Die Fohlen wurden in zwei Gruppen zu je 5 Fohlen aufgeteilt und in zwei aufeinanderfolgenden Wochen dem Versuch zugeführt.
Den Fohlen wurden 6 mg/kg KGW Gamithromycin (0.04ml/kg Zactran®, Merial, USA) mit destilliertem Wasser in einem Gesamtvolumen von 50 ml als Bolus über 2 Minuten intravenös verabreicht. Unmittelbar vor der Injektion des Bolus sowie 0.5, 1, 3, 6, 12, 24, 48, 72, 120, 168 Stunden danach wurde den Fohlen Blut abgenommen.
Nach 24 Stunden wurde zudem eine bronchoalveoläre Lavage (BAL) durchgeführt.
3.3.1.1 Untersuchung und Wiegen der Fohlen
Während der Studie wurden die Fohlen wie unter Punkt 3.2.1.1 beschrieben untersucht. Zu Beginn der Studie wurde, unabhängig vom Ergebnis der vorherigen Untersuchung, bei jedem Fohlen die Lunge ultrasonographisch untersucht.
Vor Studienbeginn wurden die Fohlen, wie unter Punkt 3.2.2 beschrieben, gewogen.
Mithilfe des hierbei ermittelten Gewichtes wurde die Dosierung des Antibiotikums sowie für die Medikamente der Allgemeinanästhesie berechnet.
3.3.1.2 Verabreichung des Antibiotikums
Das Gamithromycin wurde mit 6 mg/kg KGW dosiert, was 0.04 ml/kg KGW Zactran® (Merial, USA) entspricht.
Dieses wurde mit destilliertem Wasser auf 50 ml aufgefüllt, um die stark hypertone Formulierung des Zactrans® abzumildern.
Für die Injektion wurde mittels Braunüle ein Zugang zur Vena cephalica gelegt. Hierfür wurden die Fohlen in Seitenlage verbracht. Die Braunüle wurde direkt nach Beendigung der Injektion wieder entfernt.
3.3.1.4 Blutprobenentnahme und bronchoalveoläre Lavage
Am Vorabend der Studie wurden die Fohlen mit ihren Müttern in Einzelboxen verbracht.
Die Blutproben wurden während der ersten Stunden über eine Braunüle in der Vena jugularis externa, welche zeitgleich mit der in der Vena cephalica gelegt wurde, entnommen. Alle folgenden Blutproben wurden durch Punktion der Vene mittels Kanüle entnommen.
24 Stunden nach der Gamithromycin-Gabe wurde eine bronchoalveoläre Lavage durchgeführt.
Danach wurden die Fohlen mit ihren Müttern zurück in den Laufstall gebracht.
3.3.2 Blutprobenentnahme zur Bestimmung der Konzentration von Gamithromycin und dessen Metaboliten
Für die Entnahme der Blutproben wurde ein Zugang in entweder der rechten oder linken Vena jugularis externa mit einer Braunüle (Vaso Vet, Größe 14 Gx 2" bzw. 2,2 x 50mm, B. Braun Melsungen AG, Melsungen/Deutschland) gelegt. Zur Vorbereitung wurde die Haut in diesem Bereich rasiert und desinfiziert.
Die Braunüle wurde an drei Stellen zur Fixation mit der Haut vernäht und mit einem Durchstechstopfen verschlossen (Injection Cap, Fresenius Kabi AG, Bad Homburg/Deutschland).
Für die Entnahme wurde durch diesen mit einer Kanüle gestochen und mittels Spritze (Injekt® Luer Solo 10 ml, B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland) das Blut entnommen. Vor und nach der Blutentnahme wurde die Braunüle mit etwa 5 ml Natriumchlorid-Lösung (Isotonische Natriumchlorid Lösung ad. us. vet. - Für Tiere -,
B. Braun Melsungen AG, Melsungen/Deutschland) gespült. Die ersten 6-8 ml Blut wurden verworfen, danach wurden 8 ml als eigentliche Probe entnommen.
Diese wurden dann in eine Lithium-Heparin-Monovette (Li-Heparin, 9 ml, Sarstedt AG, Nümbrecht, Deutschland) gefüllt.
Nach der Entnahme wurden die Proben in einer Kühlzentrifuge bei 2000 x g für zehn Minuten zentrifugiert. Anschließend wurde das Plasma abpipettiert und gleichmäßig auf zwei Kryoröhrchen umgefüllt.
Diese wurden zunächst bei -20°C gelagert und nach Beendigung des jeweiligen Studienabschnittes gesammelt in einen -80°C-Tiefkühlschrank überführt.
Am Ende der Studie wurden die Proben auf Trockeneis gelagert und zum Labor der klinischen Pharmakologie der Universitätsmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald transportiert, wo sie bis zur weiteren Bearbeitung bei -80°C gelagert wurden.
3.3.3 Bronchoalveoläre Lavage
Um die Konzentration des Gamithromycins im Zielorgan, der Lunge, zu ermitteln, genauer in der pulmonary epithelial lining fluid (PELF) sowie den bronchoalveolären Zellen (BALC) wurde 24 Stunden nach Applikation des Gamithromycins eine bronchoalveoläre Lavage durchgeführt.
Hierfür wurden die Fohlen zunächst mit 0,9 – 1,3 mg/kg Xylazin i.m. (Xylazin 2 %®, Riemser Arzneimittel AG, Greifswald – Insel Riems, Deutschland) sediert und noch für etwa zwei Minuten bei ihren Müttern belassen, bis die Wirkung weit genug eingesetzt hatte. Dann wurden die Fohlen aus den Boxen geholt und mit 2,1 – 3,0 mg/kg Ketamin i.v. (Ursotamin®100 mg/ml, Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Deutschland) und 0,1 – 0,2 mg/kg Diazepam i.v. (Diazepam® 10 mg Rotexmedica, 5 Ampullen zu 2 ml, Rotexmedica GmbH, Trittau, Deutschland) narkotisiert. Während der bronchoalveolären Lavage wurden sie in Brustlage auf einer Schaumstoffmatte gelagert, an den Seiten von je einem Futtersack gestützt. Der Kopf wurde von einem Helfer, der neben dem Fohlen saß, fixiert.
Die BAL wurde mit einem flexiblen Endoskop (endoskopische Videoeinheit Tel Pack, Videoendoskop 138XX, Typ SG22-140, Karl Storz GmbH u. Co. KG, Tuttlingen, Außendurchmesser: 0,9 cm, Länge: 140 cm) durchgeführt, welches an eine Lichtquelle (Xenon 1000, Karl Storz GmbH u. Co. KG, Tuttlingen) angeschlossen war.
Zunächst wurde eine Nüster äußerlich trocken gereinigt, dann wurde das flexible Endoskop über den ventralen Nasengang und die Trachea in die linke Lungenhälfte eingeführt. Dort wurde es in einem dorsal führenden Bronchus der zweiten Generation soweit vorgeschoben, bis das Endoskop den Bronchus verschloss.
Dann wurden für die Spülung vier 100 mL-Spritzen (100 ml BD PlastipakTM, Becton Dickinson, Drogheda, Irland) mit 100 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS phosphate buffered saline) (Dulbecco’s PBS (1 x) without Ca u. Mg, PAA Laboratories GmbH, Pasching, Österreich) gefüllt, welche vorher auf etwa 37°C erwärmt wurde.
Der Inhalt jeder Spritze wurde einzeln über das Endoskop mit anschließend 20 ml Luft in die Lunge injiziert und direkt im Anschluss wieder vorsichtig aspiriert.
Das zurückgewonnene Volumen jeder Fraktion wurde notiert, danach wurde die erste Fraktion verworfen. Die restlichen drei wurden zusammengeführt und durch zwei Lagen Mull in mehrere Probenröhrchen (BD FalconTM, BD Drogheda, Ireland) filtriert und anschließend bei 4°C und 125 x g zehn Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde wieder zu gleichen Teilen gemischt, wovon je 1,5 ml in vier Kryoröhrchen pipettiert wurden und zunächst bei -20°C eingefroren wurden. Der restliche Überstand wurde verworfen.
Die Zellpellets wurden vereinigt, indem das erste mit 10 ml PBS aufgeschwemmt wurde, welches dann in das nächste überführt wurde, um auch dort das Zellpellet aufzuschwemmen.
Gemeinsam wurden sie dann wieder zentrifugiert (125 x g, 10 min, 4°C).
Der Überstand wurde erneut verworfen und das Zellpellet wieder in 10ml PBS gelöst, wovon 10 µl für die Zellzählung mittels Neubauer Zählkammer (Karl Hecht, Sondheim, Germany) verwendet.
Dann wurden je zwei Eppendorf-Gefäße mit 5x106 Zellen (wo das nicht möglich war, wurden 2,5x106 Zellen verwendet) befüllt und zentrifugiert (125 x g, 10 min, 4°C). Der Überstand wurde verworfen und die Eppendorf-Gefäße mit dem Zellpellet in flüssigem
Stickstoff schockgefroren und dann bis zum Transport ins Labor der klinischen Pharmakologie der Universitätsmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald bei -80°C gelagert.
Anschließend wurde das Probenröhrchen erneut zentrifugiert und der Überstand entfernt. Das entstandene Zellpellet wurde in 8 x 845 µl eiskaltem PBS resuspendiert, dann wurden jeweils 1,69 ml davon auf vier Kryoröhrchen verteilt. Auch diese wurden bei -80°C gelagert.