Die bisherige antimikrobielle Therapie ist aufgrund der kurzen Dosierungsintervalle (1-2 mal pro Tag) sehr arbeitsaufwendig. Ein Wirkstoff wie Gamithromycin mit einer deutlich längeren Halbwertszeit und somit einem deutlich weiteren Dosierungsintervall würde den Arbeitsaufwand senken und somit nicht nur Kosten senken, sondern auch die Kooperationsbereitschaft der Halter erhöhen. Tulathromycin ist ein solcher Wirkstoff, jedoch ist seine Wirksamkeit in Anbetracht der hohen MHK90-Werte für R.
equi nicht sicher gegeben. Gamithromycin wäre hier eine mögliche Alternative.
Aufgrund der doch deutlichen Nebenwirkungen, die in der Studie von HILDEBRAND et al. (2015) beschrieben wurden und sich auch beim Rind bereits angedeutet haben, ist ein intramuskulärer Applikationsweg nicht zu empfehlen. Daher soll in dieser Studie die Pharmakokinetik nach intravenöser Gabe beim Fohlen bestimmt werden, um zu überprüfen, ob diese als möglicher alternativer Applikationsweg in Frage kommt.
3 Material und Methode 3.1 Probanden
Für die Studie wurden 10 gesunde Fohlen, sechs weibliche und vier männliche, im Alter von 42 bis 56 Tagen und einem Gewicht von 105 - 148 kg ausgewählt. Sie kamen alle von demselben deutschen Warmblutgestüt, auf welchem auch die Untersuchungen durchgeführt wurden.
Es handelt sich hierbei um einen genehmigungspflichtigen Tierversuch, welcher vom Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern (LALLF) unter dem Aktenzeichen 7221.3-1-036/14 genehmigt wurde.
3.1.1 Haltungsbedingungen
Die Fohlen wurden bis mindestens zu ihrem siebten Lebenstag mit ihren Müttern in Einzelboxen gehalten. Danach wurden sie in kleinen Gruppen von acht bis zwölf Stuten-Fohlen-Paaren in Laufställen untergebracht. Diese waren mit Stroh eingestreut und wurden vor der Belegung gereinigt und desinfiziert. Zu diesen gehörte jeweils ein betonierter Auslauf, welcher frei zugänglich war. Zweimal täglich wurden sie mit einem Gras-Maissilage-Mischfutter gefüttert, welches mit Hafer und Mineralfutter angereichert war. Zudem standen Heu, Salzlecksteine und Selbsttränken zur freien Verfügung.
Die Stuten wurden regelmäßig gegen equines Herpesvirus 1 und 4, sowie gegen equine Influenza und Tetanus geimpft, zudem wurden die Fohlen und Stuten regelmäßig mit verschiedenen Wirkstoffen entwurmt.
3.1.2 Einschlusskriterien
Die Fohlen mussten vor Studienbeginn klinisch allgemeingesund und ultrasonographisch lungengesund sein, die Blutleukozytenzahl durfte nicht über 13.000 Zellen/µl Blut liegen.
In den vorangegangenen vier Wochen durften sie keinerlei antibiotische Medikation erhalten haben.
3.2 Methoden
3.2.1 Untersuchung der Fohlen
3.2.1.1 Allgemeine und spezielle Untersuchung der Fohlen
Von Geburt an bis zum Absetzen wurden die Fohlen einmal pro Woche einer klinischen Allgemeinuntersuchung sowie einer speziellen Untersuchung des Respirationstraktes unterzogen.
Dabei wurden die Haltung, das Verhalten, der Ernährungszustand sowie die Kotkonsistenz beurteilt. Adspektorisch wurde auf vermehrt gefüllte Gelenke, Verletzungen oder andere Auffälligkeiten geachtet.
Zudem wurde die Rektaltemperatur gemessen. Der Nabel sowie die Mandibularlymphknoten wurden palpiert.
Es wurde auf Konsistenz und Qualität von eventuellem Nasenausfluss geachtet (serös, mukös, purulent), sowie die Lunge und Trachea an mehreren Stellen auskultiert, wobei der Grad der physiologischen Atemgeräusche und eventuelle Nebengeräusche wie Rasseln oder Giemen bestimmt wurden.
3.2.1.2 Bestimmung der Blutleukozytenzahl
Ebenfalls einmal pro Woche, im Rahmen der allgemeinen Untersuchung, wurden den Fohlen etwa zwei Milliliter Blut abgenommen für die Bestimmung der Anzahl der Leukozyten im Blut.
Dies geschah im wöchentlichen Wechsel aus der rechten bzw. linken Vena jugularis externa mittels Kanüle (BD MicrolanceTM, 1,2mm x 40mm, Becton Dickinson,
Drogheda, Irland). Das Blut wurde direkt in einem EDTA-Kalium-Probenröhrchen (EDTA K, 4 ml, Sarstedt AG, Nümbrecht, Deutschland) aufgefangen.
Zur Messung des Leukozytengehalts wurde ein automatischer Hämatologie-Analysator (Sysmex KX-21N, Sysmex Deutschland GmbH, Hamburg, Deutschland) verwendet, welcher die Anzahl der Leukozyten pro Mikroliter Blut mittels Widerstandsmessung durchführte.
3.2.1.3 Ultrasonographische Untersuchung der Lunge
Wurden im Rahmen der allgemeinen und speziellen Untersuchung eines Fohlens nicht physiologische Befunde erhoben, wurde eine weiterführende, ultrasonographische Untersuchung der Lunge angeschlossen.
Diese erfolgte mithilfe eines transportablen Ultraschallgerätes (Tringa Linear, Esaote Piemedical, Maastricht, Niederlande) mit einem Linearschallkopf mit einer Frequenz von 7,5 MHz, einer Länge von 7,5 cm und einer Breite von 2 cm, sodass die beim Fohlen noch recht schmalen Intercostalräume untersucht werden konnten.
Der zu untersuchende Bereich wurde mit 99,5%igem Alkohol (Isopropylalkohol, 2-Propanol, 99,5%, Rebo-Pharm, Bochholt, Deutschland) eingesprüht, um eine gute Ankopplung zu gewährleisten. Dann wurde, beginnend im 12. Intercostalraum, die Lunge von dorsal nach ventral und von kaudal nach kranial bis zum 4. Intercostalraum untersucht.
Diese Untersuchung wurde auch mit jedem Fohlen zu Beginn der Studie durchgeführt.
3.2.2 Wiegen der Fohlen
Zu Beginn der Studie wurde das Gewicht der Fohlen mithilfe einer transportablen Waage bestimmt („Die mobile Pferdewaage“, Deutschland). Diese wurde in einem Untersuchungsstand aufgebaut und die Fohlen darauf geführt. Damit diese während der Messung ruhiger standen, wurde die Mutterstute in einen Stand direkt daneben
geführt. Die hierbei bestimmten Gewichte dienten der Berechnung der genauen Dosierung des Antibiotikums.
3.3 Studiendesign 3.3.1 Ablauf der Studie
Die Fohlen wurden in zwei Gruppen zu je 5 Fohlen aufgeteilt und in zwei aufeinanderfolgenden Wochen dem Versuch zugeführt.
Den Fohlen wurden 6 mg/kg KGW Gamithromycin (0.04ml/kg Zactran®, Merial, USA) mit destilliertem Wasser in einem Gesamtvolumen von 50 ml als Bolus über 2 Minuten intravenös verabreicht. Unmittelbar vor der Injektion des Bolus sowie 0.5, 1, 3, 6, 12, 24, 48, 72, 120, 168 Stunden danach wurde den Fohlen Blut abgenommen.
Nach 24 Stunden wurde zudem eine bronchoalveoläre Lavage (BAL) durchgeführt.
3.3.1.1 Untersuchung und Wiegen der Fohlen
Während der Studie wurden die Fohlen wie unter Punkt 3.2.1.1 beschrieben untersucht. Zu Beginn der Studie wurde, unabhängig vom Ergebnis der vorherigen Untersuchung, bei jedem Fohlen die Lunge ultrasonographisch untersucht.
Vor Studienbeginn wurden die Fohlen, wie unter Punkt 3.2.2 beschrieben, gewogen.
Mithilfe des hierbei ermittelten Gewichtes wurde die Dosierung des Antibiotikums sowie für die Medikamente der Allgemeinanästhesie berechnet.
3.3.1.2 Verabreichung des Antibiotikums
Das Gamithromycin wurde mit 6 mg/kg KGW dosiert, was 0.04 ml/kg KGW Zactran® (Merial, USA) entspricht.
Dieses wurde mit destilliertem Wasser auf 50 ml aufgefüllt, um die stark hypertone Formulierung des Zactrans® abzumildern.
Für die Injektion wurde mittels Braunüle ein Zugang zur Vena cephalica gelegt. Hierfür wurden die Fohlen in Seitenlage verbracht. Die Braunüle wurde direkt nach Beendigung der Injektion wieder entfernt.
3.3.1.4 Blutprobenentnahme und bronchoalveoläre Lavage
Am Vorabend der Studie wurden die Fohlen mit ihren Müttern in Einzelboxen verbracht.
Die Blutproben wurden während der ersten Stunden über eine Braunüle in der Vena jugularis externa, welche zeitgleich mit der in der Vena cephalica gelegt wurde, entnommen. Alle folgenden Blutproben wurden durch Punktion der Vene mittels Kanüle entnommen.
24 Stunden nach der Gamithromycin-Gabe wurde eine bronchoalveoläre Lavage durchgeführt.
Danach wurden die Fohlen mit ihren Müttern zurück in den Laufstall gebracht.
3.3.2 Blutprobenentnahme zur Bestimmung der Konzentration von Gamithromycin und dessen Metaboliten
Für die Entnahme der Blutproben wurde ein Zugang in entweder der rechten oder linken Vena jugularis externa mit einer Braunüle (Vaso Vet, Größe 14 Gx 2" bzw. 2,2 x 50mm, B. Braun Melsungen AG, Melsungen/Deutschland) gelegt. Zur Vorbereitung wurde die Haut in diesem Bereich rasiert und desinfiziert.
Die Braunüle wurde an drei Stellen zur Fixation mit der Haut vernäht und mit einem Durchstechstopfen verschlossen (Injection Cap, Fresenius Kabi AG, Bad Homburg/Deutschland).
Für die Entnahme wurde durch diesen mit einer Kanüle gestochen und mittels Spritze (Injekt® Luer Solo 10 ml, B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland) das Blut entnommen. Vor und nach der Blutentnahme wurde die Braunüle mit etwa 5 ml Natriumchlorid-Lösung (Isotonische Natriumchlorid Lösung ad. us. vet. - Für Tiere -,
B. Braun Melsungen AG, Melsungen/Deutschland) gespült. Die ersten 6-8 ml Blut wurden verworfen, danach wurden 8 ml als eigentliche Probe entnommen.
Diese wurden dann in eine Lithium-Heparin-Monovette (Li-Heparin, 9 ml, Sarstedt AG, Nümbrecht, Deutschland) gefüllt.
Nach der Entnahme wurden die Proben in einer Kühlzentrifuge bei 2000 x g für zehn Minuten zentrifugiert. Anschließend wurde das Plasma abpipettiert und gleichmäßig auf zwei Kryoröhrchen umgefüllt.
Diese wurden zunächst bei -20°C gelagert und nach Beendigung des jeweiligen Studienabschnittes gesammelt in einen -80°C-Tiefkühlschrank überführt.
Am Ende der Studie wurden die Proben auf Trockeneis gelagert und zum Labor der klinischen Pharmakologie der Universitätsmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald transportiert, wo sie bis zur weiteren Bearbeitung bei -80°C gelagert wurden.
3.3.3 Bronchoalveoläre Lavage
Um die Konzentration des Gamithromycins im Zielorgan, der Lunge, zu ermitteln, genauer in der pulmonary epithelial lining fluid (PELF) sowie den bronchoalveolären Zellen (BALC) wurde 24 Stunden nach Applikation des Gamithromycins eine bronchoalveoläre Lavage durchgeführt.
Hierfür wurden die Fohlen zunächst mit 0,9 – 1,3 mg/kg Xylazin i.m. (Xylazin 2 %®, Riemser Arzneimittel AG, Greifswald – Insel Riems, Deutschland) sediert und noch für etwa zwei Minuten bei ihren Müttern belassen, bis die Wirkung weit genug eingesetzt hatte. Dann wurden die Fohlen aus den Boxen geholt und mit 2,1 – 3,0 mg/kg Ketamin i.v. (Ursotamin®100 mg/ml, Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Deutschland) und 0,1 – 0,2 mg/kg Diazepam i.v. (Diazepam® 10 mg Rotexmedica, 5 Ampullen zu 2 ml, Rotexmedica GmbH, Trittau, Deutschland) narkotisiert. Während der bronchoalveolären Lavage wurden sie in Brustlage auf einer Schaumstoffmatte gelagert, an den Seiten von je einem Futtersack gestützt. Der Kopf wurde von einem Helfer, der neben dem Fohlen saß, fixiert.
Die BAL wurde mit einem flexiblen Endoskop (endoskopische Videoeinheit Tel Pack, Videoendoskop 138XX, Typ SG22-140, Karl Storz GmbH u. Co. KG, Tuttlingen, Außendurchmesser: 0,9 cm, Länge: 140 cm) durchgeführt, welches an eine Lichtquelle (Xenon 1000, Karl Storz GmbH u. Co. KG, Tuttlingen) angeschlossen war.
Zunächst wurde eine Nüster äußerlich trocken gereinigt, dann wurde das flexible Endoskop über den ventralen Nasengang und die Trachea in die linke Lungenhälfte eingeführt. Dort wurde es in einem dorsal führenden Bronchus der zweiten Generation soweit vorgeschoben, bis das Endoskop den Bronchus verschloss.
Dann wurden für die Spülung vier 100 mL-Spritzen (100 ml BD PlastipakTM, Becton Dickinson, Drogheda, Irland) mit 100 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS phosphate buffered saline) (Dulbecco’s PBS (1 x) without Ca u. Mg, PAA Laboratories GmbH, Pasching, Österreich) gefüllt, welche vorher auf etwa 37°C erwärmt wurde.
Der Inhalt jeder Spritze wurde einzeln über das Endoskop mit anschließend 20 ml Luft in die Lunge injiziert und direkt im Anschluss wieder vorsichtig aspiriert.
Das zurückgewonnene Volumen jeder Fraktion wurde notiert, danach wurde die erste Fraktion verworfen. Die restlichen drei wurden zusammengeführt und durch zwei Lagen Mull in mehrere Probenröhrchen (BD FalconTM, BD Drogheda, Ireland) filtriert und anschließend bei 4°C und 125 x g zehn Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde wieder zu gleichen Teilen gemischt, wovon je 1,5 ml in vier Kryoröhrchen pipettiert wurden und zunächst bei -20°C eingefroren wurden. Der restliche Überstand wurde verworfen.
Die Zellpellets wurden vereinigt, indem das erste mit 10 ml PBS aufgeschwemmt wurde, welches dann in das nächste überführt wurde, um auch dort das Zellpellet aufzuschwemmen.
Gemeinsam wurden sie dann wieder zentrifugiert (125 x g, 10 min, 4°C).
Der Überstand wurde erneut verworfen und das Zellpellet wieder in 10ml PBS gelöst, wovon 10 µl für die Zellzählung mittels Neubauer Zählkammer (Karl Hecht, Sondheim, Germany) verwendet.
Dann wurden je zwei Eppendorf-Gefäße mit 5x106 Zellen (wo das nicht möglich war, wurden 2,5x106 Zellen verwendet) befüllt und zentrifugiert (125 x g, 10 min, 4°C). Der Überstand wurde verworfen und die Eppendorf-Gefäße mit dem Zellpellet in flüssigem
Stickstoff schockgefroren und dann bis zum Transport ins Labor der klinischen Pharmakologie der Universitätsmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald bei -80°C gelagert.
Anschließend wurde das Probenröhrchen erneut zentrifugiert und der Überstand entfernt. Das entstandene Zellpellet wurde in 8 x 845 µl eiskaltem PBS resuspendiert, dann wurden jeweils 1,69 ml davon auf vier Kryoröhrchen verteilt. Auch diese wurden bei -80°C gelagert.
3.4 Analytische Untersuchungen der Proben
Im Labor des Institutes für klinische Pharmakologie der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald wurde die Konzentration von Gamithromycin und dessen Metaboliten Declad-Gamithromycin im Plasma, der PELF und den BALC bestimmt. Hierfür wurde eine Flüssigchromatographie (high performance liquid chromatography HPLC) mit nachgeschalteter Tandem-Massenspektroskopie (MS/MS) verwendet.
3.4.1 Aufbewahrung und Aufarbeitung der Proben 3.4.1.1 Herstellung der Stamm- und Arbeitslösungen
Für die tägliche Herstellung einer Kalibrationsgeraden und der Qualitätskontrollen wurden Arbeitslösungen verwendet. Diese wurden täglich neu aus einer Stammlösung hergestellt.
Es gab von jedem Analyten sowie von dem internen Standard Clarithromycin eine Stammlösung mit einer Konzentration von 500 µg/ml für Gamithromycin und seinen Metaboliten, sowie 1000 µg/ml für den internen Standard Clarithromycin. Sie wurden jede Woche frisch angesetzt, indem jeweils 5 mg Gamithromycin bzw. Declad-Gamithromycin in 5 ml Methanol (MeOH) gelöst wurden und anschließend mit 5 ml Aqua bidest auf 10 ml aufgefüllt. Für den internen Standard wurden 10 mg Clarithromycin in 10 ml eines Wasser-Methanol-Gemisches (50:50 v/v) gelöst. Die Haltbarkeit dieser Lösungen beträgt vier Wochen bei -20°C.
Für jeden Analyten wurden drei Arbeitslösungen unterschiedlicher Konzentrationen hergestellt durch schrittweise 1:9 Verdünnung mit einem Wasser-Methanol-Gemisch (50:50 v/v), sodass am Ende Konzentrationen von 50 ng/µl, 5 ng/µl und 0,5 ng/µl entstanden.
Der interne Standard diente der Berechnung der unbekannten Konzentration des Analyten. Hier wurde für die Herstellung der Arbeitslösung nur eine 1:99 Verdünnung mit Aqua bidest durchgeführt, sodass eine Konzentration von 10 ng/µl entstand.
Die Haltbarkeit der Arbeitslösungen beträgt bei 4°C eine Woche.
Für die Ammoniumformiat-Lösung (5 mM) wurde 1,93 g Ammoniumacetat in 500 ml Wasser gelöst und auf einen pH-Wert von 5 eingestellt.
3.4.1.2. Ansatz und Aufarbeitung der Kalibratoren und Qualitätskontrollen
Für die Berechnung der Konzentration in den Proben wurde jeden Tag vor den Messungen eine Kalibrationsgerade angefertigt. Diese wurde erstellt, indem 10 Proben mit einer definierten, ansteigenden Konzentration gemessen wurden.
Zusätzlich wurden auch eine Blindprobe, die die biologische Matrix und den internen Standard (IS) enthielt, sowie eine Doppelblindprobe, die nur die biologische Matrix enthielt, vermessen. Aus den hierbei erhaltenen Werten wurde mittels linearer Regression die Kalibrationsgerade errechnet.
Zur Erstellung der Kalibratoren wurden zunächst 1 ml biologische Matrix vorgelegt.
Dazu wurden 25 µl IS (entsprachen 250 ng CLR), 0,5 ml 50 mM Formiatpuffer (pH 5) und die für die jeweilige Konzentration notwendige Menge Arbeitslösung der Analyten (Gamithromycin und Declad-Gamithromycin) gegeben. Die Konzentrationen für die Kalibratoren betrugen für Gamithromycin 1, 5, 20, 50, 200, 600, 1000 ng/ml, für den Metaboliten 2, 5, 20, 50, 200, 600, 1000 ng/ml.
Anschließend wurde die Lösung kurz und intensiv gemischt, dann wurden 4 ml Methyl-tert-buthylether (MTBE) für die Flüssig/Flüssig-Extraktion dazugegeben. Hierbei wandern die Analyten sowie der IS gemäß ihrer lipophilen Eigenschaften in
unterschiedlichem Maße aus der Plasma- in die Etherphase. Um das zu unterstützen, werden die Proben für 10 Minuten auf einen Horizontalschüttler gegeben. Dabei werden die Phasen durchmischt und so die Oberfläche, an der ein Übergang stattfinden kann, vergrößert.
Anschließend wurden die Proben zentrifugiert (2 min, 3500 U/min) und die organische Phase abgehoben. Daraufhin wurden erneut 4 ml MTBE zu dem verbliebenen Rest gegeben und die Prozedur wiederholt, um die gewonnene Menge der Analyten aus der Probe zu erhöhen.
Die 2 x 4 ml organischer Überstand wurden vereint und dann bei 50°C im Luftstrom bis zur Trockne eingedampft. Die zurückgebliebene, eingetrocknete Substanz wurde dann in 60 µl mobiler Phase (Ammoniumformiatpuffer 15%; Acetonitril 85%) resuspendiert und in ein Probengefäß überführt.
Als Maß für die Richtigkeit der Messung liefen in jedem Messdurchgang Qualitätskontrollen (QK) als Improzesskontrollen mit.
Sie enthalten den zu analysierenden Stoff in bekannter Konzentration und wurden in identischer Weise aufbereitet wie die Kalibratoren und die Analyseproben. In jedem Durchlauf waren mindestens 10% der Proben QK mit Konzentrationen von 3, 500 und 800 ng/ml.
Als Akzeptanzkriterium galt eine maximale Abweichung von 15% von der tatsächlichen Konzentration, wurde dieser Wert bei mehr als zwei von sechs Proben überschritten, galt der Lauf als ungültig. Am Detektionslimit von 1 ng/ml für GAM und 2 ng/ml für Declad-GAM war jedoch eine Abweichung bis 20% zulässig.
3.4.1.3 Aufbereitung der Plasmaproben, der broncho-alveolären Zellen (BALC) und des BAL-Überstandes
Die Proben wurden bis zur Bearbeitung bei -80°C gelagert. Am Tag der Bearbeitung wurden sie bei Raumtemperatur aufgetaut.
Die Bearbeitung der Probe verlief analog zu jener der Kalibratoren. Es wurde 1 ml der zu vermessenden Probe (Plasma, BAL-Überstand, BAL-Zellsuspension) vorgelegt und dazu 25 µl des internen Standards sowie 500 µl Formiatpuffer dazugegeben. Die
Proben der Zellsuspension aus der BAL wurden zuvor 10 Minuten bei Raumtemperatur im Ultraschallbad inkubiert, um die Zellwände zu zerstören.
Anschließend wurde alles gründlich gemischt. Dann wurde in zweimal 4 ml MTBE der Analyt extrahiert. Die hierbei gewonnenen 8 ml organische Phase wurden vereint und bei 50°C bis zur Trockne verdampft. Die zurückgebliebene, eingetrocknete Substanz wurde in 60 µl mobiler Phase (Ammoniumformiatpuffer 15%; Acetonitril 85%) resuspendiert und in ein HPLC-Probengefäß überführt.
3.4.2 Flüssigkeitschromatographie (LC) mit nachgeschalteter Tandemmassenspektroskopie (MS/MS-System)
Die Analyse der Proben erfolgte mittels Flüssigchromatographie mit nachgeschalteter Tandemmassenspektroskopie (LC-MS/MS). Hierbei erfolgte die Auftrennung der einzelnen Analyten in der Flüssigchromatographie. Die Analyten wurden mit Hilfe eines Laufmittels (mobile Phase) über eine Trennsäule (stationäre Phase) gepumpt.
Die Trennsäule bestand aus einem Kieselgel mit unterschiedlichen funktionellen Gruppen, an denen die zu trennenden Stoffe gemäß ihrer Eigenschaften unterschiedlich lange gebunden werden. Auf diese Art entsteht eine Trennung des Gemisches, sodass die einzelnen Substanzen zeitlich versetzt in das Massenspektrometer gelangen.
In diesem Fall erfolgte die Auftrennung isokratisch. Die mobile Phase bestand aus einem 15:85 Gemisch von Ammoniumformiatpuffer (5mM, pH 5) und Acetonitril und die Fließgeschwindigkeit betrug 250 µl/min. Als stationäre Phase wurde eine Reversed Phase-Säule XTerra® MS (100 × 2,1 mm, 3,0 µm, Waters, Milford, USA) verwendet, die auf 40 °C temperiert war. Um eine Verunreinigung der Säule durch Partikel zu vermeiden, war ein 0,5 µm PEEK Mikrofilter (PEEK, Sulpeco, Bellefonte, USA) vorgeschaltet. Ein auf 10°C gekühlter Probengeber (Hewlett Packard series 1100, Agilent Technologies, Waldbronn, Deutschland) gab die Proben mit einem Volumen von 15 µl in das System.
Anschließend wurden die einzelnen Stoffe dann im Massenspektrometer (ABSciex API 2000 TurboIon Interface, AB Sciex, Darmstadt, Deutschland) gemäß ihrer
Masse-zu-Ladungs-Verhältnisse (m/z) detektiert. Hierfür wurden sie zunächst mittels Elektronenspray-Ionisation ionisiert. Um die Selektivität sowie die Sensitivität zu erhöhen, wurde ein Tandem-Massenspektrometer verwendet.
Das Tandem-Massenspektrometer besteht aus zwei nacheinander geschalteten Massenspektrometern, wobei in dem ersten die Muttersubstanzen, im zweiten deren spezifisches Ionenprodukt detektiert werden.
Die Detektion fand im positiven, ionisierten Modus statt, wofür die spezifischen Massenübergange der Muttersubstanzen in die Tochterionen nach Ionisation und Fragmentierung verwendet wurden. Hierfür wurden folgende Massenübergänge für Gamithromycin (GAM), den Metaboliten Declad-Gamithromycin (Declad-GAM) und den internen Standard Clarithromycin (CLR) verwendet: GAM: 389.5 619.4; Declad-GAM: 310,5 462,3; CLR: 748,5 590,5.
Die durch die Detektion entstandenen Signale wurden auf einem angeschlossenen Rechner als Chromatogramme dargestellt und mit der validierten Software „Analyst 1.4“ (AB Sciex, Darmstadt, Deutschland) ausgewertet. Dies geschah nach der interner-Standard-Methode über das jeweilige Verhältnis der Peakflächen (Peak Area Ratio, PAR). Die Berechnung der Konzentration erfolgte über diese PARs durch quadratische Regression mit 1/x Gewichtung.
Abb. 1 zeigt ein Beispielchromatogramm mit Clarithromycin als internem Standard, Gamithromycin und Declad-Gamithromycin.
Abb. 1 Chromatogramm einer Qualitätskontrolle (500 ng/ml) mit Internem Standard a.) IS: Clarithromycin b.) Gamithromycin c.) Declad- Gamithromycin
Vor der Messung wurde die Methode entsprechend den international geltenden Richtlinien validiert. Hierbei wurde die Quantifizierungsgrenze (LOQ) für Gamithromycin bei 1 ng/ml und für den Metaboliten Declad-Gamitrhomycin bei 2 ng/ml festgelegt. Präzision und Richtigkeit waren für diesen Wert mit <15% erfüllt.
Tab. 1: Korrelationskoeffizient und Konzentrationsbereich für Gamithromycin und Declad-Gamithromycin
Gamithromycin
Declad-Gamithromycin
Konzentrationsbereich-Bereich (ng/ml)
0,9990 - 0,9998 0,9996 - 1,0000
1-1000 2-1000 Analyt Korrelationskoeffizient
In Tabelle zwei sind die Qualitätsparameter für Richtigkeit und Präzision zu den in dieser Studie gemessenen Konzentrationen von Gamithromycin und Declad-Gamithromycin dargestellt. Für die Qualitätskontrollen und die Kalibratoren waren sie mit <15% erfüllt.
Tab 2: Richtigkeit und Präzision (Between-day und Within-day) für die Bestimmung der Konzentration von Gamithromycin und Declad-Gamithromycin
Between-Day Richtigkeit (%) Präzision (%)
Gamithromycin-M: Declad-Gamithromycin; K: Kalibratoren;
QK: Qualitätskontrollen
Gamitrho-mycin-M
Gamithro-mycin
3.4.3 Bestimmung des Volumens der pulmonary epithelial lining fluid (PELF)
Durch die Spülflüssigkeit der BAL wurden die Konzentrationen des Gamithromycins und des Declad-Gamithromycins in der pulmonary epithelial lining fluid (PELF) stark verdünnt. Um die Konzentrationen berechnen zu können, muss also zunächst das Volumen der gewonnenen PELF ermittelt werden.
Das Volumen der PELF wurde nach der Methode von RENNARD et al. (1986) bestimmt. Grundlage hierfür ist, dass Harnstoff (Urea) frei im Körper diffundiert und
somit in gleicher Konzentration im Plasma und der PELF vorliegt. Zunächst wurde also die Konzentration (C) von Harnstoff im Plasma zum Zeitpunkt der BAL und in der BALF bestimmt. Hierfür wurden die Proben an das Labor der Klinik für kleine Klauentiere der Stiftung tierärztliche Hochschule Hannover (Leitung Prof. Dr. Martin Ganter) geschickt.
somit in gleicher Konzentration im Plasma und der PELF vorliegt. Zunächst wurde also die Konzentration (C) von Harnstoff im Plasma zum Zeitpunkt der BAL und in der BALF bestimmt. Hierfür wurden die Proben an das Labor der Klinik für kleine Klauentiere der Stiftung tierärztliche Hochschule Hannover (Leitung Prof. Dr. Martin Ganter) geschickt.