Lab.med. 16: 123-127(1992)
Messung der Elastase-lnhibitionskapazität in der bronchoalveolären Lavage:
Erhöhung der Empfindlichkeit mittels Ultrazentrifugation
Measurement of Elastase Inhibition Copaeity in Bronchoalveolar Lavage Fluid:
Increase of Sensitivity by Ültracentrifugation
J. Braun, B. Schaaf, K. Dalhoff, W. G. Wood
Klinik für Innere Medizin {Direktor: Prof. Dr. H. L Fehm), Medizinische Universität Lübeck Zusammenfassung:
Es wurde geprüft, ob durch Proteinkonzentration mittels Ultrazentrifugation in Mikrokonzentratoren (Centri- con W, Fa. Amlcon) der Nachweis von Enzymaktivitäten in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit (BALF) er- leichert und verbessert wird. Bestimmt wurde die Elastase-lnhibitionskapazität (EIC) mittels des spezifischen chromogenen Substrates Meo-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-p-Nitroanilid, sowie die Konzentration von alpha-1-Pro- teinaseinhibitor (ajPi) mittels Chemilumineszenzimmunoassay. Die untere Nachweisgrenze der EIC-Messung wurde durch Ultrazentrifugation von 10 ml U/ml auf 0,3 mlU/ml gesteigert, die Impräzision von Tag zu Tag war 5.24 % und in der Serie 5,45 %. Die Wiederfindung für EIC und ajPi betrug 93 % und 52 % für Ekstase-Aktivi- tät. Unter Verwendung dieser Methodik wurde die funktionelle Aktivität von exjPi (EIQ = ElC/^Pi) in BALF von Patienten mit Pneumonie (n = 21), Patienten mit abgelaufener Pneumonie (n = 9) und gesunden Probanden (n = 10) bestimmt. Nach Ultrazentrifugation konnte in BALF von 26 der 30 Pneumonie-Patienten und 9 der 10 Probanden eine EIC oder eine Elastase-Aktivität bestimmt werden. Bei Bestimmung in nativer BALF hingegen war nur bei 2 der Pneumonie-Patienten und keinem der Probanden eine EIC nachweisbar. Die funktioneile Ak- tivität von (xjPi (EIQ) war bei akuter Pneumonie im Mittel (MW) mit 0,63 (+/- 0,75) mlUfag deutlich erniedrigt im Vergleich zu Patienten mit abgelaufener Pneumonie (MW 3,98 [+/- 4,05 mlUfag]; p < 0,02) und Proban- den (MW 7,61 [+/- 3,35 ] mlUfag]; p < 0,01). Die funktioneile Aktivität war um so geringer, je ausgeprägter die Granulozytose in der BAL war. Ultrazentrifugation ist eine praktikable und präzise Methode, die Empfind- lichkeit für Enzymaktivitätsmessungen in der BALF zu erhöhen.
Schlüsselwörter:
Ultrazentrifugation - alProteinase-Inhibitor - Elastase-lnhibitionskapazität - Pneumonie - neutrophile Gra- nulozyten - bronchoalveoläre Lavage
Summary:
The enhancement of protein concentration by Ültracentrifugation using microconcentrators (Centricon 10, Fa.
Amicon) can facilitate the measurement of enzyme-activities in bronchoalveolar lavage fluid (BALF). The ela- stase inhibition capacity (EIC) was quantified using an enzyme assay with the specific chromogenic substrat Meo-Suc-Ala-Ala-Pfo-Val-p-Nitroanilid. The concentration of ajPi was measured by chemiluminescence im- muno assay. Ültracentrifugation increased the sensitivity of the EIC assay from W mlU/ml to 0.3 mlU/ml. The intraassay-variation was 5.24 %. The variation in the series was 5.45 %. The recovery for EIC and <*7P/ was about 93%, the recovery for elastase activity about 52 %. The functional activity ofa-iPi (ElC/ ^ ) In BALF of 21 patients with acute pneumonia, of 9 patients after successful treatment of pneumonia and of W healthy persons was determined. Elastase-activity resp. EIC was detected in 26 of 30 BALF of the pneumonia patients and in 9 of 10 BALF of the healthy persons. Measurement in native BALF showed activity only in 2 of the pneumonia patients and none of the healthy persons. The mean functional activity ofajPi in BALF of patients with acute pneumonia (0.63 [+/- 0,75] n^l(J/ g) was significantly lower than in BALF of patients after treatment (3.98 [+/- 4.05] mlUfag) and BALF of healthy persons (7.61 [+/- 3.35] mlUfag; p = 0). The functio- nal activity was inversely proportional to the granulocytosis in the lavage. Ültracentrifugation of BALF is an practical and precise method to increase the sensitivity of enzyme assays.
Keywords:
Ültracentrifugation - a^Proteinase inhibitor - elastase inhibition capacity - pneumonia - neutrophils - bronchoalveolar lavage
Abkürzungen:
BALBALF 04 Pi EA EiC
Bronchoalveoläre Lavage
Bronchoalveoläre Lavage-Flüssigkeit arProteinaseinhibitor, früher ctrAntitrypsin Elastaseaktivität
Elastase-lnhibitor-Kapazitat
EIQEla MGMW
: funktionelle Aktivität von a}P\
: Elastase-ttiPi-Komplex : Molekulargewicht : Mittelwert
Lab.med. 16: 123 (1992) 123
Einleitung
Eine Imbalance zwischen Proteinasen und Antiprotein- äsen stellt einen wesentlichen Pathomechanismus bei entzündlichen Lungenerkrankungen dar (10, 12). Dabei hat die von neutrophilen Granulozyten freigesetzte Ela- stase eine besondere Bedeutung: durch intratracheale In- stillation dieser Proteinase konnte im Tierversuch ein Lungenemphysem induziert werden (13, 20, 22).
<\rProteinaseinhibitor («, ) stellt im unteren Respira- tionstrakt die wesentliche Antiproteinase dar (10, 12). Bei Patienten mit kongenitalem Mangel an c^Pi (Pi ZZ-Phäno- typ) entwickelt sich fast regelhaft im mittleren Lebensal- ter ein Lungenemphysem (8, 14).
Die Proteinasen-Antiproteinasen-lmbalance ist mög- licherweise auch verantwortlich für die Lungenparen- chymschädigung im Rahmen von akuten Pneumonien.
Die Fähigkeit von i^Pi, Elastase zu inhibieren (Elastase-ln- hibitionskapazität [EIC]), wird unter anderem durch toxi- sche Sauerstoffradikale, die bei der akuten Pneumonie freigesetzt werden, beeinflußt (25).
Durch Bronchoalveoläre Lavage (BAL) können humorale und zelluläre Änderungen im alveolaren Kompartiment untersucht werden (18). Die Messung der Elastase-lnhibi- tionskapazität in der BAL als Ausdruck der lokal protekti:
ven Funktion von « ist aufgrund der relativ geringen Empfindlichkeit der photometrischen Nachweismethode schwierig (1). Sie gehört daher, im Gegensatz zu zellulä- ren Befunden und, in jüngster Zeit, Bestimmungen der Proteinkonzentrationen, nicht zu den üblicherweise in BAL bestimmten Parametern.
Es sollte daher geprüft werden, ob durch Einsatz von Mi- krokonzentratoren eine Erhöhung der Empfindlichkeit zu erreichen ist. Zu diesem Zweck wurde bronchoalveoläre Lavage von Patienten mit Pneumonie, Patienten nach ab- gelaufener Pneumonie und gesunden Probanden unter- sucht.
Material und Methoden
Gewinnung der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit (BALF)
Die bronchoalveoläre Lavage wurde während der Bron- choskopie über ein Fiberglasbronchoskop bei lokaler An- ästhesie mit 2%iger Lidocainlösung nach intravenöser Prämedikation mit 2,5—7,5 mg Midazolam durchgeführt..
Bei den Patienten mit nachweisbarem Infiltrat erfolgte die Lavage in diesem Bereich; war kein Infiltrat nachweisbar bzw. lagen diffuse Infiltrate vor, erfolgte die Lavage im la- teralen Mittelappensegment der rechten Lunge. Es wur- den im Mittel 200 ml 0,9%iger NaCI-Lösung in 20 ml Ali- quoten instilliert und sofort wieder aspiriert. Die erste Fraktion wurde verworfen, die übrigen gepoolt. Die BAL wurde durch sterile Gaze von Schleim und durch 10 min Zentrifugation bei 200 g in Zellpellet und Überstand (bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit: BALF) getrennt.
Nach Ermittlung der Zellzahl wurden Zytozentrifugen-Prä- parate (Pappenheim) angefertigt und die prozentualen Anteile der verschiedenen Zelltypen durch Auszählung von mindestens 600 Zellen ermittelt. Die gewonnene BALF wurde bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C ge- lagert. Die Aufarbeitung der BALF-Proben unterschied sich nicht zwischen Patienten und Probanden.
500
Abb. 1: Meßprinzip der EIC: Verwendet wird ein chromogenes Substrat dessen Proteolyse einen linearen Anstieg der Extink- tion bei 405 nm bewirkt. Im Standardansatz (minlere Kurve) liegt nur das Substrat mit der exogen zugesetzten Protease vor. Eine zugegebene Probe besitzt entweder eine Elastase-lnhibitionska- pazität (EIC; untere Kurve) oder Elastase-Aktivität (obere Kurve).
#j Pi-Konzentration
Die Konzentrationsbestimmungen von Alpha-1-Protein- aseinhibitor (c^-Pi) in der BALF erfolgte mittels eines hochsensitiven Chemilumineszenzimmunoassays (5).
Messung der Elastase-lnhibitionskapazität (EIC)
Die EIC wurde in einer kinetischen Messung mittels des chromogenen Substrates Meo-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-p-Ni- troanilid (Protogen Schweiz), einem für humane Leukozy- ten-Elastase spezifischen Substrat, bestimmt (11, 17).
10 , Probe (bzw. 10 , Assaypuffer als Leerwert), 100 \ Assay Puffer (0,1 mol/l Hepes, 1 mol/l NaCI, pH 7,5) und 10 \ humane Leukozyten-Elastase (1 U in 0,05 mol/l Tris- puffer, pH 7,5) wurden 5 min bei 25 °C inkubiert. Die Sub- strathydrolyse wurde mit Zugabe von 100 \ Substrat (0,016 mol/l) gestartet. Die Extinktionsänderung pro. Mi- nute wurde bei einer Wellenlänge von 405 nm über 5 min auf einem Mikrotiterplattenphotometer bestimmt und die EIC berechnet (Formel: F X [dE|eer/rnin -dEprobe/min] = mlU/ml; F = 2,15/K; K = Konzentrationsfaktor; dE = Ex- tinktionsdifferenz). War die Extinktionsdifferenz in der Probe niedriger als im Referenzansatz, lag EIC vor. War die Extinktionsdifferenz höher, lag nicht inhibierte Ela- stase-Aktivität vor (Abb. 1). Die Elastase-Aktivität wurde mittels eines Kontrollansatzes in einer photometrischen Endpunktmessung überprüft. Hierzu wurde anstelle des Referenzansatzes eine Elastase-Verdünnungsreihe in das gleiche Fließschema eingesetzt, und die Extinktion 24 h nach Substratzusatz bei 405 nm gemessen.
Funktionelle Aktivität von <x,Pi
Weil 90 Prozent der Elastase-lnhibitionskapazität (EIC) im unteren Respirationstrakt durch « erbracht wird (12), kann mittels Quotienten aus EIC und immunologisch ge- messener ^Pi-Konzentration annäherungsweise die funk- tioneile Aktivität dieses Inhibitors bestimmt werden (EIC pro « Pi-Konzentration: mlU//Ltg). Die funktionelle Aktivi- tät wurde in Prozent des rechnerisch voll aktiven Inhibi- 124 Lab.med. 16: 124 (1992)
tors ausgedrückt. 100% funktionelle Aktivität von , entsprechen 14,4 IU pro mg c^Pi (bei einer spezifischen Elastaseaktivität von 25 U/mg [Protogen, Schweiz], einem 1:1 molaren Inhibitorverhältnis (12) und dem Molekular- gewicht von Elastase mit MG ca. 30000 und mit MG ca. 52000).
Ultrazentrifugation
Die Mikrokonzentratoren bestehen aus einem Retentatbe- hälter, einem Probenreservoir, einem Membranträger und einem Filtratbehälter (Amicon GmbH, Witten). Aus- getestet wurde die optimale Volumenvorgabe, die Zentri- fugendauer und die Wiederfindung bei Filtern mit unter- schiedlicher Membranporengröße (Centricon 3 - Cutoff MG 3000, Centricon 10 - Cutoff MG 10000 und Centricon 30 - Cutoff MG 30000). Die Probe wurde in das Proben- reservoir gefüllt und bei 5000 g in einer Zentrifuge mit Winkelkopfrotor (45°) zentrifugiert Danach wurde der Be- hälter gewendet und das Retentat durch nochmaliges Zentrifugieren (3 min bei 2000 g) in den Retentatbehälter gewonnen.
Bestimmung der Wiederfindung
Um die Wiederfindung der Elastase-lnhibitionskapazität, der -Konzentration und der Elastase-Aktivität (EA) zu bestimmen, wurden je Filtertyp 5mal 2 ml Plasmaproben (1:40 verdünnt) und 5mal 2 ml humane Leukozyten-Ela- stase (Protogen, Schweiz) in der beschriebenen Weise 40fach konzentriert und das gewonnene Retentat auf die Ausgangskonzentration rückverdünnt. EIC, EA und c^Pi wurde vor Ultrafiltration (Soll) und nach Ultrafiltration mit Resuspendierung (Ist) gemessen. Die Wiederfindung (Ist) wurde in Prozent der Sollwerte angegeben (s. Tab.
1a). Außerdem wurde ein Kontrollplasma gemessen, eine Verdünnungsreihe hiervon hergestellt und die ent- sprechende EIC errechnet (Soll). Die Verdünnungsreihe wurde bei 5000 x g 40fach konzentriert und die EIC be- stimmt (Ist).
Patientenkollektiv
Bestimmt wurde die funktionelle Aktivität von OL^?\ in der BALF von Patienten mit akuter Pneumonie (n = 21, mittle-
Tab. 1a: Methodik der Wiederfindung (1) Pro Filtertyp
5 Plasmaproben (2 ml) 5 Elastaselösungen (2 ml)
4- 3- - 2- o
CO
1-
1 2 3 4 5
1st [mlU/ml]
Abb. 2: Wiederfindung: Unterschiedliche EIC nach 40facher Kon- zentrierung mit Centricon-10-Mikrokonzentratoren (2 ml Flüssig- keit, 90 min bei 5000 g zentrifugiert). Soll: Errechneter EiC-Wert.
Ist: Nach Konzentrierung gemessener ElC-Wert.
(2) Sollwert: Bestimmung von a1Pi, EIC und EA
(3) Ultrazentrifugation bei 5000 x g (40fache Konzentrierung) und Resuspension des Retentates auf 2 ml
(4) Istwert: Bestimmung von a1Pi, EIC und EA (5) Wiederfindung: Istwert in Prozent des Sollwertes
Dauer: Zeit bis zum Erreichen des minimalen Endvolumens. EA: Elastase-Aktivität.
Tab. 1b: Wiederfindung bei unterschiedlichen Mikrokonzentrato- ren (2 ml Flüssigkeit, 5 g)
Cutoff EIC a1Pi EA Dauer (MG) (%) (+/-) (%) (+/-) (%) (+/-) (Min.) Centricon 3 3000 93,2 3,6 95,6 3,7 56,7 2,8 180 Centricon 10 1000093,6 5,4 93,6 5,2 52,2 2,6 90 Centricon 30 30000 82,8 4,8 90,6 4,2 39,6 0,7 60
res Alter 57,6 Jahre; 13 m, 8 w; Raucher 13, Nichtraucher 8). Wir verglichen diese mit den Ergebnissen bei Patien- ten mit abgelaufener Pneumonie (n = 9; mittleres Alter 59,2 Jahre; 6 m, 3 w; Raucher 7, Nichtraucher 2) und ge- sunden Probanden ( n = 10; mittleres Alter 24,2 Jahre;
10 m; Raucher 4, Nichtraucher 6).
Statistik
Die statistischen Signifikanzprüfungen wurden für ge- paarte, nicht parametrische Stichproben mit dem Wilco- xon-Test, für nicht gepaarte Stichproben mit dem Mann- Whitney-U-Test ermittelt. Die Korrelation wurde mittels der Rangkorrelation nach Spearmann errechnet.
Ergebnisse
Die Wiederfindung des immunologisch aktiven c^Pi mit der MG-10000-Cutoff-Membran war im Mittel (MW) 93,6% {+/- 5,2), für EIC 93,6% (+/-5,4) und für Ela- stase-Aktivität 52,2% (+/-2,6). Die Wiederfindung bei un- terschiedlichen EIC ist in Abbildung 2 dargestellt. Für die Membranen mit MG 3000 und MG 10000 Cutoff ergaben sich keine Unterschiede hinsichtlich der Wiederfindung, die Wiederfindung der MG 30000 Cutoff hingegen war mit 90,6% für c^Pi, 82,8% für EIC und 39,6% für Ela- stase-Aktivität geringer. Die Dauer bis zum Erreichen des minimalen Endvolumens von ca. 30-40 \ war bei Centri- con-3-Filtern ca. 180 min, bei Centricon-10-Filtern 90 min und bei Centricon-30-Filtern 60 min.
Als optimale Versuchsanordnung ergab sich somit ein Probeneinsatz von 2ml BALF in Centricon-10-Filtern (s.
Tab. 1a). Die Flüssigkeit wurde in 90 min bei 5000 g auf ca. 30-40 \ konzentriert und auf 50 } resuspendiert.
Mit dieser 40fachen Konzentrierung konnte in BALF von 26 der 30 Pneumonie-Patienten, 9 der 10 Probanden und 121 von 132 konsekutiv untersuchten Patienten eine EIC oder eine Elastase-Aktivität gemessen werden. In nativer BALF wurde nur bei 2 der 30 Pneumonie-Patienten, bei keinem der Probanden und 13 der 132 konsekutiv unter- suchten Patienten eine EIC bestimmt (s. Tab. 2).
Lab.med. 16: 125 (1992) 125
Tab. 2: Assayvergleich: Vergleich der Messung mit (konzentriert) und ohne (nativ) Ultrazentrifugation
BALF nativ konzentriert
EIC/EA meßbar boi Pneumonic-Patienten (30) Probanden (10)
BALF gesamt (132) Impräzision in der Serie (%) Impräzision von Tag zu Tag {%) Empfindlichkeit (mlU/ml)
20 13 4,796,79 10
269 121 5,455,24 0,25
Bei ca. 90% der Messungen unkonzentrierter BALF ergab sich eine Extinktionsdifferenz, die höher als im Referenz- ansatz war: Es lag also rechnerisch eine Elastase-Aktivi- tät vor. Diese korrelierte nicht mit den Messungen nach Konzentrierung. In den 24-h-Kontrollmessungen konnten diese Aktivitäten nicht bestätigt werden. Bei der in unkon- zentrierter BALF gemessenen Elastase-Aktivität handelt es sich wahrscheinlich um Fehlbestimmungen. Dies ist möglicherweise eine Erklärung für sich widersprechende Ergebnisse in der Literatur (12, 16).
Die Impräzision von Tag zu Tag war 5,24%, die Impräzi- sion in der Serie 5,45%. Die untere Nachweisgrenze der Methode wurde nach Ekins bestimmt (7) und ist ca. 10 mlU/ml vor und 0,3 mlU/ml nach Ultrafiltration.
Die c^Pi-Konzentration bei Pneumonie-Patienten (MW 13,0 mg/l [+/- 27,8]) war signifikant höher als bei Patien- ten mit abgelaufener Pneumonie (MW 2,65 mg/l [+/- 4,73]; p < 0,02) und gesunden Probanden (MW 0,33 mg/l [+/- 0,35); p = 0) (s. Abb. 2). Die absoluten Inhibitionska- pazitäten variierten bei den Pneumonie-Patienten stark und unterschieden sich im Mittel nicht von den gesunden Probanden (Ergebnisse nicht gezeigt). Die funktionelle Aktivität des c^Pi hingegen war im Mittel mit 0,63 (+/- 0,75) mlU/jLtg a^?\ (bzw. 4,4%) signifikant niedriger als bei Patienten mit abgelaufener Pneumonie (MW 3,98 [+/- 4,05] mlU//xg; 27,6%, p < 0,03) und bei gesunden Probanden (MW 7,61 [+/- 3,35] mlU//xg; 52,8%, p <
0,01) (s. Abb. 4). Die EIQ war bei Pneumonie-Patienten
umgekehrt proportional zum relativen Granulozytenanteil (r « -0,53, p < 0,03).
6 von 21 Patienten mit Pneumonie zeigten in der BALF freie Elastase-Aktivität als Ausdruck eines dekompensier- ten antiproteolytischen Inhibitorsystems.
Diskussion
Die Elastase-lnhibitionskapazität (EIC) kann mittels chro- mogenem Substrat einfach, schnell und präzise gemes- sen werden (15). Hierbei besitzt das von uns verwendete Substrat die höchste Enzymaffinität (17). In der unkonzen- trierten BALF ist die Messung der Enzymaktivitäten we- gen der niedrigen Proteinkonzentrationen schwierig (1).
Die Lyophilisation als Proteinkonzentrationsmethode ist für immunologische Messungen brauchbar (2, 24), für funktionelle Messungen jedoch problematisch. Wieder- holtes Einfrieren und Auftauen führt zu einem Funktions- verlust der Proteinase-lnhibitoren (Ergebnisse nicht ge- zeigt). Neben der Lyophilisation ist die Ultrafiltration der BALF eine mögliche Technik, die Proteinkonzentrationen zu erhöhen (6, 9, 21). Olsen et al. (18) berichteten von ei- nem Verlust von ca. 50% (+/- 10%) der c^Pi-Konzentra- tion während der Ultrafiltration. Affort et al. (1) überprüf- ten sowohl den immunologischen als auch den funktio- nellen Verlust dieses Inhibitors. Hierzu benutzten sie Fil- termembranen mit einem Cutoff von MG 500 bzw. 2000 in einer 'Überdruckkammer (Luft 2,9 Bar) und gewannen das Retentat durch Abwaschen von der Membran. Mit dieser Methode erreichten sie eine Wiederfindung für c^Pi von 53,6% und 18,4% für EIC. Sie erklärten diesen generell hohen Verlust durch Adhäsion an die Filtermem- bran.
Mittels der von uns verwendeten Centricon-10-Filter (Cutoff MG 10000) erreichten wir eine Wiederfindung von über 90% für «iPi-Konzentration und EIC. Der sehr ge- ringe Verlust an immunologischen und funktionellen ar
Pi kann durch die dieser Methode eigenen minimalen Ad- häsion an die Filtermembran erklärt werden. Die Aus- beute an aktiver Elastase ist mit ca. 52% jedoch auch bei dieser Methode niedriger. Verwendung von Filtern mit
P . Pa N
Abb. 3: ajPi in der BALF: Mittels Chemilümineszensassay ge- messene Konzentration von a^Pi in derbronchoalveolären Lava- geflüssigkeit (BALF) von Patienten mit akuter Pneumonie (P), Pa- tienten nach abgelaufener Pneumonie (Pa) und gesunden Pro- banden (N).
Pa N
Abb. 4: EIQ in der BALF: Funktionelle Aktivität (EIQ) von , ' in Prozent des voll aktiven Inhibitors in der bronchoalveolären La- vageflüssigkeit (BALF) von Patienten mit akuter Pneumonie (P), Patienten nach abgelaufener Pneumonie (Pa) und gesunden Pro- banden (N).
126 Lab.med. 16: 126 (1992)
MG 3000 Cutoff brachten keine besseren Ergebnisse. Fil- ter mit MG 30000 Cutoff hingegen führten mit ca. 39%
zu einer geringeren Wiederfindung für Elastase-Aktivität.
Elastase mit einem Molekulargewicht von ca. 30000 wird vermutlich stärker als a<i?\ (MG ca. 52000) an die Mem- bran absorbiert bzw. durch diese abgepreßt. Wegen der besseren Wiederfindung von Centrikon-10-Filtern gegen- über Centrikon-30-Filtern und der günstigeren Zentrifu- gendauer gegenüber Centrikon-3-Filtern verwendeten wir Centrikon-10-Filter für die klinische Untersuchung.
Bei einer Sensitivität von 0,3 mlU/ml liegen 92% der ge- messenen BALF im meßbaren Bereich. In der Literatur finden sich unterschiedliche Ergebnisse bei Messung der Elastase-Aktivität und EIC in BALF (12,16). Wir fanden bei Messung in unkonzentrierter BALF scheinbare Elastase- Aktivitäten, die nicht mit den Messungen nach Konzentra- tion korrelierten. Messungen der Elastase-Aktivität in un- konzentrierter BALF sind daher kaum verwertbar. Dies ist möglicherweise eine Erklärung für kontroverse Ergeb- nisse.
Wir fanden bei Patienten mit akuter Pneumonie eine er- höhte Konzentration von a^Pl. Dies ist am ehesten Aus- druck einer erhöhten Permeabilität der endothelial-inter- stitiellen-epithelialen Barriere im Rahmen der Entzün- dungsreaktion mit vermehrtem Übertritt von c^Pi in den Alveolarraum (4). Dabei konnten wir jedoch eine ausge- prägte Einschränkung der funktionellen Aktivität dieses Proteinaseinhibitors nachweisen: So wiesen Patienten mit akuter Pneumonie eine funktionelle Aktivität des c^Pi von 4,4%, Patienten nach abgelaufener Pneumonie eine funktionelle Aktivität von 27,6% und gesunde Probanden eine funktionelle Aktivität von 52,8% auf. Diese Inaktivie- rung von c^Pi kann auf unterschiedliche Mechanismen zurückgeführt werden: Einerseits können hochtoxische Sauerstoff radikale der polymorphnukleären Granulo- zyten -, im aktiven Zentrum oxidieren und dessen Af- finität gegenüber Granulozyten-Elastase 2000fach senken (3, 25), zum anderen komplexiert ein Teil des mit freier Granulozyten-Elastase oder-wird von dieser gespal- ten (23).
So war die Proteinase-/Antiproteinasen-lmbalance bei Pa- tienten mit akuter Pneumonie um so ausgeprägter, je hö- her die Granulozytose der bronchoalveolären Lavage war.
6 von 21 Pneumonie-Patienten zeigten in der BALF freie . Elastase-Aktivität als Ausdruck eines dekompensierten In- hibitorsystems.
Unsere Ergebnisse zeigen, daß unter Verwendung von Ul- trafiltration bei fast allen Patienten eine Quantifizierung der biologischen Elastase-lnhibitionskapazität in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit möglich ist. Dabei zeichnet sich die von uns· verwendete Methode durch eine hohe Praktikabilität und Präzision (Impräzision
< 6%) bei ausreichender Wiederfindung (> 90%) aus.
Dies sollte in der Zukunft eine routinemäßige Bestim- mung dieses Parameters in der BALF ermöglichen.
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Anschrift des Verfasser:
Dr. med. J. Braun Klinik für Innere Medizin
Medizinische Universität zu Lübeck Ratzeburger Allee 160
2400 Lübeck 1
Lab.med. 16: 127 (1992) 127
Lab.med. 16: 128-133(1992)
Serumelektrophorese-Befundsystem
auf der Basis künstlicher neuronaler Netze
Analysis of Serum Electrophoresis Pattern by Artificial Neural Networks
B. T. Ivandic, M. A. A. Kratzer, A. Fateh-Moghadam
Institut für Klinische Chemie, Klinikum Großhadern der Ludwig-Maximilians-Universität München
Zusammenfassung:
Als Prototyp eines medizinischen Expertensystems auf der Basis künstlicher neuronaler Netze wird ein Sy- stem zur automatischen Befundung von Serumelektrophoresen beschrieben. Uni Elektrophoresemuster 28 Befundtext-Modulen zuordnen zu können, wurden 4 neuronale Netze mit insgesamt 239 Beispielen nach dem Backpropagation-Verfahren trainiert. Zum Erkennen monoklonaler Gammopathien wurde zusätzlich eine Fou- riertransformation der Beta- und Gammakurven durchgeführt.
95 % von 446 zur Evaluierung gesammelten Serumelektrophoresemustern wurden nach dem Urteil eines la- bormedizinischen Experten richtig befundet. Pathologische Serumelektrophoresen wurden mit einer Sensiti- vität von 97,5 % und normale Elektrophoresen mit einer Spezifität von 98,8 % richtig erkannt, 86 % aller patho- logischen Muster wurden richtig befundet.
Unsere Ergebnisse legen den klinischen Einsatz des hier beschriebenen Systems nahe und unterstreichen die Anwendungsmöglichkeit neuronaler Netze in medizinischen Expertensystemen.
Schlüsselwörter:
Neuronale Netze - Serumelektrophorese - Expertensystem - künstliche Intelligenz - computerunterstützte Diagnosefindung - Fouriertransformation
Summary:
As a prototype of a medical expert system the authors describe a computerized system based on artificial neural networks analysing serum electrophoresis patterns to generate a diagnosis using 28 text modules. 4 neural networks have been'trained with 239 patterns using the back-propagation method. Additionally a fou- rier-transformation has been applied on the beta- and gamma-curves to improve the detection of monoclonal gammopathies.
In an independant evaluation 95% of all 446 test patterns and 86% of the pathological test patterns have been diagnosed correctly as the expert confirmed. Pathological test patterns have been identified with a sen- sitivity of 97,5% and physiological patterns with a specifity of 98,8%.
In conclusion the clinical use of this system and the broader application of neural networks within the do- main of medical expert systems should be considered.
Keywords:
Neural network - serum electrophoresis - expert system - artificial intelligence - computer assisted diagno- sis - Fourier-transformation
1. Einleitung
Seit der Einführung durch Grassmann et al. (1) hat sich die Serumelektrophorese auf Trägermedien zu einem wichtigen Standard verfahre n mit hoher Aussagekraft für die medizinische Diagnostik und Therapiekontrolle ent- wickelt.
Der komplexe Informationsgehalt einer Serumelektro- phorese läßt sich jedoch nur noch von einem Speziali- sten vollkommen erschließen. Der am Krankenbett tätige Arzt ist daher in zunehmendem Maße auf die Interpreta- tionshilfe des Labormediziners angewiesen.
Wachsender Rationalisierungsdruck bei steigenden An- forderungszahlen und das Streben nach Kostensenkung
bei gleichzeitiger Qualitätssicherung zwingen anderer- seits den Laborarzt nach Verfahren zu suchen, die eine EDY-unterstützte Befund interpretation bei leichter Be- dienbarkeit und Modifizierbarkeit erlauben. Diesen Forde- rungen kann mit sogenannten Experte n Systemen Rech- nung getragen werden, für die sich ein wachsender Be- darf in der Medizin abzeichnet. Bereits existierende Sy- steme basieren zumeist auf formallogischen Regeln oder speziellen mathematischen Algorithmen. Die Entwick- lung solcher Systeme ist jedoch zeitaufwendig und schwierig, da ein medizinischer Experte nicht gewohnt ist/ in Formeln oder Regeln zu denken, sondern Entschei- dungen oft intuitiv trifft. Neuronale Netze bieten hier Vor- teile, da sie in kurzer Zeit die Klassifizierung bestimmter Muster anhand von Beispielen lernen können und durch den Anwender leicht zu modifizieren sind.
128 Lab.med. 16: 128 (1992)
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VI
Als Beispiel für ein labormedizinisches Miniexpertensy- stem auf der Basis neuronaler Netze wird ein System be- schrieben, das Serumelektrophoresemuster mit verschie- denen Befundtexten versieht. Zusätzlich soll durch Fou- riertransformation die Empfindlichkeit des Systems zur Detektion monoklonaler Gammopathien erhöht werden.
2. Material und Methode
2.1 Künstliche neuronale Netze
Die Aufgabe des Befundsystems besteht in der Zuord- nung von bestimmten Eingangsmustern (z. B. einer pa- thologischen Serumelektrophorese) zu definierten Aus- gängen (Befundtextmodulen). Diese Zuordnung wird im wesentlichen von künstlichen neuronalen Netzen bewerk- stelligt, die sich am Verhalten biologischer Nervensy- steme orientieren und durch Beispiele lernen können.
Wir verwendeten das Programm NBP (Neurosoft Backpro-\ pagation) Version 1.0 und die Klassifizierroutinen der Firma KI-Technik Schmitz 8t Schicker, Regensburg, mit dem ein dreischichtiges Netzwerk mit Backpropagation- Lernmechanismus auf einem PC simuliert werden kann (Abb. 1) (2, 3).
Die „Neuronen" der Eingabeschicht (Input) haben die Aufgabe, dem Netzwerk in Vektorform „angebotene" Mu- ster zu puffern und sind über eine Zwischenschicht (Hid- den) mit einer Ausgabeschicht (Output) verbunden, de- ren Neurone jeweils eine Klasse, bzw. in unserem System ein bestimmtes Befundtextmodul repräsentieren. Im Netzwerk ist jedes „Neuron" einer Schicht mit jedem
„Neuron" der übergeordneten Schicht synapsenähnlich verknüpft (Abb. 1). Diese Verbindungen haben, vergleich- bar mit einem elektrischen Widerstand, unterschiedliche Stärke (w) und werden durch eine Gewichtsmatrix darge- stellt. Die Aktivität eines Neurons wird grundsätzlich aus der Summe aller afferenten gewichteten Aktivitäten er- rechnet. Die efferente Aktivität der Neuronen der Hidden- und Outputschicht wird jedoch von ihrer Aktivität selbst und einer sigmoidalen Schwellwertfunktion bestimmt (Abb. 2), deren Schwelle wiederum von der gewichteten Aktivität einer Biaszelle abhängt.
Das „Wissen" eines Netzes ist in der Gesamtheit seiner synaptischen Gewichte enthalten, die durch „Lernen"
spezifische Werte erhalten. Die Gewichtsmatrix ist zu Be- ginn der Lernphase mit Zufallswerten belegt und wird mit Hilfe des Lernalgorithmus verändert. Zum Netzwerk- training wird ein Satz Lernbeispiele, bestehend aus In- put- und dazugehörigen Outputvektoren, in einer Trai- ningsdatei bereitgestellt. Die Präsentation der zu lernen- den Beispiele geschieht in zufälliger Reihenfolge und wird eigenständig vom NBP-Programm durchgeführt.
Liegt ein Vektor an der Inputschicht an, verteilt sich das Aktivitätsmuster der Inputneuronen über die gewichteten Verbindungen bis in die Outputschicht und erzeugt dort einen bestimmten Outputvektor (Forward Propagation).
Der Vergleich mit dem erwünschten, zu lernenden Out- putvektor ergibt nun, im untrainierten Netz, eine Fehler- größe, die als Maß für die Gewichtsanpassung dient. Da- bei werden schrittweise zuerst die Gewichte zwischen Output- und Hiddenschicht und anschließend zwischen der Hidden- und Inputschicht verändert (Backpropaga- tion-Lernalgorithmus) (2, 3).
Die Lernphase ist erst abgeschlossen, wenn mit der ge- fundenen Gewichtsverteilung alle Lernbeispiele mit einer einstellbaren Toleranzbreite richtig zugeordnet worden sind (Konvergenz).
In der Erinnerungsphase (Recall), d. h. wenn nach dem Training das Wissen des Netzwerks angewendet werden soll, erzeugen unbekannte Inputvektoren durch Forward Propagation eine Aktivitätsverteilung in der Output- schicht, die den Grad der Ähnlichkeit mit den gelernten Klassen widerspiegelt. Jedes Outputneuron repräsentiert dabei ein bestimmtes Befundmodul.
2.2 Datenverarbeitung
Die Serumproben wurden von einem voll mechanisierten Elektrophoresegerät (Olympus Hite 600) verarbeitet und densitometrisch ausgewertet. Diese Ergebnisse wurden online über eine RS 232-Schnittstelle in das institutsei- gene Rechnersystem eingespeist. Die dort zentral gespei- cherten Datensätze, die aus den Patientendaten, dem Ge- samteiweiß (g/dl) sowie ca. 350 digitalisierten Kurvenwer- ten (12 Bit Auflösung) bestehen, wurden von einem PC AT '286 mit 1 Mb Arbeitsspeicher und 20 Mb Festplatten- kapazität zur weiteren Verarbeitung übernommen.
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mINPUT HIDDEN OUTPUT-»
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i i.1 - -
Abb. 1: Modell eines künstlichen neuronalen Netzes mit einer In- Abb. 2: Modell eines Neurons (hier Hiddenneuron) mit den affe- put-, Hidden- und Outputneuronenschicht. Jedes Neuron einer renten Aktivitäten aT-a", den synaptischen Verbindungsstärken Schicht besitzt synaptische Verbindungen unterschiedlicher w'-W, einer Biaszelle zur Schwellwerteinstellung und der effe- Stärke (w) zu allen Neuronen der folgenden Schicht. renten Aktivität a.
Lab.med. 16: 129 (1992) 129
Albumin: 66,4 % A1-Glob.: 3,2%
A2-Glob.: 6,7 % 81-Glob.: 7,8 % Gamma-G/. 11,0%
Gesamt-Eiweifc 7.2 g/dl
Abb. 3: Datensatz einer Serumelektrophoreseprobe mit Angabe des Gesamteiweißes und der einzelnen integrierten Fraktionen als Prozentsätze des Gesamtintegrals.
Klassen Ges.eiw.
Albumin A1-Qlob.
A2-Olob.
B1-Glob.
Oam.-O.
Input- Vektor (3x8-
Feld)
—<5,0
<40.0
<0,9
<3,5
<4,5
<7,0
~ 5,0-5,5 40,1-52,0
0,9-1,2 3,5-4.49 4,5-5,9 7,0-8,49
- 5.6-5.9 52.1-61,9 1.21-1,49 4,5-4,9
, -6,9 8,5-9,9
u
norm
6,0-8,0 62,0-73,0
1,5-4,0 5,0-9,0 7,0-12,0 10,0-18,0
+ 8,1-8,5 73.1-76.0
4,1-5,0 9,1-12,0 12.1-14,0 18.1-21.0
++
8,6-9,0 76,1-80,0
5,1-8,0 12.1-20,0 14,1-20,0 21,1-45,0
+++
> 9,0 g/dl
>80,0%
>8,0 %
> 20,0 %
> 20,0 %
>45,0%
Abb. 4: Klassierung der integrierten Fraktionen mit Hilfe einer Referenzwertetafel und grafische Darstellung der resultierenden Inputvektoren.
Ein in der Sprache Pascal entwickeltes Programm diente der graphischen Darstellung und Vorbereitung der Daten- sätze. Die aufbereiteten Daten wurden dann von den ein- gebundenen Neuronalen Netzen klassifiziert und Teile der Elektrophoresekurve fouriertransformiert. Eine überge- ordnete Funktion verknüpfte abschließend alle Ergeb- nisse mit UND/ODER/NICHT-Aussagen und wählte aus 28.
Textmodulen (Tab. 1) die jeweils passenden Befundtexte, die zusammen mit einem Analysereport ausgedruckt wurden.
2.2.7 Datenaufbereitung für die neuronalen Netzwerke In Anlehnung an das Verhalten des befundenden Arztes, der sowohl die integrierten Fraktionen als auch die Kur- venformen gesondert betrachtet wurden diese in unse- rem System von jeweils spezialisierten Netzwerken aus- gewertet.
Die Kurven der einzelnen Fraktionen (Albumin-, Alpha-1-, Alpha-2-, Beta- und Gammafraktion) wurden jeweils inte- griert und in Prozentsätzen des Gesamtintegrals ausge- drückt (Abb. 3). Zusammen mit dem Gesamteiweiß wur- den diese dann anhand klinischer Referenzwerte in 7 Klassen eingeteilt (Abb. 4), die von „normal" über
«leicht" und „deutlich" bis „stark" „erhöht" bzw. „ver- mindert" reichen ( , —, -, norm, +, ++, +++). Die so verarbeiteten Daten wurden auf einen Vektor mit 144 binären Elementen (6 Fraktionen 3 x8) abgebildet, der als Inputvektor für Netz 1 (144 Input-, 18 Hidden-, 21 Out- putneuronen) diente.
Zur Untersuchung der Pherogramme auf Formverände- rungen wurden die Meßwerte der Albumin-, Beta- und Gammafraktion gesondert ausgewertet. Pro Fraktion wur- den maximal 60 digitalisierte Kurvenwerte nach 8 relativ auf die Kurvenhöhe bezogenen Grenzen eingeteilt und so ein vergröbertes Abbild der Fraktion in Histogrammform (Abb. 5) erzeugt, das als Grundlage für einen Vektor mit 480 (8 60) binären Elementen dient. Die Netzwerke 2, 3 und 4 analysierten jeweils speziell die Albumin-, Beta- und Gammafraktion und verfügten über 6,8 und 12 Hid- den- bzw. 3,4 und 5 Outputneuronen.
2.2.2 Fouriertransformation
Um die Sensitivität des Systems zur Detektion monoklo- naler M-Gradienten zu erhöhen, wurden die Beta- und Gammafraktion zusätzlich einer eindimensionalen Fou^
riertransformation unterzogen. Die Meßwerte der Kurven sind dabei als eine sich periodisch wiederholende
Schwingung aufzufassen, die sich aus einem Gemisch von Sinusschwingungen mit verschiedener Frequenz und Amplitude zusammensetzt. Mit der eindimensionalen Fouriertransformation kann ein Schwingungszug sehr ge- nau in seine Oberwellenanteile (Harmonische) zerlegt werden.
Zur Vermeidung artifizieller, überlagernder Oberwellenan- teile wurden die Kurven zuerst auf die Nullinie normiert und durch den letzten Meßwert punktgespiegelt, um ei- nen vollständigen Schwingungszug zu erhalten (Abb. 6).
Das Verhältnis der Amplitudensumme der 1. bis 4. und 5.
bis 9. Oberwellen wurde zur Untersuchung auf Vorliegen eines M-Gradienten herangezogen (Abb. 7).
Albumin: 66,4 % Al-Glob.: 3,2%
A2-Glob.: 6,7 % B1-Glob.: 7,8%
Gamma-G.: 11,0%
Gesamt-Eiweiß: 7,2 g/dl
Beta-Glob. Gamma-Glob.
Abb. 5: Datenvorverarbeitung der Albumin-, Beta^ und Gamma- kurven: die Einteilung der digitalisierten Kurvenwerte anhand von 8 hohenbezogenen Grenzwerten ergibt ein vergröbertes Ab- bild der Kurve in Histogrammform.
130 Lab.med. 16: 130 (1992)
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VIII
Abtrennung der Fraktion ind Punktspiegelung
Abb. 6: Darstellung der Aufbereitung der digitalisierten Kurven- werte zur Fouriertransformation.
Normalkurve
Q=14,3
Monoklonaler Peak
überlagerter M-Gradient
1. 5. 9. Harmonische
Q=3,6 9. Harmonische
Q-4,1
1. ff-
9. Harmonische Abb. 7: Ergebnisse der Fouriertransformation einer Gammafrak- tion mit a} normalem Kurvenzug, b) monoklonalem Peak und c) überlagertem M-Gradienten. Zusätzlich wird der Quotient Q der Amplitudensummen der 1. bis 4. und 5. bis 9. Oberwelle angege- ben.
Tab. 1: Befundtextmodule, verantwortliche Netze und Anzahl ihrer Trainingsbeispiele (Bsp.).
ßefundtextmodule Netz Bsp.
1. Normalbefund · 1,2,3,4 83 2. artifizielle Albuminvermehrung 1 8 3. anodische Verbreiterung
der Albuminzacke 2 3 4. Doppelalbuminämie vom langsamen Typ 2 1 5. Doppelalbuminämie vom schnellen Typ 2 0 6. V.a. Alpha-1-Antitrypsin-Mangelsyndrom 1 6 7. Alpha-2-Verminderung. Haptoglobin?
Hämolyse? 1 4 8. Alpha-2-Erhöhung. Entzündlicher oder
maligner Prozeß? 1 3 9. starke Alpha-1-Erhöhung. Frühphase einer
akuten Entzündung? 1 1 10. leichte entzündliche Alpha-Dysproteinämie 1 3 11. Dysproteinämie vom- Alpha-Typ
Akute Entzünd./Malignität? 1 17 12. Hypoprot. Dysproteinämie v.
Alpha-2/Beta-Typ. Nephrose? 1 1 13. Normoprot. Dysproteinämie v. Beta-Typ.
Galle? 1 1 14. Beta-Erhöhung. Transferrin? Eisenmangel-
anämie? 1 4 15. Beta-Erniedrigung. Transferrin-
verminderung? 1 3 16. Hypogammaglobulinämie 1 8 17. V.a. humorales Antikörpermangelsyndrom 1,4 14 18. Hypogammaglob. + Alpha-Dysprot.,
Entzündung bei AMS? 1 2 19. polyklon. Gammopathie + Hyperprot.
Hepatitis? Autoimmun? 1 2 20. polyklon. Gammopathie + Transferrin-
syntheseverminderung 1 2 21. polyklon. Gammopathie. Leber?
Chron. Entz.? Autoimmun? 1 14 22. polyklon. Gammopathie + Beta-Gamma
Brücke, chron. Entz.? 3 8 23. Beta-Gamma Brücke. IgA-Vermehrung?
Alkohol? 1 4 24. V.a. monoklonale Gammopathie der
' Gammafraktion 4 7 25. monoklonale Gammopathie der Gamma-
fraktion 4 21 26. monoklonale Gammopathie der Betafraktion 3 4 27. gemischte hypoprot. Dysproteinämie.
Maligne Erkrankung? 1 5 28. gemischte normoprot. Dysprot. Chron.
Entzündung/Malignität? 1 10
3. Ergebnisse (8)
3.1 Netzwerktraining
Für das Training der neuronalen Netze wurde eine Datei mit 83 normalen und 156 pathologischen Beispielen zu- sammengestellt die jeweils einem der 28 Befundtexte entsprechen (Tab. 1). Diese wurden mit einer Toleranz- schwelle von 850 und Lernkonstanten von 1 nach den Lernregeln 1 und 2 gelernt (spezifische Parameter des N BP-Program ms, siehe [2]).
Die Dauer der Lernphase lag im Minutenbereich, verlän- gerte sich aber überproportional mit der Anzahl der Lern- beispiele. Die 128 Beispiele des ersten Netzes waren z. B.
in weniger als einer halben Stunde bei bis zu 400 Zyklen (Präsentationen des gesamten Lernmaterials) gelernt worden.
Bestanden im Lernmaterial Widersprüche, d. h., wurde z. B. versucht, zwei gleichen Inputvektoren unterschiedli- che Outputvektoren „beizubringen", so konvergierte (s.
2.1) das Netz nicht. Das NBP-Programm ermöglichte es, in diesem Fall auf die zugrundeliegenden widersprüchli- chen Beispiele zurückzuschließen.
3.2 Evaluierung des Systems
Nach Abschluß der Trainingsphase wurde das System mit neuen, unbekannten Serumelektrophoresemustern evaluiert. Dazu wurden ca. 2 Monate später 446 Serum- elektrophoresen an drei aufeinanderfolgenden Tagen im Routinelaborbetrieb gesammelt und von unserem Sy- stem befundet. Diese Befunde wurden anschließend aus- gewertet, wobei das Urteil eines labormedizinischen Ex- perten als· Referenz diente. Insgesamt wurden 95% aller 446 Elektrophoresen richtig befundet. Pathologische Elek- trophoresen wurden mit einer Sensitivität von 97,5%
und normale mit einer Spezifität von 98,8% (Tab. 2) rich- tig erkannt. 86% aller 122 pathologischen Elektrophore- sen waren die richtigen Befundtexte zugeordnet worden (Tab. 3). Eine genauere Fehlerbetrachtung zeigte, daß vor allem die Befunde, für die in der Lerndatei weniger als 5 Lab.med. 16: 131 (1992) 131
Tab. 2: Evaluierung des Systems mit 446 unabhängig gesam- melten Serumelektrophoresen.
Befund (System) pysiologische pathologische Summe Elektrophoresen Elektrophoresen
Normalbcfund pathol. Befund 320
4 (f. pos.) 3 (f. neg.)
119 323
123
Summe 324 122
Spczifität 98,8 % Sensitivität 97,5 %
446
Tab. 3: Befundung von 122 pathologischen Berumelektrophore- sen.
richtiger Befund 105 86%
falscher Befund 171 14%
Pathologische Elektrophoresen 122 100%
1 Zahl enthüll 3 falsch negative Befunde
Beispiele (Befunde 10, 12, 18, 19, 27 in Tab. 1) vorhanden waren, falsch klassifiziert'wurden. Die 4 falsch patholo- gisch beurteilten Elektrophoresen (Tab. 2) verteilten sich auf je 2 Fehler des Netzes für die semiquantitative Ana- lyse und des Netzes für die Analyse der Gammakurve, das bei normalen Gamma-Kurven den Verdacht auf eine monoklonale Gammopathie äußerte. Bei den 3 falsch normal befundeten Elektrophoresen handelte es sich aus- schließlich um Fehler des für die semiquantitative Ana- lyse zuständigen Netzes. Darunter befanden sich zwei gleiche Muster, so daß eigentlich nur 2 falsch negative Fälle auftraten.
Die Fouriertransformation identifizierte alle laborche- misch gesicherten monoklonalen Gammopathien (1 der Beta- und 13 der Gammafraktion) richtig. Das Ober- wellenspektrum einer monoklonalen Gammopathie un- terschied sich durch seine „Doppelgipfligkeit" von dem anderer Kurvenformen (Abb. 7a, b, c). Durch Bestim- mung des Quotienten der Amplitudensumme der 1. bis 4. und 5. bis 9. Harmonischen verfügten wir über einen empfindlichen Parameter, der selbst durch die Normal- fraktion stark überlagerte Gradienten anzeigte (Abb. 7c).
Im Falle der Gammafraktion wurde erfahrungsgemäß ein Quotient unter 5 als Hinweis auf eine monoklonale Gam- mopathie gewertet.
4. Diskussion
4.7 Neuronale Netze im Einsatz
Neuronale Netze können die Klassifizierung komplexe- ster Muster, wie sie z. B. bei der automatischen Sprach- und Schrifterkennung auftreten, durch Training mit Bei- spielen in kurzer Zeit lernen.
Ihre Klassifizierungsleistung ist dabei von der Güte des verwendeten Lernmaterials abhängig. Aufgrund der par- allelen Arbeitsweise neuronaler Netze, die eine Generali- sation und Fehlertoleranz ermöglicht, mußten darin kei- neswegs alle denkbaren Beispiele enthalten sein. Grund- sätzlich wurde versucht, sie mit möglichst wenigen und für die jeweiligen Befundtexte sehr typischen Beispiele zu trainieren. Zuvor wurden die Elektrophoresedaten ei- ner adäquaten Datenreduktion unterzogen, um unwich- tige von aussagekräftigen Informationsanteilen zu tren- nen und dadurch den Lernprozeß zu beschleunigen.
Darüber hinaus ermöglichte Nachtrainieren mit weiteren Beispielen die einfache Erweiterung der „Wissensbasis", die Abgrenzung ähnlicher Klassen und das Lernen aus Fehlern. Die Trainingsdatei wurde so beispielsweise zur Identifizierung von Elektrophoreseartefakten und, nach Umstellung des Elektrophoresesystems auf ein neues Puffermedium, an die veränderten Formen der Betakur- ven angepaßt. Während ein herkömmlicher Algorithmus theoretisch entwickelt und sofort eingesetzt, aber meist schwer modifiziert werden kann, mußten genügend Bei-
spiele für das Training neuronaler Netze zur Verfügung gestellt werden, um sicheres Klassifizieren zu gewährlei- sten.
Nach dem Training der Netzwerke war jedoch die Einstel- lung der synaptischen Gewichte zwischen den einzelnen Neuronen nicht mehr nachvollziehbar. Da die einzelnen Lernbeispiele in zufälliger Reihenfolge dem Netzwerk prä- sentiert wurden, konnte die Klassifizierung eines be- stimmten Musters mit verschiedenen Gewichtseinstellun- gen erreicht werden. Ein neuronales Netz konnte nur in seiner Gesamtheit durch sein Verhalten, nämlich der Zu- ordnung von Mustern zu bestimmten Klassen anhand der gelernten Beispiele, verstanden werden.
Anhand der Pherogrammauswertung konnte gezeigt wer- den, daß sich neuronale Netze zur Lösung komplexer Pro- bleme in der Medizin eignen, wenn sich auf Regeln oder Wahrscheinlichkeiten (Bayes) basierende Systeme nicht mehr anwenden lassen. In umfangreicheren medizini- schen Expertensystemen könnten diese aber den geeig- neten Rahmen für den Einsatz neuronaler Netze darstel- len.
4.2 System zur Befundung von Serumelektrophoresen In der Literatur sind bereits Datenverarbeitungssysteme beschrieben worden, die densitometrische Auswertun- gen von Elektrophoresekurven klassifizieren und mit ent- sprechenden Befundtexten versehen können (4, 5). Auch an unserem Institut wurde von Knüppel et al. (6) in zwei- jähriger Entwicklungszeit ein solches System erstellt, das die Elektrophoresekurven mit speziellen mathematischen Algorithmen analysierte. Anhand von 239 Beispielen lernte unser System in relativ kurzer Zeit die Zuordnung zu 28 Befundtexten, die weitgehend den von Knüppel ver- wendeten entsprachen. Dadurch entstand in nur ca. 5 Monaten ein System, das 95% von 446 unbekannten Test-Serumelektrophoresen richtig befundete. Pathologi- sche Serumelektrophoresen wurden mit einer Sensitivi- tät von 97,5% und*'normale mit einer Spezifität von 98,8% richtig erkannt. Von allen pathologischen Mustern wurden 86% richtig befundet.
Diese Ergebnisse sind mit den Angaben von Furlong et al. (7) vergleichbar, die ein Backpropagation-Netzwerk zur Diagnose eines akuten Myokardinfarkts (AMI) anhand des zeitlichen Verlaufs von Enzymaktivitäten nutzten. Sie erzielten Übereinstimmung mit dem Urteil des Experten in 100% der Fälle bei der Diagnose AMI und in 93% der Fälle, bei denen diese Diagnose nicht gestellt wurde.
Die Ergebnisse unseres Systems, die speziell die Analyse der Formveränderungen der Elektrophoresekurven betref- fen, lassen sich am Beispiel der monoklonalen Gammo- pathie darstellen. Während das von Knüppel beschrie- bene System 77% von 79 Fällen mit gesicherten Para- proteinämien der Gammafraktion identifizierte, wurden bei der Evaluation unseres Systems alle 13 (100%) richtig.
132 Lab.med. 16: 132 (1992)
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erkannt. Dieses Ergebnis wurde u. a. durch den Einsatz der eindimensionalen Fouriertrareformation ermöglicht, die die Sensitivität bei der Erkennung von monoklonalen Gammopathien im Bereich der Beta- und Gammafraktio- nen steigerte.
Aufgrund der Ergebnisse und bisherigen Erfahrungen sollte der klinische Einsatz des hier beschriebenen Sy-
stems zur automatischen Befundung von Serumelektro- phoresen erwogen werden. Die hohe Befundungsge- schwindigkeit (ein Netz klassifiziert in weniger als einer Sekunde) sowie die leichte Ausbau- und Anpassungsfä- higkeit entsprechen den Anforderungen des modernen rationalisierten Alltags in der Klinischen Chemie.
Schrifttum:
1. Grassmann, W., Hannig, K. & Knedel, M. (1951) Über ein Verfahren zur elektrophore- tischen Bestimmung der Serumproteine auf Filterpapier. Dtsch. med. Wschr. 333, 2. Firma Kl-Schmitz & Schicker, Regensburg: Einfuhrungsband zum Thema Neuronale Netze.
3. McClelland, J. L. & Rumelhart, D. E. (1989) Explorations in Parallel Distributed Pro- cessing. MIT Press, Cambridge. Mass. pp 130-137.
4. Dito, W R. (1977) An Octal Algorithm for Pattern Coding and Computerassisted Inter- pretative Reporting. Am. J. Clin. Pathol. 68, 575-583.
5. Okamura, K. (1979) Derivative Electrophoretograms and their Applications. Clin.
Chem. A. 96. 273-279.
6. Knüppel, W, Neumeier, D., Fateh-Moghadam, A. & Knedel, M. (1984) Rechnerge- stützte Befundung von. Eiweißelektrophoresen auf Celluloseacetatfolie. J. Clin. Chem.
Clin. Biochem. 22, 407-417.
7. Furlong, J. W, Dupuy, M. E. & Heinsimer, J. A. (1991) Neural Network Analysis of Se- rial Cardiac Enzyme Data. Am. J. Clin. Pathol. 96,134-141.
8. Ivandic, B. (in Vorbereitung) Serumelektrophorese Befundsystem mit Hilfe von künstlichen neuronalen Netzen. Dissertation der Medizinischen Fakultät der Ludwig Maximilians-Universität München.
Anschrift der Verfasser:
Priv.-Doz. Dr. med. Michael Kratzer1
Prof. Dr. med. A. Fateh-Moghadam Boris Ivandic
Institut für Klinische Chemie
Klinikum Großhadern der Universität München Marchioninistraße 15
8000 München 70
1 Korrespondenzadresse für Sonderdrucke etc.
Lab.med. 16: 133 (1992) 133
Lab.med. 16: 134-136(1992)
TRH-Stimulationstest während verschiedener Phasen des menstruellen Zyklus
TRH Stimulation Test during different Phases of the Menstrual Cycle
L Röcker1, E. Bair?, W. Hopfenmüller3, B. Hoyduck1 1 Physiologisches Institut der Freien Universität Berlin
7 Institut für Leistungsmedizin, Abt. Leistungsphysiologie, Berlin
3 Klinikum Steglitz, Institut für Dokumentation und Statistik, Berlin
Zusammenfassung:
Bei 16 gesunden Frauen im Alter von 22 bis 48 Jahren wurden innerhalb eines menstruellen Zyklus je einmal während der Follikelphase (4.-8. Zyklustag) und in der Lutealphase ( 8.-22. Zyklustag) ein TRH-Test (200 g TRH nasal) durchgeführt. Außerdem wurden vor und nach dem TRH-Test die peripheren Schilddrüsenhor- mone ( 3, fT4) analysiert. Es konnte zwischen der Follikel- und der Lutealphase weder ein Unterschied des basalen TSH-Wertes noch des stimulierten TSH-Wertes festgestellt werden. Ebensowenig unterschieden sich die peripheren Schilddrüsenhormone fT3 und fT4 zwischen beiden Zyklusphasen. Die vorliegenden Ergeb- nisse rechtfertigen deshalb nicht, zyklusabhängige Referenzwerte für Frauen aufzustellen.
Schlüsselwörter:
Schilddrüsenhormone - Menstruationszyklus - TRH-Test Summary:
Two TRH-Tests (200 g TRH nasal) were performed in 16 healthy women (age: 22-48 years) during the men- strual cycle both in the follicular phase (4th-8th day of the cycle), and in the luteal phase (18th-22th day of the cycle). Furthermore, the peripheral thyroid hormones (fT3, fT4) were analysed before, and after the TRH-test No difference was found between the follicular and the luteal phase, neither concerning the basic TSH values nor concerning the stimulated TSH values. Accordingly there was no difference in the peripheral thyroid hor- mones fT3 und fT4 inbetween the two phases of the cycle. Therefore, the presented data do not urge to de- fine cycle-dependent reference values for women.
Keywords:
Thyroid hormones - menstrual cycle - TRH-test
Einleitung
Die Konzentration der Schilddrüsenhormone ist von ei- ner Vielzahl von Einflußgrößen abhängig. Neben analyti- schen Schwankungen (16) werden diese Meßwerte durch biologische Faktoren wie zum Beispiel Alter, Geschlecht, Schwangerschaft, Tagesperiodik etc. beeinflußt (5, 7, 8, 12, 16, 21, 22, 23).
Bei der Erstellung bzw. Beurteilung von Referenzberei- chen müssen diese präanalytischen und analytischen Einflüsse beachtet werden. Eine besondere Bedeutung für die Schilddrüsenfunktion spielt bis heute noch der TRH-Test. Auch die Stimulierbarkeit von TSH durch TRH- Gabe ist von präanalytischen Faktoren abhängig. Im Jahre 1977 berichteten Boyd und Sanchez-Franco (3) über einen signifikanten Unterschied der Stimulierbarkeit der TRH-induzierten TSH-Reaktion während des Men- struationszyklus. Danach ist die Stimulierbarkeit in der Follikelphase (13,8 , - 1) erheblich größer als in der Lutealphase (7,7 , - 1). Die Ergebnisse dieser Untersu- chung basierten jedoch auf einem interindividuellen Ver- gleich, die Analytik entsprach zu dem damaligen Zeit- punkt nicht dem heutigen Standard.
In der vorliegenden Untersuchung wurde im intraindivi- duellen Vergleich mit zwei sensitiven Methoden unter- sucht, ob und wenn ja, in welcher Größenordnung sich
die basalen TSH-Werte und die TSH-Antwort auf TRH- Gabe in der Follikel- und Lutealphase unterscheiden. Im Gegensatz zu früheren Untersuchungen wurde bei der statistischen Analyse der Ergebnisse sowohl der Fehler 1. Art (<*) als auch der Fehler 2. Art (ß) abgeschätzt.
Methodik
16 gesunde Frauen im, Alter von 22 bis 48 Jahren nah- men an der Untersuchung teil. Keine der Frauen nahm Kontrazeptive ein. Alle Teilnehmerinnen hatten in den letzten sechs Monaten einen regelmäßigen Zyklus von 26 bis 31 Tagen. Eine Schwangerschaft bestand vor und während der Untersuchung nicht. Die Versuchsteilnehme- rinnen führten drei Monate einen Zykluskalender mit täg- licher Basaltemperaturmessung in den Morgenstunden.
Der Ovulationszeitpunkt wurde zusätzlich durch die Ana- lyse von LH, FSH, östradiol, Progesteron und Prolaktin abgesichert. Auf dieser Grundlage wurden die Zeitpunkte für die Ovulation (Maximum von LH und FSH) bzw, für die mittlere Lutealphase (Progesteronmaximum) be- stimmt und die Probandinnen an den errechneten Termi- nen dem Test unterzogen. Um Probandinnen mit Erkran- kungen, welche die Schilddrüsenhormone beeinflussen können, zu erfassen, wurde eine sorgfältige Schilddrü- senanamnese erhoben. Die Blutentnahmen wurden un- ter den im folgenden genannten standardisierten Bedin- 134 Lab.med. 16: 134 (1992)
