Tierärztliche Hochschule Hannover
Untersuchung zur Konzentration von Tulathromycin im Plasma und in der bronchoalveolären Lavage von
gesunden und an Bronchopneumonie erkrankten Fohlen
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae – (Dr. med. vet.)
Vorgelegt von Birgit Lehenauer
Hallein
Hannover 2018
Wissenschaftliche Betreuung: PD Dr. Monica Venner PhD, Dipl. ECEIM Klinik für Pferde
1. Gutachterin: PD Dr. Monica Venner PhD, Dipl. ECEIM Klinik für Pferde
2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. M. Kietzmann
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie, Tierärztliche Hochschule Hannover
Tag der mündlichen Prüfung: 08.05.2018
Meiner lieben Kuchl - Oma
In dankbarer Erinnerung
Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 1
2 Schriftum ... 2
2.1 Rhodococcus equi (R.equi) ... 2
2.1.1 Allgemeines ... 2
2.1.2 Der Erreger ... 2
2.1.3 Erkrankung des Fohlens ... 3
2.1.4 Diagnostik ... 4
2.1.5 Therapie ... 4
2.2 Makrolidantibiotika ... 5
2.2.1 Allgemeines und Wirkungsweise ... 5
2.2.2 Wichtige Vertreter ... 7
2.3 Tulathromycin ... 9
2.3.1 Tulathromycin in der Nutztiermedizin ... 9
2.3.2 Tulathromycin beim Fohlen ... 13
2.3.3 Minimale Hemmstoffkonzentrationen gegenüber R. equi ... 16
2.4 Verteilung von Antibiotika in gesunden und entzündeten Lungen ... 17
2.4.1 Faktoren, welche die Anreicherung im kranken Lungengewebe verändern können ... 17
2.4.2 Bereits erfolgte Vergleichsstudien ... 18
2.5 Bronchoalveoläre Lavage als Methode zur Bestimmung von Wirkstoffkonzentrationen in Lungen ... 19
2.5.1 Harnstoff als Dilutionsmarker der PELF Volumina in BAL-Aspiraten ... 20
2.6 Ziel der vorliegenden Arbeit ... 22
3 Material und Methode ... 23
3.1 Probanden ... 23
3.1.1 Allgemeines ... 23
3.1.2 Haltung und Fütterung ... 23
3.1.3 Wöchentliche Untersuchung ... 23
3.2 Spezielle Voruntersuchung zur Orientierung in der Lunge ... 24
3.3 Auswahl der Probanden und abschließende Untersuchung ... 26
3.4 Ablauf der Probennahme ... 27
3.4.1 Übersicht ... 27
Inhaltsverzeichnis
II
3.4.2 Verabreichung des Antibiotikums ... 28
3.4.3 Blutprobenentnahme ... 28
3.4.4 Bronchoalveoläre Lavage (BAL) ... 28
3.5 Verarbeitung der Proben vor Ort ... 29
3.5.1 Blutproben ... 29
3.5.2 Proben der bronchoalveolären Lavage (PELF, BALC) ... 29
3.6 Auswertung der biochemischen Parameter ... 30
Harnstoff im Plasma und in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit ... 31
Totalprotein in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit ... 31
Laktatdehydrogenase und Alkalische Phosphatase in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit ... 31
3.7 Berechnung der Gesamtzellzahl in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit 31 3.8 Erstellung eines zytologischen Differentialbildes der bronchoalveolären Lavage ... 31
3.9 Analyse der Zelltransporterexpression in den Zellen der bronchoalveolären Lavage ... 32
3.10 Bestimmung der Tulathromycinkonzentration ... 32
3.10.1 Herstellung der Referenzsubstanz-Lösungen ... 33
3.10.2 Herstellung der Kalibrier- und Qualitätskontrollproben ... 35
3.10.3 Aufbewahrung, Übernahme und Aufarbeitung der Plasmaproben, des BAL Überstandes (BALF) und der BAL Zellen ... 35
3.10.4 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit nachgeschalteter Tandemmassenspektroskopie (MS/MS) ... 35
3.11 Konzentration von Tulathromycin im Plasma und Berechnung der pharmakokinetischen Parameter ... 37
3.12 Berechnung der PELF ... 38
3.13 TULA-Konzentration in der PELF ... 39
3.14 Tulathromycinkonzentration in den Zellen der BAL ... 39
3.15 Statistik ... 40
4 Ergebnisse ... 41
4.1 Probanden ... 41
4.2 Biochemische Parameter in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit ... 41
4.2.1 Harnstoff in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit ... 41
4.2.2 Totalprotein in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit ... 42
Inhaltsverzeichnis
III
4.2.3 Laktatdehydrogenase in der bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit... 43
4.2.4 Alkalische Phosphatase in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit ... 43
4.3 Gesamtzellzahl in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit ... 44
4.4 Zytologisches Differentialbild in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit ... 44
4.5 mRNA-Expression der Zelltransporter in den Zellen der bronchoalveolären Lavage ... 45
4.6 Volumina der zurückgewonnen Lavageflüssigkeit und Berechnung der Pulmonary Epithelial Lining Fluid ... 47
4.6.1 Volumina der zurückgewonnenen Lavageflüssigkeit ... 47
4.6.2 Pulmonary Epithelial Lining Fluid Volumina ... 48
4.7 Tulathromycinkonzentration im Plasma und pharmakokinetische Parameter 49 4.8 Tulathromycinkonzentration in der PELF ... 50
4.9 Tulathromycinkonzentration in den Zellen der bronchoalveolären Lavage .. 51
4.10 Ratios der Tulathromycinkonzentrationen in Plasma, PELF und BALC ... 52
4.10.1 PELF/Plasma ... 52
4.10.2 BALC/Plasma... 53
4.10.3 BALC/PELF... 53
5 Diskussion ... 54
5.1 Probanden ... 54
5.2 Methode ... 54
5.3 Berechnung der Pulmonary Epithelial Lining Fluid aus der zurückgewonnenen Lavageflüssigkeit ... 54
5.4 Biochemische Parameter der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit ... 55
5.4.1 Harnstoff ... 55
5.4.2 Totalprotein ... 56
5.4.3 Enzyme ... 56
5.5 Gesamtzellzahl in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit ... 56
5.6 Zytologisches Differentialbild in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit ... 57
5.7 Relative mRNA-Expression der Zelltransporter in den Zellen der bronchoalveolären Lavage ... 58
5.8 Tulathromycin im Plasma und pharmakokinetische Parameter ... 59
5.9 Tulathromycinkonzentration in der Pulmonary Epithelial Lining Fluid ... 59
5.10 Tulathromycinkonzentration in den Zellen der bronchoalveolären Lavage .. 60
5.11 Ratios ... 61
Inhaltsverzeichnis
IV
5.12 Gegenüberstellung der eigenen Resultate mit klinischen Studien ... 62
5.13 Einschränkungen ... 63
6 Zusammenfassung ... 65
7 Summary ... 67
8 Literaturverzeichnis ... 69
9 Anhang ... 97
10 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis ... 114
11 Danksagung ... 118
12 Selbstständigkeitserklärung ... 120
Abkürzungsverzeichnis
V
Abkürzungen
Abb. Abbildung
AUC Area under the plasma concentration-time curve BAL bronchoalveoläre Lavage
BALC bronchoalveoläre Lavage Zellen (engl. bronchoalveolar lavage cells) BRD Bovine Respiratory Disease
BP Bronchopneumonie bzw. beziehungsweise cm Zentimeter
Cmax maximale Plasmakonzentration
°C Grad Celsius d Tage
dl Deziliter
EDTA Ethylendiamintetraacetat et al. et alii
g Gramm
g Erdbeschleunigungskonstante GZ Gigazelle
h Stunde(n)
HIV Humanes Immundefizienzvirus
HPLC High Performance Liquid Chromatography i.m. intramuskulär
IS Interner Standard i.v. intravenös
kDa Kilodalton kg Kilogramm KGW Körpergewicht
Abkürzungsverzeichnis
VI IKR Interkostalraum
IKT innere Körpertemperatur L Liter
LC-MS/MS Liquid Chromatography with Tandem Mass Spectrometry
MHK/MIC minimale Hemmkonzentration (engl. minimal inhibitory concentration) mHz Megahertz
mg Milligramm ml Milliliter µg Mikrogramm µl Mikroliter mM Millimol mm Millimeter min Minute(n)
MRP2 Multidrug resistance-related protein 2 MW Mittelwert
ng Nanogramm Nr Nummer OTC Oxytetracyclin
PBS Phosphate buffered saline PCR Polymerase chain reaction PELF Pulmonary epithelial lining fluid P-gp p-Glykoprotein
pH potentia hydrogenii QK Qualitätskontrolle R. equi Rhodococcus equi
RNA Ribonukleinsäure (engl. ribonucleic acid) rpm rounds per minute
Abkürzungsverzeichnis
VII s.c. subkutan
SD Standardabweichung SRD Swine Respiratory Disease Tab. Tabelle
TBS Tracheobronchialsekret TMS Trimethoprim-Sulfonamid TULA Tulathromycin
Tmax Zeitpunkt der maximalen Konzentration (Cmax) T ½ Halbwertszeit
u.a. unter anderem U Unit
Urea Harnstoff V Volumen V. Vena
Vap Virulenzplasmid WBC White blood cell
Einleitung
1 1 Einleitung
Rhodococcus equi (R. equi) Pneumonien bei Fohlen führen weltweit zu erheblichen wirtschaftlichen Verlusten in der Pferdeaufzucht (ELISSALDE et al. 1980; TAKAI 1997;
VENNER et al. 2012). Neben einer hohen Mortalität macht das Fehlschlagen präventiver Maßnahmen die Erkrankung so gefährlich (CHIRINO-TREJO et al. 1987;
LOPEZ et al. 2003; HOOPER-MCGREVY et al. 2005; BAUMANN 2006; VENNER et al. 2012; VENNER et al. 2013a). Makrolidantibiotika gehören sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin zu den effektivsten Wirkstoffen gegen Pneumonieerreger (FARRINGTON 1998; MUSCATELLO et al. 2007; MARTIN- LOECHES et al. 2010). Sie haben die Überlebensrate von an R. equi erkrankten Fohlen von 20 % auf über 90 % erhöht (HILLIDGE 1987). Da das erstmals vor über 60 Jahren beim Pferd eingesetzte Erythromycin (WASHINGTON u. WILSON 1985) starke Nebenwirkungen aufweist und das Gabeintervall mit 6 - 8 h kurz ist (GUSTAFSSON et al. 1997; GIGUÈRE et al. 2011), ist es wichtig, neue Vertreter von Makroliden für die Therapie im Fohlen zu untersuchen und die Wirksamkeit zu testen. Tulathromycin, ein in der Nutztiermedizin bereits erfolgreich eingesetztes Makrolidantibiotikum (ROWAN 2005), ist auch für Fohlen gut verträglich (VENNER et al. 2007a). Durch den Einsatz von Tulathromycin konnte, in einem von R. equi endemisch betroffenen Gestüt, eine hohe Genesungsrate (89 %) erzielt werden (RUTENBERG et al. 2017).
Da die Minimale Hemmkonzentration (MHK) von 64 µg/ml gegenüber R. equi in der gesunden Fohlenlunge jedoch nicht erreicht wird (CARLSON et al. 2010; VENNER et al. 2010), ist diese gute Wirksamkeit theoretisch nicht zu begründen. Eine mögliche Erklärung ist, dass die Anreicherung von Tulathromycin in der Fohlenlunge durch pathologisch bedingte Veränderungen von der Situation im gesunden Tier abweicht.
Ziel ist es daher zu untersuchen, ob Tulathromycin in erkrankten Fohlenlungen höhere Konzentrationen aufweist. In der vorliegenden Studie wird erstmals der Vergleich von Konzentrationen eines Makrolidantibiotikums zwischen gesunden und an Bronchopneumonie erkrankten Lungen im Fohlen durchgeführt.
Schriftum
2 2 Schriftum
2.1 Rhodococcus equi (R.equi) 2.1.1 Allgemeines
Die Rhodokokkose ist eine seit 1923 bekannte Infektionskrankheit (MAGNUSSON 1938), an der vor allem Fohlen erkranken (MUSCATELLO 2012). Die dadurch entstehende pyogranulomatöse Bronchopneumonie führt weltweit zu hohen Verlustraten in der Pferdeaufzucht (ELISSALDE et al. 1980). Auch im Nutztierbereich richtet R. equi Schäden an. So kann es, allerdings sehr selten, bei Schweinen zu granulomatösen Lymphadenitiden (TAKAI et al. 1996), bei Rindern zur Abszessbildung in Lymphknoten, Bronchopneumonien und Mastitiden (PRESCOTT 1991) kommen. Erkrankte Ziegen zeigen Abszesse in der Leber, sowie ebenfalls Bronchopneumonien (TKACHUK-SAAD et al. 1998). Cameliden können an einer systemischen Form leiden, entwickeln Pneumonien oder Abszesse in Lymphknoten (KINNE et al. 2011). Äußerst selten wird auch von Pneumonien und Wundinfektionen bei Hunden und Katzen berichtet (TAKAI et al. 2003). Immunschwache Menschen, wie Neonate oder HIV-Positive, können durch R. equi als opportunistischer, pathogener Erreger an lebensbedrohlichen Pneumonien erkranken (DONISI et al. 1996).
2.1.2 Der Erreger
R. equi ist ein grampositives, pleomorphes und unbewegliches Bakterium (GOODFELLOW 1977). Der aerobe und nicht sporenbildende Bodensaprophyt wächst am besten in trockenen Böden bei warmen Temperaturen und Beimischung von Herbivorenkot (HUGHES u. SULAIMAN 1987). R. equi kann sich im Darm vermehren, was für einen fäkal-oralen Lebenszyklus sorgt. Da die Infektion aber überwiegend inhalativ erfolgt, wird sie neben einer hohen Bestandsdichte durch trockenes Wetter und Staub in der Atemluft der Tiere begünstigt (MUSCATELLO et al. 2007).
R. equi ist zumeist ein harmloser Umweltbewohner; erst die Expression von virulenzassoziierten Plasmiden (pVAP) machen den Erreger pathogen. Erkrankte Fohlen scheiden eine hohe Zahl an Pathogenen über den Kot aus (VENNER et al.
2007b). Die Vermehrung des Bakteriums erfolgt in der Lunge ausschließlich in mononukleären Leukozyten (JOHNSON et al. 1983). Dabei werden die Bakterien durch Rezeptoren erkannt und phagozytiert (HONDALUS et al. 1993). Die virulente
Schriftum
3
Form von R. equi ist in der Lage, die intrazelluläre Lysosomen-Phagosomen-Fusion zu hemmen und so einer Ansäuerung und damit der Eradikation zu entgehen (ZINK et al. 1987; TOYOOKA et al. 2005). Die unkontrollierte Vermehrung von R. equi in Makrophagen führt zum Zelltod durch Nekrose und dadurch zur Abszessbildung (LÜHRMANN et al. 2004).
2.1.3 Erkrankung des Fohlens
R. equi kann weltweit in vielen Pferdebetrieben nachgewiesen werden, Fohlen erkranken aber in manchen Betrieben endemisch, in anderen sporadisch und in vielen gar nicht (GIGUÈRE et al. 2011). Die typische respiratorische Erkrankung betrifft Fohlen in einem Alter von 1 bis 6 Monaten (PRESCOTT 1991). Ohne Behandlung ist eine Mortalität bis 80 % beschrieben (HILLIDGE 1987).
Pneumonie
Erkrankte Fohlen zeigen eine subakute oder chronische pyogranulomatöse Bronchopneumonie (ZINK et al. 1986). Die pyogranulomatösen Konsolidierungen können dabei mehrere Zentimeter groß werden (MIESSNER u. WETZEL 1923; BAIN 1963). In seltenen Fällen kann es zu akuten bis perakuten Verläufen kommen.
Betroffene Fohlen können dann innerhalb von wenigen Stunden versterben. Dabei handelt es sich zumeist um interstitielle Pneumonien mit diffusen, kleinen Läsionen (MARTENS et al. 1982).
Extrapulmonale Erkrankungen
Extrapulmonale Erscheinungen sind nicht ungewöhnlich und senken die Überlebenswahrscheinlichkeit deutlich (REUSS et al. 2009). 50 % der Fohlen mit Bronchopneumonie weisen auch intestinal pathologische Veränderungen auf. Dabei kann es entweder zu multifokalen Ulzera in Dick- und Blinddarm kommen oder zu einem einzigen großen Abszess im Gekröse, der mit einer schlechten Prognose verbunden ist (ZINK et al. 1986). Immunmediierte Entzündungsprozesse verursachen häufig sterile Polysynovitiden (SWEENEY et al. 1987). Durch die Verschleppung von R. equi über das Blut sind auch septische Synovitiden und Osteomyelitiden, sowie Diskospondylitiden beschrieben (GIGUERE u. LAVOIE 1994; CHAFFIN et al. 1995).
R. equi kann durch Bakteriämie einen Großteil aller Organe befallen (REUSS et al.
2009).
Schriftum
4 2.1.4 Diagnostik
Der chronische Krankheitsverlauf in Kombination mit der Fähigkeit des Fohlens, einen Funktionsausfall eines großen Lungengebietes zu kompensieren, macht eine klinische Diagnose im Frühstadium schwierig. Am häufigsten kommt es zu einer milden Pneumonie, die vereinzelt pyogranulomatöse Veränderungen in der Lunge ohne klinische Symptomatik aufweist (VENNER et al. 2007a). Schreitet der Krankheitsprozess fort, werden klinische Symptome wie Husten, Rasseln der Trachea, mukopurulenter Nasenausfluss, Fieber, Lethargie und angestrengte Atmung beobachtet (GIGUÈRE et al. 2011). Häufig kann eine Leukozytose im Blut nachgewiesen werden (GIGUÈRE et al. 2003), die aber im frühen Stadium der Erkrankung nicht zuverlässig ist (ALTHAUS 2004). Labordiagnostisch erweist sich die Detektion von R. equi ebenfalls als unzuverlässig. So konnte in einer Studie gezeigt werden, dass durch Kulturanzucht bzw. PCR aus Tracheobronchialsekret keine verlässlichen Sensitivitäten erreicht werden (VENNER et al. 2006). Die Ultrasonographie des Thorax stellt in endemisch betroffenen Gestüten die sicherste diagnostische Methode dar (ALTHAUS 2004).
2.1.5 Therapie
In vielen Fällen heilen die kleinen pyogranulomatösen Pneumonieherde, die mit einer milden, subklinischen Erkrankung einhergehen, spontan ab (VENNER et al. 2012;
VENNER et al. 2013a). Nimmt die Erkrankung jedoch einen ernsten Verlauf und zeigen die Fohlen klinische Symptome, ist eine antibiotische Therapie unverzichtbar (PRESCOTT 1991). Die intrazelluläre Lokalisation und vorhandene Resistenzfaktoren (β-Laktamasen, Aminoglycosid-Phosphotransferasen und Effluxpumpen) von R. equi grenzen die Wahl der anwendbaren Antibiotika ein (LETEK et al. 2010; VÁZQUEZ- BOLAND et al. 2013). Die Kombination eines Makrolidantibiotikums mit Rifampicin konnte bereits vor über 30 Jahren die hohe Mortalität von erkrankten Fohlen senken und ist bis jetzt Goldstandard in der Therapie der R. equi-Pneumonie (HILLIDGE 1987;
GIGUÈRE et al. 2011). Beide Antibiotika sind zwar in vitro wirksam gegen R. equi, sollten aber in vivo nicht als Monotherapie verwendet werden, um der Entstehung von Resistenzen vorzubeugen (PRESCOTT u. NICHOLSON 1984; NORDMAM u.
RONCO 1992). Das früher eingesetzte Makrolidantibiotikum Erythromycin wurde durch Makrolide einer neuen Generation ersetzt. Diese haben den Vorteil, dass sie im Vergleich deutlich niedriger dosiert und das Gabeintervall verlängert werden konnte
Schriftum
5
(GIGUÉRE et al. 2004). Zu den Makroliden der neuen Generation gehören u.a.
Azithromycin, Clarithromycin, Gamithromycin und Tulathromycin. In vielen Studien konnte gezeigt werden, dass Azithromycin als Monotherapie und in Kombination mit Rifampicin sehr gut wirksam gegen R. equi ist und die pyogranulomatösen Veränderungen in der Lunge innerhalb von Tagen zurückgehen (VENNER et al.
2007a; VENNER et al. 2013b). In einer retrospektiven Studie weist Clarithromycin in Kombination mit Rifampicin eine verkürzte Behandlungsdauer im Vergleich zur Kombination Azithromycin-Rifampicin auf (GIGUÉRE et al. 2004). Dieses Ergebnis sollte die Wahl des geeigneten Makrolids jedoch nicht beeinflussen, da die Bioverfügbarkeit von Clarithromycin bei Gabe von Rifampicin sehr stark reduziert wird (PETERS et al. 2011). Gamithromycin weist ebenfalls eine starke klinische Wirksamkeit gegenüber R. equi auf, jedoch werden Nebenwirkungen wie Koliken und Lahmheit beobachtet (HILDEBRAND et al. 2015). Eine aktuelle Studie von Rutenberg et al. zeigt, dass Tulathromycin bei moderat an R. equi erkrankten Fohlen eine hohe Genesungsrate von 88,6 % im Gegensatz zur Placebogruppe mit 27,5 % aufweist (RUTENBERG et al. 2017).
Generell sollte die Therapie drei bis 12 Wochen andauern, je nach Schweregrad der Erkrankung. Ausschlaggebend ist, dass sich ultrasonographisch darstellbare Verdichtungen zurückbilden und evtl. vorhandene klinische Symptome abklingen (GIGUÈRE et al. 2011; VENNER et al. 2013b).
2.2 Makrolidantibiotika
2.2.1 Allgemeines und Wirkungsweise
Makrolidantibiotika (lat. makro = groß; olid = Lakton) sind organische Moleküle, die aus einem 12- bis 16-gliedrigen Laktonring mit mindestens einem substituierten Zuckerrest bestehen. Es gibt natürliche (Erythromycin) und semisynthetische (Clarithromycin, Tulathromycin) Makrolide (PRESCOTT u. DOWLING 2013). Sie verhindern die bakterielle Proteinbiosynthese, indem sie an die ribosomale 50S Untereinheit binden.
Dadurch wird die Transpeptidierungs- und Translokationsreaktion gehemmt, was zur verfrühten Freisetzung von inkompletten Polypeptidketten führt. Makrolide wirken zumeist bakteriostatisch, nur in hohen Konzentrationen und gegenüber stark empfindlichen Bakterien können sie bakterizid wirken (BRISSON-NOËL et al. 1988;
VANNUFFEL u. COCITO 1996; PRESCOTT u. DOWLING 2013). Ihre Hauptwirkung
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6
umfasst vor allem ein grampositives Keimspektrum (CHARLES u. SEGRETI 1997), jedoch sind auch Wirkungen gegen gramnegative Keime beschrieben (NEU 1991).
Insbesondere gegen viele intrazelluläre Keime kommen Makrolide aufgrund ihres lipophilen und schwach basischen Charakters, sowie ihres niedrigen Molekulargewichtes erfolgreich zum Einsatz (LABRO 1996; SCORNEAUX u.
SHRYOCK 1999; AMSDEN 2001). Dazu zählen in der Humanmedizin Pathogene wie Campylobacter, Chlamydia, Legionella und Mycobacterium. Auch in der Veterinärmedizin finden die Makrolide geschätzte Anwendung (GIGUÉRE et al. 2004;
VENNER et al. 2007a). Aufgrund der guten Verteilung, der langen Persistenz im Lungengewebe und der intrazellulären Akkumulation in mononukleären Phagozyten sind die Makrolide optimal zur Behandlung von R. equi-bedingten Pneumonien im Fohlen geeignet (VILLARINO u. MARTÍN‐JIMÉNEZ 2013).
Makrolide diffundieren aufgrund ihrer lipophilen und schwach basischen Eigenschaft, sowie einem niedrigen Molekulargewicht gut in Zellen und zählen zu den Antibiotika, die am besten in Zellen akkumulieren (AMSDEN 2001). Doch der basophile Charakter ist auch verantwortlich dafür, dass Makrolide intrazellulär im sauren Milieu von Lysosomen protoniert werden und durch die positive Ladung nicht mehr durch die Lysosomenmembran zurück in das Zellplasma diffundieren können. Dieser Effekt wird
„Base trapping“ oder „Ion trapping“ genannt und ist der Grund, dass Makrolide intrazellulär zu zwei Drittel im Lysosom und zu einem Drittel im Zellplasma vorliegen (VAN BAMBEKE et al. 2006).
Neben der antimikrobiellen Wirkung zeigen die Makrolide auch entzündungshemmende Eigenschaften, indem sie die Produktion von proinflammatorischen Zytokinen, wie Interleukinen und des Tumornekrosefaktors Alpha unterbinden (ALTENBURG et al. 2011). Diesen Effekt machte man sich bei Therapie entzündlicher Lungenerkrankungen in der Humanmedizin (FRIEDLANDER u. ALBERT 2010), und in der Veterinärmedizin (JEFFREY LAKRITZ et al. 1997;
FISCHER et al. 2011) zu Nutze.
Als Motilinrezeptoragonisten haben Makrolide außerdem einen prokinetischen Effekt auf den Gastrointestinaltrakt, der bei Tieren oft beschrieben ist (LESTER et al. 1998;
COWLES et al. 2000; NOURI u. CONSTABLE 2007).
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7 2.2.2 Wichtige Vertreter
Erythromycin
Erythromycin ist ein Produkt des Bakteriums Streptomyces erythreus, das 1952 erstmals isoliert wurde (HAIGHT u. FINLAND 1952). Es besteht aus einem 14- gliedrigen Laktonring und wurde als erster Vertreter der Makrolidantibiotika zur Behandlung von Diphtherie, Keuchhusten, Campylobakteriose und Legionellose eingesetzt (WASHINGTON u. WILSON 1985). In der Pferdemedizin hat der Einsatz von Eryrthromycin die hohe Mortalität der an R. equi erkrankten Fohlen stark reduziert (HILLIDGE 1987). Es wurde jedoch beobachtet, dass Stuten die von behandelten Fohlen ausgeschiedenen, noch aktiven Erythromycinrückstände im Kot zu sich nehmen und starke Kolitiden entwickeln, teilweise sogar mit tödlichem Ausgang (GUSTAFSSON et al. 1997). Die klinische Anwendung von Erythromycin wurde nahezu vollständig von den Makroliden der neuen Generation abgelöst, weil diese einige bedeutende Vorteile aufweisen. Im Gegensatz zu Erythromycin, das durch die kurze Halbwertszeit ein Gabeintervall von sechs Stunden hat, müssen neue Makrolide einmal täglich oder sogar nur einmal wöchentlich verabreicht werden (PRESCOTT et al. 1983; VILLARINO u. MARTÍN‐JIMÉNEZ 2013). Außerdem ist die Bioverfügbarkeit bei oraler Gabe von Erythromycin durch die Säureinstabilität sehr variabel und die Injektion schlecht verträglich (JEFFREY LAKRITZ et al. 2000; STRATTON-PHELPS et al. 2000). Weiterhin weist Erythromycin im Vergleich zu anderen Makroliden signifikant geringere Lungenkonzentrationen auf (SUAREZ-MIER et al. 2007).
Azithromycin
Azithromycin gehört zur Klasse der Azalide, die ein methyliertes Stickstoffatom im makrozyklischen Ring besitzen (NEU 1991). Azithromycin ist semisynthetisch und der Laktonring ist 15-gliedrig (RETSEMA et al. 1987). Durch das erweiterte, gramnegative Keimspektrum findet Azithromycin in der Humanmedizin großen Einsatz, in der Veterinärmedizin wird es aufgrund der fehlenden Zulassung nur nach Erregernachweis bei Therapienotständen als lebensrettende Maßnahme eingesetzt (RETSEMA et al.
1987; SAKUMA et al. 2009; ZUCKERMAN et al. 2011). In der Humanmedizin wird Azithromycin u.a. gegen Pneumonien und Otitis erfolgreich eingesetzt (SCHÖNWALD et al. 1990; PLOUFFE et al. 2000; GUVEN et al. 2006). In der Fohlenmedizin zeigen zahlreiche klinische Studien, dass Azithromycin das erfolgreichste und geeignetste Makrolid ist, um R. equi Pneumonien zu behandeln (GIGUÉRE et al. 2004; VENNER
Schriftum
8
et al. 2007a; VENNER et al. 2013b; RUTENBERG et al. 2017). Es ist sowohl als Monotherapie, wie auch in Kombination mit Rifampicin gut wirksam (VENNER et al.
2013b). Neben der starken Wirksamkeit punktet Azithromycin mit einer guten Bioverfügbarkeit nach oraler Gabe und erreicht nach einmal täglicher Applikation hohe Konzentrationen in der Lunge (GIRARD et al. 1987; STEPHANIE JACKS et al. 2001;
DAVIS et al. 2002).
Clarithromycin
Clarithromycin, ein semisynthetisches Derivat von Erythromycin, weist einen 14- gliedrigen Laktonring auf (PRESCOTT u. DOWLING 2013). In der Humanmedizin wird Clarithromycin zur Behandlung von Chlamydien- und Mycoplasmen-Infektionen eingesetzt (BLOCK et al. 1995; KRAFT et al. 2002). In der Fohlenmedizin hat Clarithromycin in Kombination mit Rifampicin in einer retrospektiven Studie eine minimal höhere Genesungsrate (17/18) erzielt, als die Kombination von Rifampicin mit Azithromycin (15/20) oder Erythromycin (18/24) (GIGUÉRE et al. 2004). Die Studie weist jedoch einige Limitationen auf, u.a. wurden die Tiere nicht prospektiv in Gruppen eingeteilt, mehrere verschiedene Rassen wurden an unterschiedlichen Standorten einbezogen, die Betreuung der Tiere erfolgte durch verschiedene Tierärzte, Dosierungen und Gabeintervalle wichen innerhalb der Gruppen voneinander ab und die Gesamtdauer der Studie erstreckte sich über einen Zeitraum von insgesamt sieben Jahren. Dieselben Autoren haben auch festgestellt, dass Clarithromycin das Makrolid mit der größten In-vitro-Aktivität gegen R. equi ist (JACKS et al. 2003). Die Arbeitsgruppe um PETERS et.al. hat jedoch festgestellt, dass Rifampicin beim Fohlen die Bioverfügbarkeit von Clarithromycin über 90 % reduziert. Darum wird diese Kombination zur Behandlung der R. equi-bedingten Pneumonie nicht mehr empfohlen (PETERS et al. 2011; BERLIN et al. 2016).
Gamithromycin
Gamithromycin gehört, wie Azithromycin, zu den Azaliden. Es ist semisynthetisch und besteht aus einem 15-gliedrigen Laktonring. Gamithromycin wurde zur Behandlung von Erkrankungen des Respirationstraktes in der Rindermedizin entwickelt und zeigt in vivo gute Wirkung gegen klinisch relevante Keime (BAGGOTT et al. 2011;
LECHTENBERG et al. 2011). Auch Streptococcus equi zooepidemicus und Rhodococcus equi sind in vitro sensibel (BERGHAUS et al. 2012). Außerdem wird Gamithromycin erfolgreich gegen die Moderhinke bei Schafen eingesetzt (SARGISON
Schriftum
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u. SCOTT 2011). Im Fohlen wird durch die Gabe von Gamithromycin eine hohe Genesungsrate (38/40) bei an R. equi erkrankten Tieren erreicht. Damit ist die klinische Wirksamkeit von Gamithromycin mit der Wirksamkeit der Kombinationstherapie Azithromycin/Rifampicin gleichzusetzen (HILDEBRAND et al. 2015). Allerdings kommt es beim Fohlen vermehrt zu Nebenwirkungen, wie Koliken oder Lahmheit nach i.m.
Injektionen, aufgrund der hohen Osmolalität der Injektionslösung (HILDEBRAND et al.
2015).
2.3 Tulathromycin
Tulathromycin ist der erste Vertreter der Klasse der Triamilide, die einen Laktonring mit drei funktionellen Stickstoffgruppen aufweisen (LETAVIC et al. 2002).
Tulathromycin ist ein semisynthetisches Isomer, der Laktonring besteht zu 90 % aus 15 und zu 10 % aus 13 Gliedern (PRESCOTT u. DOWLING 2013). Jede Aminogruppe kann je nach pH-Wert eine positive Ladung tragen. Die Dissoziationskonstante (pKa) reicht von 8,6 bis 9,6. Tulathromycin ist, wie alle Makrolide, lipidlöslich (EVANS 2004).
In der Humanmedizin ist Tulathromycin noch nicht zum Einsatz gekommen, da es nur für die Nutztiermedizin zugelassen wurde (PRESCOTT u. DOWLING 2013). In vitro zeigt Tulathromycin eine ausgeprägte antibiotische Aktivität gegen viele gramnegative Keime wie Mannheimia, Pasteurella, Histophilus, Moraxella, Fusobacterium, Actinobacillus, Haemophilus und Bordetella. Ebenso wurde eine gute Wirksamkeit gegen Mycoplasmen festgestellt (KILGORE et al. 2005; GODINHO 2008). Das grampositive Keimspektrum ist noch nicht hinreichend auf Empfindlichkeit untersucht.
In vitro liegt gegen Arcanobacterium pyogenes eine gute Wirksamkeit vor, gegen Rhodococcus equi eine schwächere (CARLSON et al. 2010; PRESCOTT u.
DOWLING 2013).
2.3.1 Tulathromycin in der Nutztiermedizin
Tulathromycin kommt in der Nutztiermedizin metaphylaktisch und therapeutisch von vielen Infektionskrankheiten zum Einsatz. Vor allem Erkrankungen des Respirationstraktes, u.a. Bovine Respiratory Disease bei Rindern und Swine Respiratory Disease bei Schweinen, stellen Hauptindikationen dar. Doch auch andere Erkrankungen, wie Keratokonjunktivitiden, Zwischenklauennekrosen und Blasenentzündungen bei Rindern können mit Tulathromycin erfolgreich therapiert werden (KILGORE et al. 2005; ROBB et al. 2007; ROVAY et al. 2008). Selbst bei kleinen Wiederkäuern wird Tulathromycin gerne eingesetzt, die Behandlung von
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Lymphadenitiden erzielte Genesungsraten von über 80 % bei intraläsionaler oder systemischer Applikation (WASHBURN et al. 2009).
2.3.1.1 Klinische Wirksamkeit Rinder
Eine Studie, in der Mastkälber einmalig metaphylaktisch mit verschiedenen Antibiotika behandelt wurden, ergab, dass die Kälbergruppe, welche Tulathromycin erhielt, signifikant weniger Fälle von undifferenziertem Fieber, signifikant niedrigere Behandlungsraten, signifikant weniger Rezidive und signifikant geringere Mortalitätsraten im Vergleich zu den mit Tilmicosin bzw. Oxytetracyclin behandelten Gruppen aufwies. Außerdem fielen die täglichen Gewichtszunahmen in der Tulathromycingruppe signifikant höher aus (BOOKER et al. 2006). Weiterhin wurde der therapeutische Einsatz von Tulathromycin bei jungen Milchkühen mit künstlich induzierter Mycoplasma bovis-Infektion (ein Erreger der Bovine Respiratory Disease) untersucht, dabei wurden signifikant geringere Höchsttemperaturen und Lungenläsionen in der mit Tulathromycin behandelten Gruppe im Vergleich zur Plazebogruppe festgestellt (GODINHO et al. 2004). Auch bei Behandlung von natürlich vorkommender Bovine Respiratory Disease konnte Tulathromycin in vielen Studien seine Wirksamkeit beweisen. So wurden in den USA durch die Verabreichung von Tulathromycin bessere Genesungsraten (88 % und 70 %) und höhere Gewichtszunahmen, als bei Behandlung mit Enrofloxacin (ROBB et al. 2007) und signifikant höhere Genesungsraten, als nach Gabe von Florfenicol und Tilmicosin beobachtet (NUTSCH et al. 2005b). Ähnliche Erfolge konnten in Europa durch die Behandlung von an Bovine Respiratory Disease erkrankten Kälbern mit Tulathromycin erzielt werden. So wurde von signifikant höheren Genesungsraten in der Tulathromycingruppe (78 %) als in der Tilmicosingruppe (65 %) und der Kontrollgruppe (23 %) berichtet (KILGORE et al. 2005). Außerdem wiesen an Bovine Respiratory Disease erkrankte Kälber, die mit Tulathromycin behandelt wurden, eine 50 % geringere Rezidivwahrscheinlichkeit auf, als solche, die mit Tilmicosin behandelt wurden (WELLMAN u. O'CONNOR 2007). Auch im Vergleich zu Florfenicol erzielte Tulathromycin signifikant niedrigere Rezidivraten und Mortalitäten bei Behandlung von Mastkälbern mit Fieber unbekannter Ursache (SCHUNICHT et al. 2007). Die subkutane (s.c.) Gabe von Tulathromycin erwies sich als wirkungsvolle Therapie von Kälbern mit künstlich induzierten, infektiösen Moraxella bovis Keratokonjunktivitiden
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(LANE et al. 2006). Auch bei Zwischenklauennekrosen wurden signifikant bessere Heilungsraten nach Tulathromycinbehandlung (60 %) im Vergleich zur Kontrollgruppe (8 %) erzielt (PFIZER 2005). Auch Vesikulitiden bei Rindern wurden erfolgreich mit Tulathromycin (88 %) behandelt, während in der Kontrollgruppe keine Genesung beobachtet werden konnte (ROVAY et al. 2008).
Schweine
Eine groß angelegte Studie teilte 720 an natürlicher Swine Respiratory Disease erkrankte Schweine, gehalten in sechs verschiedenen Populationen in Nordamerika, zufällig in zwei Behandlungs- (Tulathromycin oder Ceftiofur) und eine Plazebogruppe ein. Für die Tulathromycingruppe wurde eine signifikant höhere Genesungsrate von 71 % erreicht (Plazebogruppe: 47 %). Auch die Ceftiofur-Gruppe erreichte eine Genesungsrate von 63 % und unterscheidet sich damit nur unwesentlich von der Tulathromycingruppe. Weiterhin war die Mortalität in den beiden Behandlungsgruppen signifikant geringer als in der Plazebogruppe (NUTSCH et al. 2005a). In Europa wurde eine ähnliche Studie in fünf verschiedenen Betrieben durchgeführt. Die ebenfalls auf natürliche Weise an Swine Respiratory Disease erkrankten Schweine wurden in eine von drei Behandlungsgruppen (Tulathromycin, Tiamulin oder Florfenicol) eingeteilt.
Rektaltemperaturen waren in allen Behandlungsgruppen signifikant geringer als vor Behandlungsbeginn. Die täglichen Gewichtszunahmen unterscheiden sich zwischen den verschiedenen Behandlungsgruppen nicht signifikant, jedoch wiesen die mit Tulathromycin behandelten Schweine eine signifikant höhere Genesungsrate (81 %) auf, als jene, welche mit Tiamulin (63 %) oder Florfenicol (68 %) behandelt wurden (NANJIANI et al. 2005). Sowohl die Studie aus den USA, als auch die aus Europa haben gezeigt, dass Tulathromycin erfolgreich zur Therapie von Swine Respiratory Disease eingesetzt werden kann und die Verabreichung von 2,5 mg/kg i.m. gut vertragen wird.
Kleine Wiederkäuer
In einer Studie mit an Lymphadenitis erkrankten Schafen und Ziegen (Corynebacterium pseudotuberculosis) erzielte Tulathromycin gute Genesungsrate bei intraläsionaler (83 %) und subkutaner (82 %) Injektion (WASHBURN et al. 2009).
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2.3.1.2 Pharmakokinetik und Anreicherung in der Lunge
In allen untersuchten Tierarten (Rind, Schwein, Pferd und Maus) wird Tulathromycin schnell vom Injektionsort absorbiert und anschließend gut im Gewebe verteilt, wobei die Verteilungsvolumina nach Tierart unterschiedlich zwischen 13 und 41 l/kg liegen (BENCHAOUI et al. 2004; COX et al. 2010; VENNER et al. 2010; CLOTHIER et al.
2012). Im Vergleich mit anderen Makroliden akkumuliert Tulathromycin ebenso gut im Lungenkompartiment, weist aber eine deutlich längere Halbwertszeit im Plasma (~ 90 h) auf (BENCHAOUI et al. 2004; VENNER et al. 2010). Die Bioverfügbarkeit ist nach i.m. und s.c. Applikation hoch (ca. 90 %). In der Lunge liegt Tulathromycin hauptsächlich intrazellulär, aber auch proteingebunden (Mukus) und frei im Interstitium vor (VILLARINO et al. 2014). Tulathromycin wird vom Körper nicht metabolisiert und somit unverändert über Leber und Niere ausgeschieden (PFIZER 2005).
Rinder
In einer Studie an Kälber wurde Tulathromycin (2,5 mg/kg) s.c. einmalig verabreicht und anschließend an acht verschiedenen Zeitpunkten, von einer bis 360 h nach Tulathromycin-Gabe reichend, bei je drei Tieren Blut abgenommen, eine BAL durchgeführt und Lungengewebe entnommen. Dabei wurde 3 h (tmax) nach Tulathromycin-Gabe eine maximale Konzentration (Cmax) von 277 ng/ml gemessen.
Die AUC betrug 9,26 µg × h/ml und die Halbwertszeit 64 h. Bereits 3 h nach Tulathromycin-Gabe wurden Konzentrationen von > 1.000 ng/ml in der PELF und 1.000 ng/g im Lungenhomogenat gemessen. Die höchste Konzentration in den Zellen der BAL (BALC) betrug 19.500 ng/ml nach 72 h. Doch auch 360 h nach Tulathromycin- Gabe wurden noch immer Konzentrationen von 10.600 ng/ml gemessen. Damit entsprach die AUCLunge ungefähr dem 565-fachen der AUCPlasma (COX et al. 2010).
Schweine
In einer Studie an Schweinen konnte eine schnelle Absorption (tmax 0,25 h), sowie eine hohe Bioverfügbarkeit (> 87 %) von Tulathromycin (2,5 mg/kg, single-dose) nach i.m.
Injektion beobachtet werden. Cmax im Plasma betrug 616 ng/ml. Die AUC betrug 10,9 µg × h/ml und die Halbwertszeit 75,6 h. Im Lungenhomogenat wurden 2.840 ng/g 12 h bzw. 3.470 ng/g 24 h nach Tulathromycin-Gabe gemessen. Auch zehn Tage nach Tulathromycin-Gabe konnten noch 1.240 ng/g gemessen werden. Es zeigte sich eine 61,4-mal höhere AUC in der Lunge im Vergleich zum Plasma (BENCHAOUI et al.
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2004). Weitere Studien, welche die i.v.-Gabe von Tulathromycin am Schwein untersuchten, lieferten vergleichbare pharmakokinetische Daten (WANG et al. 2012).
Im Lungenhomogenat reichte die Konzentration von 2.010-4.400 ng/ml und in der Pulmonary Epithelial Lining Fluid (PELF) von 2.580-7.890 ng/ml (WANG et al. 2012;
VILLARINO et al. 2013b, a).
Ziegen
In einer pharmakokinetischen Studie an juvenilen und adulten Ziegen wurde Tulathromycin (2,5 mg/kg, single-dose) s.c. verabreicht. Nach 0,22 h (tmax) wurden Konzentrationen (Cmax) von 988 ng/ml bei juvenilen und 1185 ng/ml bei adulten Ziegen erreicht. Die AUC betrug 10.580 ng × h/ml für juvenile und 7.918 ng x h/ml für adulte Ziegen. Die terminale Halbwertszeit betrug 60 h bei juvenilen und 61 h bei adulten Ziegen. Ein signifikanter Unterschied zwischen beiden Gruppen war nicht auszumachen. In einem weiteren Versuch wurden ausschließlich juvenile Ziegen über einen Zeitraum von drei Wochen mit drei verschiedenen Dosierungen (2,5; 7,5 und 12,5 mg/kg) einmal wöchentlich therapiert. Pharmakokinetisch war kein signifikanter Unterschied zwischen den verschiedenen Dosisgruppen feststellbar (CLOTHIER et.
al. 2012). Die Plasmakonzentrationen waren im multiple-dose-Regimen jedoch signifikant höher im Vergleich zur single-dose-Gabe.
2.3.2 Tulathromycin beim Fohlen
2.3.2.1 Einsatz und klinische Wirksamkeit
Verschiedene klinische Studien mit Tulathromycin zeigen vielversprechende Ergebnisse im Einsatz gegen Infektionen der unteren Atemwege, besonders zur Behandlung der R. equi-bedingten Pneumonie (VENNER et al. 2007a; RUTENBERG et al. 2017). Bereits vor zehn Jahren wurde gezeigt, dass Tulathromycin nach i.m.
Injektion der empfohlenen Dosis von 2,5 mg/kg in die lange Sitzbeinmuskulatur von Fohlen gut vertragen wird. Außerdem waren nach durchschnittlich 53 Tagen Behandlungsdauer 30 der 37, an einer milden Form der R. equi-bedingten Pneumonie erkrankten Fohlen frei von klinischen oder ultrasonographischen Symptomen (VENNER et al. 2007a). An Fohlen eines Gestütes mit endemischer Rhodokokkose wurde der in der Nutztiermedizin übliche metaphylaktische Einsatz von Tulathromycin zur Anwendung gegen R. equi-bedingten Pneumonien evaluiert. Dabei wurden 24 Fohlen vom zehnten Lebenstag bis zum Absetzen einmal wöchentlich 2,5 mg/kg i.m.
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verabreicht. Es konnte kein signifikanter Unterschied bezüglich der Morbidität zwischen behandelter und Kontrollgruppe festgestellt werden. Somit werten die Autoren Tulathromycin als ungeeignet zur Vorbeugung der R. equi Pneumonie beim Fohlen (BACH 2011). In einer weiteren kontrollierten Blindstudie in demselben Gestüt wurde die klinische Wirksamkeit von Tulathromycin zur Behandlung von 128 subklinisch an R. equi erkrankte Fohlen mit ultrasonographisch darstellbaren Lungenabszessen von geringem Ausmaß untersucht. Die Probanden wurden zufällig drei Behandlungsgruppen (Gruppe 1: Tulathromycin 2,5 mg/kg, i.m. in wöchentlichem Intervall, Gruppe 2: Azithromycin Monotherapie 10 mg/kg, oral einmal täglich und Gruppe 3: Azithromycin in Kombination mit Rifampicin, je 10 mg/kg, oral einmal täglich und einer Plazebogruppe) zugeteilt. Obwohl die Genesungsrate der Tulathromycingruppe mit 63 % die höchste war, unterschied sie sich nicht signifikant zu jener der Plazebogruppe (44 %). Die Genesungsrate der anderen Behandlungsgruppen erreichte trotz „Goldstandard“-Status keine signifikant höheren Werte (53 %) im Vergleich zur Tulathromycingruppe (VENNER et al. 2012). Die Veröffentlichung einer hohen MHK von Tulathromycin gegenüber R. equi von 64 µg/ml und der damit verbundenen theoretisch geringeren Wirksamkeit im Vergleich zu anderen Makroliden in vivo, hatte zur Folge, dass von der Verwendung von Tulathromycin zur Behandlung der R. equi-bedingten Pneumonien beim Fohlen abgeraten wurde (CARLSON et al. 2010). Kürzlich hat jedoch eine prospektive klinische Blindstudie an erkrankten Fohlen ergeben, dass Tulathromycin keineswegs ungeeignet zur Therapie ist. Insgesamt wurden 240 erkrankte Fohlen mit ultrasonographisch darstellbaren Lungenabszessen (Abszesscore: 10-15 cm) zufällig in eine von zwei Behandlungsgruppen, Tulathromycin bzw. Azithromycin in Kombination mit Rifampicin oder in die Plazebogruppe eingeteilt. In der Tulathromycingruppe wurde eine Genesungsrate von 89 % erreicht. Damit war die Genesungsrate signifikant höher als die der Plazebogruppe mit 28 % und nur wenig geringer als die der „Goldstandard“-Gruppe (Azithromycin + Rifampicin) mit 95 %.
Tulathromycin wird außerdem von den Autoren als sicher und annähernd nebenwirkungsfrei (lediglich ein Fohlen wies eine Schwellung an der Injektionsstelle auf) beschrieben (RUTENBERG et al. 2017).
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2.3.2.2 Pharmakokinetik und Anreicherung von Tulathromycin in der Lunge beim lungengesunden Fohlen
Tulathromycin wird beim Fohlen nach i.m. Applikation in die lange Sitzbeinmuskulatur schnell absorbiert. In einer pharmakokinetischen Studie mit 21 Fohlen, welche die single- und multiple-dose-Gaben (einmal wöchentlich für 5 Wochen) von Tulathromycin (2,5 mg/kg, i.m.) untersuchte, zeigte sich, dass, wie auch bei den Nutztieren, der Wirkstoff schnell vom Injektionsort absorbiert wird (tmax 0,3 bis 2,5 h) und in der Lunge akkumuliert (in der PELF ~ 7-fach und in den BALC ~ 23-fach höhere Konzentrationen als im Plasma zum Zeitpunkt 192 h nach Tulathromycin-Gabe). Die Parameter Cmax, AUC, und die Konzentrationen in den Zellen der BAL waren zu beiden Spülzeitpunktenbei multiple-dose-Verabreichung signifikant höher als bei single-dose- Verabreichung (
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Tabelle 1). Auch die PELF/Plasmaverhältnisse zu beiden Spülzeitpunkten und das BALC/Plasma, sowie das BAL/PELF Verhältnis zum Zeitpunkt 24 h nach Tulathromycin-Gabe zeigten bei multiple-dose-Verabreichung signifikant höhere Werte als die single-dose-Verabreichung. Ein hohes Verteilungsvolumen von Tulathromycin im Fohlen von bis zu 41 l/kg wurde gemessen (VENNER et al. 2010).
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Tabelle 1: Die wichtigsten pharmakokinetischen Parameter und
Lungenkonzentrationen beim gesunden Fohlen nach einmaliger (single-dose) Gabe und nach mehrmaliger (multiple-dose) Gabe von Tulathromycin (VENNER et al.
2010). Die Untersuchung der multiple-dose-Werte erfolgte nach der letzten Gabe.
Signifikante Unterschiede sind mit * markiert (p ≤ 0,05).
Parameter Single-dose Multiple-Dose Einheit
Plasma
Cmax 0,46 ± 0,18 0,66 ± 0,17 * µg/ml
tmax 2,47 ± 4,09 0,36 ± 0,11 h
t1/2 105 ± 25,0 140 ± 51,0 h
AUC 20,5 ± 5,00 24,4 ± 3,70 * ng x h/ml
PELF
C 24 h 1,52 ± 1,14 1,66 ± 0,91 µg/ml
C 192 h 0,31 ± 0,25 0,40 ± 0,14 µg/ml
BAL
C 24 h 0,20 ± 0,08 1,56 ± 1,02 * µg/ml
C 192 h 0,30 ± 0,17 1,23 ± 0,90 * µg/ml
Verhältnisse
PELF/Plasma 24 h 10,8 ± 7,3 7,51 ± 5,22 * PELF/Plasma 192 h 16,0 ± 16,0 7,50 ± 5,20 * BALC/Plasma 24 h 1,62 ± 0,88 6,61 ± 4,16 * BALC/Plasma 192 h 15,2 ± 11,1 22,8 ± 20,2
BALC/PELF 24 h 0,22 ± 0,18 1,50 ± 1,70 * BALC/PELF 192 h 1,58 ± 1,46 2,77 ± 1,54
2.3.3 Minimale Hemmstoffkonzentrationen gegenüber R. equi
Die Minimale Hemmkonzentration (MHK) ist die niedrigste Konzentration eines Antibiotikums, die nötig ist, um das Wachstum eines bestimmten Bakteriums zu verhindern. Je geringer die MHK, desto empfindlicher ist das Bakterium gegenüber dem Antibiotikum. Die Bestimmung der MHK erfolgt in vitro und sollte, je nach Empfindlichkeit eines Bakteriums, als Orientierungshilfe für die Wahl des geeigneten Antibiotikums zur Anwendung in vivo dienen (ANDREWS 2001). Tulathromycin weist je nach Isolat eine MHK von >32 µg/ml gegenüber R. equi auf. Mit Konzentrationen von ~ 0,70 µg/ml (Cmax) im Plasma bzw. 1,56 µg/ml am Ort der Wirkung, in den BALC, nach multiple-dose-Gabe erscheint damit, aus pharmakokinetischer Sicht, eine erfolgreiche Therapie von Fohlen mit R. equi überaus fraglich. Im Vergleich dazu weisen Azithromycin und Clarithromycin sehr niedrige MHKs von 0,06-2,00 µg/ml bzw.
0,06-0,12 µg/ml gegenüber R. equi auf (CARLSON et al. 2010). Bisher sind sämtliche
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pharmakologische Untersuchungen von Makroliden an gesunden Fohlen durchgeführt worden. Inwiefern aber die ermittelten Werte auch bei der entzündlich veränderten Lunge vorkommen, ist bis heute nicht ermittelt worden. Im Folgenden wird der Einfluss der Gewebeveränderung auf die Verteilung des Wirkstoffes zusammengestellt.
2.4 Verteilung von Antibiotika in gesunden und entzündeten Lungen
2.4.1 Faktoren, welche die Anreicherung im kranken Lungengewebe verändern können
Im entzündeten Lungengewebe kommt es durch Einstrom von Entzündungszellen und Ausschüttung von Entzündungsmediatoren, sowie aufgrund des schlechten Gasaustausches und der damit verbundenen Anreicherung von Kohlendioxid, zum Absinken des pH-Wertes (VON ENGELHARDT u. BREVES 2005; MCGAVIN u.
ZACHARY 2009). Durch den hohen pK-Wert von Tulathromycin (EVANS 2004) ist eine verstärkte Anreicherung von Tulathromycin in saurem Lungengewebe aufgrund des unter Punkt 2.2.1 beschriebenen „Base Trappings“ denkbar. Zusätzlich zum Abfall des pH-Wertes kommt es im entzündeten Lungengewebe zum massenhaften Einstrom von Makrophagen und anderen Entzündungszellen (HILLIDGE 1986; PRESCOTT 1991). Besonders in Makrophagen akkumuliert Tulathromycin in hohen Konzentrationen (VILLARINO u. MARTÍN‐JIMÉNEZ 2013). Erhöhte Konzentrationen von Makrophagen sollten somit eine Erhöhung der Tulathromycinkonzentration mit sich ziehen. Es kommt durch den Einstrom der Entzündungszellen außerdem zu Veränderungen der Zelltransporterexpression (FARDEL u. LE VÉE 2009), was eine vermehrte Aufnahme oder Ausschleusung von Stoffen, wie Tulthromycin, in bzw.
aus Zellen bewirken kann. Die Durchblutung eines pyogranulomatösen Lungengewebes ist aufgrund des schlechten Gasaustausches (hypoxische Vasokonstriktion) (VON ENGELHARDT u. BREVES 2005) und dem verdichteten Bezirk bzw. der Kapsel um die veränderten Bereiche (MAGNUSSON 1923;
MIESSNER u. WETZEL 1923; BAIN 1963) reduziert (HAMMOND et al. 1993). Dies und die Verlängerung der Penetrationswege durch die Ödematisierung des Gewebes (MCGAVIN u. ZACHARY 2009) würde eine reduzierte bzw. verlangsamte Aufnahme von Stoffen zur Folge haben. Entzündungsprozesse verursachen lokal eine Zerstörung von Gefäßwänden und senken die Proteinbindung von Medikamenten im Blutplasma, was dazu beitragen kann, dass sich diese vermehrt im extravaskulären
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Raum anreichern (ZONGHUI u. XIAOQUN 1992). Fazit ist, dass diese Einflussfaktoren zusammenspielen und sich zu unbekannt hohen Anteilen auf die Konzentration von Makroliden in der Lunge auswirken. Der tiefere pH-Wert, der Einstrom von Makrophagen, die Zerstörung von Gefäßwänden und das Senken der Proteinbindungskapazität lassen eine erhöhte Konzentration von Makroliden in entzündeten Lungengebieten vermuten, was sich wiederum aufgrund der verringerten Durchblutung und der verlängerten Penetrationswege in einem späteren Zeitpunkt der höchsten Konzentration (tmax) widerspiegeln könnte.
2.4.2 Bereits erfolgte Vergleichsstudien
Obwohl angenommen wird, dass durch die ungleichmäßige Durchblutung der Lunge (BROGAN et al. 2007) die homogene Verteilung von Medikamenten negativ beeinflusst wird (ROLAND u. TOZER 2011), ergab eine Studie an Schweinen, dass die Konzentration von Tulathromycin in mittleren und caudalen Lungenlappen von gesunden Lungen homogen ausfällt (VILLARINO et al. 2013b).
Die Konzentration von Azithromycin war in entzündeten Arealen signifikant höher als in gesunden Arealen derselben Lunge (GIRARD et al. 1996). Auch Oxytetracyclin (OTC), ein Tetrazyklinantibiotikum, erreichte in künstlich induzierten entzündeten Kälberlungen eine höhere Konzentration als in Lungen gesunder Kontrollkälber. Das Verteilungsvolumen und die Halbwertszeit von OTC waren in der Pneumoniegruppe ebenfalls erhöht (AMES et al. 1983).
Wie bereits zuvor erwähnt, kann die Anreicherung von Wirkstoffen im Lungenkompartiment durch die multifaktoriellen Einflüsse von Entzündungen negativ beeinflusst werden. So wurden in entzündeten, cranioventralen Lungenarealen niedrigere Konzentrationen von Danofloxacin, einem Antibiotikum aus der Gruppe der Chinolone, als in caudodorsalen, gesunden Arealen von Rindern nach i.m. Injektion gemessen (APLEY u. UPSON 1993). Der Einfluss von pulmonalen Infektionen auf die Anreicherung von Tulathromycin im Vergleich zu gesunden Lungen wurde bis dato nicht signifikant unterschiedlich bzw. niedriger in infizierten Lungen im Vergleich zu gesunden Lungen beschrieben, was sogleich näher erläutert wird. In einer Studie an Mäusen wurde gezeigt, dass sich die Tulathromycinkonzentration weder zwischen gesunden und infizierten (Lipopolysaccharide von E. coli) Lungen noch zwischen Lungen von normalen und neutropenischen Mäusen nach s.c. Injektion signifikant unterscheidet. Die Autoren nehmen daher an, dass neutrophile Granulozyten nicht zur
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Anreicherung von Tulathromycin im Lungengewebe beitragen (VILLARINO et al.
2012). Die Tulathromycinkonzentration in mit Actinobacillus pleuropneumoniae infizierten Lungen von Schweinen unterscheidet sich nicht signifikant von den Konzentrationen in Lungen gesunder Kontrolltiere nach i.m. Injektion. Während sich die absoluten Konzentrationen zwischen infizierten und gesunden Lungen nicht signifikant unterscheiden (3412 ± 748 ng/g vs. 3337 ± 937 ng/g), sind tmax in infizierten Lungen signifikant verlängert (12 h vs. 48 h). Außerdem weisen infizierte Tiere längere Halbwertszeiten im Plasma (126 h vs. 121 h) und der Lunge (165 h vs. 144 h) auf (GAJDA et al. 2015).
Weiterhin zeigte sich die Tulathromycinkonzentration nach i.m. Injektion in Mittellappen von künstlich infizierten (Lipopolysaccharide von E. coli) Lungen von Schweinen signifikant geringer als in Mittellappen gesunder Kontrolllungen (Mittelwerte je nach Zeitpunkt der Probenahme zwischen 358 und 2590 ng/g in der gesunden und zwischen 331 und 2350 ng/g in infizierten Gruppe) (VILLARINO et al.
2013b). Die Auswertung der bisher beschriebenen Vergleichsstudien erfolgte durch Gewinnung und Homogenisierung von Lungengewebe, dadurch kann nicht zwischen PELF und BALC unterschieden werden.
Im Gegensatz dazu unterscheiden sich die Tulathromycinkonzentrationen in der PELF von gesunden und infizierten (Lipopolysaccharide von E. coli) Schweinelungen nicht (Cmax 7890 ng/g in gesunden und 2350 ng/g in infizierten) (VILLARINO et al. 2013a).
Im Einklang mit den bisher beschriebenen Studien wurde Cmax in den Lungen der infizierten Tiere signifikant später (tmax= 6 h vs. 24 h) erreicht.
Die bisherigen, teilweise widersprüchlichen Studienergebnisse zeigen, dass Entzündungsprozesse auf verschiedene Weise die Konzentration von Wirkstoffen in Lungen beeinflussen. Weitere systematische Untersuchungen dieser Fragestellung sind erforderlich.
2.5 Bronchoalveoläre Lavage als Methode zur Bestimmung von Wirkstoffkonzentrationen in Lungen
Die bronchoalveoläre Lavage (BAL) stellt ein wenig invasives Verfahren dar, um Zellen (BALC), Pulamonary Epithelial Lining Fluid (PELF) oder auch Erreger aus terminalen Bronchien und Alveolen zu gewinnen (COSTABEL 1994; FEY 2004). Sie ist ein wichtiger Bestandteil in Human- und Veterinärmedizin sowohl in der Diagnostik pathologischer Geschehen im unteren Atmungstrakt, als auch zur Ermittlung von
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Wirkstoffkonzentrationen (HUNNINGHAKE et al. 1979; GANTER et al. 1993; LAMER et al. 1993; GANTER 1996; VENNER 2003). Obwohl Fohlen durch die Durchführung einer BAL einer höheren körperlichen Belastung als z.B. adulte Pferde oder Menschen ausgesetzt sind, hat sich die Methode zu diagnostischen Zwecken etabliert (HOFFMAN et al. 1991; BAIN 1997). Außerdem sind mittels BAL zahlreiche Untersuchungen zur Ermittlung von Wirkstoffkonzentrationen durchgeführt worden (BLOCK 2010; VENNER et al. 2010; RANDOW 2015; BERLIN et al. 2017a; BERLIN et al. 2017b). Das Endoskop wird dazu durch eine äußerlich gereinigte Nüster über den ventralen Nasengang und die Trachea bis zur Bifurcatio tracheae vorgeschoben.
Nach Auswahl des rechten oder linken Hauptbronchus wird das Endoskop weiter in Bronchi der zweiten Generation vorgeschoben, bis sich das Endoskop verkeilt und den entsprechenden Bronchus abdichtet. Es wird vier Mal mit 100 ml vorgewärmtem PBS gespült, die Aspiration erfolgt wenige Sekunden nach Instillation. Wichtig beim Fohlen ist, dass die BAL in Allgemeinanästhesie durchgeführt wird, da es sonst zu schlechten Rückgewinnungsraten durch Abwehrbewegungen und Husten kommen kann (BLOCK et al. 2011).
In der Nutztiermedizin ist zur Untersuchung von Wirkstoffkonzentrationen in der Lunge eine Methode beschrieben, die post mortem die zu untersuchenden Gewebe homogenisiert. Wirkstoffkonzentrationen in solchen Lungenhomogenaten setzen sich zu unbekannten Anteilen aus intrazellulären und interstitiellen Konzentrationen sowie aus Konzentrationen im Blut zusammen und gelten daher als unspezifisch (VILLARINO et al. 2014). Dadurch, dass die Homogenisation ausschließlich post mortem möglich ist, findet diese Methode zur Ermittlung von Wirkstoffkonzentrationen in der Pferdemedizin selten Anwendung.
2.5.1 Harnstoff als Dilutionsmarker der PELF Volumina in BAL-Aspiraten Wie bereits unter Punkt 2.5 beschrieben, ist die BAL die Methode, um beim Pferd PELF und BALC zu gewinnen. Allerdings wird die PELF bei dieser Methode mit einem unbekannten Anteil an Spülflüssigkeit stark verdünnt zurückgewonnen. Das Volumen der PELF ist eine wichtige Bezugsgröße, um Konzentrationen von zellulären und azellulären Bestandteilen anzugeben (RENNARD et al. 1986). Deshalb wurden verschiedene Methoden zur Bestimmung der Verdünnung eingesetzt. Hierbei hat sich die Messung des Harnstoffes in der BAL-Flüssigkeit bewährt. Harnstoff diffundiert aufgrund seiner geringen Molekülgröße frei im Körper und liegt daher im Plasma und
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in der PELF in identischer Konzentration vor (ADAMS et al. 1963; TAYLOR et al. 1965;
ADAMSON et al. 1969; THEODORE et al. 1975). Durch die Messung der Harnstoffkonzentration zum gleichen Zeitpunkt im BAL-Aspirat und Plasma kann das reale, unverdünnte Volumen der PELF in der BAL-Flüssigkeit berechnet werden. Es wird berichtet, dass sich bei längerer Verweildauer der Spülflüssigkeit in der Lunge, also die Zeit, die von Instillation bis Aspiration verstreicht, die Harnstoffkonzentration signifikant erhöht. Die Autoren nehmen an, dass der Harnstoff aufgrund des Konzentrationsgefälles zwischen Spülflüssigkeit und Gewebe aus anderen Bereichen als der PELF stammt und empfehlen, die Aspiration direkt im Anschluss an die Instillation durchzuführen, um eine Überschätzung der Harnstoff-Konzentration und somit des PELF-Volumens zu vermeiden (RENNARD et al. 1986).
Auch bei minimaler Verweildauer verändern sich die Konzentrationen an Harnstoff in aufeinanderfolgenden Aliquots signifikant (WARD et al. 2000). Die selbe Arbeitsgruppe zeigte, dass pathologische Veränderungen in der Lunge, z.B. ausgelöst durch Rauchen, die Permeabilität der Blut-Alveolarschranke und somit auch die Konzentration von gelösten Stoffen wie Harnstoff in der PELF signifikant verändern (FICK et al. 1987; WARD et al. 2000). Harnstoff wird von anderen Autoren gar als Indikator für Veränderungen der Blut-Alveolarschranke und Zellschädigung beschrieben (HENDERSON et al. 1985; MADEN et al. 2001).
Auch bei Hunden mit Infektionen der unteren Atemwege wurden in der BAL-Flüssigkeit signifikant erhöhte Harnstoffwerte im Vergleich zu gesunden Kontrolltieren gemessen (GONUL et al. 2010).
Andererseits ist in der Literatur auch beschrieben, dass pathologische Veränderungen das Volumen der PELF erhöhen können, was seinerseits erhöhte Harnstoff- Konzentrationen in der BAL-Flüssigkeit zur Folge hat (DOHN u. BAUGHMAN 1985).
Im Widerspruch dazu wurde mehrfach gezeigt, dass beim Menschen die Clearance von überschüssiger Flüssigkeit im Alveolarraum sowie die Alveolarepithelfunktion unbeeinflusst ist von Veränderungen des Blutflusses oder der Ventilation, sowie der Anwesenheit von Endotoxinen und lebenden Bakterien (BLAND et al. 1980;
MATTHAY et al. 1982; BERTHIAUME et al. 1987; SMEDIRA et al. 1991; WIENER- KRONISH et al. 1991; SAKUMA et al. 1993).
Trotz dieser widersprüchlichen Ergebnisse sind in der Literatur keine anderen, verlässlicheren Dilutionsmarker beschrieben: Albumin liegt aufgrund des großen Molekulargewichts und der damit eingeschränkten Permeabilität nicht in
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vergleichbaren Konzentrationen im Plasma und Alveolarraum vor. Kleinere Moleküle, wie Kalzium und Kalium sind durch ihr intrazelluläres Auftreten stärker fehlerbehaftet (RENNARD et al. 1986; MCGORUM et al. 1993). Harnstoff bleibt somit Goldstandard und wird in der vorliegenden Studie als Dilutionsmarker verwendet.
2.6 Ziel der vorliegenden Arbeit
Tulathromycin ist nicht nur in der Nutztiermedizin, sondern auch in der Fohlenmedizin ein Antibiotikum, das besonders zur Behandlung infektiöser Bronchoneumonien eingesetzt wird (NUTSCH et al. 2005a; LANE et al. 2006; VENNER et al. 2013b;
RUTENBERG et al. 2017). In einer aktuellen Studie wurde die Wirksamkeit von Tulathromycin bei Behandlung gegen R. equi-bedingte Pneumonien eindeutig belegt (Genesungsrate: Tulathromycin 89 % vs. Placebo 28 %) (RUTENBERG et al. 2017).
Die MHK von > 32 µg/ml von Tulathromycin gegenüber R. equi wird allerdings im gesunden Fohlen mit maximalen Lungenkonzentrationen von 1,5 µg/ml bei weitem nicht erreicht (CARLSON et al. 2010; VENNER et al. 2010). Deshalb ist die Wirksamkeit von Tulathromycin zur Behandlung von R. equi-bedingten Pneumonien somit aus pharmakokinetischer Sicht nicht zu erklären. Weil die pharmakokinetischen Untersuchungen jedoch bisher nur an gesunden Fohlen durchgeführt wurden, aufgrund der Literaturergebnisse aber davon auszugehen ist, dass sich die Situation im erkrankten Tier durch Veränderungen des Lungengewebes (u.a. Ansäuerung der Umgebung) anders darstellt als im gesunden, ist das Ziel der vorliegenden Dissertation die Hypothese zu prüfen, ob sich Tulathromycin in Lungen mit Bronchopneumonie stärker konzentriert. Angenommen wird, dass die Anreicherung von Tulathromycin von lokalen Faktoren beeinflusst wird, die durch das Entzündungsgeschehen verändert werden. Erstmals wird hier eine Untersuchung zum Vergleich von Antibiotikakonzentrationen in gesunden und erkrankten Lungen am Fohlen durchgeführt.
Material und Methode
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3.1 Probanden 3.1.1 Allgemeines
Für die Studie wurden 24 Warmblutfohlen ausgewählt. Je 12 gesunde Fohlen und 12 Fohlen mit Bronchopneumonie bildeten eine Gruppe. Die gesunde Gruppe bestand aus fünf männlichen und sieben weiblichen Fohlen im Alter von 6-22 Wochen mit einem Gewicht zwischen 117 und 272 kg. Die Bronchopneumonie Gruppe bestand aus sieben männlichen und fünf weiblichen Fohlen im Alter von 8-21 Wochen mit einem Gewicht zwischen 112 und 211 kg.
Die Studie wurde vom „Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern (LALLF)“ genehmigt (Aktenzeichen: 7721.3-2- 035/16).
3.1.2 Haltung und Fütterung
Alle Fohlen der Studie wurden zusammen mit den Stuten in Laufställen oder auf Weiden gehalten. Während der Durchführung der Studie wurden sie für 24 h in Einzelboxen aufgestallt. Den Tieren wurde Heu ad libitum und zusätzlich einmal täglich das betriebsübliche Grassilage-Mischfutter angeboten. Nach Abschluss der Probennahme wurden fünf Fohlen, aufgrund noch vorhandener Pneumonien, mit einer Kombination aus Tulathromycin und Rifampicin weiterbehandelt und dafür für weitere fünf Wochen in Laufställen untergebracht. Die restlichen Fohlen wurden zusammen mit den Stuten auf Weiden gebracht.
3.1.3 Wöchentliche Untersuchung Klinische Untersuchung
Die Fohlen wurden in ihrer ersten Lebenswoche täglich und anschließend einmal pro Woche untersucht. Dabei wurden Verhalten, Körperhaltung, Allgemeinzustand, Haarkleid und Kotbeschaffenheit beurteilt. Die innere Körpertemperatur (IKT) wurde gemessen, Mandibularlymphknoten und Nabel wurden palpiert. Außerdem wurde auf Verletzungen, vermehrt gefüllte Gelenke oder Lahmheiten geachtet. Es wurden Vorhandensein und Qualität von Nasenausfluss beurteilt, Trachea und Lunge
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auskultiert. Dabei wurde auf verschärfte Atemgeräusche sowie Rasseln oder Giemen geachtet.
Bestimmung der Blutleukozyten
Von ihrer ersten Lebenswoche an wurden die Fohlen einer wöchentlichen Zählung der Blutleukozyten unterzogen. Dazu wurde mit Hilfe einer Kanüle (BD MicrolanceTM, 1,2mm x 40mm, Becton Dickinson, Drogheda, Irland) etwa 1 ml Blut in ein EDTA- Kalium Probenröhrchen (EDTA K, 4 ml, Sarstedt AG, Nümbrecht, Deutschland) abgenommen. Die Analyse erfolgt mittels Hämatologie Analysator (Sysmex KX-21N, Sysmex Deutschland GmbH, Hamburg, Deutschland), welcher per Widerstandsmessung die Leukozyten pro µl zählt. Die Seite der zur Blutabnahme herangezogenen Vena jugularis externa wurde dabei wöchentlich gewechselt.
Ultrasonographische Untersuchung der Lungen
Ebenfalls von der ersten Lebenswoche an wurden die Fohlen einer ultrasonographischen Untersuchung der Lunge unterzogen. Dabei wurde die Lunge mit Hilfe eines mobilen Ultraschallgerätes (Tringa Linear, Esaote Piemedical, Maastricht, Niederlande) mit Linearschallkopf (7,5 × 2 cm) und einer Frequenz von 7,5 MHz untersucht. Eine gute Ankopplung wurde durch das Besprühen mit Alkohol (Isopropylalkohol, 2-Propanol, 99,5 %, Rebo-Pharm, Bochholt, Deutschland) gewährleistet. Die sonographische Untersuchung der Lunge erfolgte von caudal (15.
IKR) nach cranial (3. IKR) und von dorsal nach ventral.
3.2 Spezielle Voruntersuchung zur Orientierung in der Lunge
Da in der Gruppe mit Bronchopneumonie ein entzündetes Lungenareal gespült werden sollte, durch die ultrasonographische Untersuchung jedoch nur die Lungenoberfläche ersichtlich ist, war es das Ziel dieser Voruntersuchung, einen Bereich der Lunge zu finden, der sowohl dem Endoskop gut zugänglich ist, als auch superfiziell liegt.
Weiterhin musste der versorgende Bronchus des Areals für weiterführende Untersuchungen (u.a. BAL) identifiziert werden.
Der erste Vorversuch wurde an einem toten Fohlen (aufgrund von Kolik verstorben) durchgeführt. Das Fohlen wurde in Brust-Bauch-Lage gebracht. Zur Orientierung wurde mittels schwarzer Lebensmittelfarbe (Brauns-Heitmann GmbH & Co. KG, Warburg, Deutschland) je ein ml in den 12., 9. und 6. Interkostalraum, in den Bereich
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der Pleura und des anliegenden Lungengewebes, injiziert. Anschließend wurde die Lunge bronchoskopiert. Mittels Endoskop (endoskopische Videoeinheit Tel Pack, Videoendoskop 138XX, Typ SG22-140, Karl Storz GmbH u. Co. KG, Tuttlingen, Außendurchmesser: 0,9 cm, Länge: 140 cm) und einer angeschlossenen Lichtquelle (Xenon 1000, Karl Storz GmbH u. Co. KG, Tuttlingen) wurden mehrere Bronchi in beiden Lungenhälften mit unterschiedlicher Lebensmittelfarbe (Brauns-Heitmann GmbH & Co. KG, Warburg, Deutschland) gefärbt. Nach Präparation der Lunge konnte ein Bereich in der linken Lungenhälfte gefunden werden, der etwa zwischen 3. und 7.
Interkostalraum und zu einem großen Anteil superfiziell lag. Versorgt wurde dieser Bereich vom zweiten Segmentbronchus, welcher in lateraler Richtung vom linken Hauptbronchus abzweigte. Ein inkonstant vorkommender kleiner Segmentbronchus, welcher in ventrale Richtung abzweigt, wurde dabei stets nicht mit eingerechnet.
Um abzusichern, dass an den Tagen der Probenahme der richtige Bronchus gespült wird, wurde kurz vor der Probennahme eine Lunge mit etwa 30 cm Trachea von einem an Kolik verstorbenen Fohlen herauspräpariert. Das Endoskop wurde in den entsprechenden Bronchus der ersten Voruntersuchung vorgeschoben, bis es diesen verschloss. Es wurde im Anschluss 120 ml Luft über das Endoskop in diesen Bronchus injiziert, was dazu führte, dass das entsprechende Areal scharf abgegrenzt belüftet an Volumen zunahm (Abbildung 1). Somit bestätigte sich die Richtigkeit der Zuordnung von dem gewählten Bronchus (linker 2. Segmentbronchus) zu dem Lungenbereich, der links im Thorax und ventral zwischen dem 3. und 7. Interkostalraum unmittelbar kaudal vom Herzen sonographisch darstellbar ist.
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Abbildung 1: 120 ml mittels Endoskop in den zweiten nach lateral abzweigenden Segmentbronchus der linken Lunge eingebrachte Luft führen zur Volumenzunahme und Farbveränderung des entsprechend belüfteten Areals (in der roten Ellipse).
3.3 Auswahl der Probanden und abschließende Untersuchung Einschlusskriterien - Gruppe mit gesunden Tieren
• Frei von klinischen und speziellen, respiratorischen Symptomen
• Ultrasonographischer Lungenbefund ohne Besonderheiten
• Blutleukozyten zwischen 5.000 und 13.000 Zellen/µl
• Keine antibiotische Behandlung in den letzten sechs Wochen Einschlusskriterien – Gruppe der Fohlen mit Bronchopneumonie
• Geringe bis mittelgradige klinische und respiratorische Symptome
• Summe der ultrasonographisch gemessenen Abszesse zwischen 3 und 11 cm
• Lokalisation der Pneumoniebereiche zwischen 3. und 7. IKR und ventral
• Blutleukozyten zwischen 5.000 bis 20.000 Zellen/µl
• Keine vorangegangene antibiotische Behandlung in den letzten sechs Wochen Ausschlusskriterien - beide Gruppen
• Dyspnoe
• Schlechter Allgemeinzustand
• Sonstige Erkrankungen (z.B. Durchfall, Parasiten) sowie starke Lahmheit
