Tierärztliche Hochschule Hannover
Vergleichende Bestimmung von Rifampicin in Blutplasma, pulmonary epithelial lining fluid
und bronchoalveolären Lavage Zellen von Fohlen
INAUGURAL – DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin – Doctor medicinae veterinariae –
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Anja Kirschbaum
Köln
Hannover 2015
Wissenschaftliche Betreuung: PD, Dr. M. Venner, PhD, Dipl. ECEIM Klinik für Pferde, Tierärztliche Hochschule Hannover
1. Gutachterin: PD, Dr. M. Venner, PhD, Dipl. ECEIM
2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. M. Kietzmann
Tag der mündlichen Prüfung: 23.09.2015
Für Mateo
1 EINLEITUNG………...…1
2 LITERATURÜBERSICHT………...…. 3
2.1 Das Rhodococcus equi - Bakterium……….…...……...……...…3
2.2 Die Rhodococcus equi - Pneumonie………...5
2.3 Prävention, Diagnostik und Therapie der Rhodokokkose……….……7
2.3.1 Prävention der Rhodokokkose………..7
2.3.2 Diagnostik der Rhodokokkose………...…………...…....8
2.3.3 Therapie der Rhodokokkose………...………...9
2.4 Rifampicin………..………11
2.4.1 Pharmakodynamik und Pharmakokinetik von Rifampicin…...……11
2.4.2 Resistenzen……….………..15
2.4.3 Unerwünschte Arzneimittelwirkungen und Interaktionen………….…16
3 MATERIAL UND METHODE………..18
3.1 Probanden………..………...……18
3.1.1 Einschlusskriterien……….……….18
3.1.2 Ausschlusskriterien……….………18
3.2 Methode………..………..….20
3.2.1 Untersuchung der Fohlen………..………..…….…..20
3.2.1.1 Allgemeinuntersuchung……….…….…20
3.2.1.2 Bestimmung der Blutleukozytenzahl……….…..20
3.2.1.3 Ultraschall- Untersuchung der Lunge………..21
3.2.2. Wiegen der Fohlen……….…………21
3.3 Studiendesign………21
3.3.1 Übersicht über den Ablauf der Studie………..…21
3.3.2 Verabreichung von Rifampicin………..………..…24
3.3.3 Blutprobenentnahme zur Bestimmung der Konzentration von Rifampicin, 25-O-Desacetylrifampicin und der Blutchemie im Plasma..25
3.3.4 Bronchoalveoläre Lavage (BAL)………..27
3.3.5 Abschlussuntersuchung der Fohlen……….………30
3.4 Bestimmung der Rifampicinkonzentration im Plasma, im BAL-Überstand und in den Zellen der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit………….…..30
3.4.1 Probenaufarbeitung………31
3.4.1.1 Ansatz von Stamm- und Arbeitslösungen……….…..31
3.4.1.2 Ansatz und Aufarbeitung von Kalibratoren und Qualitätskontrollen……….……32
3.4.1.3 Aufarbeitung der Plasmaproben, des BAL-Überstandes und der
BAL-Zellsuspension……….………..33
3.4.2 Flüssigkeitschromatographie (LC) mit nachgeschalteter Tandem- Massenspektrometrie (MS/MS-System)………..34
3.4.3 Berechnung der Arzneistoffkonzentration in den BALC………..…….35
3.4.4 Berechnung der Arzneistoffkonzentration in der PELF……….36
3.4.5 Bestimmung pharmakokinetischer Parameter………..36
4 ERGEBNISSE………39
4.1 Auftreten von unerwünschten Arzneimittelwirkungen……….………39
4.2 Blutchemische Parameter…………..……..……….……39
4.2.1 Bestimmung von Cholesterol und 4β –Hydroxycholesterol.……..……39
4.2.2 Harnstoffbestimmung ……..………..40
4.3 Volumen der zurückgewonnenen BALF und PELF………..40
4.4 Differenzialzellbild der BALC……….………41
4.5 Konzentrationen von Rifampicin und 25-O-Desacetylrifampicin in Plasma, PELF und BALC……….……41
4.5.1 Konzentration von Rifampicin im Plasma……….……41
4.5.1.1 Intravenöse Applikation (Behandlungsprotokoll A)…….…...41
4.5.1.2 Orale Applikation (Behandlungsprotokoll B und C)….……… 44
4.5.2 Konzentration von 25-O-Desacetylrifampicin im Plasma………….….47
4.5.2.1 Intravenöse Applikation (Behandlungsprotokoll A)…….….…47
4.5.2.2 Orale Applikation (Behandlungsprotokoll B und C)……...…..50
4.5.3 Konzentration von Rifampicin in der PELF………...53
4.5.4 Konzentration von 25-O-Desacetylrifampicin in der PELF…………....55
4.5.5 Konzentration von Rifampicin in den BALC………..58
4.5.6 Konzentration von 25-O-Desacetylrifampicin in den BALC………...…58
4.6 Quotienten…...…..…..……….60
4.6.1 Quotient PELF / Plasma24h………..60
4.6.2 Quotient BALC / Plasma24h………...…..62
4.6.3 Quotient BALC / PELF………...……….…64
5 DISKUSSION………..…….66
5.1 Probanden……….……66
5.2 Unerwünschte Arzneimittelwirkungen……… …….…67
5.3 Methode………….………..………..67
5.4 Ergebnisse………..………..69
5.5 Schlussfolgerungen………..…73
6 ZUSAMMENFASSUNG………...………75
7 SUMMARY……….………77
8 LITERATURVERZEICHNIS………..……..79
9 ANHANG………..114
Abbildungsverzeichnis………144
Tabellenverzeichnis……….146
Danksagung………...………151
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
ABC ATP-binding cassette
ATP Adenosintriphosphat
AUC Area under the curve (Gesamtkonzentration
des Arzneistoffes im Organismus)
BALC bronchoalveoläre Lavage Zellen
BAL bronchoalveoläre Lavage
BALF bronchoalveoläre Lavage Flüssigkeit
bzw. beziehungsweise
°C Grad Celsius
ca. circa (ungefähr)
Cav durchschnittliche Plasmakonzentration über
einen Zeitraum von 24 Stunden
cm Zentimeter
Cmax Maximalkonzentration
Cmin Minimalkonzentration
C24h Konzentration24 Stunden nach der letzten
Arzneimittelapplikation
CRF Case record form
CYP3A4 Cytochrom P450 3A4 Enzymsystem
DNA Desoxyribonukleinsäure
EDTA Ethylendiamintetraacetat
ELF Epithelial lining fluid
et al. et alii (und andere)
evtl. eventuell
GLP Good laboratory practice
GZ Gigazelle
HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
i. v. intravenös
kg Kilogramm
LC-MS/MS Flüssigkeitschromatographie mit nachge-
schalteter Tandem-Massenspektrometrie
LOQ Limit of quantitation (Nachweisgrenze)
max. maximal
mg Milligramm
MHK Minimale Hemmkonzentration
MHK90 Minimale Hemmkonzentration, bei der 90%
der Erreger abgetötet werden
min Minute
mind. mindestens
mmol Millimol
MS Massenspektrometrie
M. tuberculosis Mycobacterium tuberculosis
MW Mittelwert
m/z Masse-zu-Ladung-Verhältnis
μg Mikrogramm
µm Mikrometer
μl Mikroliter
ng Nanogramm
OATP Organic anion transporting polypeptide
PAIn Pathogenitätsinseln
PELF Pulmonary epithelial lining fluid
pH potentia Hydrogenii (Stärke des
Wasserstoffs)
p. o. per os
PBS Phosphate buffered saline
PXR Pregnane X receptor
q quo (pro)
QK Qualitätskontrolle
R. equi Rhodococcus equi
RNA Ribonukleinsäure
s. siehe
s. o. siehe oben
SD Standardabweichung
TBS Tracheobronchialsekret
Tab. Tabelle
THP-1 Zelllinie Human acute monocytic leukemia cell line
tmax Zeit bis zum Erreichen der Maximal-
konzentration
t1/2 Eliminationshalbwertszeit
UAW unerwünschte Arzneimittelwirkung
Urea Harnstoff
usw. und so weiter
v. a. vor allem
z.B. zum Beispiel
ZS Zellsuspension
1
1 Einleitung
Rifampicin, ein Ansamycin-Antibiotikum, wird seit den 60er Jahren in der Humanmedizin zur Tuberkulosetherapie eingesetzt. In den letzten Jahren fand Rifampicin auch zunehmend Verwendung bei immunsupprimierten Patienten, die an opportunistischen rhodokokkenbedingten Pneumonien erkrankten (ZIGLAM 2002). In der Veterinärmedizin wird Rifampicin seit Jahrzehnten zur Therapie der Rhodococcus equi (R. equi) Pneumonie des Fohlens eingesetzt, meist in Verbindung mit einem Makrolid-Antibiotikum (GIGUÈRE et al. 2011).
Das grampositive Bakterium R. equi verursacht bei Fohlen im Alter von vier bis zwölf Wochen abszedierende, oft lebensbedrohliche Bronchopneumonien. Dabei dringt der Erreger in Makrophagen ein und kann sich dort auch vermehren (ZINK et al. 1987).
Bei endemisch betroffenen Gestüten sind Morbiditätsraten von ≥ 40% beschrieben (COHEN et al. 2000), und die Letalität kann nach Angaben aus den 80er Jahren bis zu 80% erreichen (ELISSALDE et al. 1980, HILLIDGE 1987). Die Rhodokokkose spielt daher in der Pferdeaufzucht und Fohlenmedizin eine große Rolle.
Die Therapie der Rhodokokkose ist mit mindestens vier Wochen lang, kostenintensiv, teilweise mit Nebenwirkungen verbunden und nicht immer erfolgreich (COHEN et al. 2000). Neben Früherkennung und schnell eingeleiteten Therapien ist die Wahl geeigneter Antiinfektiva entscheidend für eine erfolgreiche Behandlung.
Geeignete Antiinfektiva müssen auf die Erregereigenschaften von R. equi abgestimmt sein. So ist Rifampicin durch seine hohe Lipophilie in der Lage, in Makrophagen und abszedierend eingeschmolzene Lungenbereiche einzudringen und erreicht in der Lunge eine ausreichend hohe intrazelluläre Konzentration (MANDELL 1983, HILLIDGE 1987).
Obwohl Rifampicin bereits seit Jahrzehnten beim Fohlen eingesetzt wird, gibt es dazu bisher nur wenige pharmakokinetische Studien. Diese sind nicht ausreichend für eine exakte Beurteilung der Dosierung von Rifampicin beim Fohlen. So sind in den bisherigen Studien nur adulte Pferde untersucht worden (WILSON et al. 1988, KOHN et al. 1993), der Hauptmetabolit von Rifampicin, 25-O-Desacetylrifampicin,
2
wurde nicht berücksichtigt (WILSON et al. 1988, BURROWS et al. 1992a,b), Rifampicin wurde nur in Kombination mit anderen Arzneimitteln verabreicht (BLOCK 2010, VENNER et al. 2010), ein steady state wurde nicht erreicht (CASTRO et al.
1986), oder ohne i.v. Kinetik konnte nur bedingt eine valide Eliminationshalbwertszeit bestimmt werden (PETERS et al. 2012).
Bei fast allen bisherigen Studien wurde zudem keinebronchoalveoläre Lavage (BAL) bei Fohlen durchgeführt, so dass die Konzentrationen in der Lunge nicht exakt bestimmt werden konnten. Eine pharmakokinetische Studie von EGGERS (2011) erfüllte zwar die o. a. Kriterien, kam aber zu einem überraschenden Ergebnis: Die Rifampicinkonzentration war zum Zeitpunkt der BAL im Plasma höher als in den jeweiligen Lungenkompartimenten. Eine zuvor angenommene Anreicherung in der pulmonary epithelial lining fluid (PELF) und / oder in den bronchoalveolären Lavage Zellen (BALC) konnte in der Studie von EGGERS also nicht nachgewiesen werden.
Ziel der vorliegenden Arbeit ist eine aktuell angepasste Dosierungsempfehlung von Rifampicin beim Fohlen. Eine rationale Antibiotikagabe wäre im Hinblick auf eine in den letzten Jahren verstärkt beobachtete Resistenzentwicklung bei R. equi (GIGUÈRE et al. 2010, BURTON et al. 2013), derzeit noch fehlende geeignete Therapiealternativen und Prophylaxemöglichkeiten sowie einer Verminderung unerwünschter Arzneimittelwirkungen äußert empfehlenswert.
3
2 Literaturübersicht
2.1 Das Rhodococcus equi - Bakterium
Die Erstbeschreibung und -isolierung von Rhodococcus equi (R. equi) erfolgte 1923 unter der Bezeichnung Corynebacterium equi beim Pferd durch MAGNUSSON in Südschweden. R. equi wurde bis in die späten 70er Jahre aufgrund seiner Ähnlichkeit mit den Corynebakterien (grampositiv, diphteroid) als Corynebacterium equi beschrieben und 1987 nach Genanalysen in den Genus Rhodococcus eingeordnet (SLY et al. 1983, GOODFELLOW 1987).
R. equi gehört zu den Mycolata, einer Gruppe grampositiver Bakterien mit hohem GC-Gehalt, die Arten der Gattungen Rhodococcus, Nocardia, Corynebacterium und Mycobacterium enthält (GOODFELLOW und ALDERSON 1977). Die phylogenetische Verwandtschaft von R. equi und Mycobacterium tuberculosis (M.
tuberculosis) zeigt sich in Zellwänden mit Mykolsäuren, dem Wachstum in primären Phagosomen in Makrophagen, der Verhinderung der Phagosom-Lysosom-Fusion und der Fähigkeit zur Vermehrung in Makrophagen (HIETALA und ARDANS 1987, HONDALUS und MOSSER 1994).
R. equi und R. erythropolis sind die einzigen Pathogene für Tiere in der Rhodokokkengruppe, die sich aus über 40 verschiedenen Bakterienspezies zusammensetzt. R. erythropolis kann bei Fischen systemische Infektionen und Peritonitiden auslösen, wurde bisher aber kaum beschrieben (OLSEN et al. 2006).
Das weitaus besser beschriebene Bakterium R. equi ist ein streng aerober Kokkobazillus, der sich durch einen sogenannten „dualen Lifestyle“ als Bodensaprophyt und intrazellulärer Parasit auszeichnet. Das grampositive Bakterium ist aerob, unbeweglich, kein Sporenbildner und pleomorph (MAGNUSSON 1923, LACHMAN 1995). R. equi ist extrem resistent gegenüber Umgebungsstress, z.B.
oxidativem Stress und niedrigen pH-Werten (BENOIT et al. 2000).
Makrophagen sind die einzige Wirtszelle für R. equi. Das Bakterium kann in Makrophagen überleben und sich in primären Lysosomen vermehren (HONDALUS
4
und MOSSER 1994). Durch die Verhinderung des Ansäuerns der Vakuole wird die endosomale Maturation beeinflusst, die normalerweise der Phagozytose folgt (TOYOOKA et al. 2005). Eine Phagosom-Lysosom-Fusion wird verhindert, weshalb die Phagozytose von R. equi nicht zur Zerstörung der Bakterien, dem sogenannten respiratory burst führt (HIETALA und ARDANS 1987).
In der Erforschung der Virulenzmechanismen und in der Sequenzierung von R. equi hat es seit den 90er Jahren große Fortschritte gegeben. Der erste Durchbruch erfolgte 1991 mit der Entdeckung der Virulenzmechanismen (Virulence-associated Protein A, VapA) von R. equi (TAKAI et al. 1991a). Das VapA ist ein großes plasmidkodiertes Oberflächenantigen und liegt zusammen mit mehreren anderen Vap-Genen auf sogenannten Pathogenitätsinseln (PAIn) (LETEK et al. 2010). 2006 wurden insgesamt neun VAPs bei R. equi (VapA, VapC - VapI, pseudo - VapE) beschrieben (POLIDORI und HAAS 2006). Der Entdeckung der Vap-Proteine als Virulenzmechanismen folgte der Nachweis, dass das VapA Gen auf einem Plasmid von 80-85 kb Größe liegt (TAKAI et al. 1991b). Dieses Plasmid ist für die intrazelluläre Replikation in Makrophagen und für die Entwicklung des Krankheitsbildes im Fohlen essentiell (GIGUÈRE et al. 1999). Plasmidlose R. equi- Stämme sind also avirulent und nicht zur Replikation in Makrophagen fähig; ein Wachstum außerhalb des Wirts ist aber möglich (JAIN et al. 2003).
VapA und VapB sind wirtsspezifische Plasmide. VapA-Plasmide sind pferdespezifisch, VapB-Plasmide werden typischerweise in Schweineisolaten nachgewiesen (LETEK et al. 2008). Basierend auf drei Plasmid-Gen-Markern (traA, VapA und VapB) wurde 2007 von OCAMPO‐SOSA et al. ein PCR-Typen-System für R. equi entwickelt, das eine Unterscheidung „plasmidpositiv“ bzw. „plasmidnegativ“
durch PCR ermöglicht. Im Typisierungsschema TRAVAP existieren vier Kategorien:
traA+ / VapA+B- (Pferdeisolate), traA+ / VapA-B+ (Schweineisolate), traA+ / VapAB- (Rinderisolate) und traA- / VapAB- (plasmidlos).
5
2.2 Die Rhodococcus equi - Pneumonie
Pneumonien sind einer der Hauptgründe für Erkrankungen und Todesfälle bei Fohlen. R. equi ist dabei einer der wichtigsten Auslöser für Pneumonien beim Fohlen. Der Erreger kann auf fast allen Pferdebetrieben aus dem Boden isoliert werden und ist auf manchen Betrieben endemisch (MARTENS et. al 2000). Die Letalität von Fohlen in Bezug auf eine R. equi-Erkrankung kann nach Angaben aus den 80er Jahren bis zu 80% erreichen (ELLISALDE et al. 1980, HILLIDGE 1987).
Auf endemisch betroffenen Betrieben erkranken 31,5 - 64% der Fohlen subklinisch, 5 - 20% klinisch (ZINK et al. 1986, CHAFFIN et al. 2003, ALTHAUS 2004, SLOVIS et al. 2005). Die dadurch notwendigen Behandlungen der Fohlen implizieren, dass durch R. equi ein erheblicher finanzieller Schaden für Züchter verursacht wird.
Die Infektion mit R. equi erfolgt beim Fohlen ab dem ersten Tag, wenn sich der Erreger in der Umgebung der Pferde befindet (COHEN et al. 2013). Der Hauptinfektionsweg ist die Inhalation von virulenten R. equi-Aerosolenvon mit Fäzes kontaminierten Böden oder von Ausatemluft anderer infizierter Fohlen (MUSCATELLO et al. 2006a, 2009, KUSKIE et al. 2011, COHEN et al. 2013). Die minimale Infektionsdosis für R. equi wird beim Fohlen mit kleiner gleich 104 Bakterien pro Fohlen angegeben (WADA et al. 1997). Fohlen mit Pneumonien können über 106 virulente R. equi ausscheiden; dabei kann in 1 g Boden schon eine für eine Infektion ausreichende Menge an R. equi enthalten sein (TAKAI et al. 1994, 1997, BUNTAIN et al. 2010).
Nach einer R. equi-Infektion zeigen sich die ersten Krankheitssymptome bei Fohlen im Alter von ein bis vier Monaten. Das Krankheitsbild äußert sich als schwere pyogranulomatöse Bronchopneumonie mit Abszedierung (ZINK 1986, GIGUÈRE et al. 2011). Am häufigsten zeigt sich eine subakute bis chronische eitrige Bronchopneumonie mit extensiver Abszedierung und damit assoziierter suppurativer Lymphadenitis. Die R. equi-Pneumonie verläuft anfangs meist klinisch inapparent. Im weiteren Verlauf sind Symptome wie Husten, mukopurulenter Nasenausfluss, Fieber bis ≥ 40 °C, erhöhte Atemfrequenz, verschärft vesikuläre Atemgeräusche bei der Lungenauskultation,Tachykardie und Apathie beschrieben (BAIN 1963, FALCON et
6
al. 1985, ARDANS et al. 1986). Im Lungenparenchym entwickeln sich multiple fokale bis konfluierende Lungenabszesse. Diese nekrotischen Läsionen haben einen eitrigen bis käsigen Charakter (PRESCOTT 1991). Histologisch zeigt sich eine pyogranulomatöse Entzündung in Form von Makrophagen und multinukleären Riesenzellen, die in großer Zahl intakte Bakterien enthalten (HONDALUS und MOSSER 1994).
Bei bis zu 50% der Fohlen entwickelt sich eine intestinale Form der Rhodokokkose.
Charakteristisch dafür sind eine multifokale ulzerative Enterocolitis und Typhlitis im Bereich der Peyer´schen Platten mit granulomatöser oder purulenter Entzündung der regionalen Lymphknoten (HUTCHINS et al. 1980, ZINK et al. 1986). Die Mehrheit der Fohlen mit R. equi-Pneumonie zeigt aber trotz intestinaler Läsionen keine klinischen Zeichen der gastrointestinalen Erkrankung, die sich in Fieber, Depression, Anorexie, Gewichtsverlust, Kolik und Diarrhoe äußern können (BALDWIN et al. 1992a). Ein geringer Anteil von 4% der Fohlen entwickelt rein intestinale Läsionen ohne Pneumonie (ZINK et al. 1986).
Neben der klassischen pulmonalen und der intestinalen Form tritt bei manchen erkrankten Fohlen ein akutes Syndrom auf, das durch eine Immunkomplexbildung verursacht wird. Dabei führen Immunkomplexablagerungen in synovialen Strukturen zu einer Polysynovitis. Hier sind Sprung- und Kniegelenke am häufigsten betroffen.
Lahmheiten zeigen sich meist – wenn überhaupt – lediglich in einem steifen Gangbild. Weitere durch Immunkomplexablagerungen beschriebene Komplikationen sind Uveitis, Anämie und Thrombozytopenie (MADISON und SCARRATT 1988).
Eine von Lunge oder Gastrointestinaltrakt ausgehende Bakteriämie kann auch zu septischer Arthritis und / oder Osteomyelitis mit meist hochgradig lahmen Fohlen führen. Andere seltene extrapulmonale Symptome umfassen Panophthalmitis, Luftsackempyem, Sinusitis, Perikarditis, Nephritis sowie hepatische und renale Abszesse (CHAFFIN und MARTENS 1997).
Berichte über R. equi-Infektionen bei adulten Pferden sind sehr selten (ROBERTS et al. 1980, GENETSKY et al. 1982, ZINK et al. 1986). Bei Schweinen konnten regelmäßig R. equi-Isolate in den submaxillären Lymphknoten nachgewiesen
7
werden, die für Mäuse intermediär virulent waren (TAKAI et al. 1996a, MAKRAI et al.
2005). Bei Wildschweinen wurden Bronchopneumonien durch R. equi-Infektionen beschrieben (DE VARGAS et al. 2013), und auch Katzen sind für R. equi-Infektionen empfänglich und entwickeln pyogranulomatöse Läsionen, die sich aber v.a.
extrapulmonal manifestieren (TAKAI et al. 2003).
2.3 Prävention, Diagnostik und Therapie der Rhodokokkose 2.3.1 Prävention der Rhodokokkose
Begünstigende Faktoren für eine R. equi-Infektion sind sehr hohe Infektionsdosen, eine defiziente immunologische Kapazität, Koinfektionen und Stress. Zur Kontrolle der Rhodokokkose beim Fohlen wird daher folgendes empfohlen:
1) Senkung des Infektionsdrucks
Maßnahmen zur Verminderung des Infektionsdrucks beziehen sich auf die Vermeidung von Staub und kotbelasteten Böden; die Wahrscheinlichkeit, virulentem R. equi ausgesetzt zu sein, ist in Ställen deutlich höher als auf Paddocks (COHEN et al. 2012). Empfohlen werden weiterhin geringere Gruppengrößen, wenig Wechsel innerhalb einer Gruppe sowie ein Separieren erkrankter und gesunder Fohlen (PRESCOTT 1987, COHEN et al. 2000, MUSCATELLO et al. 2006b).
2) Erhöhung von Widerstandskraft und Immunität der Fohlen
Ergebnisse aus Studien zum Nutzen von Hyperimmunplasma, der passiven Übertragung maternaler Antikörper von geimpften Mutterstuten auf ihre Fohlen sowie von Impfversuchen bei Fohlen zur Prophylaxe der R. equi-Pneumonie sind ambivalent. Manche Studien zeigen einen protektiven Effekt (MARTENS et al. 1989, MADIGAN et al. 1991, BECÚ et al. 1997, CAUCHARD et al. 2004), andere konnten keine prophylaktische Schutzwirkung nachweisen (PRESCOTT et al. 1979, MARTENS et al. 1991, HURLEY und BEGG 1995, VARGA et al. 1997, HIGUCHI et al. 1999, GIGUÈRE et al. 2002). Bisherige Untersuchungen zu prophylaktischen
8
Antibiotikabehandlungen bezogen sich auf die Anwendung von Makroliden. Eine prophylaktische Tulathromycinbehandlung erwies sich als nicht erfolgreich (BACH 2011). Eine Azithromycingabe verzögerte dagegen die Entwicklung des Krankheitsbildes (VENNER et al. 2009) bzw. bewirkte eine signifikante Reduzierung des Anteils an R. equi erkrankter Fohlen (CHAFFIN et al. 2008).
3) Programme für Früherkennung und Behandlung
Eine Früherkennung und Behandlung erkrankter Fohlen auf endemisch betroffenen Gestüten kann die Mortalität erheblich senken (PRESCOTT et al. 1989, PRESCOTT und YAGER 1991, COHEN et al. 2000, GIGUÈRE et al. 2011). Als besonders praktikable, schnelle und genaue diagnostische Methode zum Rhodokokkose- Screening gilt die Ultraschall-Untersuchung der Lunge (SLOVIS et al. 2005). Auf großen betroffenen Betrieben erfolgt oft eine Kombination aus Bestimmung der Blutleukozytenzahl und lungensonographischen Untersuchungen (GIGUÈRE et al.
2011, LECLERE et al. 2011).
2.3.2 Diagnostik der Rhodokokkose
Als Goldstandard für die Diagnostik von R. equi gilt die bakterielle Kultur oder die PCR auf VapA-Gen aus Tracheobronchialsekret (TBS) von kranken Fohlen.
Problematisch bei einer auf TBS-Entnahme basierenden Diagnostik ist eine vorherige Antibiotikagabe sowie Mischinfektionen und Umweltkontaminanten, die falsch negative bzw. falsch positive Ergebnisse liefern können (SELLON et al. 2001).
So liegen bei 20% der nachgewiesenen R. equi-Infektionen Mischinfektionen vor, meist mit Streptococcus, Klebsiella, Pasteurella und Bordetella (SWEENEY et al.
1987). Die Entnahme von TBS ist zudem auf endemisch betroffenen Gestüten aufgrund der großen Anzahl zu testender Fohlen nicht praktikabel. Außerdem wird eine transendoskopische Probennahme aus der Trachea von Fohlen mit schwerer Dyspnoe oft schlecht toleriert. Hingegen ist eine transtracheale Entnahme für den Patienten weniger belastend. Eine Kultur oder PCR aus einer TBS-Probe muss
9
immer im Kontext der klinischen Diagnose beurteilt werden, da auch bei gesunden Fohlen R. equi in TBS-Proben nachweisbar sein kann. Obwohl der Erregernachweis im TBS also Goldstandard bei der Diagnose beim Einzeltier ist, sollte sie auf endemisch betroffenen Gestüten nicht als Screeningtest für klinisch gesunde Fohlen eingesetzt werden (GIGUÈRE et al. 2003). Ein weiterer Nachteil der Methode ist die 72-stündige Wartezeit bis zum Vorliegen von Ergebnissen (LECLERE et al. 2011).
Als Screeningtest auf Rhodokokkose hat sich die Sonographie der Lunge bewährt, da mit diesem Verfahren auch subklinisch erkrankte Fohlen erkannt werden (SLOVIS et al. 2005). Eine Antikörperbestimmung durch ELISA ist nur bei Fohlen aus nicht belasteten Beständen sinnvoll; bei Fohlen aus betroffenen Betrieben sind die spezifischen Antikörper fast immer erhöht, auch bei gesunden Fohlen (TAKAI et al.
1996b).
Als Marker für eine Früherkennung ist ein erhöhter Fibrinogengehalt im Blut wenig spezifisch. Hingegen kann die Leukozytenzahlen im Blut hilfreich sein: bei einem Wert von gleich oder über 13.000 Leukozyten/µl Blut liegt die Sensitivität für R. equi bei 95,2%, die Spezifität bei 61,2%; ein Wert von gleich oder über 15.000 Leukozyten/µl Blut ergibt eine Sensitivität von 78,6% und eine Spezifität von 90,8%
(GIGUÈRE et al. 2003).
2.3.3 Therapie der Rhodokokkose
Die Therapie der Rhodokokkose ist mit mindestens vier Wochen Behandlungsdauer lang, kostenintensiv und teils mit Nebenwirkungen verbunden. Dabei ist sie aber sehr effektiv: vor der in den 80er Jahren eingeführten Behandlung mittels einer Antibiotikakombination von Rifampicin und Erythromycin lag die Überlebensrate erkrankter Fohlen bei lediglich 20%; nach deren Einführung stieg die Überlebensrate auf 59 - 88% (GIGUÈRE et al. 2004).
Obwohl viele Antibiotika in vitro wirksam gegen R. equi sind, stellen sie sich in vivo aufgrund ihrer geringen intrazellulären Aufnahme häufig als ineffektiv dar (JACKS et
10
al. 2003, GIGUÈRE et al. 2012). Antibiotika, die in vitro eine hohe Aktivität gegenüber R. equi aufweisen, sind z.B. Enrofloxacin, Gentamicin und Vancomycin.
Diese Antibiotika werden aber aus verschiedenen Gründen nicht zur Behandlung der R. equi-Pneumonie eingesetzt; so verursachen sie Knorpelschäden bei Jungtieren (Enrofloxacin), sind in vivo aufgrund von geringen intrazellulären Konzentrationen ineffektiv (Gentamicin) oder verbieten sich aus anderen Gründen wie einer sich verschlechternden Resistenzlage in der Humanmedizin (Vancomycin).
Da die Konzentration am Wirkort einen entscheidenden Einfluss auf die mikrobielle Aktivität hat, müssen gegen R. equi wirksame Antibiotika lipophil sein, eine gute Verteilung in die Lunge aufweisen, käsige Abszesse penetrieren und Bakterien in Makrophagen abtöten (HILLIDGE 1987, DRUSANO 2005).
Die seit den 1980ern eingesetzte Kombination aus Rifampicin und einem Makrolid wirkt bakteriostatisch bis bakterizid, ist synergistisch und reduziert die Resistenzgefahr (COTTAREL et al. 2007, FISCHBACH 2011). In der Veterinärmedizin wird Rifampicin in Verbindung mit einem Makrolidantibiotikum deshalb seit Jahrzehnten zur Therapie der R. equi-Pneumonie des Fohlens eingesetzt. Dabei ist das Makrolid Erythromycin, der Prototyp der Klasse, in den letzten Jahren von neueren Makroliden wie Azithromycin und Clarithromycin nahezu ersetzt worden (GIGUÈRE et al. 2011, 2012).
Neben der klassischen Therapie der Rhodokokkose mit einer Rifampicin-Makrolid- Kombination gibt es auch neuere Therapieansätze bzw. zusätzliche Arzneimittel, die sich aber derzeit alle noch in der Testphase befinden. So ist R. equi mit einer MHK ≤ 1 µg/ml hoch empfindlich gegenüber Imidazolen (DABBS et al. 2003). Auch Gallium, ein Halbmetall mit antimikrobiellen Effekten, das sich in eisenabhängige Enzymsysteme einbaut, ist gegen R. equi wirksam (CHAFFIN et al. 2010). Ebenso wurde Streptolysin O, ein Zytolysin aus der Zellwand von Streptococcus pyogenes, als Zusatztherapie vorgeschlagen; Streptolysin O bindet an Cholesterol in der Zellwand eukaryotischer Zellen und formt eine Pore; die dadurch erhöhte Permeabilität der Membran erleichtert den Eintritt von Rifampicin in die Zelle (HOROHOV et al. 2011). Weiterhin wurden einige antimikrobielle Peptide (AMP)
11
getestet; dabei zeigte das AMP eCATH1 einen synergistischen Effekt mit Rifampicin (SCHLUSSELHUBER et al. 2012).
Trotz der sehr guten Überlebenschancen bei einer frühzeitig erkannten und therapierten Rhodokokkose beim Fohlen wird der großflächige Antibiotikaeinsatz v.
a. subklinisch erkrankter Fohlen auf endemischen Betrieben zunehmend kritisch gesehen. Einerseits wird eine zunehmende Resistenzentwicklung befürchtet, andererseits zeigen aktuelle Studien, dass viele Fohlen mit sonographisch diagnostizierten subklinischen Läsionen die Infektion auch ohne Behandlung eliminieren. So konnte in einer Studie gezeigt werden, dass sich 43,8% einer Placebogruppe ohne Therapie wieder erholten und eine Behandlung subklinisch erkrankter Fohlen zudem nicht deren Heilung beschleunigte (VENNER et al. 2012).
Diese Ergebnisse bestätigten sich in einer Folgestudie, in der über 80% der Fohlen einer Placebogruppe ausheilten (VENNER et al. 2013).
2.4 Rifampicin
2.4.1 Pharmakodynamik und Pharmakokinetik von Rifampicin
Rifampicin, ein Ansamycin-Antibiotikum, wird seit den 1960er Jahren erfolgreich in der Humanmedizin zur Therapie der Tuberkulose eingesetzt. Rifampicin ist bakterizid gegenüber R. equi, Mycobacterium tuberculosis und anderen Mykobakterien aus dem M. tuberculosis-Komplex wie M. bovis und M. africanum und ebenfalls wirksam gegenüber β-hämolisierenden Streptokokken, S. aureus und Pasteurella spp.
(JACKS et al. 2003).
Rifampicin bindet an Aminosäuren im aktiven Zentrum der bakteriellen DNA- abhängigen RNA-Polymerase und verhindert daraufhin durch sterische Okklusion die RNA-Transkription. Die Rifamycine sind die derzeit einzigen klinisch genutzten Inhibitoren der RNA Transkription (ALDRICH et al. 2010).
Rifampicin ist ein semisynthetisches Derivat des Ansamycin-Antibiotikums Rifamycin B. Die Gruppe der Rifamycine wurde erstmals 1959 von SENSI aus Streptomyces
12
mediterranei isoliert. Rifampicin war das erste Derivat mit guter Bioaktivität und guter oraler Bioverfügbarkeit und wurde 1968 in Italien zum klinischen Einsatz am Menschen zugelassen (ALDRICH et al. 2010). Rifampicin hat die Summenformel C43H58N4O12 (FURESZ 1970).
Der Hauptmetabolit von Rifampicin ist sein biologisch aktives Derivat 25-O- Desacetylrifampicin, das wie Rifampicin ebenfalls antimikrobiell wirksam ist. Beim Menschen ist 25-O-Desacetylrifampicin für den Hauptanteil der antimikrobiellen Aktivität in der Galle verantwortlich (ACOCELLA 1978). Die antimikrobielle Wirksamkeit des Metaboliten im Vergleich zu Rifampicin variiert bei den in vitro untersuchten Mikroorganismen stark. So ist die Wirksamkeit von Muttersubstanz und Metabolit bei Escherichia coli (E. coli) und Pseudomonas aeruginosa gleich, während Rifampicin bei Staphylococcus aureus (S. aureus) und Streptococcus haemolyticus 25fach wirksamer als sein Metabolit ist. Bei M. tuberculosis zeigt dagegen 25-O- Desacetylrifampicin eine 10fach höhere antimikrobielle Wirksamkeit als Rifampicin (MAGGI et al. 1968).
Die Exkretion von Rifampicin ist abhängig von seiner Transformationsrate (Desacetylierung und Hydrolysierung durch hepatische Metabolisierung) zu 25-O- Desacetylrifampicin (ACOCELLA 1983). 25-O-Desacetylrifampicin erreicht insgesamt weniger als 10% der Plasmakonzentration von Rifampicin. 25-O-Desacetylrifampicin und geringe Mengen der Muttersubstanz Rifampicin werden über die Galle ausgeschieden; dabei wird nur Rifampicin über den enterohepatischen Kreislauf wieder absorbiert. 25-O-Desacetylrifampicin unterliegt nicht dem hepatischen Kreislauf, da es - aufgrund seiner im Vergleich zu Rifampicin höheren Polarität - im Gastrointestinaltrakt sehr schlecht absorbiert wird. Ein geringer Anteil Rifampicin wird unverändert über den Urin ausgeschieden, der Rest des Arzneimittels sowie seiner Metabolite wird über die Fäzes eliminiert. Angenommen wird auch eine geringe tubuläre Resorption in der Niere (KOHN et al. 1993, ALDRICH et al. 2010).
Rifampicin wird bei adulten Pferden schneller als beim Fohlen ausgeschieden, angenommen werden Unterschiede in der hepatischen Metabolisierung, v.a. eine langsamere hepatische Desacetylierung bei Fohlen (BURROWS et al. 1985).
13
Das Verteilungsvolumen eines Stoffes wird außerdem durch den Wassergehalt des Organismus bestimmt. So liegt der Wassergehalt von Fohlen bei 80%, der von adulten Pferden dagegen bei 60% (DOWLING 2004).
Rifampicin zeigt eine pH-abhängige Löslichkeit, die die Absorption aus dem Gastrointestinaltrakt beeinflusst. Außerdem ist Rifampicin sehr lipophil und hat ein hohes Verteilungsvolumen; die Konzentration liegt in vielen Geweben höher als im Plasma, z.B. in Lunge, Leber und Muskel; Rifampicin passiert zudem die Blut-Hirn- Schranke. Die Plasmaproteinbindung beträgt 78 - 85%. Die orale Bioverfügbarkeit wird beim Menschen mit 68% angegeben, beim Pferd liegt sie zwischen 40 und 50%;
die maximale Plasmakonzentration wird ca. 2 Stunden nach Ingestion erreicht.
Rifampicin bleibt auch in der sauren Umgebung septischer Herde aktiv, kann als lipophiles Zwitterion in phagozytierende Zellen und abszedierend eingeschmolzene Lungenbereiche eindringen und intrazellulär gelegene Erreger abtöten (MANDELL 1983, BURROWS et al. 1985, WILSON et al. 1988, KOHN et al. 1993, ALDRICH et al. 2010).
In humanen Studien lag die Konzentration von Rifampicin in Alveolarmakrophagen in Relation zur Plasmakonzentration bei 16:1 (ZIGLAM 2002). Studien an adulten Pferden und Fohlen lieferten dagegen andere Ergebnisse. So war in einer Studie von BLOCK 2010 Rifampicin 48 Stunden nach seiner letztmaligen oralen Gabe lediglich im Plasma nachweisbar, nicht mehr jedoch in PELF oder BALC (Dosierung: 10 mg/kg Rifampicin p.o., kombinierte Gabe mit Clarithromycin 7,5 mg/kg, q 12 h über 11 Tage). Ein Nachweis von 25-O-Desacetylrifampicin gelang hier bei 5 von 9 Probanden nur im Plasma bis 16 Stunden nach letztmaliger Arzneimittelapplikation.
Wie Rifampicin war 25-O-Desacetylrifampicin nach 48 Stunden weder in PELF noch in BALC nachweisbar. EGGERS gelang 2011 in einer weiteren Studie der Nachweis von sowohl Rifampicin als auch von 25-O-Desacetylrifampicin in Plasma, PELF und BALC (Dosierung Rifampicin: 10 mg/kg p.o., q 12 h über 3 Tage). Die BAL erfolgte hier allerdings bereits nach 12 Stunden (statt wie bei BLOCK nach 48 Stunden).
Dabei zeigte sich ein Anreichern der Arzneistoffe nur bei 25-O-Desacetylrifampicin (Konzentration in BALC > PELF > Plasma), wobei die Konzentration in den BALC ca.
14
25fach und in der PELF ca. dreifach höher als im Plasma war. Für Rifampicin konnte dagegen keine Akkumulation in BALC und PELF nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse konnten in einer Studie von SPIECKERMANN 2014 bestätigt werden.
Die Konzentration von Rifampicin lag hier 12 Stunden nach letztmaliger oraler Applikation im Plasma > PELF > BALC, die Konzentration von 25-O- Desacetylrifampicin 12 Stunden nach Applikation in BALC > PELF > Plasma. In dieser Studie handelte es sich allerdings um eine kombinierte Gabe von Rifampicin und Clarithromycin.
Die unidirektionale Penetration von Rifampicin vom Blut durch vaskuläre, alveoläre und bronchiale Epithelien in die alveoläre und bronchiale PELF führt zum Konzentrationsanstieg des Arzneimittels in der PELF und darauf folgend in den darin enthaltenen Zellen, v.a. Alveolarmakrophagen. Die PELF ist eine Flüssigkeit, die die Epithelien umgibt. Im Organismus wird sie allgemein als epithelial lining fluid (ELF) bezeichnet, im Bereich der Lunge als pulmonary epithelial lining fluid (PELF). Die PELF liegt in Pools in der inneren Oberfläche der Alveolen, ist ein wichtiger Infektionsort bei Pneumonien und kann durch bronchoalveoläre Lavage zurückgewonnen werden (BALDWIN et al. 1992b, s. Abb. 1).
Abb. 1: Schematische Darstellung der pulmonary epithelial lining fluid (PELF), modifiziert nach BALDWIN et al. 1992b.
15
Während das fenestrierte Endothel des Lungen-Kapillarbetts eine passive Diffusion erlaubt, ist eine Diffusion durch das alveoläre Epithel nicht mehr möglich, da die Epithelzellen durch tight junctions verbunden sind. Die Arzneimittel müssen also durch die alveolären Epithelzellen hindurch transportiert werden (KIEM und SCHENTAG 2008). Dabei wird eine Anreicherung von Arzneimitteln in der PELF durch multidrug-Transporter vermittelt, z.B. durch Aufnahme-Transporter auf der Zellmembran wie OATPs und ABCs (PETERS et al. 2011).
2.4.2 Resistenzen
Die MHK90 von Rifampicin für sensible R. equi-Stämme wird mit ≤ 0,5 µg/ml angegeben (JACKS et al. 2003, CARLSON et al. 2010). 1997 wurde von TAKAI et al.
ein Bericht über rifampicinresistente R. equi-Stämme mit einer MHK ≥ 12,5 µg/ml veröffentlicht. In den USA liegt die Prävalenz rifampicinresistenter R. equi-Isolate bei 4%. Dabei werden meist kombinierte Resistenzen gegen Rifampicin, Azithromycin, Erythromycin und Clarithromycin beschrieben, nur wenige Isolate sind ausschließlich gegen Rifampicin resistent (GIGUÈRE et al. 2010). In den letzten Jahren gibt es vermehrt Berichte über eine sich verschlechternde Resistenzlage bei Rifampicin, so z.B. über eine Verdopplung der MHK für R. equi gegenüber Rifampicin in einem Zeitraum von zehn Jahren (BUCKLEY et al. 2007). Auf endemisch betroffenen Farmen stieg die Anzahl resistenter Stämme von 24 auf 62%, nachdem Fohlen dort massiv antibiotisch behandelt worden waren. Durch die Infektion mit resistenten R.
equi-Isolaten sinkt die Überlebensrate von behandelten Fohlen von nahezu 100% auf lediglich 25% (BURTON et al. 2013).
Als Ursachen für die Resistenzentwicklung von R. equi gegenüber Rifampicin werden zwei Hauptwege beschrieben: Einerseits das iri (inactivation of rifampin) - Gen, andererseits die Punktmutationen im rpoB (DNA-directed RNA polymerase subunit-beta) - Gen (ANDERSEN et al. 1997, FINES et al. 2001, ASOH et al. 2003, BOYEN et al. 2011).
16
2.4.3 Unerwünschte Arzneimittelwirkungen und Interaktionen
Als Nebenwirkung einer Behandlung mit Rifampicin tritt eine charakteristische orange-rötliche Färbung aller Körperflüssigkeiten (Urin, Fäzes, Schweiß etc.) auf.
Rifampicin kann auch beim Fohlen gastrointestinale Reaktionen verursachen, z.B.
milde, selbstlimitierende Diarrhoen am Anfang der Behandlung (HILLIDGE 1987).
Nach intravenöser Verabreichung von Rifampicin beim Fohlen können anaphylaktische Reaktionen, Schwäche, Schwitzen, vermehrte Defäkation, Stress und Unruhe auftreten (BURROWS et al. 1992a,b).
Neben diesen unerwünschten Arzneimittelwirkungen sind vielfältige Interaktionen mehrerer Arzneimittelklassen mit Rifampicin beschrieben worden, z.B. mit Analgetika, Antimykotika, Immunsuppressiva und Antibiotika. So wird die Plasmakonzentration des Antibiotikums Doxycylin beim Menschen durch Rifampicin um 50% verringert, das von Metronidazol um 33% (GARRAFFO et al. 1988, DJOJOSAPUTRO et al. 1990). Die Clarithromycinaufnahme wird um bis zu 90%
durch Rifampicin gehemmt und senkt den Plasmaspiegel von Clarithromycin unter dessen MHK90 (PETERS et al. 2012). Zudem bewirkt Rifampicin durch eine Enzyminduktion eine gesteigerte Metabolisierung beschleunigt dadurch u.a. auch seinen eigenen Abbau (ACOCELLA 1978). Es dauert mindestens 15 Tage, um diese Induktionseffekte wieder zu beseitigen (BURROWS et al. 1992b).
Erklärt werden diese Interaktionen durch eine von Rifampicin ausgelöste Induktion mehrerer arzneimittelmetabolisierender Enzyme, v.a. von CYP3A4 sowie einer Induktion von P-Glykoprotein, einem Transportprotein. Zudem ist Rifampicin ein starker Inhibitor der OATP-Familie, einer großen Gruppe von Transportern (VAVRICKA et al. 2002). Die Induktion der Cytochrom P450-3A Familie (CYP3A) erfolgt schon bei niedrigen Rifampicindosen über die Aktivierung des nukleären pregnane X Rezeptors (PXR) (ANDERSON et al. 2013, BJÖRKHEM-BERGMAN 2013). CYP3A4 ist ein wichtiges Phase I-Metabolisierungsenzym, das in großer Zahl in Enterozyten nachgewiesen wurde (TYDÉN et al. 2009). In humanen Studien wurde eine dosisabhängige Induktion von CYP3A4 nachgewiesen, die nach 14
17
Tagen eine bis zu vierfache Steigerung erreichte (KANEBRATT et al. 2008, DICZFALUSY et al. 2009).
Das P-Glykoprotein, ein vom MDR1-Gen kodiertes Plasma-Transmembran-Protein, ist Mitglied der ATP-bindenden Kassetten-Superfamilie (ABC Familie) der Transportproteine, zu der Efflux-Transporter wie ABCB1 gehören. P-Glykoprotein transportiert aktiv Xenobiotika von intra- nach extrazellulär, wird im Gastrointestinaltrakt, in Leber, Niere und Lymphozyten exprimiert und ist ein wichtiger Teil der Blut-Hirn-Schranke (TYDÉN et al. 2009). MDR1 und CYP3A4 werden oft gemeinsam induziert. Bei der Induktion von CYP3A4 ist der nukleäre PXR-Rezeptor mit beteiligt, und auch bei der MDR1-Induktion wird ein ähnlicher Mechanismus vermutet (GEICK et al. 2001). Den größten Interaktionseffekt hat Rifampicin auf oral verabreichte Medikamente, die von CYP3A4 metabolisiert werden und / oder von P-Glykoprotein transportiert werden, also auf orale Arzneimittel mit ausgeprägtem first-pass-Metabolismus. Eine durch Rifampicin ausgelöste Induktion kann über die Messung von Cholesterol und seinem Metaboliten 4β- Hydroxycholesterol als endogene Biomarker der CYP3A 4/5- Aktivität sowohl beim Menschen (DICZFALUSY et al. 2009, BJÖRKHEM-BERGMAN 2013) als auch beim Fohlen erfolgen, hier erstmals durch SPIECKERMANN (2014).
18
3 Material und Methode
3.1 Probanden
In die Studie eingeschlossen wurden zehn gesunde Warmblutfohlen im Alter von 6- 10 Wochen und mit einem Körpergewicht von 90-140 kg. Die Fohlen wurden auf einem Gestüt gezogen, auf dem auch die Untersuchungen der Fohlen sowie die Durchführung der Studie stattfanden. Die Fohlen werden mit ihren Mutterstuten zur Winterzeit in Laufställen und im Sommer auf Weiden gehalten. Sämtliche Stuten waren regelmäßig gegen EHV-1 und EHV-4, Tetanus und Influenza geimpft; Stuten und Fohlen wurden mehrfach im Jahr entwurmt.
Bei der Studie handelt es sich um einen genehmigungspflichtigen Tierversuch, der vom Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern (LALLF M-V: Az: 7221-3-1.1-027/13) genehmigt worden ist.
3.1.1 Einschlusskriterien
Um in die Studie aufgenommen zu werden, durften die Fohlen in den letzten vier Wochen vor Studienbeginn nicht mit Antibiotika behandelt worden sein. Die klinische Allgemeinuntersuchung sowie die sonographische Untersuchung der Lunge mussten ohne besonderen Befund sein. Zudem mussten die Leukozytenzahlen im Blut in einem Bereich von 5.000 - 13.000 Zellen/µl liegen.
3.1.2 Ausschlusskriterien
Aus der Studie ausgeschlossen wurden Fohlen, die im Studienverlauf pathologische Lungenveränderungen entwickelten, klinische Auffälligkeiten zeigten (Dyspnoe, Fieber) oder stark erhöhte Leukozytenwerte entwickelten.
19
Im 62-tägigen Verlauf der Studie wurden insgesamt fünf Probanden ersetzt. Gründe hierfür waren die Entwicklung von subklinischen pulmonalen Läsionen, das Auftreten einer Leukozytose sowie die Gefahr der Entwicklung von Thrombophlebitiden. Ein Fohlen wurde aufgrund der Gefahr einer Thrombophlebitisentwicklung während des Behandlungsprotokolls A aus der Studie genommen; aus diesem Grund stehen für die Untersuchung der Plasmaproben des Behandlungsprotokolls A nur die Daten von neun Fohlen (n=9, ohne CRF-Nr. 1) zur Verfügung. Zur Berechnung des Parameters Bioverfügbarkeit (F) wurden nur die Daten berücksichtigt, die einen Vergleich von ein und denselben Individuen ermöglichten (n=6, CRF-Nr. 2, 5, 6, 7, 8, 9), also nur die Fohlen, die Behandlungsprotokoll A, B und C komplett durchliefen. Zu den jeweiligen CRF-Nummern s. Tab 7 im Anhang.
Sowohl bei Behandlungsprotokoll B als auch bei Behandlungsprotokoll C konnte bei einem der Fohlen keine bronchoalveoläre Lavage (BAL) durchgeführt werden. Nach dem erfolgreichen Einleiten der Allgemeinanästhesie war eine Endoskopie bei beiden Terminen durch einen starken Laryngospasmus mit vermehrten Risiken für das Fohlen behaftet und wurde daher abgebrochen. Bei Behandlungsprotokoll C konnten bei einem weiteren Fohlen (CRF-Nr. 101) lediglich 110 von 400 ml PBS- Lösung zurückgewonnen werden. Da dies einer Rückgewinnung von nur 27,5%
entspricht (mittlere Rückgewinnung bei Behandlungsprotokoll C 62,56%) und die Auswertung des Differentialzellbilds zudem aufgrund hochgradig zerstörter Zellen im Ausstrich nicht möglich war, wurde die betreffende BAL-Probe nicht ausgewertet. In die Behandlungsprotokolle B fließen deshalb bei der Untersuchung der BAL-Proben und der Daten zu den Konzentrationen von Rifampicin und seinem Metaboliten in BALC und PELF nur die Daten von neun Fohlen (n=9; ohne CRF-Nr. 7) ein, in die Behandlungsprotokolle C nur die Daten von acht Fohlen (n=8; ohne CRF-Nr. 101 und 7). Die Analysen der Plasmaproben der Behandlungsprotokolle B und C beziehen sich dagegen auf die Daten aller zehn Fohlen (n=10).
20
3.2 Methode
3.2.1 Untersuchung der Fohlen
Alle Fohlen wurden ab dem Zeitpunkt ihrer Geburt bis zum Absetzen einmal in der Woche allgemein untersucht. Zudem wurde im selben zeitlichen Abstand die Blutleukozytenzahl bestimmt sowie ggf. die Lunge und / oder die Nabelregion sonographisch untersucht.
3.2.1.1 Allgemeinuntersuchung
Die allgemeine Untersuchung umfasste die Beurteilung von Haltung, Verhalten und Ernährungszustand sowie die Ermittlung der rektalen Körpertemperatur. Zudem wurden die mandibulären Lymphknoten (Lnn. mandibulares) in Bezug auf Größe, Schmerzhaftigkeit und vermehrte Wärme palpiert und auf spontanen Husten und auf Nasenausfluss (serös, seromukös, mukös, mukopurulent, purulent) geachtet.
Weitere Untersuchungspunkte waren etwaige Verletzungen, vermehrte Gelenkfüllungen, eine Palpation der Nabelregion sowie die Beurteilung der Kotkonsistenz. Physiologische bzw. pathologische Atemgeräusche sowie evtl.
Nebengeräusche (Rasseln, Giemen) wurden durch Auskultation der Trachea sowie beider Lungenseiten ermittelt.
3.2.1.2 Bestimmung der Blutleukozytenzahl
Zur Bestimmung der Blutleukozytenzahl wurde den Fohlen einmal wöchentlich mittels einer 18G- Kanüle (BD MicrolanceTM, 1,2 mm x 40 mm, Becton Dickinson, Drogheda, Irland) Blut entnommen und in ein EDTA-Kalium-Probenröhrchen (EDTA K, 4 ml, Sarstedt AG, Nümbrecht, Deutschland) überführt. Die Ermittlung der Leukozytenzahl erfolgte mit einem automatischen Hämatologie-Analysator (Sysmex KX-21N, Sysmex Deutschland GmbH, Hamburg, Deutschland), der mit dem Prinzip
21
der Widerstandsmessung arbeitete. Bestimmt wurde die Anzahl der Leukozyten pro Mikroliter Blut (WBC/µl Blut).
3.2.1.3 Ultraschall-Untersuchung der Lunge
Vor Beginn der Studie sowie vor und nach jedem Behandlungsprotokoll wurde bei jedem Fohlen eine Ultraschall-Untersuchung der Lunge durchgeführt. Diese Untersuchung erfolgte zudem zusätzlich bei Auffälligkeiten in der wöchentlichen klinischen Untersuchung oder einer erhöhten bzw. erniedrigten Blutleukozytenzahl.
Die Lungenuntersuchung wurde mit einem tragbaren Ultraschallgerät (Tringa Linear, Esaote Piemedical, Maastricht, Niederlande) mit Linearschallkopf (Frequenz 7,5 MHz, 7,5 cm x 2 cm) durchgeführt. Der transkutan geschallte Lungenbereich reichte auf beiden Thoraxseiten vom 15. bis zum 3. Interkostalraum. Für eine verbesserte Ankopplung wurde der Schallbereich mit Alkohol (Isopropylalkohol, 2-Propanol, 99,5%, Rebo-Pharm, Bochholt, Deutschland) eingesprüht.
3.2.2. Wiegen der Fohlen
Alle Fohlen wurden vor Beginn des jeweiligen Behandlungsprotokolls gewogen („Die mobile Pferdewaage“, Deutschland), also je dreimal pro Fohlen. Die genauen Körpergewichte sind Tab. 7 im Anhang zu entnehmen. Die Gewichtsermittlung war nötig, um einerseits das verabreichte Rifampicin exakt zu dosieren und andererseits die Medikamente zur Allgemeinanästhesie bei der bronchoalveolären Lavage (BAL) genauer zu berechnen.
22
3.3 Studiendesign
3.3.1 Übersicht über den Ablauf der Studie
Bei der Studie handelte es sich um eine kontrollierte, randomisierte, dreiarmige Cross-Over-Studie. Die Studiendauer betrug für jedes Fohlen 56 (Gruppe 1, Proband 1-5) bzw. 61 Tage (Gruppe 2, Proband 6-10) und beinhaltete 3 Behandlungsprotokolle je Fohlen (Behandlungsprotokoll A, B und C).
An jedes Behandlungsprotokoll schloss sich eine Wash-Out-Phase an, die nach dem i.v.-Behandlungsprotokoll A 7 Tage und zwischen den Behandlungsprotokollen B und C mind. 21 Tage betrug. In Behandlungsprotokoll A wurde jedem Fohlen einmalig Rifampicin i.v. 10 mg/kg verabreicht. In Behandlungsprotokoll B und C erhielt jedes Fohlen über einen Zeitraum von 10 Tagen einmal täglich Rifampicin p.o. (20 bzw. 10 mg/kg, q 24 h).
Die Zuordnung zu Behandlungsprotokoll B (20 mg/kg p.o., q 24h) bzw. C (10 mg/kg p.o., q 24 h) als zweitem bzw. drittem Behandlungsprotokoll erfolgte randomisiert (Berechnung mit nQuery 7.0 ohne spezifischen Anfangswert für den Zufallsgenerator, s. Tab. 1).
Tab. 1: Randomisierte Zuordnung zu Behandlungsprotokoll B und C.
Proband Reihenfolge Proband Reihenfolge
1 CB 6 CB
2 BC 7 CB
3 BC 8 BC
4 CB 9 CB
5 BC 10 BC
23
In bestimmten zeitlichen Abständen erfolgten bei allen drei Behandlungsprotokollen vor bzw. nach der letzten Rifampicin-Applikation Blutentnahmen. Bei den beiden oralen Behandlungsprotokollen B und C wurde zudem 24 Stunden nach der letzten Rifampicingabe eine bronchoalveoläre Lavage (BAL) durchgeführt (s. Abb. 2).
Abb. 2: Studiendesign Behandlungsprotokolle A, B und C.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
rifampicin 1× 10.0 mg/kg BW/d p.o.
BAL
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Kinetik 0-48h
rifampicin 1×20.0 mg/kg BW/d p.o.
Treatment B
Treatment C Treatment A
rifampicin 1 x 10 mg/kg BW i.v.
1 2 3
Kinetik 0-48h
13
13
BAL
Kinetik 0-48h
Behandlungsprotokoll A Rifampicin 1 x 10 mg/kg i.v.
Behandlungsprotokoll C
Rifampicin 1 x 10 mg/kg p.o., q 24 h
Behandlungsprotokoll B
Rifampicin 1 x 20 mg/kg p.o., q 24 h
24 3.3.2 Verabreichung von Rifampicin
Für das Behandlungsprotokoll A wurde aus Rifampicin (RifampicinHefa®-N 600 mg i.v., Riemser Arzneimittel AG, Greifswald, Deutschland) nach Angaben des Herstellers eine Infusionslösung hergestellt. Dazu wurde die Trockensubstanz Rifampicin zunächst in Wasser für Injektionszwecke (Aqua ad injectionem) gelöst;
diese Lösung wurde danach in isotonischer Kochsalzlösung (Isotonische Kochsalzlösung 0,9% Ecoflac Plus, 1000 ml, B. Braun, Melsungen, Deutschland) bis zu einer Konzentration von 1,2 mg/ml verdünnt. Die so hergestellte Infusionslösung wurde in einer Gesamtmenge von 868 bis 1100 ml je Fohlen (entsprechend 104 bis 132 kg Körpergewicht) als Bolus über einen Zeitraum von durchschnittlich 18 min.
über einen zuvor in eine Jugularvene platzierten Verweilkatheter appliziert. Dazu wurde der obere Halsbereich rasiert und mit Hautdesinfektionsmittel desinfiziert (Softasept® N, B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland). Nach Einbringen des Venenverweilkatheters (Braunüle MT® Luer Lock, 14G, Braun Melsungen AG, Deutschland) wurde dieser mit einem Faden an der Haut fixiert, mit einem Durchstechstopfen (Injection Cap, Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Deutschland) verschlossen und mit einem Verband fixiert (CoFlex®, Andover Healthcare, Salisburg, USA). Über diesen Katheter erfolgten nach einer Entnahme von 50 ml Blut zur Spülung des Katheters auch die weiteren Blutentnahmen (s. 3.3.3).
Für die Behandlungsprotokolle B und C wurde den Fohlen Rifampicin (EREMFAT® 600mg, Riemser Arzneimittel AG, Greifswald, Deutschland) in einer Dosierung von 10 bzw. 20 mg/kg einmal täglich mittels einer 60 ml Spritze (Soft Ject® Katheter, 60 ml, Henke Sass Wolf, Tuttlingen, Deutschland) ins Maul eingegeben. Dazu wurden die Rifampicin-Tabletten zuvor zerkleinert und mit 20-30 ml Wasser zu einer Suspension verarbeitet. Die Fohlen wurden von einer weiteren Hilfsperson fixiert und auf vollständiges Abschlucken des Medikamentes kontrolliert. Die Fohlen hatten zuvor nicht gehungert, so dass von einer physiologischen Magenfüllung auszugehen ist.
25
Um einen 24 stündigen Abstand zwischen der Applikation von Rifampicin und der BAL zu gewährleisten, wurden die Fohlen ab dem 7. Tag der Arzneimittelapplikation zeitversetzt behandelt. Entsprechend fanden auch die Blutentnahmen zeitversetzt statt. Das erste Fohlen wurde um 07:00 Uhr behandelt, dementsprechend fand am Folgetag um 07:00 Uhr die BAL statt. Das zweite Fohlen bekam um 08:00 Uhr das Präparat oral und die BAL fand um 08:00 Uhr des Folgetages statt usw.
3.3.3 Blutprobenentnahme zur Bestimmung der Konzentration von Rifampicin, 25-O-Desacetylrifampicin und der Blutchemie im Plasma
Unmittelbar vor Beginn des Behandlungsprotokolls A bzw. am jeweils zehnten Tag der Behandlungsprotokolle B und C wurde den Fohlen ein Venenverweilkatheter in die Vena jugularis externa gelegt. Über den Katheter wurde den Fohlen zu festgelegten Zeitpunkten Blutproben entnommen (s. Tab. 2). Der Katheter wurde nach der 12. Blutprobennahme entfernt und blieb damit ca. 12 Stunden liegen. Die folgenden vier Blutproben wurden durch direkte Punktion der anderen Vena jugularis mittels Kanüle (BD MicrolanceTM, 18G, Becton Dickinson, Drogheda, Irland) gewonnen.
Bei Behandlungsprotokoll B und C wurde den Fohlen an Tag 2 morgens erneut ein venöser Zugang in die gegenüberliegende Vena jugularis externa gelegt, um die Allgemeinanästhesie zur BAL einzuleiten und die Narkose adäquat aufrechterhalten zu können. Über diesen Katheter erfolgte bei Behandlungsprotokoll B und C auch die 14. Blutprobennahme nach 24 Stunden.
26
Tab. 2: Zeitpunkte der Blutentnahmen an Tag 1-3, Tag 19-21 und Tag 54-56.
Zur Blutprobennahme über den Katheter wurde eine 10 ml Spritze (Injekt® Luer Solo 10 ml, B. Braun Melsungen AG, Deutschland) mit aufgesetzter Kanüle (BD MicrolanceTM, 18G, Becton Dickinson, Drogheda, Irland) verwendet. Nach Verwerfen von 5-6 ml Blut wurde 10 ml Blut entnommen und in ein Lithium-Heparin- Probenröhrchen (Sarstedt Monovetten Lithium-Heparin PL, 9 ml, Sarstedt AG & Co.,
Zeit (h nach Applikation) Entnahmezeitpunkt
0 1
Rifampicin – Applikation
0.33 2
0.66 3
1 4
1.5 5
2 6
2.5 7
3 8
4 9
6 10
8 11
12 12
16 13
24 + BAL 14
36 15
48 16
27
Nürnbrecht, Deutschland) überführt. Nach der Blutentnahme wurde der Katheter mit ca. 5 ml einer heparinhaltigen Natriumchloridlösung gespült. Zur Herstellung dieses Flushs wurden 20.000 IE Natrium-Heparin (Heparin-Natrium Braun, 25.000 IE / 5 ml, B. Braun Melsungen AG, Melsungen/Deutschland) in 1000 ml Natriumchloridlösung (Isotonische Natriumchlorid Lösung ad. us. vet., B. Braun Melsungen AG, Deutschland) gelöst.
Die Blutproben wurden unmittelbar nach ihrer Gewinnung für zehn Minuten bei 2100 U/min zentrifugiert (Hettich Zentrifuge Universal 32, Hettich Lab Technology, Tuttlingen, Deutschland). Dann wurde das Plasma abpippetiert und in zwei beschriftete Cryo-Röhrchen (Cryo‘s, PP, 2 ml, Greiner BIO-ONE GmbH, Frickenhausen, Deutschland) aufgeteilt. Die Plasmaproben wurden sofort bei -20 °C eingefroren und nach spätestens zwei Tagen weiter bei -80 °C in der Firma Primacyt in Schwerin gelagert. Am Ende der Studie wurden die Plasmaproben sowie die weiteren bei den BALs gewonnenen Proben in die Abteilung Klinische Pharmakologie des Instituts für Pharmakologie der Ernst-Moritz-Arndt-Universität (EMAU) in Greifswald transportiert, wo die Bestimmung der Arzneistoffkonzentrationen in Plasma, PELF und BALC erfolgte. Die Ermittlung der Harnstoffkonzentration (in der 24 Stunden-Blutprobe der Behandlungsprotokolle B und C sowie im entsprechenden BAL-Überstand) wurde im Labor der Klinik für kleine Klauentiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover durchgeführt und später verwendet, um die Verdünnung der PELF zu berechnen.
3.3.4 Bronchoalveoläre Lavage (BAL)
Bei allen Fohlen wurden zwei bronchoalveoläre Lavages durchgeführt, jeweils nach Behandlungsprotokoll B bzw. C. Bei der zweiten BAL wurde die jeweils andere Lungenseite gespült. Die BALs erfolgten 24 Stunden nach der letzten Rifampicinapplikation. In den dabei gewonnenen Proben (BAL-Überstand und bronchoalveoläre Zellen (BALC)) wurden die Konzentrationen von Rifampicin und seinem Hauptmetaboliten, 25-O-Desacetylrifampicin, bestimmt.
28
Die BAL führte die Autorin mit einem Team von fünf weiteren Tierärzten durch. Für die BAL wurden die Fohlen zunächst über einen zuvor gelegten Katheter mit 0,8 mg/kg Xylazin i.v. sediert (Xylazin 2%®, Riemser Arzneimittel AG, Greifswald-Insel Riems, Deutschland). Nach 5-8 min wurden die Fohlen aus der Box geführt und mit 2,2 mg/kg Ketamin (Ursotamin® 100 mg/ml, Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Deutschland) i. v. und 0,2 mg/kg Diazepam i.v. (Diazepam® 10 mg Rotexmedica, 5 Ampullen zu 2 ml, Rotexmedica GmbH, Trittau, Deutschland) in Narkose gelegt. Die Lagerung erfolgte auf einer Schaumstoffmatte. Dazu wurden die Fohlen in Brustlage gebracht und mit Hilfe von Futtersäcken am Thorax sowie einer Hilfsperson am Kopf fixiert.
Nach Erreichen des Toleranzstadiums erfolgte die BAL. Dabei wurde ein flexibles Endoskop (endoskopische Videoeinheit Tel Pack, Videoendoskop 138XX, Typ SG22-140, Außendurchmesser: 0,9 cm, Länge: 140 cm, Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Deutschland), kombiniert mit einer Lichtquelle (Xenon 1000, Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Deutschland) benutzt. Nach Reinigung der Nüster wurde das Endoskop unter Sichtkontrolle durch den ventralen Nasengang in die Trachea eingeführt. Das Endoskop wurde mit dorsaler Orientierung so weit vorgeführt, bis es sich in einem Bronchus der 2. Generation einkeilte. Nun wurde mit vier 37 °C warmen Aliquoten von je 100 ml PBS (phosphate buffered saline) gespült.
Dazu wurden in vier Spritzen je 100 ml PBS (Dulbecco’s PBS (1 x) without Ca & Mg, PAA Laboratories GmbH, Pasching, Österreich) aufgezogen und in einem Wärmeschrank auf 37 °C vorgewärmt. Über den Arbeitskanal des Endoskops wurde der Inhalt der ersten Spritze gleichmäßig und zügig eingegeben, gefolgt von einer Instillation von 20 ml Luft. Danach wurde die Spülflüssigkeit sofort wieder manuell aspiriert. Dieser Vorgang erfolgte mit allen vier PBS-gefüllten Spritzen.
Sofort nach der Probengewinnung wurde die BAL-Spülflüssigkeit durch zwei Pharmakologen der Universität Greifswald weiter verarbeitet. Bei der ersten Fraktion wurde lediglich das Volumen der rückgewonnenen Flüssigkeit bestimmt. Da in der ersten Fraktion einer BAL keine repräsentativen Alveolarzellen erwartet werden, wurde sie anschließend verworfen. Die Fraktionen zwei bis vier wurden nach
29
Volumenbestimmung zu einer Fraktion vereint und zur Entfernung grober Verunreinigungen durch zwei Lagen Mull filtriert. Diese Nativlösung wurde nach Überführung in 50 ml Falcon-Röhrchen (BD Falcon™ Conical Tubes, Becton Dickinson, Drogheda, Irland) bei 4 °C für 10 min bei 125 x g zentrifugiert (Hettich Zentrifuge Universal 32, Hettrich Lab Technology, Tuttlingen, Deutschland). Die BAL- Überstände wurden zu gleichen Teilen in frische Falcon-Röhrchen dekantiert. Aus diesen wurden je 1,5 - 2 ml in vier Cryoröhrchen (Cryo`s, PP, 2 ml, Greiner BIO-ONE GmbH, Frickenhausen, Deutschland) pipettiert und bei - 20 °C weggefroren. Der restliche Überstand wurde verworfen und das Zellpellet mit 15 ml PBS resuspendiert und dann in das nächste Falcon-Röhrchen überführt, bis alle Zellpellets vereinigt waren. Bei diesem Falcon-Röhrchen wurde nach erneutem Zentrifugieren (4 °C, 10 min, 125 x g) der Überstand abgesaugt und das Zellpellet in 10 ml PBS aufgenommen. Aus dieser Suspension wurden 10 µl für die Zellzählung (TC 10TM Automated Cell Counter, Bio-Rad Laboratories, Hercules, Kalifornien, USA) genutzt sowie je 2 Zellausstriche zur Zelldifferenzierung angefertigt. Die Zellausstriche wurden luftgetrocknet und im Folgenden durch die Autorin im Labor der Klinik für Pferde der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover nach May-Grünwald gefärbt.
Mit einer 40 - fachen Ölimmersionsvergrößerung wurden Art und prozentualer Anteil der enthaltenen Zellen (Makrophagen, Lymphozyten, neutrophile Granulozyten, Mastzellen und eosinophile Granulozyten) mikroskopisch differenziert. Von der Zellsuspension wurden außerdem zwei Teile Zellen á 5 x 106 Zellen in zwei 2 ml Eppendorf-Gefäße überführt, zentrifugiert (4 °C, 10 min, 125 x g), der Überstand verworfen und die Eppendorf-Gefäße anschließend eingefroren.
Nun wurde das Falcon-Röhrchen mit den vereinigten Zellpellets der BAL erneut zentrifugiert (4 °C, 10 min, 125 x g) und der Überstand abgesaugt. Das verbliebene Zellpellet wurde in 8 x 845 µl eiskaltem PBS resuspendiert; danach wurden je 1,7 ml auf vier Cryoröhrchen verteilt. Ebenso wie der BAL-Überstand wurden auch diese bronchoalveolären Zellsuspensionen, die die BALC enthalten, bei -20 °C weggefroren. Die gewonnenen Proben wurden auf Trockeneis in die Abteilung Klinische Pharmakologie des Instituts für Pharmakologie der Ernst-Moritz-Arndt-
30
Universität Greifswald gebracht und dort bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C aufbewahrt.
3.3.5 Abschlussuntersuchung der Fohlen
Die Fohlen wurden jeweils am Tag nach der BAL einer klinischen Allgemeinuntersuchung, einer speziellen Untersuchung des Respirationstraktes und einer ultrasonographischen Untersuchung der Lunge unterzogen, um eine eventuelle Beeinträchtigung durch die BAL zu überprüfen. Nach dem Ende der Studie durchliefen die Fohlen bis zum Absetzen im Alter von mind. 5 ½ Monaten weiterhin die unter 3.2.1 beschriebenen wöchentlichen Routineuntersuchungen und ggf.
weiterführende Untersuchungen.
3.4 Bestimmung der Rifampicinkonzentration im Plasma, im BAL- Überstand und in den Zellen der bronchoalveolären
Lavageflüssigkeit
Die Bestimmung der Konzentration von Rifampicin und seinem Hauptmetaboliten 25- O-Desacetylrifampicin erfolgte mittels einer Hochleistungsflüssigkeits- chromatographie (HPLC) mit nachgeschalteter Tandem-Massenspektrometrie (LC- MS/MS). Die Methode ist validiert (OSWALD et al. 2011) und wurde im GLP- zertifizierten analytischen Labor der Abteilung für Klinische Pharmakologie des Instituts für Pharmakologie der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald durch Prof.
Dr. rer. nat. Stefan Oswald durchgeführt.
