gamithromycin im Hinblick auf die erforderliche MHK von R. equi für dieses Antibiotikum ... 52
5.9 Schlussfolgerungen ... 53
6 Zusammenfassung ... 55
7 Summary ... 57
8 Literaturverzeichnis ... 59
9 Anhang ... 69
Abbildungsverzeichnis ... 83
Tabellenverzeichnis ... 84
Danksagung ... 86
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
AUC area under the curve
AZT Azithromycin
BAL bronchoalveoläre Lavage
BALC bronchoalveoläre Lavage Zellen BALF bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit
BRD bovine respiratory disease
bzw. beziehungsweise
°C Grad Celsius
CLR Clarithromycin
Cm Zentimeter
Cmax höchste Konzentration
d Tag
Da Dalton
dl Deziliter
EDTA Äthylendiamintetraessigsäure
ERY Erythromycin
et al. et alii
F Bioverfügbarkeit
g Gramm
g Erdbeschleunigungskonstante
GAM/GAMI Gamithromycin
GZ Gigazelle
h Stunde
HI-Virus humanes Immundefizienzvirus
HPLC high performance liquid chromatography H. somni Histophilus somni
i.m. intramuskulär
IS Interner Standard
i.v. intravenös
kg Kilogramm
KGW Körpergewicht
l Liter
LC-MS/MS liquid chromatography with tandem masspectrometry (Flüssigkeitschromatografie mit Tandem-
Massenspektrometrie) M. haemolytica Mannheimia haemolytica
MHK50/MHK90 minimale Hemmstoffkonzentration, bei der 50/90% aller Keime gehemmt werden
MHz Megahertz
Min. Minuten
mg Milligramm
µl Mikroliter
ml Milliliter
mM Millimolar
mm Millimeter
MTBE Methyl-tert-buthylether
MW Mittelwert
ng Nanogramm
PAE post-antibiotischer Effekt
PAR Peak-Area-Ratio
PBS phosphatgepufferte Salzlösung (phosphate buffered saline)
PCR polymerase chain reaction (Polymerase Kettenreaktion) PELF pulmonary epithelial lining fluid
pH potentia Hydrogenii (Stärke des Wasserstoffs) P. multocida Pasteurella multocida
p.o. per os
QK Qualitätskontrolle
R. equi Rhodococcus equi
RIF Rifampicin
RNA Ribonukleinsäure
s.c. subkutan
SD Standardabweichung
Str. zooepidemicus Streptococcus equi ssp. Zooepidemicus
Ssp Subspezies
Tab. Tabelle
t1/2 Halbwertszeit
TBS Tracheobronchialsekret
tmax Zeitpunkt der maximalen Konzentration
TMS Trimethoprim-Sulfonamid
TUL Tulathromycin
U Umdrehung
Urea Harnstoff
V Volumen
V. Vena
Vap Virulenzplasmid
WBC White blood cell, weiße Blutkörperchen
1 Einleitung
Atemwegserkrankungen sind, neben Durchfallerkrankung, die häufigsten Ursachen für Verluste in der Fohlenaufzucht. Dabei ist das Bakterium Rhodococcus equi (R. equi) ein der bedeutendsten Erreger und ruft eine Pneumonie mit hoher Morbidität und bei unbehandelten Fällen hoher Mortalität hervor.
R. equi ist ein gram-positiver, fakultativ intrazellulärer Erreger, der sich vorwiegend in den Alveolarmakrophagen vermehrt. Obwohl er weltweit im Boden zu finden ist, kommt die Erkrankung auf vielen Gestüten nicht vor, auf einigen nur sporadisch oder endemisch.
Er verursacht eine chronische, abszedierende Bronchopneumonie von der vorwiegend Fohlen im Alter von 1 - 4 Monaten betroffen sind (GIGUÈRE et al. 2011a).
Aufgrund seines intrazellulären Vorkommens und des verkäsenden Charakters der Läsionen sind viele Antibiotika zwar in vitro wirksam, aber in vivo unwirksam. Ein lipophiler Charakter ist wichtig, damit die Antibiotika an den Ort des Geschehens gelangen können.
Makrolide in Kombination mit Rifampicin haben sich als die wirksamsten Mittel zur Therapie der Rhodokokkose erwiesen. Mit der Einführung von Erythromycin in den 1980er Jahren konnte die Mortalitätsrate durch R. equi von etwa 80% auf rund 10%
gesenkt werden (HILLIDGE 1987). Vor allem die neueren Makrolide wie Azithromycin oder Clarithromycin reichern sich in hohem Maße in der Lunge und in Makrophagen an, was ihre gute Wirksamkeit gegen R. equi bedingt. Ein Nachteil dieser Makrolide ist jedoch ihre relativ kurze Halbwertszeit, weswegen sie sehr häufig, meist 1 – 2 mal am Tag, verabreicht werden müssen. Ein Wirkstoff mit einer längeren Halbwertszeit, welcher weniger häufig verabreicht werden müsste, würde den Arbeitsaufwand der Behandlung verringern und somit einerseits die Kosten senken und andererseits die Kooperationsbereitschaft der Halter verbessern.
Gamithromycin ist ein neues Makrolid und weist nach intramuskulärer Gabe im Fohlen eine Halbwertszeit von 39 Stunden im Plasma und 70 Stunden in den Alveolarmakrophagen auf und muss somit nur einmal pro Woche verabreicht werden (BERGHAUS et al. 2011). Ein nicht unerheblicher Nachteil sind aber die sehr
schmerzhaften lokalen Reaktionen, die es am Injektionsort hervorruft und die zu teils deutlicher Lahmheit führen. Daher ist die intramuskuläre Applikation von Gamithromycin aus tierschutzrechtlichen Gründen beim Fohlen nicht zu empfehlen.
Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, Daten zur Pharmakokinetik von Gamithromycin nach intravenöser Gabe sowie deren Sicherheit im Fohlen zu sammeln. Sollte sich zeigen, dass Gamithromycin nach intravenöser Gabe sicher ist und wirksame Konzentrationen in der Lunge erreicht, kann diese als alternative Methode für die Behandlung der Rhodokokkose mit Gamithromycin in Betracht gezogen werden, da so die lokalen Reaktionen umgangen werden.
2 Literaturübersicht
2.1 Übersicht über die Rhodococcus equi-Pneumonie 2.1.1 Rhodococcus equi
Rhodococcus equi (R. equi) ist ein weltweit vorkommender, grampositiver, ubiquitärer Bodensaprophyt (BARTON u. HUGHES 1984; TAKAI et al. 1986). Er ist im Darm von Fohlen und adulten Pferden sowie anderen herbivoren Tieren zu finden und seine Vermehrung im Boden wird durch die Anwesenheit von Pferdekot begünstigt (BARTON u. HUGHES 1984; HUGHES u. SULAIMAN 1987).
Er ist der häufigste Erreger schwerer Pneumonien bei Fohlen im Alter von 1 bis 6 Monaten (COHEN u. MARTENS 2007).
Die orale Aufnahme mit dem Futter oder durch Koprophagie führt in erster Linie zu einer transienten Besiedelung des Darmes mit Immunitätsentwicklung (PRESCOTT 1991) und nur bei hohen Mengen virulenter Bakterien zu einer Erkrankung (JOHNSON et al. 1983a).
Bedingend für die Entstehung einer Erkrankung im Fohlen sind das Virulenzplasmid, welches essentiell ist für die Vermehrung von R. equi in Makrophagen sowie für das Verzögern der Fusion des Phagosoms mit dem Lysosom (BARGEN u. HAAS 2009;
GIGUERE et al. 2011a), sowie das darauf kodierte Virulenz-assoziierte-Protein A (VapA) (TAKAI 1997; MUSCATELLO 2012a).
Obwohl R. equi überall gleichermaßen im Boden vorkommt, tritt die durch R. equi hervorgerufene Pneumonie auf einigen Gestüten endemisch, auf anderen sporadisch und auf der Mehrzahl überhaupt nicht auf (COHEN u. MARTENS 2007).
2.1.2 Erkrankung durch R. equi 2.1.2.1 Pneumonie
Die durch R. equi hervorgerufene Erkrankung ist eine chronisch verlaufende pyogranulomatöse Bronchopneumonie mit Abszessbildung (GIGUERE et al. 2011a;
MUSCATELLO 2012a). Sie tritt hauptsächlich bei Fohlen im Alter von 1 bis 6 Monaten auf, vorwiegend vor dem vierten Lebensmonat (GIGUERE u. PRESCOTT 1997;
GIGUERE et al. 2011a).
Der Verlauf ist durch eine sehr lange, subklinische Phase gekennzeichnet, bei der das erkrankte Fohlen allenfalls durch geringgradig erhöhte Körpertemperatur und leicht erhöhte Atemfrequenz auffällt (GIGUERE 2001). Die klinische Manifestation ist sehr variabel, abhängig von Schweregrad und Verteilung der Läsionen und ist nicht pathognomonisch.
Lethargie und Fieber, zwischen 38,8°C und 40,0°C bis zu 41,5°C, sind häufig zu finden, bei Fortschreiten der Krankheit kommen Tachypnoe und verstärkt abdominale Atmung mit geblähten Nüstern hinzu (GIGUERE u. PRESCOTT 1997; COHEN u.
MARTENS 2007). Husten und ein- oder beidseitiger Nasenausfluss können auftreten, sind aber nicht immer zu finden (GIGUERE u. PRESCOTT 1997; COHENS u.
MARTENS 2007). Zu Beginn ist der Appetit noch erhalten und das Fohlen saugt weiter, doch bei längerem, chronischem Verlauf kann es zu Anorexie kommen und somit zu einem Abmagern der betroffenen Fohlen (GIGUERE u. PRESCOTT 1997).
Die bei der Auskultation erhobenen Befunde sind sehr variabel und korrelieren meist sehr schlecht mit dem Schweregrad der Erkrankung. Sie variieren zwischen verstärkten oder gedämpften Atemgeräuschen sowie giemenden oder rasselnden Nebengeräuschen (GIGUERE u. PRESCOTT 1997).
Die Infektion findet über das Einatmen aerosolierten Staubes, der mit R. equi kontaminiert ist, statt (MUSCATELLO et al. 2006).
Die Inkubationszeit ist bisher nicht genau bekannt (GIGUERE et al. 2011a).
Zuweilen kann auch ein subakuter Verlauf der Pneumonie beobachtet werden. Hierbei werden die Fohlen entweder tot aufgefunden oder, häufiger, fallen durch akute Atemnot sowie hohes Fieber auf (HEIDMANN et al. 2006). Diese Fohlen sterben häufig nach wenigen Tagen, trotz sofortiger, aggressiver Therapie. Während der Sektion wird bei diesen Fohlen vielfach eine über die ganze Lunge verteilte, diffuse
miliare pyogranulomatöse Pneumonie gefunden, welche auf eine bereits seit längerem bestehende Infektion hinweist (GIGUERE u. PRESCOTT 1997).
Eine durch R. equi hervorgerufene Pneumonie tritt äußerst selten bei Menschen auf, insbesondere bei durch den HI-Virus immunsupprimierten Patienten (YAMSHCHICOV et al. 2010).
Bei Schweinen kommt eine cervicale Lymphadenitis vor, die mit VapB-exprimierenden R. equi assoziiert ist (MUSCATELLO 2012a).
2.1.2.2 Extrapulmonale Erkrankungen
Andere durch R. equi hervorgerufene Erkrankungen kommen parallel zu einer Pneumonie vor oder aber auch bei Patienten ohne Lungenerkrankung (GIGUERE et al. 2011a; CHAFFIN u. MARTENS 1997). Dazu zählen Diarrhoe aufgrund einer pyogranulomatösen Typhlocolitis oder als Folge der antimikrobiellen Therapie sowie Abszessbildung an intraabdominalen Organen. Des Weiteren können Synovitiden, Osteomyelitiden und Defekte am Auge in unterschiedlicher Häufigkeit auftreten.
Die Entstehung dieser extrapulmonären Erkrankungen ist zum Teil bedingt durch eine Immunkomplex-vermittelte Reaktion, zum anderen aber auch durch hämatogene Streuung der Bakterien während einer bakteriämischen Phase (GIGUERE et al.
2011a).
2.1.3 Diagnose
Es gibt kein Verfahren, durch das alleinig eine eindeutige Diagnose einer R. equi- Pneumonie gestellt werden kann. Vielmehr stützt sie sich auf eine Vielzahl hinweisender Faktoren die im Zusammenhang interpretiert werden müssen (MUSCATELLO 2012b). Hierbei sind die oben genannten klinischen Symptome häufig hinweisend und sollten eine weitergehende Untersuchung bedingen.
Diese sollte eine hämatologische Untersuchung beinhalten (HEIDMANN et al. 2006;
LÄMMER et al. 2008), wie die Bestimmung der Blutleukozytenzahl und des
Fibrinogenwertes. Ein Wert von über 15.000 Zellen/µl Blut für die Leukozyten (GIGUÈRE et al. 2003) und von über 600 mg/dl Fibrinogen (HEIDMANN et al. 2006) korrelieren mit einem erhöhten Risiko der R. equi-Pneumonie.
Bildgebende Verfahren des Thorax, wie Radiologie oder Sonographie, geben Auskunft über mögliche pathologische Veränderungen innerhalb der Lunge und deren Ausmaß.
Zudem sind sie ein gutes Mittel, um den weiteren Verlauf und die Wirksamkeit der Therapie zu bewerten (GIGUERE et al. 2011b).
Für die definitive Diagnose einer R. equi-Pneumonie bedarf es jedoch des Nachweises des Erregers (GIGUERE et al. 2011b). Dieser wird durch kulturelle Anzucht oder eine PCR aus einer Tracheobronchialsekret-Probe (TBS) geführt. Das TBS kann entweder durch transtracheale oder endoskopisch geführte Aspiration gewonnen werden. Die Kultur gilt als Goldstandard, obwohl zum Teil negative Resultate bei infizierten Fohlen als auch positive durch transiente Besiedelung vorkommen (COHEN u. MARTENS 2007; MUSCATELLO 2012b; VENNER et al. 2007b). Daher sollte das Ergebnis immer in Zusammenhang mit den Ergebnissen anderer diagnostischer Verfahren interpretiert werden (AINSWORTH 1999; GIGUERE et al. 2011b).
Zur Unterscheidung zwischen virulenten und avirulenten Stämmen kann die PCR herangezogen werden (TAKAI et al. 1997).
Die Serologie ist für die Diagnose einer R. equi-Infektion aufgrund dessen ubiquitären Vorkommens nicht geeignet. Es kann nämlich nicht zwischen Antikörpern aufgrund einer akuten Infektion, Immunitätsbildung oder kolostraler Übertragung unterschieden werden (COHEN u. MARTENS 2007; GIGUERE et al. 2011b).
2.2 Therapie der Rhodokokkose
In vitro sind eine Vielzahl antimikrobieller Stoffe gegen R. equi wirksam, jedoch zeigen sich nur wenige davon auch als in vivo wirksam (GIGUERE et al. 2012). Dies hängt mit dem vorwiegend intrazellulären Vorkommen des Erregers sowie dem verkäsenden Charakter der Läsionen zusammen (COHEN u. MARTENS 2007). Nicht viele Antibiotika sind in der Lage, in ausreichender Konzentration in die Zellen bzw. in das verkäste Material zu gelangen, in dem sich R. equi befindet. Hierfür ist ein lipophiler
Charakter Voraussetzung. So reduziert sich die Wahl der Antiinfektiva auf Rifampicin und die Makrolide.
Seit den 1980er Jahren ist die Kombination eines Makrolids mit Rifampicin das Mittel der Wahl für die Behandlung der Rhodokokkose beim Fohlen (GIGUERE et al. 2011b, COHEN u. MARTENS 2007). Mit der Einführung der Therapie durch die Erythromycin/Rifampicin-Kombination konnte die Genesungsrate bei an R. equi- Pneumonie erkrankten Fohlen von 20% auf knapp 90% erhöht werden (HILLIDGE 1987).
Makrolide sind lipophil, mit einem basischen Charakter und einem relativ kleinen Molekulargewicht von unter 1000 Da (VILLARINO u. MARTÍN-JIMÉNEZ 2012). Durch ihren lipophilen Charakter und ihr relativ kleines Molekulargewicht gelangen sie leicht durch Membranen ins Innere von Zellen. Aufgrund ihrer Eigenschaften als Base dissoziieren sie im sauren intrazellulären Milieu und können dann nicht mehr einfach aus der Zelle hinausdiffundieren (Ionenfalle) (VILLARINO u. MARTÍN-JIMÉNEZ 2012).
Vor allem in Makrophagen, insbesondere den bronchoalveolären Lavage-Zellen (BALC), reichern sie sich stark an. Der Vorteil hierbei ist, dass Makrophagen zum einen der bevorzugte Replikationsort von R. equi sind, zum anderen dienen sie auch als Transportmittel zum Ort des Geschehens.
Weitere allgemeingültige Eigenschaften der Makrolide sind ihre geringe Plasmakonzentration sowie ihr hohes Verteilungsvolumen, welches darauf hinweist, dass sie sich stark außerhalb des Plasmas anreichern (VILLARINO u. MARTÍN- JIMÉNEZ 2012). In Studien konnte gezeigt werden, dass dies vor allem das Lungengewebe sowie die pulmonary epithelial lining fluid (PELF) sind (VILLARINO u.
MARTÍN-JIMÉNEZ 2012).
Ihre Wirkung ist bakteriostatisch und beruht auf einer Bindung an die 50S-Untereinheit der Ribosomen, wodurch sie die Proteinsynthese unterbinden (ANADON u. REEVE- JOHNSON 1999). In In-vitro-Studien konnte jedoch für einige Wirkstoffe eine bakterizide Wirkung in Abhängigkeit von der Konzentration oder der Zeit nachgewiesen werden, so zeigt zum Beispiel Gamithromycin bereits bei der zweifachen MHK90 eine bakterizide Wirkung gegen die typischen Erreger der BRD (Mannheimia haemolytica (M. haemolytica), Pasteurella multocida (P. multocida) und
Histophilus somni (H. somni)) (HUANG et al. 2009; VILLARINO u. MARTÍN-JIMÉNEZ 2012). Makrolide zählen zu den zeit-abhängigen Antibiotika (CARBON 1998;
GIGUERE et al. 2012), das heißt, für ihre Wirkung ist entscheidend, dass ihre Konzentration konstant über den MHK-Werten liegt.
Zudem entwickeln sie, abhängig von Erreger und Wirkstoff, einen unterschiedlich lang andauernden postantibiotischen Effekt (PAE) (CARBON 1998; GIGUÈRE et al. 2012).
Erythromycin
Erythromycin (ERY) war das erste Makrolid, das, in Kombination mit Rifampicin, bei der Rhodokokkose eingesetzt wurde und zu einer deutlichen Steigerung der Überlebenschancen erkrankter Fohlen führte (HILLIDGE 1987).
Die orale Bioverfügbarkeit von Erythromycin in Fohlen ist gering (<20%) und zudem variabel (VILLARINO u. MARTÍN-JIMÉNEZ 2012; SUAREZ-MIER et al. 2007). Die Aufnahme nach oraler Gabe wird stark von der Futteraufnahme beeinflusst, da Erythromycin als Base sehr säurelabil ist und somit leicht von der Magensäure inaktiviert wird (VILLARINO u. MARTÍN-JIMÉNEZ 2012).
Zudem reichert sich Erythromycin deutlich weniger stark in den BALC und der PELF an als es die neueren Makrolide tun (SUAREZ-MIER et al. 2007).
Aufgrund seiner kurzen Halbwertszeit und seiner geringen Anreicherung am Wirkungsort muss ERY mehrmals täglich in recht hohen Dosen verabreicht werden (25 mg/kg 3-4 x täglich) (GIGUÈRE 2011b).
Die unerwünschten Arzneimittelwirkungen im Zusammenhang mit Erythromycin sind auch nicht zu vernachlässigen. Zwar ist meist bei den Fohlen nicht mehr als eine milde, selbstlimitierende Diarrhoe zu bemerken (HILLIDGE 1987), es kann aber auch zu stärkeren Durchfällen kommen, die ein Aussetzen oder Umstellen der Therapie nötig machen (GIGUÈRE et al. 2011b). Zudem könnte bei Mutterstuten, deren Fohlen oral mit Erythromycin behandelt wurden, eine fatal verlaufende Colitis aufgrund einer Dysbakterie beobachtet werden (STRATTON-PHELPS et al. 2000). Dies wurde auf eine Aufnahme geringer Mengen Erythromycin, entweder durch Koprophagie oder durch kontaminiertes Wasser oder Futter, zurückgeführt (GIGUÈRE 2011b). Die Symptome konnten durch eine orale Verabreichung subtherapeutischer Dosen
reproduziert werden (GUSTAFSSON et al. 1997). Eine weitere Nebenwirkung ist das Auftreten einer idiosynkratischen Hyperthermie und Tachypnoe, vor allem bei hohen Umgebungstemperaturen (STRATTON-PHELPS et al. 2000).
Clarithromycin
Clarithromycin (CLR) gehört zu den neueren Makroliden und wird häufig in der Humanmedizin verwendet (JACKS et al. 2002).
Die Bioverfügbarkeit von 57% nach oraler Gabe in Fohlen ist deutlich höher als die von Erythromycin (WOMBLE et al. 2006, JACKS et al. 2002), da CLR aufgrund seiner Struktur säurestabiler ist. Die Halbwertszeit von CLR ist länger als die von ERY, aber kürzer als bei Azithromycin (AZT) (WOMBLE et al. 2006). Die Spitzenkonzentrationen, die CLR in den BALC und der PELF erreicht, sind deutlich höher als die von AZT oder ERY (WOMBLE et al. 2006), aber aufgrund der kürzeren Halbwertszeit fällt die Konzentration schneller wieder ab als bei AZT.
Aufgrund seiner höheren Konzentration am Wirkungsort und seiner längeren Halbwertszeit muss CLR nicht so häufig gegeben werden wie ERY (7,5 mg/kg KGW zweimal täglich) (JACKS et al. 2002).
Als unerwünschte Arzneimittelwirkung treten auch bei CLR milde, selbstlimitierende Durchfälle auf (WOMBLE et al. 2006).
Azithromycin
Azithromycin (AZT) ist ein Azalid. Azalide sind eine Untergruppe der Makrolide, bei denen eine Stickstoffgruppe an einem der Ringe gebunden ist (DAVIS et al. 2002).
Dadurch werden diese stabiler.
In Kombination mit Rifampicin wird AZT inzwischen deutlich häufiger in der Therapie der Rhodokokkose beim Fohlen als ERY angewendet (GIGUERE et al. 2011b;
MUSCATELLO 2012b). Die orale Bioverfügbarkeit des AZT ist mit 56% in Fohlen (JACKS et al. 2001) in etwa dieselbe wie die von CLR. AZT erreicht nicht so hohe Konzentrationen in den BALC und der PELF wie CLR, dafür bleibt es länger vor Ort, da die Halbwertszeit bedeutend länger ist (COHEN u. MARTENS 2007). Daher kann AZT auch in längeren Intervallen gegeben werden als CLR (10 mg/kg/d, nach einer
Woche kann das Intervall auf jeden zweiten Tag erhöht werden) (COHEN u.
MARTENS 2007). Auch Tage nach Beendigung der Therapie kann AZT noch am Wirkungsort nachgewiesen werden (WOMBLE et al. 2006).
Tulathromycin
Tulathromycin (TUL) ist ein neues Makrolid und gehört in die Untergruppe der Triamilide. Es ist als Injektionspräparat in Form einer 10%igen Lösung erhältlich. Seine Halbwertszeit ist sehr lang (7.6 Tage im Lungengewebe von Rindern, 6 Tage im Lungengewebe von Schweinen (CARLSON et al. 2010), 105 ± 25 h im Serum von Fohlen nach einmaliger intramuskulärer Gabe (VILLARINO u. MARTÍN-JIMÉNEZ 2012)), weswegen es nur einmal pro Woche verabreicht werden muss. Die Dosierung ist 2,5 mg/kg i.m. alle sieben Tage (VENNER et al. 2007a). Obwohl es sich, wie auch CLR und AZT (VENNER et al. 2010), in der PELF und den BALC anreichert, muss die Wirksamkeit in Frage gestellt werden, da die minimale Hemmstoffkonzentration, bei der 90% der Erreger abgetötet werden (MHK90), von TUL für R. equi bei >64 µg/ml liegt, weit über der Konzentration, die in den BALC und der PELF erreicht wird (BALC 24h nach letzter Gabe: 0.20 ± 0.08 µg/ml (single dose), 1.56 ± 1.02 µg/ml (steady state nach Monotherapie), 0.84 ± 0.36 µg/ml (steady state in Kombination mit RIF); PELF 24h nach letzter Gabe: 1.52 ± 1.14 µg/ml (single dose), 1.66 ± 0.91 µg/ml (steady state nach Monotherapie), 1.03 ± 0.56 µg/ml (steady state in Kombination mit RIF) (VENNER et al. 2010)) (CARLSON 2010). Dennoch konnte keine schlechtere Wirkung in einer Studie im Vergleich mit AZT/RIF nachgewiesen werden, lediglich die Dauer der Therapie war verlängert (VENNER et al. 2007a).
Kombination Rifampicin mit einem Makrolid
Rifampicin ist, wie auch die Makrolide, lipophil, reichert sich in phagozytischen Zellen an und zeigt eine bakteriostatische Wirkung (GIGUERE u. PRESCOTT 1997). Die empfohlene Dosierung ist 5 -10 mg/kg zweimal täglich (COHEN u. MARTENS 2007).
Die Kombination von zwei Wirkstoffen wird aus verschiedenen Gründen empfohlen.
Einerseits reduziert sie die Wahrscheinlichkeit einer Resistenzentwicklung gegen einen der beiden Stoffe (COHEN u. MARTENS 2007), da die Wirkung der beiden
Stoffe auf verschiedenen Mechanismen beruht. Somit können Bakterien, die gegen einen der Stoffe eine Resistenz ausgebildet haben, noch von dem anderen abgetötet werden. Anderseits wurde für ERY, CLR und AZT in Kombination mit RIF eine synergistische Wirkung festgestellt, welche die Wirksamkeit der einzelnen Stoffe potenziert (GIGUERE et al. 2012).
Im Gegensatz dazu wurde jedoch in verschiedenen Studien festgestellt, dass bei einer gemeinsamen chronischen Gabe das RIF die Konzentration der Makrolide im Serum sowie in den BALC und der PELF deutlich senkt, zum Teil sogar bis unter die MHK90
für R. equi (VENNER et al. 2010; PETERS et al. 2011).
2.2.2 Alternative Antibiotika
Aufgrund des vorwiegend intrazellulären Replikationsortes sowie des verkäsenden Charakters der durch R. equi hervorgerufenen Läsionen sind viele in vitro wirksame Antibiotika in vivo unwirksam (COHEN u. MARTENS 2007). Dies stellt ein Problem dar, wenn Infektionen durch Makrolid-resistente Stämme hervorgerufen werden oder starke Nebenwirkungen auftreten, die ein Fortführen der Therapie mit Makroliden verhindern (GIGUÈRE et al. 2011b). Nur einige wenige Antibiotika kommen als Alternativen für die Makrolid-Rifampicin-Kombination in Frage.
Doxycyclin
Doxycyclin reichert sich nach oraler Gabe deutlich im Lungengewebe, der PELF und phagozytischen Zellen an. Nach Gaben von 10 mg/kg per os zweimal täglich wurden Konzentrationen oberhalb der MHK90 für R. equi in Serum, PELF und BALC erreicht und gehalten (WOMBLE et al. 2007).
Doxycyclin wirkt bakteriostatisch und zeigt in Kombination mit RIF oder einem Makrolid einen deutlich synergistischen Effekt (GIGUÈRE et al. 2012), so dass auch hier eine Kombination möglich und sinnvoll erscheint. Allerdings traten in einer Studie von VENNER et al. (2013), in der die Effektivität unterschiedlicher Antibiotika für die Behandlung pulmonaler Abszesse beim Fohlen verglichen wurde, bei der Kombination Doxycyclin/Rifampicin starke, lebensbedrohliche Nebenwirkungen auf. Bei drei von 17
Fohlen traten eine hämolytische Anämie und ein Ikterus 17-20 Tage nach Therapiebeginn auf, wovon eines euthanasiert werden musste. Bei einem weiteren Fohlen wurden an Tag neun der Therapie erhöhte Leberwerte nachgewiesen und die Therapie abgebrochen. Bei den restlichen dreizehn Fohlen, die mit Doxycyclin/Rifampicin behandelt wurden, wurde die Behandlung bis zum Ende fortgeführt.
In anderen Studien, in denen Fohlen mit dieser Kombination behandelt wurden, traten keine dieser unerwünschten Wirkungen auf. Daher ist nicht eindeutig klar, ob die Symptome in Zusammenhang mit der Therapie standen oder sich unabhängig davon entwickelt haben. Dennoch sollten sie bei einer Therapie mit dieser Kombination Beachtung finden und die Fohlen strenger dahingehend kontrolliert werden.
Chloramphenicol
Chloramphenicol erreicht nach oraler Gabe (50 mg/kg alle 6 Stunden) hohe Konzentrationen in phagozytischen Zellen. Es sind jedoch nur etwa 70% aller R. equi- Isolate empfänglich für Chloramphenicol. Dies und die Tatsache, dass Chloramphenicol ein hohes Gefährdungsrisiko für die menschliche Gesundheit trägt, machen es zu einer wenig attraktiven Alternative (GIGUÈRE 2011b). Zudem ist die Anwendung von Chloramphenicol beim lebensmittelliefernden Tier in Deutschland verboten.
Trimethoprim-Sulfonamid
Zur Wirksamkeit der Kombination Trimethoprim-Sulfonamid (TMS) gibt es in der Literatur widersprüchliche Ergebnisse. So zeigten VAN DUIJKEREN et al. (1995), das bei einer Dosierung von 5 mg/kg (Trimethoprim) und 25 mg/kg Sulfonamid oral alle 12 Stunden Konzentrationen im Plasma oberhalb des MHK90 für R. equi erreicht wurden und auch eine ausreichende Anreicherung in der Lunge stattfand. In einer Studie von SWEENEY et al. (1987) waren 88% der untersuchten equinen R. equi sensibel gegenüber der Kombination Trimethoprim/Sulfonamid (getestet nach Kirby-Bauer). In derselben Studie konnten 4 von sechs mit Trimethoprim/Sulfonamid (2,5 mg/kg) behandelte Fohlen geheilt werden.
Bereits FEY und SCHMID (1995) sowie BARTON und FULTON (1980) hingegen fanden einen hohen Prozentsatz resistenter R. equi. Bei WILSON (1992) erwiesen sich hohe Dosen (30 mg/kg) als wirksam, wenn sich noch keine Abszesse entwickelt haben. Eine mögliche Erklärung hierfür kann darin liegen, dass TMS nur eine geringe Aktivität in verkästem Material und gegen intrazelluläre Erreger zeigt (GIGUÈRE u.
PRESCOTT 1997).
2.2.3 Begleitmaßnahmen
Wichtig für erkrankte Fohlen ist eine gute Pflege in einer kühlen und gut ventilierten Umgebung (COHEN u. MARTENS 2007; GIGUÈRE 2011b).
Als medikamentelle Begleittherapie haben sich Sekretolytika bei stark verschleimten Atemwegen oder hartnäckig festsitzendem Schleim sowie nicht-steroidale Entzündungshemmer zum Fiebersenken und Steigern des Wohlbefindens gezeigt (COHEN u. MARTENS 2007). Sauerstoff sollte bei akuter Atemnot sowie Zyanose zugeführt werden (GIGUÈRE et al. 2011b), es ist aber darauf zu achten, dass der Sauerstoffmangel dabei nicht durch zu viel Stress verstärkt wird.
Die Therapie der extrapulmonalen Erkrankungen beschränkt sich meist auf die antimikrobielle Therapie der Pneumonie, da diese häufig gemeinsam mit der Pneumonie abklingen (COHEN u. MARTENS 2007). Bei der septischen Arthritis kann jedoch eine lokale, chirurgische Behandlung nötig sein (GIGUÈRE 2011b).
Bei intraabdominalen Abszessen ist die systemische Antibiose meist nicht ausreichend und eine lokale chirurgische Behandlung schwierig durchzuführen, weswegen die Prognose hier deutlich schlechter ausfällt (GIGUÈRE 2011b).
2.3 Allgemeines über Gamithromycin
Gamithromycin ist ein noch recht neues Makrolid und gehört in die Untergruppe der halbsynthetischen Azalide. Es besteht aus einem mehrgliedrigen zentralen Laktonring mit 15-C-Atomen (HUANG et al. 2009). An Position 7a besitzt es ein alkyliertes
Stickstoffatom, welches für die rasche Absorption sowie die lange Wirkungsdauer im Zielgewebe, der Lunge, verantwortlich ist.
Das Molekül ist wasserunlöslich (WATTEYN et al. 2013) und wird hauptsächlich biliär ausgeschieden.
Seine bakteriostatische Wirkung beruht, wie bei den anderen Makroliden auch, auf einer reversiblen Bindung an die 23S-ribosomale RNA der 50S-Untereinheit prokaryontischer Ribosomen und unterbindet so die Elongation der Proteine während des Translokationsprozesses (HUANG et al. 2009).
Da Gamithromycin den gleichen Wirkmechanismus hat wie auch die anderen Makrolide, unterliegt es auch den gleichen Resistenzmechanismen der Bakterien. Zum einen verändern die Bakterien die Bindungsstelle an den Ribosomen durch Methylierung, sodass die Makrolide nicht mehr, oder nicht mehr so gut, binden können, zum anderen erhöhen sie die Anzahl an Efflux-Transportern. Als drittes produzieren sie Enzyme, die die Makrolide abbauen und so unwirksam machen. Diese Mechanismen wirken nicht nur für Makrolide, sondern auch für Lincosamide und Streptogramine (ROBERTS 2008).
Für Makrolide mit 14- oder 15-gliedrigem Laktonring wurden immunodulatorische Eigenschaften nachgewiesen, die unabhängig von ihrer antimikrobiellen Wirkung waren. Unter Immunmodulation versteht man eine Regulation von überschießenden Immunantworten und Entzündungsreaktionen ohne die normale Immun- oder Entzündungsantwort zu beeinflussen (KANOH u. RUBIN 2010). Für Gamithromycin liegen bisher noch keine Studien zu möglichen immunmodulatorischen Eigenschaften vor.
Gamithromycin ist als Injektionspräparat zur Behandlung und Metaphylaxe von Atemwegserkrankungen beim Rind („bovine respiratory disease“, BRD) zugelassen und unter dem Handelsnamen Zactran® (Merial, USA) im Handel erhältlich. Es wird einmalig mit 6 mg/kg Körpergewicht subkutan verabreicht.
Die häufigsten bakteriellen Erreger der BRD sind Mannheimia haemolytica (M.
haemolytica), Pasteurella multocida (P. multocida) und Histophilus somni (H. somni) (FORBES et al. 2011). Die MHK90 für diese Erreger liegen bei 0,5 µg/ml (M.
haemolytica), 1 µg/ml (P. multocida) und 1 µg/ml (H. somni). Ab einer Konzentration,
die der doppelten MHK90 entsprach, konnte sogar eine bakterizide Wirkung in vitro gezeigt werden (HUANG et al. 2009).
In In-vitro-Versuchen wurden bereits MHK90-Werte für R. equi und Streptococcus equi ssp. zooepidemicus (Str. zooepidemicus), die beiden wichtigsten Erreger schwerer Pneumonien bei Fohlen, ermittelt und sind mit 0,125 µg/ml für Str. zooepidemicus und 1,0 µg/ml für Makrolid-empfindliche R. equi vielversprechend niedrig (BERGHAUS et al. 2011).
Die Ergebnisse der Studie von HILDEBRAND et al. (2015) weisen auf eine auch klinische Wirksamkeit von Gamithromycin hin. Hier wurde in einer Doppelblindstudie die klinische Wirksamkeit von Gamithromycin mit derjenigen der Kombination von AZT/RIF und einem Placebo verglichen. Dafür wurden auf einem Warmblutgestüt mit nachgewiesen endemischer Rhodokokkose Fohlen mit einem „Abszessscore“ von 8- 20 cm, welcher sich aus den Durchmessern der ultrasonographisch sichtbaren Veränderungen zusammensetzt, und einer WBC-Zahl von weniger als 23.000 Zellen/µL einer von drei Behandlungsgruppen zugewiesen: AZT/RIF einmal täglich per os (p.o.), Gamithromycin einmal wöchentlich intramuskulär (i.m.) oder ohne Behandlung. Um ein einheitliches Handling zu gewährleisten bekam jede Gruppe zusätzlich einmal täglich Acetylcystein oral verabreicht. Jede Gruppe bestand aus 40 Fohlen.
Zwischen der AZT/RIF und der GAM-Gruppe konnte kein signifikanter Unterschied in der Genesungsrate gesehen werden (AZT/RIF: 98%, GAM: 95%). Die Genesungsrate der Placebo-Gruppe war jedoch signifikant niedriger (78%).
2.4 Pharmakokinetik von Gamithromycin 2.4.1 Rind s.c./i.v.
Die Pharmakokinetik nach einmaliger intravenöser (i.v.) Gabe von 3 mg/kg Gamithromycin haben HUANG et al. (2009) untersucht. Hierbei lag die mittlere Eliminationshalbwertszeit bei 45 ± 5 h und die Clearance bei 712 ± 96 ml/h x kg. Das Verteilungsvolumen ist mit 24,9 l/kg sehr groß und spricht, wie auch für andere
Makrolide bekannt, für eine Anreicherung außerhalb des Plasmas. Auf die Konzentration des Gamithromycins im Plasma gegen Zeit-Kurve fanden die Autoren ein 4-Kompartiment-Modell am passendsten. Das erste Kompartiment ist hierbei die rasche Verteilung und Aufnahme des Gamithromycins in das gut durchblutete Gewebe wie zum Beispiel die Nieren, die Leber oder die Lunge. Die Halbwertszeit in diesem Kompartiment beträgt 2 Minuten und bedingt damit einen sehr raschen Abfall der Kurve. Im zweiten und dritten Kompartiment betragen die Halbwertszeiten 0,2 ± 0,1 h und 4,9 ± 4 h. Im letzten Kompartiment beträgt die Halbwertszeit dagegen 37,1 ± 8,25 h und zeigt die lange, terminale Halbwertszeit im Plasma.
Nach subkutaner (s.c.) Applikation wird Gamithromycin rasch und vollständig absorbiert, mit einer Bioverfügbarkeit von 98 – 112% (HUANG et al. 2009). Die höchste Konzentration im Plasma wird nach einer Stunde erreicht, die in der PELF und den BALC nach 24 Stunden (GIGUÈRE et al. 2011c).
Bereits nach 0,5 h betrug das Verhältnis von BALC bzw. PELF zu Plasma 3,2 bis 16 (GIGUÈRE et al. 2011c), was eine sehr rasche und starke Anreicherung des Gamithromycins in der Lunge zeigt. Dies zeigt sich auch darin, dass die Höchstkonzentrationen in der Lunge die im Plasma um das 247 - 410fache übersteigen (HUANG et al. 2009).
Zudem bleibt das Gamithromycin auch sehr lange in der Lunge, wie die Halbwertzeiten zeigen, welche für die BALC 125 h, das Plasma 62 h und die PELF 50,6 h betragen (GIGUÈRE et al. 2011c).
Im Plasma liegt Gamithromycin zu 26% gebunden vor, es stehen also 74% freies Gamithromycin für die Verteilung zur Verfügung (HUANG et al. 2009).
Gamithromycin ist gut verträglich, in keiner der Studien wurden systemische Nebenwirkungen beobachtet (HUANG et al. 2009; GIGUÈRE et al. 2011c). Zum Teil können jedoch lokale Reaktionen am Injektionsort festgestellt werden. Dies sind meist schmerzhafte Schwellungen und Verhärtungen des umliegenden Gewebes, die größtenteils nach wenigen Tagen wieder abgeklungen waren (MERIAL LTD. 2012).
2.4.2 Schwein s.c./i.v.
Die pharmakokinetischen Eigenschaften von Gamithromycin in Schweinen nach intravenöser und subkutaner Applikation haben WYNS et al. (2014) untersucht. Die Eliminationshalbwertzeit nach i.v.-Gabe betrug 16 h, die Clearance 1,69 ± 0,33 l/h∙kg und das Verteilungsvolumen 31 l/kg.
Nach subkutaner Applikation war die höchste Konzentration im Plasma bereits nach 0,63 ± 0,21 h erreicht und die Eliminationshalbwertzeit lag bei 18,8 h. Die absolute Bioverfügbarkeit lag bei 118%.
Die Plasmaproteinbindung lag bei 23%.
Es konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den Applikationsrouten festgestellt werden.
Ebenso traten keinerlei unerwünschte Wirkungen auf.
Im Vergleich mit der Pharmakokinetik beim Rind war die Clearance größer und somit die Halbwertszeit kürzer, das Verteilungsvolumen war vergleichbar.
In der Studie wurden keine Konzentrationen innerhalb der Lunge bestimmt, so dass auch keine genaue Aussage über die Anreicherung und somit Wirksamkeit in der Lunge getroffen werden kann. Die Autoren gehen jedoch davon aus, dass sich Gamithromycin analog zum Rind und zu anderen Makroliden beim Schwein, deutlich in der Lunge ansammelt und somit wirksam für die Therapie von Lungenentzündungen beim Schwein ist.
2.4.3 Broiler s.c./i.v.
WATTEYNS et al. (2013) haben eine Studie über die Pharmakokinetik von Gamithromycin in Broilern nach intravenöser und subkutaner Applikation durchgeführt.
Die Plasmakonzentration-Zeit-Kurve ist am besten in einem 2-Kompartment-Modell beschrieben, mit einer Halbwertszeit α 0,9 h und β 14,1 h nach i.v.-Gabe sowie einer Clearance von 1,61 ± 0,52 l/h∙kg. Das Verteilungsvolumen war mit 27 ± 7 l/kg sehr groß.
Nach subkutaner Gabe wird Gamithromycin schnell und vollständig resorbiert, mit einer absoluten Bioverfügbarkeit von 102 ± 51 % und dem Erreichen der höchsten
Konzentration bereits nach 0,13 ± 0,04 h. Die Halbwertszeiten waren für α 0,34 h und β 11,6 h, die Clearance war 1,77 ± 0,98 l/h∙kg und das Verteilungsvolumen betrug 21
± 7,5 l/kg.
Einen signifikanten Unterschied zwischen der i.v.- und der s.c.-Applikation gab es nur bei der Eliminationskonstanten und t1/2α.
Im Vergleich mit den Studien bei Rind und Schwein ist die Clearance deutlich größer als beim Rind, was zu einer kürzeren Halbwertszeit führt, jedoch vergleichbar mit der beim Schwein. Auch tmax nach subkutaner Applikation ist bedeutend geringer als bei Rind oder Schwein. Dies führen die Autoren auf die höhere metabolische Rate bei Vögeln zurück, die auch schon für in pharmakokinetischen Studien anderer Arzneimittel nachgewiesen wurde.
In der Studie traten keine unerwünschten Arzneimittelwirkungen auf.
Wie auch bei der Studie von WYNS et al. (2014) wurden keine Konzentrationen in der Lunge ermittelt, was eine Aussage zur Verteilung in diese verhindert.
2.4.4 Fohlen i.m.
BERGHAUS et al. (2011) haben die pharmakokinetischen Eigenschaften von Gamithromycin nach intramuskulärer Applikation in Fohlen untersucht sowie dessen pulmonale Verteilung und In-vitro-Aktivität gegen Str. zooepidemicus und R. equi.
Bereits nach 15 Minuten waren nachweisbare Konzentrationen im Plasma vorhanden und blieben über 168 h. Die höchste Konzentration war im Plasma nach 1 h erreicht, in der PELF, den BALC und den neutrophilen Granulozyten nach 24 h.
Die terminalen Halbwertszeiten betrugen für PELF 63,6 ± 35,0 h, für BALC 70,3 ± 23,8 h, für neutrophile Granulozyten 78,6 ± 16,4 h und für Plasma 39,1 ± 3,12 h. Die Halbwertszeit im Plasma war signifikant kürzer als in der PELF, den BALC und den neutrophilen Granulozyten.
Das Gamithromycin reicherte sich schnell und stark in der PELF, den BALC und den neutrophilen Granulozyten an, bereits nach vier Stunden betrugen die Verhältnisse von PELF/Plasma 4,9 – 70, von BALC/Plasma 26 – 732 und von neutrophilen Granulozyten/Plasma 33 – 563. Cmax war in den BALC (8,91 ± 1,64 µg/ml) und den
neutrophilen Granulozyten (8,35 ± 1,77 µg/ml) signifikant höher als in der PELF (2,15
± 2,78 µg/ml) und dem Plasma (0,333 ± 0,119 µg/ml).
Da keine i.v.-Gabe in dieser Studie durchgeführt wurde, konnten die Bioverfügbarkeit und somit das Verteilungsvolumen und die Clearance nicht bestimmt werden.
Zusätzlich zu der Pharmakokinetik wurden auch die MHK50 und die MHK90 für Str.
zooepidemicus und R. equi in der Studie von BERGHAUS et al. (2011) bestimmt.
Für Makrolid-empfindliche R. equi-Isolate lagen die Werte für die MHK50 und MHK90
bei 1,0 µg/ml, für Makrolid-resistente Isolate waren es 64 µg/mL (MHK50) bzw. 128 µg/ml (MHK90).
Für Str. zooepidemicus lagen die MHK50 bei 0,06 µg/ml und die MHK90 bei 0,125 µg/ml.
In dieser Studie lag die Gamithromycin-Konzentration in der PELF für 7 Tage über der MHK90 für Str. zooepidemicus und für 8 Tage über der MHK90 für R. equi in den BALC und den neutrophilen Granulozyten.
Im Vergleich mit der Studie beim Rind nach subkutaner Applikation lagen die höchsten Konzentrationen im Plasma, der PELF und den BALC deutlich niedriger. Die terminale Halbwertszeit im Plasma war kürzer nach intramuskulärer Applikation im Fohlen als nach subkutaner Applikation beim Rind.
In der Studie von BERGHAUS et al. (2011) zeigte keines der Fohlen unterwünschte Wirkungen.
In einer anderen Studie zur klinischen Effektivität von Gamithromycin (HILDEBRAND et al. 2015), in der eine Gruppe von Fohlen über einen Zeitraum von mindestens 40 Tagen einmal wöchentlich intramuskulär mit Gamithromycin behandelt wurde, wurden in einer hohen Zahl von Fohlen (53%) deutliche, unerwünschte Wirkungen beobachtet.
Diese bestanden zum einen aus milden Koliksymptomen direkt nach der Injektion des Gamithromycins in die Semimembranosus/Semitendinosus-Muskulatur bei 45% der Fohlen sowie deutlicher Lahmheit des Hinterbeines, in das die Injektion geschah (35%). Die Autoren gehen davon aus, da keine weiteren intestinalen Nebenwirkungen wie etwa Durchfall beobachtet wurden, dass die Koliksymptome eher auf Schmerzen an der Injektionsstelle als auf abdominale Schmerzen zurück zu führen waren.
2.5 Ziel der vorliegenden Arbeit
Die bisherige antimikrobielle Therapie ist aufgrund der kurzen Dosierungsintervalle (1- 2 mal pro Tag) sehr arbeitsaufwendig. Ein Wirkstoff wie Gamithromycin mit einer deutlich längeren Halbwertszeit und somit einem deutlich weiteren Dosierungsintervall würde den Arbeitsaufwand senken und somit nicht nur Kosten senken, sondern auch die Kooperationsbereitschaft der Halter erhöhen. Tulathromycin ist ein solcher Wirkstoff, jedoch ist seine Wirksamkeit in Anbetracht der hohen MHK90-Werte für R.
equi nicht sicher gegeben. Gamithromycin wäre hier eine mögliche Alternative.
Aufgrund der doch deutlichen Nebenwirkungen, die in der Studie von HILDEBRAND et al. (2015) beschrieben wurden und sich auch beim Rind bereits angedeutet haben, ist ein intramuskulärer Applikationsweg nicht zu empfehlen. Daher soll in dieser Studie die Pharmakokinetik nach intravenöser Gabe beim Fohlen bestimmt werden, um zu überprüfen, ob diese als möglicher alternativer Applikationsweg in Frage kommt.
3 Material und Methode 3.1 Probanden
Für die Studie wurden 10 gesunde Fohlen, sechs weibliche und vier männliche, im Alter von 42 bis 56 Tagen und einem Gewicht von 105 - 148 kg ausgewählt. Sie kamen alle von demselben deutschen Warmblutgestüt, auf welchem auch die Untersuchungen durchgeführt wurden.
Es handelt sich hierbei um einen genehmigungspflichtigen Tierversuch, welcher vom Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg- Vorpommern (LALLF) unter dem Aktenzeichen 7221.3-1-036/14 genehmigt wurde.
3.1.1 Haltungsbedingungen
Die Fohlen wurden bis mindestens zu ihrem siebten Lebenstag mit ihren Müttern in Einzelboxen gehalten. Danach wurden sie in kleinen Gruppen von acht bis zwölf Stuten-Fohlen-Paaren in Laufställen untergebracht. Diese waren mit Stroh eingestreut und wurden vor der Belegung gereinigt und desinfiziert. Zu diesen gehörte jeweils ein betonierter Auslauf, welcher frei zugänglich war. Zweimal täglich wurden sie mit einem Gras-Maissilage-Mischfutter gefüttert, welches mit Hafer und Mineralfutter angereichert war. Zudem standen Heu, Salzlecksteine und Selbsttränken zur freien Verfügung.
Die Stuten wurden regelmäßig gegen equines Herpesvirus 1 und 4, sowie gegen equine Influenza und Tetanus geimpft, zudem wurden die Fohlen und Stuten regelmäßig mit verschiedenen Wirkstoffen entwurmt.
3.1.2 Einschlusskriterien
Die Fohlen mussten vor Studienbeginn klinisch allgemeingesund und ultrasonographisch lungengesund sein, die Blutleukozytenzahl durfte nicht über 13.000 Zellen/µl Blut liegen.
In den vorangegangenen vier Wochen durften sie keinerlei antibiotische Medikation erhalten haben.
3.2 Methoden
3.2.1 Untersuchung der Fohlen
3.2.1.1 Allgemeine und spezielle Untersuchung der Fohlen
Von Geburt an bis zum Absetzen wurden die Fohlen einmal pro Woche einer klinischen Allgemeinuntersuchung sowie einer speziellen Untersuchung des Respirationstraktes unterzogen.
Dabei wurden die Haltung, das Verhalten, der Ernährungszustand sowie die Kotkonsistenz beurteilt. Adspektorisch wurde auf vermehrt gefüllte Gelenke, Verletzungen oder andere Auffälligkeiten geachtet.
Zudem wurde die Rektaltemperatur gemessen. Der Nabel sowie die Mandibularlymphknoten wurden palpiert.
Es wurde auf Konsistenz und Qualität von eventuellem Nasenausfluss geachtet (serös, mukös, purulent), sowie die Lunge und Trachea an mehreren Stellen auskultiert, wobei der Grad der physiologischen Atemgeräusche und eventuelle Nebengeräusche wie Rasseln oder Giemen bestimmt wurden.
3.2.1.2 Bestimmung der Blutleukozytenzahl
Ebenfalls einmal pro Woche, im Rahmen der allgemeinen Untersuchung, wurden den Fohlen etwa zwei Milliliter Blut abgenommen für die Bestimmung der Anzahl der Leukozyten im Blut.
Dies geschah im wöchentlichen Wechsel aus der rechten bzw. linken Vena jugularis externa mittels Kanüle (BD MicrolanceTM, 1,2mm x 40mm, Becton Dickinson,
Drogheda, Irland). Das Blut wurde direkt in einem EDTA-Kalium-Probenröhrchen (EDTA K, 4 ml, Sarstedt AG, Nümbrecht, Deutschland) aufgefangen.
Zur Messung des Leukozytengehalts wurde ein automatischer Hämatologie- Analysator (Sysmex KX-21N, Sysmex Deutschland GmbH, Hamburg, Deutschland) verwendet, welcher die Anzahl der Leukozyten pro Mikroliter Blut mittels Widerstandsmessung durchführte.
3.2.1.3 Ultrasonographische Untersuchung der Lunge
Wurden im Rahmen der allgemeinen und speziellen Untersuchung eines Fohlens nicht physiologische Befunde erhoben, wurde eine weiterführende, ultrasonographische Untersuchung der Lunge angeschlossen.
Diese erfolgte mithilfe eines transportablen Ultraschallgerätes (Tringa Linear, Esaote Piemedical, Maastricht, Niederlande) mit einem Linearschallkopf mit einer Frequenz von 7,5 MHz, einer Länge von 7,5 cm und einer Breite von 2 cm, sodass die beim Fohlen noch recht schmalen Intercostalräume untersucht werden konnten.
Der zu untersuchende Bereich wurde mit 99,5%igem Alkohol (Isopropylalkohol, 2- Propanol, 99,5%, Rebo-Pharm, Bochholt, Deutschland) eingesprüht, um eine gute Ankopplung zu gewährleisten. Dann wurde, beginnend im 12. Intercostalraum, die Lunge von dorsal nach ventral und von kaudal nach kranial bis zum 4. Intercostalraum untersucht.
Diese Untersuchung wurde auch mit jedem Fohlen zu Beginn der Studie durchgeführt.
3.2.2 Wiegen der Fohlen
Zu Beginn der Studie wurde das Gewicht der Fohlen mithilfe einer transportablen Waage bestimmt („Die mobile Pferdewaage“, Deutschland). Diese wurde in einem Untersuchungsstand aufgebaut und die Fohlen darauf geführt. Damit diese während der Messung ruhiger standen, wurde die Mutterstute in einen Stand direkt daneben
geführt. Die hierbei bestimmten Gewichte dienten der Berechnung der genauen Dosierung des Antibiotikums.
3.3 Studiendesign 3.3.1 Ablauf der Studie
Die Fohlen wurden in zwei Gruppen zu je 5 Fohlen aufgeteilt und in zwei aufeinanderfolgenden Wochen dem Versuch zugeführt.
Den Fohlen wurden 6 mg/kg KGW Gamithromycin (0.04ml/kg Zactran®, Merial, USA) mit destilliertem Wasser in einem Gesamtvolumen von 50 ml als Bolus über 2 Minuten intravenös verabreicht. Unmittelbar vor der Injektion des Bolus sowie 0.5, 1, 3, 6, 12, 24, 48, 72, 120, 168 Stunden danach wurde den Fohlen Blut abgenommen.
Nach 24 Stunden wurde zudem eine bronchoalveoläre Lavage (BAL) durchgeführt.
3.3.1.1 Untersuchung und Wiegen der Fohlen
Während der Studie wurden die Fohlen wie unter Punkt 3.2.1.1 beschrieben untersucht. Zu Beginn der Studie wurde, unabhängig vom Ergebnis der vorherigen Untersuchung, bei jedem Fohlen die Lunge ultrasonographisch untersucht.
Vor Studienbeginn wurden die Fohlen, wie unter Punkt 3.2.2 beschrieben, gewogen.
Mithilfe des hierbei ermittelten Gewichtes wurde die Dosierung des Antibiotikums sowie für die Medikamente der Allgemeinanästhesie berechnet.
3.3.1.2 Verabreichung des Antibiotikums
Das Gamithromycin wurde mit 6 mg/kg KGW dosiert, was 0.04 ml/kg KGW Zactran® (Merial, USA) entspricht.
Dieses wurde mit destilliertem Wasser auf 50 ml aufgefüllt, um die stark hypertone Formulierung des Zactrans® abzumildern.
Für die Injektion wurde mittels Braunüle ein Zugang zur Vena cephalica gelegt. Hierfür wurden die Fohlen in Seitenlage verbracht. Die Braunüle wurde direkt nach Beendigung der Injektion wieder entfernt.
3.3.1.4 Blutprobenentnahme und bronchoalveoläre Lavage
Am Vorabend der Studie wurden die Fohlen mit ihren Müttern in Einzelboxen verbracht.
Die Blutproben wurden während der ersten Stunden über eine Braunüle in der Vena jugularis externa, welche zeitgleich mit der in der Vena cephalica gelegt wurde, entnommen. Alle folgenden Blutproben wurden durch Punktion der Vene mittels Kanüle entnommen.
24 Stunden nach der Gamithromycin-Gabe wurde eine bronchoalveoläre Lavage durchgeführt.
Danach wurden die Fohlen mit ihren Müttern zurück in den Laufstall gebracht.
3.3.2 Blutprobenentnahme zur Bestimmung der Konzentration von Gamithromycin und dessen Metaboliten
Für die Entnahme der Blutproben wurde ein Zugang in entweder der rechten oder linken Vena jugularis externa mit einer Braunüle (Vaso Vet, Größe 14 Gx 2" bzw. 2,2 x 50mm, B. Braun Melsungen AG, Melsungen/Deutschland) gelegt. Zur Vorbereitung wurde die Haut in diesem Bereich rasiert und desinfiziert.
Die Braunüle wurde an drei Stellen zur Fixation mit der Haut vernäht und mit einem Durchstechstopfen verschlossen (Injection Cap, Fresenius Kabi AG, Bad Homburg/Deutschland).
Für die Entnahme wurde durch diesen mit einer Kanüle gestochen und mittels Spritze (Injekt® Luer Solo 10 ml, B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland) das Blut entnommen. Vor und nach der Blutentnahme wurde die Braunüle mit etwa 5 ml Natriumchlorid-Lösung (Isotonische Natriumchlorid Lösung ad. us. vet. - Für Tiere -,
B. Braun Melsungen AG, Melsungen/Deutschland) gespült. Die ersten 6-8 ml Blut wurden verworfen, danach wurden 8 ml als eigentliche Probe entnommen.
Diese wurden dann in eine Lithium-Heparin-Monovette (Li-Heparin, 9 ml, Sarstedt AG, Nümbrecht, Deutschland) gefüllt.
Nach der Entnahme wurden die Proben in einer Kühlzentrifuge bei 2000 x g für zehn Minuten zentrifugiert. Anschließend wurde das Plasma abpipettiert und gleichmäßig auf zwei Kryoröhrchen umgefüllt.
Diese wurden zunächst bei -20°C gelagert und nach Beendigung des jeweiligen Studienabschnittes gesammelt in einen -80°C-Tiefkühlschrank überführt.
Am Ende der Studie wurden die Proben auf Trockeneis gelagert und zum Labor der klinischen Pharmakologie der Universitätsmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald transportiert, wo sie bis zur weiteren Bearbeitung bei -80°C gelagert wurden.
3.3.3 Bronchoalveoläre Lavage
Um die Konzentration des Gamithromycins im Zielorgan, der Lunge, zu ermitteln, genauer in der pulmonary epithelial lining fluid (PELF) sowie den bronchoalveolären Zellen (BALC) wurde 24 Stunden nach Applikation des Gamithromycins eine bronchoalveoläre Lavage durchgeführt.
Hierfür wurden die Fohlen zunächst mit 0,9 – 1,3 mg/kg Xylazin i.m. (Xylazin 2 %®, Riemser Arzneimittel AG, Greifswald – Insel Riems, Deutschland) sediert und noch für etwa zwei Minuten bei ihren Müttern belassen, bis die Wirkung weit genug eingesetzt hatte. Dann wurden die Fohlen aus den Boxen geholt und mit 2,1 – 3,0 mg/kg Ketamin i.v. (Ursotamin®100 mg/ml, Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Deutschland) und 0,1 – 0,2 mg/kg Diazepam i.v. (Diazepam® 10 mg Rotexmedica, 5 Ampullen zu 2 ml, Rotexmedica GmbH, Trittau, Deutschland) narkotisiert. Während der bronchoalveolären Lavage wurden sie in Brustlage auf einer Schaumstoffmatte gelagert, an den Seiten von je einem Futtersack gestützt. Der Kopf wurde von einem Helfer, der neben dem Fohlen saß, fixiert.
Die BAL wurde mit einem flexiblen Endoskop (endoskopische Videoeinheit Tel Pack, Videoendoskop 138XX, Typ SG22-140, Karl Storz GmbH u. Co. KG, Tuttlingen, Außendurchmesser: 0,9 cm, Länge: 140 cm) durchgeführt, welches an eine Lichtquelle (Xenon 1000, Karl Storz GmbH u. Co. KG, Tuttlingen) angeschlossen war.
Zunächst wurde eine Nüster äußerlich trocken gereinigt, dann wurde das flexible Endoskop über den ventralen Nasengang und die Trachea in die linke Lungenhälfte eingeführt. Dort wurde es in einem dorsal führenden Bronchus der zweiten Generation soweit vorgeschoben, bis das Endoskop den Bronchus verschloss.
Dann wurden für die Spülung vier 100 mL-Spritzen (100 ml BD PlastipakTM, Becton Dickinson, Drogheda, Irland) mit 100 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS phosphate buffered saline) (Dulbecco’s PBS (1 x) without Ca u. Mg, PAA Laboratories GmbH, Pasching, Österreich) gefüllt, welche vorher auf etwa 37°C erwärmt wurde.
Der Inhalt jeder Spritze wurde einzeln über das Endoskop mit anschließend 20 ml Luft in die Lunge injiziert und direkt im Anschluss wieder vorsichtig aspiriert.
Das zurückgewonnene Volumen jeder Fraktion wurde notiert, danach wurde die erste Fraktion verworfen. Die restlichen drei wurden zusammengeführt und durch zwei Lagen Mull in mehrere Probenröhrchen (BD FalconTM, BD Drogheda, Ireland) filtriert und anschließend bei 4°C und 125 x g zehn Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde wieder zu gleichen Teilen gemischt, wovon je 1,5 ml in vier Kryoröhrchen pipettiert wurden und zunächst bei -20°C eingefroren wurden. Der restliche Überstand wurde verworfen.
Die Zellpellets wurden vereinigt, indem das erste mit 10 ml PBS aufgeschwemmt wurde, welches dann in das nächste überführt wurde, um auch dort das Zellpellet aufzuschwemmen.
Gemeinsam wurden sie dann wieder zentrifugiert (125 x g, 10 min, 4°C).
Der Überstand wurde erneut verworfen und das Zellpellet wieder in 10ml PBS gelöst, wovon 10 µl für die Zellzählung mittels Neubauer Zählkammer (Karl Hecht, Sondheim, Germany) verwendet.
Dann wurden je zwei Eppendorf-Gefäße mit 5x106 Zellen (wo das nicht möglich war, wurden 2,5x106 Zellen verwendet) befüllt und zentrifugiert (125 x g, 10 min, 4°C). Der Überstand wurde verworfen und die Eppendorf-Gefäße mit dem Zellpellet in flüssigem
Stickstoff schockgefroren und dann bis zum Transport ins Labor der klinischen Pharmakologie der Universitätsmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald bei -80°C gelagert.
Anschließend wurde das Probenröhrchen erneut zentrifugiert und der Überstand entfernt. Das entstandene Zellpellet wurde in 8 x 845 µl eiskaltem PBS resuspendiert, dann wurden jeweils 1,69 ml davon auf vier Kryoröhrchen verteilt. Auch diese wurden bei -80°C gelagert.
3.4 Analytische Untersuchungen der Proben
Im Labor des Institutes für klinische Pharmakologie der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald wurde die Konzentration von Gamithromycin und dessen Metaboliten Declad-Gamithromycin im Plasma, der PELF und den BALC bestimmt. Hierfür wurde eine Flüssigchromatographie (high performance liquid chromatography HPLC) mit nachgeschalteter Tandem-Massenspektroskopie (MS/MS) verwendet.
3.4.1 Aufbewahrung und Aufarbeitung der Proben 3.4.1.1 Herstellung der Stamm- und Arbeitslösungen
Für die tägliche Herstellung einer Kalibrationsgeraden und der Qualitätskontrollen wurden Arbeitslösungen verwendet. Diese wurden täglich neu aus einer Stammlösung hergestellt.
Es gab von jedem Analyten sowie von dem internen Standard Clarithromycin eine Stammlösung mit einer Konzentration von 500 µg/ml für Gamithromycin und seinen Metaboliten, sowie 1000 µg/ml für den internen Standard Clarithromycin. Sie wurden jede Woche frisch angesetzt, indem jeweils 5 mg Gamithromycin bzw. Declad- Gamithromycin in 5 ml Methanol (MeOH) gelöst wurden und anschließend mit 5 ml Aqua bidest auf 10 ml aufgefüllt. Für den internen Standard wurden 10 mg Clarithromycin in 10 ml eines Wasser-Methanol-Gemisches (50:50 v/v) gelöst. Die Haltbarkeit dieser Lösungen beträgt vier Wochen bei -20°C.
Für jeden Analyten wurden drei Arbeitslösungen unterschiedlicher Konzentrationen hergestellt durch schrittweise 1:9 Verdünnung mit einem Wasser-Methanol-Gemisch (50:50 v/v), sodass am Ende Konzentrationen von 50 ng/µl, 5 ng/µl und 0,5 ng/µl entstanden.
Der interne Standard diente der Berechnung der unbekannten Konzentration des Analyten. Hier wurde für die Herstellung der Arbeitslösung nur eine 1:99 Verdünnung mit Aqua bidest durchgeführt, sodass eine Konzentration von 10 ng/µl entstand.
Die Haltbarkeit der Arbeitslösungen beträgt bei 4°C eine Woche.
Für die Ammoniumformiat-Lösung (5 mM) wurde 1,93 g Ammoniumacetat in 500 ml Wasser gelöst und auf einen pH-Wert von 5 eingestellt.
3.4.1.2. Ansatz und Aufarbeitung der Kalibratoren und Qualitätskontrollen
Für die Berechnung der Konzentration in den Proben wurde jeden Tag vor den Messungen eine Kalibrationsgerade angefertigt. Diese wurde erstellt, indem 10 Proben mit einer definierten, ansteigenden Konzentration gemessen wurden.
Zusätzlich wurden auch eine Blindprobe, die die biologische Matrix und den internen Standard (IS) enthielt, sowie eine Doppelblindprobe, die nur die biologische Matrix enthielt, vermessen. Aus den hierbei erhaltenen Werten wurde mittels linearer Regression die Kalibrationsgerade errechnet.
Zur Erstellung der Kalibratoren wurden zunächst 1 ml biologische Matrix vorgelegt.
Dazu wurden 25 µl IS (entsprachen 250 ng CLR), 0,5 ml 50 mM Formiatpuffer (pH 5) und die für die jeweilige Konzentration notwendige Menge Arbeitslösung der Analyten (Gamithromycin und Declad-Gamithromycin) gegeben. Die Konzentrationen für die Kalibratoren betrugen für Gamithromycin 1, 5, 20, 50, 200, 600, 1000 ng/ml, für den Metaboliten 2, 5, 20, 50, 200, 600, 1000 ng/ml.
Anschließend wurde die Lösung kurz und intensiv gemischt, dann wurden 4 ml Methyl- tert-buthylether (MTBE) für die Flüssig/Flüssig-Extraktion dazugegeben. Hierbei wandern die Analyten sowie der IS gemäß ihrer lipophilen Eigenschaften in
unterschiedlichem Maße aus der Plasma- in die Etherphase. Um das zu unterstützen, werden die Proben für 10 Minuten auf einen Horizontalschüttler gegeben. Dabei werden die Phasen durchmischt und so die Oberfläche, an der ein Übergang stattfinden kann, vergrößert.
Anschließend wurden die Proben zentrifugiert (2 min, 3500 U/min) und die organische Phase abgehoben. Daraufhin wurden erneut 4 ml MTBE zu dem verbliebenen Rest gegeben und die Prozedur wiederholt, um die gewonnene Menge der Analyten aus der Probe zu erhöhen.
Die 2 x 4 ml organischer Überstand wurden vereint und dann bei 50°C im Luftstrom bis zur Trockne eingedampft. Die zurückgebliebene, eingetrocknete Substanz wurde dann in 60 µl mobiler Phase (Ammoniumformiatpuffer 15%; Acetonitril 85%) resuspendiert und in ein Probengefäß überführt.
Als Maß für die Richtigkeit der Messung liefen in jedem Messdurchgang Qualitätskontrollen (QK) als Improzesskontrollen mit.
Sie enthalten den zu analysierenden Stoff in bekannter Konzentration und wurden in identischer Weise aufbereitet wie die Kalibratoren und die Analyseproben. In jedem Durchlauf waren mindestens 10% der Proben QK mit Konzentrationen von 3, 500 und 800 ng/ml.
Als Akzeptanzkriterium galt eine maximale Abweichung von 15% von der tatsächlichen Konzentration, wurde dieser Wert bei mehr als zwei von sechs Proben überschritten, galt der Lauf als ungültig. Am Detektionslimit von 1 ng/ml für GAM und 2 ng/ml für Declad-GAM war jedoch eine Abweichung bis 20% zulässig.
3.4.1.3 Aufbereitung der Plasmaproben, der broncho-alveolären Zellen (BALC) und des BAL-Überstandes
Die Proben wurden bis zur Bearbeitung bei -80°C gelagert. Am Tag der Bearbeitung wurden sie bei Raumtemperatur aufgetaut.
Die Bearbeitung der Probe verlief analog zu jener der Kalibratoren. Es wurde 1 ml der zu vermessenden Probe (Plasma, BAL-Überstand, BAL-Zellsuspension) vorgelegt und dazu 25 µl des internen Standards sowie 500 µl Formiatpuffer dazugegeben. Die
Proben der Zellsuspension aus der BAL wurden zuvor 10 Minuten bei Raumtemperatur im Ultraschallbad inkubiert, um die Zellwände zu zerstören.
Anschließend wurde alles gründlich gemischt. Dann wurde in zweimal 4 ml MTBE der Analyt extrahiert. Die hierbei gewonnenen 8 ml organische Phase wurden vereint und bei 50°C bis zur Trockne verdampft. Die zurückgebliebene, eingetrocknete Substanz wurde in 60 µl mobiler Phase (Ammoniumformiatpuffer 15%; Acetonitril 85%) resuspendiert und in ein HPLC-Probengefäß überführt.
3.4.2 Flüssigkeitschromatographie (LC) mit nachgeschalteter Tandemmassenspektroskopie (MS/MS-System)
Die Analyse der Proben erfolgte mittels Flüssigchromatographie mit nachgeschalteter Tandemmassenspektroskopie (LC-MS/MS). Hierbei erfolgte die Auftrennung der einzelnen Analyten in der Flüssigchromatographie. Die Analyten wurden mit Hilfe eines Laufmittels (mobile Phase) über eine Trennsäule (stationäre Phase) gepumpt.
Die Trennsäule bestand aus einem Kieselgel mit unterschiedlichen funktionellen Gruppen, an denen die zu trennenden Stoffe gemäß ihrer Eigenschaften unterschiedlich lange gebunden werden. Auf diese Art entsteht eine Trennung des Gemisches, sodass die einzelnen Substanzen zeitlich versetzt in das Massenspektrometer gelangen.
In diesem Fall erfolgte die Auftrennung isokratisch. Die mobile Phase bestand aus einem 15:85 Gemisch von Ammoniumformiatpuffer (5mM, pH 5) und Acetonitril und die Fließgeschwindigkeit betrug 250 µl/min. Als stationäre Phase wurde eine Reversed Phase-Säule XTerra® MS (100 × 2,1 mm, 3,0 µm, Waters, Milford, USA) verwendet, die auf 40 °C temperiert war. Um eine Verunreinigung der Säule durch Partikel zu vermeiden, war ein 0,5 µm PEEK Mikrofilter (PEEK, Sulpeco, Bellefonte, USA) vorgeschaltet. Ein auf 10°C gekühlter Probengeber (Hewlett Packard series 1100, Agilent Technologies, Waldbronn, Deutschland) gab die Proben mit einem Volumen von 15 µl in das System.
Anschließend wurden die einzelnen Stoffe dann im Massenspektrometer (ABSciex API 2000 TurboIon Interface, AB Sciex, Darmstadt, Deutschland) gemäß ihrer Masse-zu-
Ladungs-Verhältnisse (m/z) detektiert. Hierfür wurden sie zunächst mittels Elektronenspray-Ionisation ionisiert. Um die Selektivität sowie die Sensitivität zu erhöhen, wurde ein Tandem-Massenspektrometer verwendet.
Das Tandem-Massenspektrometer besteht aus zwei nacheinander geschalteten Massenspektrometern, wobei in dem ersten die Muttersubstanzen, im zweiten deren spezifisches Ionenprodukt detektiert werden.
Die Detektion fand im positiven, ionisierten Modus statt, wofür die spezifischen Massenübergange der Muttersubstanzen in die Tochterionen nach Ionisation und Fragmentierung verwendet wurden. Hierfür wurden folgende Massenübergänge für Gamithromycin (GAM), den Metaboliten Declad-Gamithromycin (Declad-GAM) und den internen Standard Clarithromycin (CLR) verwendet: GAM: 389.5 619.4; Declad- GAM: 310,5 462,3; CLR: 748,5 590,5.
Die durch die Detektion entstandenen Signale wurden auf einem angeschlossenen Rechner als Chromatogramme dargestellt und mit der validierten Software „Analyst 1.4“ (AB Sciex, Darmstadt, Deutschland) ausgewertet. Dies geschah nach der interner-Standard-Methode über das jeweilige Verhältnis der Peakflächen (Peak Area Ratio, PAR). Die Berechnung der Konzentration erfolgte über diese PARs durch quadratische Regression mit 1/x Gewichtung.
Abb. 1 zeigt ein Beispielchromatogramm mit Clarithromycin als internem Standard, Gamithromycin und Declad-Gamithromycin.
