CTLA-4 single-strand Polymorphismus A/G an Position 49 in Exon 1 als Prädiktor für eine steroidfreie Posttransplantationsmedikation und akute Transplantatabstoßung

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Aus dem Zentrum Kinderheilkunde

Abteilung pädiatrische Nephrologie und Stoffwechsel-Erkrankungen der Medizinischen Hochschule Hannover

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Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin

in der Medizinischen Hochschule Hannover

vorgelegt von Jan Kwant

aus Nordhorn

Hannover, im Jahre 2009

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Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 10.03.2010

Gedruckt mit der Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover

Präsident: Prof. Dr. med. Bitter-Suermann

Betreuer der Arbeit: Prof. Dr. med. Jochen H. H. Ehrich

Referent: Prof. Dr. med. Jörg Radermacher

Koreferent: PD. Dr. med. Rainer Lück

Tag der mündlichen Prüfung: 10.03.2010

Promotionsausschussmitglieder: Prof. Dr. med. Johann Karstens

Prof. Dr. med. Michael Winkler

Prof. Dr. med. Oliver Rühmann

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Inhaltsverzeichnis

1. EINLEITUNG UND HINTERGRUND 1.1. Allgemeines

1.2. Signalmodell der Immunaktivierung 1.2.1. Signal 1 – Antigen Kontakt

1.2.2. Signal 2 – Costimulation

1.2.3. Signal 3 – Zytokin Aktivierung und Proliferation der T-Zellen

1.3. Beeinflussung des 3-Signal Modells durch eine immunsuppressive Therapie

1.4. Single Nucleotide Polymorphisms

1.5. CTLA-4 - Schlüsselmolekül in der Immunantwort 1.5.1. Rolle von CTLA-4 bei der Immunantwort

1.5.2. CTLA-4 im Mausmodell

1.5.3. Relevanz von Single Nucleotide Polymorphisms im CTLA-4 Gen bei Autoimmunerkrankungen

1.5.4. CTLA-4 in älteren Patienten

1.6. Steroide bei transplantierten Kindern 1.7. CTLA-4 in Exon 1 an Position 49 (A/G)

2. FRAGESTELLUNG

3. MATERIAL UND METHODEN 3.1. Patienten

3.2. Probenentnahme 3.3. DNA-Isolierung 3.4. CTLA-4 in Exon 1 3.5. PCR-Methodik 3.6. Primer Auswahl 3.7. Qualitative PCR

3.8. Real Time Taq-Man ^TM PCR Methodik

3.9. Besonderheiten der Allel spezifischen Taq-Man PCR 3.10. Geräte

3.11. Hilfsmittel

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Inhaltsverzeichnis

3.12. Reagentien

3.13. Computer Software

4. ERGEBNISSE

4.1. Akute Abstoßungen in den einzelnen Genotypen

4.2. Vorhersage eines erfolgreichen Steroidentzuges mittels des CTLA-4 Polymorphismus 49 A/G

4.3. Geschlechtsspezifische Unterschiede in der Inzidenz akuter Abstoßungen und der Verteilung der A/G Polymorphismen

5. DISKUSSION 5.1. Eigene Ergebnisse 5.2. Aussicht

5.3. Grenzen unserer Studie

6. ZUSAMMENFASSUNG

7. LITERATUR

8. LEBENSLAUF

9. ERKLÄRUNG

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1. Einleitung und Hintergrund

1.1. Allgemeines

Die Transplantation von Spendernieren hat in den letzten 30 Jahren zu dramatischen Erfolgen in der Behandlung der terminalen Niereninsuffizienz im Kindes- und Säuglingsalter geführt. Sie ist heute unumstritten die Therapie der Wahl für diese Patienten (1).

Nach einer Nierentransplantation ist bei Kindern wie bei erwachsenen Patienten eine lebenslange immunsuppressive Therapie erforderlich, um Abstoßungsreaktionen und chronisch-inflammatorische Transplantatschädigungen zu verhindern (2). Aufgrund der langen Lebensspanne sind für Kinder besonders gute Langzeitfunktionen der Transplantate anzustreben. Obwohl Verbesserungen in den letzten Jahren erzielt wurden, zeigen die Daten großer Transplantationsregister jedoch, dass Kinder bestenfalls gleich gute, im Mittel jedoch leicht schlechtere Funktionsraten der Transplantatnieren, im Vergleich zu Erwachsenen erreichen. Die 1-Jahres Überlebensraten und Transplantat-Funktionsraten der Kinder über 2 Jahren sind vergleichbar mit denen der Erwachsenen, allerdings führen non-compliance und späte akute Abstoßungsepisoden zu deutlich höheren Organverlusten, insbesondere bei jungendlichen Patienten (3).

Das Ausmaß der erforderlichen immunsuppressiven Behandlung wird nach Medikamentenspiegeln und empirischen Gesichtspunkten gesteuert. Den Risiken einer zu geringen Immunsuppression, in Form von Abstoßung und chronischer Transplantatschädigung, stehen bei zu hoher Immunsuppression vermehrte Infektionen (Cytomegalie, Epstein-Barr-Virus, BK-Virus, Urosepsis, Pneumocystes Infektionen), die Entstehung von Posttransplantationslymphomen und in späterem Alter Karzinome entgegen. Hinzu kommen medikamentenbedingte Nebenwirkungen (chronische Nephrotoxizität der Calcineurin-Inhibitoren, Störungen des Fettstoffwechsels, des Knochenstoffwechsels, Thrombo- und Leukozytopenien). Weitere unerwünschte Nebenwirkungen sind die Hemmung des Wachstums durch Corticosteroide und Proliferationshemmer und eine verschlechterte Transplantatfunktion. Insbesondere eine höher dosierte Corticosteroidbehandlung führt zu deutlichen Wachstumsbeeinträchtigungen und anhaltenden osteopathischen Veränderungen.

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1. Einleitung und Hintergrund

Die Vermeidung von Steroidnebenwirkungen ist daher ein lange bestehendes Anliegen der pädiatrischen Transplantationsmedizin. Die frühen Versuche einer steroidfreien Posttransplantationsbehandlung oder eines späteren Steroidentzugs haben in bis zu 30%

zu späten Abstoßungen geführt und daher zuerst keine Verbreitung gefunden (4) (5).

Durch die Entwicklung neuer Immunsuppressiva zeigten Studien, dass ein langfristiger Steroidentzug in der pädiatrischen Klientel keine höhere Abstoßungswahrscheinlichkeit nach sich zieht (6) (7) (8). Die Daten zeigen, dass ungefähr 80% der nierentransplantierten Patienten einen langfristigen Steroidentzug ohne erhöhte Inzidenz von akuten Abstoßungen tolerieren (9). Allerdings besitzen Patienten, die unter einer steroidfreien Medikation eine akute Abstoßungsreaktion erleiden, ein hohes Risiko für eine weitere akute Abstoßungsreaktion, sollten sie einem erneuten Steroidentzug zugeführt werden. Somit sollte hier ein erneuter Steroidentzug kritisch gesehen werden (9) (10).

Bis heute steht kein immunologischer Parameter zur Verfügung, der jene kindlichen Patienten identifizieren kann, die problemlos einer Reduktion von Steroiden zugeführt werden können. Eine Prädiktion der späteren individuellen Immunreaktivität anhand der prädeterminierten Aktivität der Schlüsselgene im Abstoßungsgeschehen ist aktuell nicht möglich.

1.2. Signalmodell der Immunaktivierung:

Die Aktivierung nativer T-Zellen nach Antigen-Kontakt im Rahmen einer Transplantation bedarf nach heutiger Vorstellung dreier Signale, um zur zytotoxischen Zerstörung des Transplantates durch Effektor-T-Zellen - klinisch zur Abstoßung - zu führen. Folgende Signale sind erforderlich:

1.2.1. SIGNAL 1 - Antigen-Kontakt

Antigen-präsentierende Zellen (APC) im Gewebe sind in der Lage, Peptide zu binden und sie mittels MHC-Molekülen zur Erkennung für T-Lymphozyten zur Verfügung zu stellen (Abb. 1.1.). Die Aktivierung der T-Lymphozyten erfordert die Erkennung eines Peptid-MHC-Molekül-Komplexes durch einen spezifischen T-Zell-Rezeptor.

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Peptide können direkt durch Antigen-präsentierende Zellen des Spenders oder indirekt durch später eingewanderte Antigen-präsentierende Zellen des Empfängers präsentiert werden. T-Zellen wandern nach Antigen-Kontakt zur Stimulierung, Proliferation und Differenzierung in lokale Lymphknoten ab (11).

Abbildung 1.1.: Ruhende Dendritenzellen werden durch fremde HLA Peptide aktiviert (12)

1.2.2. SIGNAL 2 - Costimulation

Für die Aktivierung nativer T-Zellen nach Antigenkontakt bedarf es einer sogenannten Costimulation mit Zellkontakt zwischen Antigen-präsentierender Zelle und T-Zelle.

Fehlende Costimulation führt zu einer dauerhaften Anergie. Die am besten definierten Costimulatoren für T-Lymphozyten sind B7-1 (CD80) und B7-2 (CD86), die auf aktivierten B-Lymphozyten, dendritischen und Langerhans-Zellen, Makrophagen, Kupferzellen, aktivierten Monozyten und auf einigen Killerzell-Klonen (13) exprimiert werden.

Der Ligand CD28 ist auf ca. 90% der CD4+ und auf 50% der CD8+ T-Zellen zu finden.

Die Bindung von B7-CD28 induziert die Expression von antiapoptotischen Proteinen, stimuliert die Produktion von Wachstumsfaktoren und Zytokinen (IL2, IL13, TNF- alpha, GM-CSF, IFN-gamma, TNF beta (13)) und leitet die T-Zell Proliferation und Differenzierung ein (Abb. 1.2.) (11).

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CD40 ist ein B-Zell Oberflächenprotein, welches einen Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) Rezeptor und ein Fas-Protein beinhaltet, CD40L (CD154) ein Membran Protein auf T- Helferzellen, welches eine TNF und Fas-Liganden ähnliche Struktur hat und nur von T- Lymphozyten nach Aktivierung durch Antigen und Costimulatoren exprimiert wird.

Wenn ein CD40L auf aktivierten T-Zellen mit einem CD40 Rezeptor interagiert, kommt es in Folge der Assoziation von zytoplasmatischen Proteinen und Enzymkaskaden zur Aktivierung von NF-κB and AP-1 (activation protein-1).

Die Interaktion von CD40 führt zu einem Anstieg der Expression von B7 Molekülen auf den B-Zellen, welche wiederum eine vermehrte Aktivierung von T-Zellen zur Folge hat (11).

Abbildung 1.2.: Signal 2. Nach Antigenkontakt leitet der CD40/B7 Mechanismus die Costimulation der T-Zelle ein. In der Folge werden Zytokine und Wachstumsfaktoren produziert (12).

CTLA-4 - Terminierung der Immunaktivierung. Ein zweiter, verzögert nach Antigen-Kontakt exprimierter Rezeptor für B7 Moleküle ist das CTLA-4 (cytotoxic T- lymphocyte associated antigen 4, CD152). CTLA-4 besitzt die gleiche Struktur wie CD28 und wird von aktivierten CD4+ und CD8+ T-Zellen exprimiert. Es verhindert ein Überschießen der Immunantwort und greift bereits in der Frühphase nach Antigen- Kontakt in die Costimuation ein, indem es anstelle des CD28 die Bindung des B7 Proteins übernimmt und damit die Immunreaktion beendet (Abb. 1.3.). Die T-Zelle wird

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zur Apoptose angeregt, ein geringer Teil entwickelt sich zu Memory-T-Zellen und regulatorischen T-Zellen.

Abbildung 1.3.: Bindung des CTLA-4 an das B7 Protein und damit Verhinderung der T- Zell Aktivierung (12)

CTLA-4 Signale inhibieren, durch Phosphatasen vermittelt, die Signaltransduktion des T-Zell Rezeptors (14) (15) (Abb. 1.4.).

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1.2.3. SIGNAL 3 - Zytokin-Aktivierung und Proliferation der T-Zellen

Nach Antigen-MHC-Kontakt und erfolgreicher Costimulation kommt es zur autokrinen und polykrinen Aktivierung von T-Zellen durch Ausschüttung von Zytokinen (IL-2, IFN-g). Sie binden mit einer hohen Affinität an spezifische Rezeptoren der Zielzellen und steuern eine weitere Proliferation und Differenzierung von verschiedenen Zellen (Abb. 1.5.). Diese zeitlich begrenzte Freisetzung und Aktivierung hochaffiner Rezeptoranteile (alpha-Rezeptoren) wird als Signal 3 bezeichnet.

Abbildung 1.5.: Signal 3. Die Interaktion der Zytokine mit den entsprechenden Rezeptoren der Zielzellen führt zur Zellproliferation (12).

Abbildung 1.6. zeigt eine Übersicht über das Signal Modell der Immunaktivierung.

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Abbildung 1.6.: Darstellung des 3-Signal Modells der Immunaktivierung im Rahmen der Transplantatabstoßung nach Strom. Inhibition der Signalwege durch Medikamente zur Verhinderung einer Abstoßung (12).

1.3. Beeinflussung des 3-Signal Modells durch eine immunsuppressive Therapie

Durch eine immunsuppressive Therapie werden verschiedene Abläufe in der Immunaktivierung beeinflusst. So hemmen Steroide die Gentranskription in Makrophagen und T-Lymphozyten. Hierdurch wird die Antigenpräsentation und Proliferation der Lymphozyten gestört. Ciclosporin A und Tacrolimus hemmen die Proliferation von CD4+ Lymphozyten mit anschließender Apoptose. Nachfolgend werden die CD4 - vermittelte Aktivierung von B-Lymphozyten und die Proliferation von CD8-Lymphozyten gestört. Als Purinantagonist hemmt Mycophenolat-Mofetil (MMF) zwei Enzyme der Purinsynthese, wodurch es zu einer selektiven Hemmung der lymphozytären Reaktion kommt. Weiter werden B-Zell Proliferation, Antikörperbildung, sowie die Entstehung zytotoxischer T-Lymphozyten nach Stimulation reduziert. Sirolimus und Everolimus stören die intrazelluläre Signalübertragung von Interleukin-2 und anderen T-Zell Wachstumsfaktoren. Sirolimus blockiert ebenfalls direkt den kostimulatorischen Weg der B7-CD28/CTLA-4 Interaktion. Durch die Gabe eines monoklonalen Antikörper (OKT3) erfolgen eine

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Depletion von T-Zellen sowie eine Modifikation des T-Zellrezeptorkomplexes. Die Verabreichung von Basiliximab oder Daclizumab führen zu einer Blockierung des IL-2 Rezeptors (Interleukin-2) und inhibieren so über mehrere Wochen die T-Zell Aktivierung (2).

1.4. Single Nucleotide Polymorphisms (SNP´s)

Ein menschliches Gen wird durch Exone und Introne codiert, die in koordinierter Abfolge die Proteingenerierung steuern. Im menschlichen Genom kommt es in verschiedenen Häufigkeiten zu dem Austausch eines Nukleotids, in Form eines Single Nucleotide Polymorphism.

Ein Polymorphismus führt nicht immer zur Änderung der Proteinsequenz oder -faltung, da die einzelnen Aminosäuren durch mehrere Kombinationen von 3-Nukleotid- Basenpaaren verschlüsselt werden. Kommt es durch den Austausch eines Nukleotids jedoch zur Codierung einer anderen Aminosäure, kann die Änderung der Protein- Sequenz zur Veränderung der Faltstruktur des Proteins führen. Im Falle von Rezeptoren kann sich daraus durch veränderte Rezeptoraffinität eine Änderung der in vivo Funktion ergeben, wenn das aktive Zentrum des Rezeptors betroffen ist. Damit kann die Reaktion des Rezeptors auf biologische Signale verändert, eingeschränkt oder erhöht sein. Die Auffindung solcher Polymorphismen durch die Genkartierung zeigt, dass innerhalb des menschlichen Organismus Polymorphismen mit einer Häufigkeit von ca. 1:100 Basenpaaren auftreten. (11)

In den vergangenen Jahren wurde das Interesse an Single Nucleotide Polymorphismen (SNPs) aufgrund ihrer möglichen Verbindung mit Autoimmunerkrankungen (17) (18) stetig größer. Studien berichteten von SNPs, die in den Zytokin Genen ein höheres Risiko für eine akute Abstoßung und eine chronische Dysfunktion des Transplantates signalisieren können (19).

1.5. CTLA-4 - Schlüsselmolekül in der Immunantwort

Das Cytotoxic T-Lymphocyte Associated Gene 4 (CD152, CTLA-4) ist ein costimulatorisches Gen, welches einen Rezeptor für das costimulatorische Molekül B7

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codiert, der die Gen-Aktivierung in T-Zellen nach Antigenkontakt durch B7-CD28 terminiert und zur Regulation der initialen Immunantwort auf das Transplantat beiträgt.

Es nimmt damit eine zentrale Bedeutung in der Regulation der Immunaktivierung nach Transplantation mittels Antigen-Kontakt, Costimulation und Zytokin-Unterstützung ein.

Es ist bisher nicht genau geklärt, warum in einem Fall die T-Zellen das B7 einer APC mit dem Rezeptor CD28 erkennen und eine Immunreaktion einleiten und im anderen Fall die gleichen B7 Moleküle mit dem Rezeptor CTLA-4 interagieren, um schließlich eine Akzeptanz zu induzieren. Es wird angenommen, dass geringe Konzentrationen von B7 auf APCs den CTLA-4 Rezeptor bevorzugen, weil CTLA-4 die B7 Moleküle mit einer 20mal höheren Affinität bindet, als CD28 (20) (21). Zudem induziert die Aktivität von CTLA-4 und die Expression von CD28 die Down-Regulation von CD28, ein selbstlimitierender Faktor, der zu einer erhöhten Interaktion zwischen B7 und CTLA-4 führt (11) (22) (23).

Veränderungen der Bindekapazität des CTLA-4 haben damit im Rahmen eines labilen Gleichgewichtes deutliche Effekte auf die CD28 vs. CTLA-4 Bindung der B7- Moleküle.

Das humane CTLA-4 Gen zeigt genetische Polymorphismen, die die immunologische Aktivität bei Autoimmunerkrankungen signifikant beeinflussen und zu einer stärkeren oder schwächeren Ausprägung der regulatorischen CTLA-4 Funktion beitragen (17, 24, 25).

1.5.1. Rolle von CTLA-4 bei der Immunantwort

Die Antigenpräsentation, die durch die Bindung des Antigens, gebunden an den MHC- Rezeptor mit dem T-Zell Rezeptor, zustande kommt, reicht alleine zu einer Aktivierung der T-Zelle nicht aus.

Es muss zusätzlich der Kontakt zwischen dem B7 Protein mit dem CD28 und dem CD40 mit dem CD40L stattfinden. Erst durch die Summe der costimulatorischen Moleküle wird die T-Zell Aktivierung und Proliferation eingeleitet. Die T-Zelle startet die Produktion von weiteren T-Zell Wachstumsfaktoren.

Das CTLA-4 besitzt die gleiche Struktur wie CD28 und wird von CD4+ und CD8+ T- Zellen nach Aktivierung exprimiert (26).

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CTLA-4 Immunglobuline blockieren das B7 Protein, so dass es nicht zu einer Interaktion zwischen B7 und CD28 kommen kann. In Tierexperimenten wurde durch die Gabe von CTLA-4 Immunglobulinen eine protektive Wirkung für die Entwicklung einer autoimmunen Enzephalomyelitis nachgewiesen (27). Eine kombinierte Gabe von CTLA-4 Immunglobulinen und zusätzlich anti-CD40L monoklonalen Antikörpern verhinderte sicher und anhaltend eine Posttransplantations-Vaskulopathie bei Mäusen (28). In weiteren Tierversuchen führte die Blockade von B7 durch CTLA-4-Fc allein oder in Kombination mit CD40-CD40L zur Toleranzinduktion (29) (30).

Durch die Blockierung der 2 Untereinheiten des B7 (B7-1 (CD 80) und das B7-2 (CD 86)) durch CTLA-4 Immunglobuline ist eine Immunreaktion in vivo zu inhibieren.

Diese blockieren den CD28/CTLA-4 – CD80/CD86 Signalweg und induzieren somit eine Transplantattoleranz in einem vaskularisierten Allograft (31). Für eine langfristige Transplantattoleranz wird ein negatives T-Zell Signal, vermittelt durch den CTLA-4 Rezeptor, benötigt (32).

1.5.2. CTLA-4 im Mausmodell

Aufschlüsse über die Bedeutung von CTLA-4 konnten durch vielfältige ex vivo und in vivo Versuche gewonnen werden. Ein direkter Nachweis für die Funktion von CTLA-4 in der Akzeptanz von körpereigenen Zellen zeigte sich im Tierversuch mit CTLA-4 Gen defizienten Mäusen. Hier fanden sich unkontrollierte Lymphozyten-Aktivierungen, mit vergrößerter Milz und vergrößerten Lymphknoten und schließlich mit fatalen Lymphozyteninfiltrationen in multiplen Organen (33) (34).

1.5.3. Relevanz von Single Nucleotide Polymorphisms im CTLA-4 Gen bei Autoimmunerkrankungen

Bei verschiedenen Krankheiten werden autoimmunologische Pathogenesen diskutiert.

Nachfolgend sollen einige von diesen dargestellt und die Relevanz des CTLA-4 Rezeptors in der Pathogenese erläutert werden. Im fortlaufenden Text werden die SNP´s

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mit Nummern versehen, eine Auflistung findet sich in der Tabelle am Ende des Kapitels 1.5.3.

Der IDDM (Insulin Dependent Diabetes Mellitus, Diabetes mellitus Typ I), welcher durch eine körpereigene Zerstörung der Inselzellen des Pankreas pathogenetisch in Erscheinung tritt, wurde in mehreren Studien in Bezug auf die unterschiedlichen Genotypen des CTLA-4 untersucht. Bouqbis et al. zeigten einen direkten Zusammenhang zwischen dem IDDM und verschiedenen Polymorphismen (SNP´s 1. 2.

3. 4.) in einer Population von Marokkanern (35). Laut Klitz et al. wiesen Philippinos eine erhöhte Korrelation zum GG- Genotyp im 1. SNP auf (36). Eine italienische Studie berichtete von einem weniger häufigen Auftreten eines LADA (latent autoimmune diabetes in adults) beim AA-Genotyp und häufiger beim G/A-Genotyp (1. SNP) (37).

Eine weitere Studie unterstellte dem G-Allel (1. SNP) eine erhöhte Prädisposition zum IDDM, beeinflusst durch einen bestimmten Typ eines Vitamin D Rezeptors (38).

Weitere Studien aus anderen Populationen unterstrichen den Zusammenhang des G- Allels (Alanin/Alanin) mit dem erhöhten Auftreten des IDDM (39) (40).

Fajardy et al. (41) berichteten über einen modulierenden Effekt bei der genetischen Ausprägung eines IDDM beim CTLA-4 SNP (1.). Der GG-Genotyp zeigte eine höhere Frequenz bei der Entwicklung eines IDDM, allerdings fand sich kein signifikanter Zusammenhang. Ebenfalls fanden Mochizuki et al. (25) und auch Cinek et al. (42) keinen Unterschied in der Genotyp und Allel Frequenz zwischen der diabetischen Patienten- und der Kontrollgruppe.

Genetische Daten von Populationen ließen eine Beziehung zur Autoimmunthyreoiditis (Hashimoto Thyreoiditis / Morbus Basedow) vermuten (19). Das G- Allel (1.) stand für ein signifikant höheres Risiko an einer solchen zu erkranken (24) (25) und prädisponierte zum Morbus Basedow (17). Die SNP´s in den Exonen 1 und 4 (1. und 6.) führten somit zu einer erhöhten Frequenz von Morbus Basedow, der SNP 4 zeigte allerdings keine Korrelation (43). Weiterführende Studien zeigten, dass der GG- Genotyp eine wichtige Rolle in der Entwicklung von Schilddrüsen Antikörpern einnimmt. So besaßen GG-Individuen erhöhte Werte für Antikörper gegen Thyroideaperoxidase und Thyreoglobulin (44). In einer Studie zeigte eine japanische Patientengruppe mit der Basedowschen Krankheit eine erhöhte Anzahl von G-Allel Trägern, im Gegensatz zu einer Vergleichsgruppe Gesunder. In der Studie wurden die Patienten in Gruppen aufgeteilt, abhängig von der Dauer der thyreostatischen Therapie,

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bis zum Verschwinden der TSH Rezeptor Antikörper. So zeigte sich, dass die GG- Genotypen eine deutlich längere Therapiedauer benötigen und die Zeit zur Remission bei den AA-Genotypen deutlich kürzer war (45).

Bei der Entwicklung der systemischen Sklerose (sSk) wird ein autoimmunologischer Prozess angenommen, da eine T-Zell Sensibilisierung gegen Kollagen und antinukleäre Antikörper gegen Zentromere und Topoisomerase-I nachgewiesen werden konnten. In diesem Zusammenhang untersuchten Hudson et al. (18) eine Gruppe Afroamerikaner und eine kaukasische Patientengruppe mit sSk auf die SNP 1. 2. 3. und 4. Als Ergebnis zeigte sich eine erhöhte AG-Genotyp Frequenz in der Gruppe der Afroamerikaner mit sSk für SNP 1 und eine erniedrigte Häufigkeit von erkrankten AA-Genotypen. Andere Assoziationen im kaukasischen Patientenkollektiv oder auch in den anderen CTLA-4 Genotypen wurden nicht gefunden.

Erkenntnisse zur Multiplen Sklerosis zeigten keinen Zusammenhang zum CTLA-4 Gen, weder dem Auftreten, der Häufigkeit; noch dem Verlauf der Krankheit (46) (47), welche anfänglichen Vermutungen von Maurer et al. (48) entgegenstehen.

Eine Studie aus Taiwan an 186 Patienten mit Rheumatoider Arthritis (RA) zeigte eine hohe Frequenz von GG-Allel Trägern unter den Erkrankten, (49) wobei GA und AA Genotypen einen protektiven Charakter besaßen. Andere Studien zeigten keinen Zusammenhang von RA zu den verschiedenen SNP´s. (50)

In den USA wurde das CTLA-4 Gen in Zusammenhang mit dem systemischen Lupus Erythematodes untersucht, und es wurde eine erhöhte Prädisposition bei Patienten mit dem Genotyp T/T für diese Erkrankung gefunden (2.) (51).

Eine Studie aus Italien proklamierte 2003 einen Zusammenhang zwischen dem CTLA-4 Gen und der Zöliakie. (52) Zuvor berichteten King et al. (53) von gleich verteilten Single Nucleotide Polymorphismen 1. und 4. bei den Zöliakie-Trägern in einer englischen Population. Ein möglicher Mechanismus bei der T-Zell gesteuerten Zerstörung der Dünndarmzotten durch Zöliakie könnte eine erniedrigte lösliche Isoform des CTLA-4 sein (54), laut van Belzen et al. würde diese Tatsache eine Rolle von CTLA-4 bei der Zöliakie unterstützen.

In Studien wurde der CTLA-4 Gen Ort immer wieder unter dem Aspekt der einzelnen Verteilung der Genotypen betrachtet. Nach Giscombe et al. fanden sich im CTLA-4

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Gen Risikofaktoren für die Wegenersche Granulomatose (55), der CTLA-4 Genotyp beeinflusst nach Yee et al. ebenfalls die Reaktion auf eine Interferon Therapie bei der Hepatitis C Infektion (56), und auch bei der Akuten Myeloischen Leukämie (AML) scheint er eine Rolle zu spielen (57). In einer Gruppe von lebertransplantierten Patienten konnte für den Genotyp CTLA-4 +49 GG eine geringere Reinfektionsrate von Hepatitis B beobachtet werden (58).

Verschiedene Polymorphismen im CTLA-4 Gen, deren Rolle bei autoimmunologischen Vorgängen in den o.g. Studien diskutiert wurden (verfolge auch Abbildung 1.6.) sind nachfolgend dargestellt (35) (51) (59).

1. Exon 1 Position 49 A/G (Thr/Ala) 2. SNP promoter region –1722 3. SNP promoter region –1661 4. SNP promoter region –318 5. codon 17 dimorphism

6. (AT)n microsatellite marker in the 3' untranslated region of exon 4 7. SNP –308 C/T

8. SNP –658 C/T

Abbildung 1.7. gibt einen Überblick über die 10 wichtigsten von insgesamt 42 SNP´s im CTLA-4 Gen. Weitere Informationen unter Genecards:

http://www.genecards.org

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Abbildung 1.7..: Übersicht über die 10 wichtigsten Single Nucleotide Polymorphisms im CTLA-4 Gen (60).

1.5.4. CTLA-4 in älteren Patienten

In einer Stichprobe gesunder Probanden fanden sich durchschnittlich höhere CTLA-4 Spiegel bei älteren Menschen, als bei jüngeren (61). Dies könnte eine Maturation der immunologischen Antwort zeigen und eine geringere Abstoßungstendenz im Alter erklären (62). Kusztal et al. zeigten in ihrer Studie eine verminderte Expression von CD28 und eine erhöhte Expression von CTLA-4 im Alter (63).

1.6. Steroide bei transplantierten Kindern

Bislang ist die Gabe von Steroiden in der Posttransplantationsmedizin übliche Praxis (2), insbesondere bei akuten Abstoßungen gelten Steroide weiter als Goldstandard (2).

Allerdings verursachen Steroide gerade bei dem pädiatrischen Patientenkollektiv ernste Nebenwirkungen. Sie induzieren eine erhöhte Infektanfälligkeit und beeinflussen besonders bei Kindern die weitere körperliche und geistige Entwicklung. Bei organtransplantierten jungen Patienten ist das Wachstum ohnehin ein Problem und die Gabe von Steroiden in hohen Dosierungen wirken zusätzlich wachstumshemmend.

Darum ist man um möglichst niedrige Dosierungen bemüht, doch konkurrieren hier

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zwei Grundsätze, zum einen eine möglichst geringe Steroidmedikation, um die Nebenwirkungen gering zu halten und zum anderen eine ausreichende Immunsuppression, um den Verlust des Organs zu vermeiden. Eine Prädiktion im Vorfeld der Transplantation und so eine Separierung von High/Low Respondern, könnten viele Nebenwirkungen einsparen.

1.7. CTLA-4 in Exon 1 an Position 49 (A/G)

Studien zu CTLA-4 Polymorphismen in der Transplantation nehmen keine Stellung zur möglichen Prädiktion und der Erfordernis einer Steroidmedikation. Steroidreduktion und komplett steroidfreie Immunsuppression erfolgen ausschließlich auf empirischer Basis.

In der Organtransplantation wird für eine Minimierung von Abstoßung und Infektionsepisoden eine suffiziente Immunsuppression benötigt. Daraus folgt die Notwendigkeit von individuellen Dosen einer immunsuppressiven Medikation. Gäbe es einen quantitativ und qualitativ prädiktiven Indikator, der eine Abstoßungsreaktion in ihrer Art und Stärke voraussagte, so wäre es nicht nur möglich, die immunsuppressive Einstellung daran anzupassen, sondern auch therapeutisch frühzeitig auf eine Abstoßung zu reagieren.

Die hier vorgelegte Untersuchung ist die erste dieser Art mit definiertem pädiatrischen Krankengut zur Frage der Steuerung des Steroidentzugs.

Für unsere Studie wählten wir den Single Nucleotide Polymorphismus im CTLA-4 Gen in Exon 1 Position 49 (A/G Thr/Ala), der in Studien in Zusammenhang mit verschiedenen autoimmunologischen Erkrankungen gebracht wird (s.o.).

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2. Fragestellung:

1. Gibt es einen Zusammenhang zwischen dem CTLA-4 single-strand Polymorphismus A/G (Thr/Ala) an Position 49 in Exon 1 und dem klinischen Verlauf nach Transplantation? Kann einem bestimmten Genotyp eine höhere bzw. eine geringere Wahrscheinlichkeit akuter Abstoßungen zugeordnet werden?

2. Kann die potentielle Möglichkeit einer steroidfreien Medikation anhand des CTLA-4 Polymorphismus erkannt werden?

3. Gibt es geschlechtsspezifische Unterschiede in der Häufigkeit der akuten Abstoßungsepisoden zwischen den einzelnen Genotypen?

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3. Material und Methoden

3.1. Patienten

Es standen die klinischen Daten von nachuntersuchten nierentransplantierten Kindern des Klinikums Schwabing der technischen Universität München zur Verfügung, die konsequent einem Steroidentzug zugeführt wurden und – wenn diese Behandlung sich empirisch als sicher und effektiv gezeigt hatte – diese Therapieform dauerhaft behalten haben. Die Abstoßungshäufigkeiten und Nierenfunktionsdaten wurden mit dem CTLA- 4 49 A/G Polymorphismus korreliert.

Die Auswertung erfolgte für insgesamt 89 im Ablauf verfolgte Nierentransplantationen bei 83 Kindern. Die Beobachtungsdauer nach Transplantation betrug 12 Monate - 21

2/12 Jahre für Mädchen und 1 ⁷/12 Jahre - 22 ⁵/12 Jahre für Jungen. Das jüngste transplantierte Kind war zum Zeitpunkt der Transplantation 1 ⁸/12 Jahre, der älteste Patient war 20 ⁶/12 Jahre alt.

Vier Verläufe mussten wegen fehlender Daten / technischer Probleme / Tod aus der Studie ausgeschlossen werden.

Insgesamt sind damit 85 Patientenverläufe auswertbar.

Die Altersverteilung ist in Abbildung 3.1. dargestellt. Insgesamt befanden sich 78,8%

unserer Patienten in der Altersklasse von 6-18 Jahren. Lediglich 12,9 % der Patienten waren bei Transplantation unter 6 Jahre und 8,2 % über 18 Jahre alt.

Hinsichtlich des Geschlechtes zeigten sich Unterschiede in der Gruppe der 6-12- jährigen Patienten, in der 44,1 % männlich und 55,9 % der Probanden weiblich waren.

In der Altersgruppe 12-18 Jahre fanden sich 36,4 % männliche und 63,6 % weibliche Patienten.

Altersgruppe 0 – 6 Jahre: 11 Patienten ♀ : 5 ♂ : 6 Altersgruppe 6 – 12 Jahre: 34 Patienten ♀ : 15 ♂ : 19 Altersgruppe 12 – 18 Jahre: 33 Patienten ♀ : 12 ♂ : 21 Altersgruppe 18 – 20 Jahre: 7 Patienten ♀ : 3 ♂ : 4

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3. Material und Methoden

Altersverteilung der Patienten

12

38 42

8 14

43

34

9

0 10 20 30 40 50 60

0 - 6 6 - 12 12 - 18 18 - 20

Alter der Patienten in Jahren Geschlechterverteilung in %

♂

♀

Abbildung 3.1.: Alters- und geschlechtsspezifische Verteilung der transplantierten Patienten

3.2. Probenentnahme

In München wurde den Patienten 2-3 ml Vollblut entnommen und mit EDTA vermischt. Da es sich um nicht veränderliche genetische Information handelte, war nur eine Blutentnahme erforderlich. Für alle Patienten lag eine Einwilligung vor. Das Blut wurde ungekühlt über den Postweg in die Medizinische Hochschule nach Hannover versandt.

3.3. DNA Isolierung

Aus EDTA Blut wurde genomische DNA isoliert. Die Extraktion wurde mittels QI Aamp ® DNA Mini Kit von QIAGEN nach Herstellerangaben durchgeführt:

Schema:

1. 20 l Protease in ein silikonisiertes 1,7ml Tube pipettieren 2. 200 l Blut dazugeben

3. 200 l AL-Puffer -> 15 sec. vortexen 4. 10 Minuten bei 56 °Celsius inkubieren

5. 200 l 100% Ethanol dazugeben -> 15 sec. vortexen

(23)

6. Die angesetzte Mixtur in eine QI Amp Säule geben und bei 8000U/min 1 Minute zentrifugieren

7. 500 l AW1 Puffer auf die Säule geben -> bei 8000U/min 1 Minute zentrifugieren

8. Säule in ein neues 2 ml Tube umsetzen; 500 l AW2 Puffer auf die Säule geben und bei 14000U/min 3 Minuten zentrifugieren

9. Säule auf ein 1,5ml Tube setzen; 200 l AE Puffer oder Wasser auf die Säule pipettieren und 1 Minute bei Rautemperatur inkubieren, danach bei 8000U/min zentrifugieren

(AL-Puffer und AW1/2 Puffer von OIAamp Blood & Tissue Test Kit (10) Cat.

No. 29990)

Bei einem Materialeinsatz von 200 l Blut wurden durch diese Methodik aus einer Säule ca. 2-20 g DNA gewonnen. Die UV-Spektrometrie ergab eine Reinheit von 1,6- 1,9 im Vergleich 260/280 nm. Mit diesem Verfahren sind ca. 200 PCR Reaktionen pro Patient möglich bei einem DNA-Einsatz von 1 l (10-100ng DNA) pro einzelner PCR.

Es wurden zur Bestimmung des Polymorphismus eine nichtquantitative Multiplex PCR mit Mastermix-Enzym und farbcodierter SNP-Taqman PCR entwickelt.

3.4. CTLA-4 in Exon 1

Nachfolgend sind jeweils der Wildtyp und die Mutante des CTLA-4 Gen in Exon 1 dargestellt. Der Polymorphismus A/G (Thr/Ala) an Position 49 ist jeweils markiert.

Wildtyp:

atg gct tgc ctt gga ttt cag cgg cac aag gct cag ctg aac ctg gct acc agg acc tgg ccc tgc act ctc ctg ttt ttt ctt ctc ttc atc cct gtc ttc tgc aaa g

Mutante:

atg gct tgc ctt gga ttt cag cgg cac aag gct cag ctg aac ctg gct gcc agg acc tgg ccc tgc act ctc ctg ttt ttt ctt ctc ttc atc cct gtc ttc tgc aaa a

(24)

3.5. PCR – Methodik

Die Polymerase Ketten Reaktion (PCR) ist eine außerordentlich empfindliche und bei exakter Primer-Position auch spezifische Technik, um gezielt Desoxyribonukleinsäure- (DNA-) Abschnitte zu vervielfältigen.

Um den gewünschten DNA-Strang gezielt an einer Position mit Hilfe einer PCR amplifizieren zu können, benötigt man als Starthilfe Oligonukleotidprimer (i.d.R. 16- 30bp Nucleotidfragmente), sogenannte Amplimere (lat. amplificare = erweitern). Dabei handelt es sich um kurze, einzelsträngige DNA-Moleküle, die komplementär zu den Enden der definierten Sequenz der DNA-Matrize (Template) sind.

Bei der PCR wird die Vervielfältigung der DNA-Segmente durch eine vielfache Abfolge von Denaturierung der Template DNA durch Erhitzung, Anlagerung der Oligonukleotid-Primer an die Template DNA bei optimaler Temperatur (Annealing) und Verdoppelung des DNA-Stranges mittels Taq-DNA-Polymerase (ein Enzym aus dem Bakterium Thermus aquaticus, Amplification) erreicht.

Programm für die PCR:

1. Denaturierung 94 °C für 1:00 Minute 2. Denaturierung 94 °C für 15 Sekunden 3. Anlagerung 55 °C für 15 Sekunden 4. Verdopplung 72 °C für 30 Sekunden 5. Insgesamt 38 Zyklen: Schritt 2 bis 4 6. 72 °C für 7 Minuten

7. Abkühlung auf 4 °C für 6 Stunden

(25)

3.6. Primer Auswahl

Primerlänge:

In der Regel sind die Primer für die PCR bis zu 30 Nucleotide lang, die Spezifität nimmt mit weiterer Länge zu, da aber rein statistisch die vorgegebene Sequenz seltener auftritt und längere DNA-Fragmente aneinander (Self-Dimer) und untereinander (Primer-Dimer) binden, sind selten längere Fragmente sinnvoll.

Lange Primer machen die Amplifikation spezifisch, kurze Primer empfindlich, führen aber leichter zur unerwünschten Mitamplifikation von ähnlichen Sequenzen. Die angewendeten Längen von 18-24 Nucleotiden sind ein Kompromiss zwischen diesen Zielen.

Basenhäufigkeit und Temperatur:

Durch die dreifach Bindung der C- und G-Nucleotide trennen sich die C-G- Verbindungen schwerer als die T-A-Bindungen. Je höher der C-G-Anteil an den Nucleotiden des Primers ist, desto fester ist die Primer-cDNA Bindung und damit wird mehr Energie benötigt, diese Bindung zur Amplifikation zur lösen. Die dadurch gewonnene Spezifität geht zu Lasten der Amplifikationsgeschwindigkeit und damit der Ausbeute an DNA. In der Regel werden Sequenzen mit einem C-G-Anteil von 60% und einem Meltingpoint (=Trennung von Primer und cDNA) von 55 °Celsius gewählt.

Entscheidend für die PCR-Ausbeute ist die Einhaltung des gemeinsamen Melting-Points für sense- und antisense-Primer, was durch eine computergestützte Berechnung gewährleistet wird.

DNA-Ausbeute:

Das verwendete Enzym „Taq-Polymerase“ verarbeitet pro Sekunde 20-25 Oligonucleotide. Lange Sequenzen von ca. 700 bp werden damit langsamer verarbeitet, als kurze Sequenzen von ca. 200 bp und zeigen weniger Ausbeute, bzw. benötigen mehr Zyklen oder längere Zykluszeiten. Mit der Zahl und der Zeit der Zyklen wächst das Risiko der Amplifikation von Verunreinigungen und das Erreichen der Plateau-Phase der PCR-Reaktion durch Enzym- und Substratverbrauch sowie Hitzeinaktivierung. Die Auswahl der amplifizierten cDNA-Stücke von ca. 400-500 bp stellt einen Kompromiss zwischen Empfindlichkeit und Spezifität der Reaktion dar.

(26)

Primer-Primer-Interaktionen:

In den Primern sollten Bereiche mit ungewöhnlichen Sequenzabschnitten aus Polypurin, Polypyrimidin oder sich wiederholenden Motiven ebenso vermieden werden wie Bereiche mit ausgeprägter Sekundärstruktur. Die Primerpaare sollten so beschaffen sein, dass die Sequenzen an ihren 3´-Enden weder inter- noch intramolekular komplementär sind. Interaktionen sind Sequenz- und Temperaturabhängig und können speziell in der Anfangsphase der PCR-Reaktion mit bis zu 1:10⁶-fachem Primerüberschuss zu erheblichen Beeinträchtigungen bis hin zum Stillstand der Reaktion führen.

Im Einzelnen sind zu beachten:

Haarnadelbildung: Bindung des distalen Primerendes an ein mittiges oder proximales Stück (max. 3 Nucleotide). Bei Haarenadelbildung am 3´-Ende mit hoher Temperaturkonstante erfolgt keine oder nur eine eingeschränkte Bindung an das Substrat.

Primer-Dimere: Komplementäre Bindung eines Primers an sich selbst oder sein Gegenstück (sense-sense, sense-antisense, antisense-antisense). Bei langen komplementären Sequenzen mit hohem C-G-Anteil kommt es zur Blockade der Reaktion.

Die Auswahl der Primer-Paare für das Gen ist damit sehr limitiert, per Augensichtung kaum möglich und fehleranfällig. Im vorliegenden Fall wurden die Primer daher mittels Computerhilfe entsprechend Qualitätsstandards des NIH ausgewählt (DNA-Star und Primer Express).

3.7. Qualitative PCR:

Für die Identifikation des Single Nucleotide Polymorphism wurde eine nicht quantitative PCR erstellt. Im Anschluss wurde das PCR-Fragment durch eine Gel- Elektrophorese von anderen Bestandteilen getrennt. Nach der Gewinnung des PCR- Fragmentes aus dem Agarose Gel folgte eine DNA-Verdauung mit einem sequenzspezifischen Restriktionsenzym (Enzyme für die Restriktionsanalyse: HAE III und SAU 96 I).

(27)

Der Master-Mix für die Multiplex PCR:

d-NTP 2,5 µmol 4 µl

MgCl2 25 mmol 2 µl

Puffer 10x 5 µl

Taq-Polymerase 0,5U 0,3 µl Sense-Primer 100ng 1 µl

Anti-Sense Primer 100ng 1 µl

H20 34,7 µl

48 µl je Probenreaktion

Benutzte Primer für die qualitative PCR:

Name: IKBA-S Länge: 22 bp

Sequence (5´ to 3´): CGC CCA AGC ACC CGG ATA CAG C

Name: IKRA-AS Länge: 24 bp

Sequence (5´ to 3´): TGG GGT CAG TCA CTC GAA GCA CAA Produktlänge: 503 bp

---

Name: Primer1-AS Länge: 20 bp

Sequence (5´ to 3´): GTA CAC CAT TTA CAG GAG GG Produktlänge: 609 bp

---

(28)

Name: Upper- S Länge: 24 bp

Sequence (5´ to 3´): GGG CCA GCT GAC ACT AGA AAA CCT

Name: Lower-AS Länge: 24 bp

Sequence (5´ to 3´): GTC AGT CAC TCG AAG CAC AAT AAA Produktlänge: 470 bp

Jedoch differierten die erwarteten Fragmentgrößen nach dem Verdau, so dass eine spezifische Zuordnung nicht möglich war. Wir wechselten die Primer, jedoch ließen sich durch den Verdau nicht die dazugehörigen DNA-Fragmente darstellen. Deshalb fertigten wir einen zweiten methodischen Ansatz und bedienten uns einer quantitativen Multiplex-PCR.

3.8. Real Time Taq-Man ^TM PCR- Methodik

In einem zweiten Ansatz wurde eine Multiplex-PCR mittels Taqman-Sonden etabliert, bei denen ein unterschiedlicher Fluoreszenz-Farbstoff an die letzten Nuleotide G bzw. C der sonst identischen Sonde platziert wurde. Hierbei wird bei optimaler Trennschärfe der Sondenbindung beim homozygoten Genotyp des CTLA-4 ein Farbstoff, beim heterozygoten Genotyp beide Farbstoffe im Rahmen der Amplifikation freigesetzt.

Programm für die Taq-Man PCR:

1. Anlagerung : 60 °C für 2 Minuten 2. Denaturierung: 95 °C für 10 Minuten 3. Denaturierung: 95 °C für 15 Sekunden 4. Verdopplung: 65 °C für 1 Minute

Wiederholung Schritt 3 – 4 in insgesamt 45 Zyklen.

(29)

Benutzte Primer für die Taq-Man-PCR:

Primer 1: Forward , CTLA-4-S, Länge: 18 bp

Sequence (5´ to 3´): TTC AGC GGC ACA AGG CTC

Primer 2: Backward, CTLA-4-AS, Länge: 24 bp

Sequence (5´ to 3´): GCA GAA GAC AGG GAT GAA GAG AAG

Produktlänge: 89 bp

Sonde 1: Sequence (5´ to 3´): CTG AAC CTG GCT ACC AGG ACC TGG A FAM codiert

Sonde 2 : Sequence (5´ to 3´): CTG AAC CTG GCT GCC AGG ACC T G BoTMR codiert

Die Primerlänge und – lokalisation wurde bewusst mit hohem GC-Nukleotidanteil und damit hoher Hybridisierungstemperatur und innerhalb eines DNA-Segmentes von nur 100 bp gewählt, um eine möglichst spezifische und effektive Amplifikation zu gewährleisten. In der Real Time TaqMan PCR muss berücksichtigt werden, dass die TaqMan^TM Sonde stabil etwa 5°C oberhalb der optimalen Primertemperatur hybridisiert.

Gerät: ABI PRISM 7700 Sequence Detector

Reaktionsbedingungen: Grundsätzlich gelten für die Auswahl der Sonden und der Primer in der TaqMan PCR ähnliche bzw. gleiche Kriterien wie für die von Primern der qualitativen Multiplex PCR, da beide eine möglichst stabile Bindung an die DNA- Matrize gewährleisten sollen und die Reaktionsbedingungen der quantitativen PCR

(30)

gleichzusetzen sind. Prinzipiell ist die Sondenbindung wichtiger als die Primerbindung, damit keine PCR-Reaktion ohne fluorogenes Signal ablaufen kann.

Übliche Primerkonzentrationen in der TaqMan PCR liegen bei 0,2 bis 0,5 M. Durch Optimierung im Rahmen einer Matrix durch Austesten der Primer im Bereich von 0,05 bis 0,9 M mit unterschiedlichen Primermengen wurde die optimale Konzentration ermittelt (sog. asymmetrische PCR).

Die hinreichende Signalgebung hängt von der Menge der zu Beginn der PCR eingesetzten Matrizenmoleküle ab. Etwa 10.000 Startkopien und 25-30 Zyklen sind für den Beginn einer Optimierung ausreichend. In unserem Fall werden in 0,1 µl Template 1-10 ng Human-DNA in hinreichender DNA-Menge eingesetzt.

3.9. Besonderheiten der Allel spezifischen Taq-Man PCR

Aufgrund der Multiplexfähigkeit im Sonden-Design können mit Hilfe der TaqMan PCR auch Allele mit nur einer Punktmutation unterschieden werden. Die Lage der Taqman- Sonde wird in diesem Fall durch den Single Nucleotide Polymorphism vorgegeben.

Bei der Optimierung eines Allel-spezifischen TaqMan Assays werden unterschiedliche Annealing/Extension Temperaturen verglichen, da bei niedrigen Temperaturen ein höheres Gesamtsignal erwartet wird, jedoch die Gefahr besteht, dass die zwei Allele nicht mehr voneinander zu differenzieren sind. Bei höheren Temperaturen resultiert ein schwächeres Gesamtsignal, wobei die Spezifität verbessert wird. Falls der Polymorphismus in einer der Sonden eine Abnahme des A/G-Gehaltes bewirkt, so empfiehlt es sich, die betroffene Sonde um ein bis zwei Basen zu verlängern, um den niedrigeren Tm dieser Sonde zu kompensieren.

Die Platzierung der Punktmutation innerhalb der Sondensequenz sollte möglichst in der Mitte der Sonde erfolgen, da dort der destabilisierende Effekt einer Fehlpaarbildung am stärksten ist.

(31)

Der Mix für die Taqman PCR:

2x Puffer 12,5 µl Sense-Primer 17,37 µmol 0,43 µl Anti-Sense Primer 12,56 µmol 0,60 µl BOTMR-Sonde 0,56 µl Fam-Sonde 0,65 µl H20 5,26 µl

Probenansatz:

H20 4,9 µl Probe (template) 0,1 µl

Die Spezifität der Reaktion ist bei einem 1-Nuleotid-Unterschied im Rahmen eines Single Nukleotid Polymophism entscheidend für die Qualität der Analyse. Es sollen zweifelsfrei Homozygote des Typ A, Heterozygote des Typ A/G und Homozygote des Typ G für 49 A/G CTLA-4 erkannt werden.

Zu diesem Ziel sind folgende Schritte der Sicherstellung einer spezifizischen Amplifikation eingehalten worden:

- Auswahl der Primer und der farbkodierten Oligonukleotide bei gemeinsam optimierter Annealing Temperatur mittels computergesteuerter Primer Auswahl (Programm Primer Express 1.0 der Firma Applied Biosystems)

- Vermeidung von Primer-Dimer und Hairpin Anlagerungen der Oligonukleotide durch Positionierung und Sequenzüberprüfung (Programm DNAStar)

- Vermeidung der unerwünschten Co-Amplifikation von Isogenen und unbekannten EST-DNA-Sequenzen im Genom über BLAST-Search in der Datenbank des National Center for Biotechnology Information, National Institutes of Health, USA (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gquery/gquery.fcgi)

(32)

- Farbcodierung des SNP an der Position 49 durch Bindung von FAM an A und BoTMR an G als letztes Nukleotid der fluorogenen Sonde.

- Überprüfung der Trennschärfe von Homozygoten und Heterozygoten in der Multiplex-PCR

Abbildung 3.2.: Taq-Man Ansatz Farbstoff FAM

Die Abbildung 3.2. zeigt den Taq-Man Ansatz für den Farbstoff FAM (3-fach Bestimmung), welcher das Allel A repräsentiert. Die obere Kurve ist somit dem homozygoten Genotyp AA zuzuordnen, die mittlere Kurve dem heterozygoten Genotyp AG und die untere Kurve dem homozygoten Genotyp GG.

(33)

Abbildung 3.3.: Taq-Man Ansatz Farbstoff BoTMR

Die Abbildung 3.3. zeigt den zweiten Farbstoff BoTMR (3-fach Bestimmung), welcher das Allel B repräsentiert. Dementsprechend zeigt die obere Kurve den Genotyp GG, die mittlere Kurve den Genotyp AG und die untere Kurve den Genotyp AA.

Die Abbildungen der Amplifikationen zeigen eine optimale Trennschärfe der einzelnen Sondenbindungen und ermöglichen somit sowohl in der BoTMR, als auch in der FAM Bestimmung eine sichere und genaue Trennung von heterozygoten und homozygoten Allelträgern.

(34)

3.10. Geräte

• Eppendorf MasterCycler 5330plus

• Gel Doc 1000 BIO RAD (UV-Kamera)

• Power PAC 300 BIO RAD (Spannungsgerät für Gelelektrophorese)

• ABI PRISM TM 7700 Sequenze Detection Systems (7700 SDS) Perkin-Elmer Corporation Applied Biosystems

• Beckman AllegraTM 21R Centrifuge

• Eppendorf Centrifuge 5415C

• Gene Quant Photometer RNA/DNA Calculator Pharmacia Biotech

• MS 1 Minishaker IKA®

• Epson STYLUS Color 640

• KERN 510 Waage Kern & Sohn GmbH, Albstadt, Germany

• GFL Gesellschaft für Labortechnik –80 °Celsius Gefriertruhe

• Liebherr Comfort –20 °Celsius Gefrierschrank

• Liebherr Economy Kühlschrank

• Moulinex® FM 1510 E Mikrowelle

• GFL Gesellschaft für Labortechnik 1083 Wasserbad

3.11. Hilfsmittel

• MicroAmp® Optical Tubes (Part Number 8010-933) Applied Biosystems Foster City, CA 94404

• MicroAmp® Optical Caps (Part Number 8010-0935) Applied Biosystems Foster City, CA 94404

• MicroAmp® Optical 96-Well Plate (Part Number 8010-0560) Applied Biosystems Foster City, CA 94404

• Cellstar® PP-Röhrchen, steril 15ml Greiner Labortechnik Lot.No 99300196 Cat.No 188.271

• TUBES MICROCENTRIFUGE Polypropylene Volume: 0,65 ml, Graduated SIGMA® CHEMICALS CO. P.o. St.Louis, USA, Lot 10B203281

• TUBES MICROCENTRIFUGE Polypropylene Volume: 1.7ml, Graduated

(35)

SIGMA® CHEMICALS CO. P.o. St.Louis, USA, Lot 10B203406

• Filter tip DNa-RNase free 10E greiner Labortechnik

• Eppendorf Pipette 2,5 l

• Eppendorf Pipette 10 l

• Gelkammer BIO RAD SUB-CELL® GT

• Gelkammer BIO RAD WIDE MINI SUB-CELL® GT

• Labsystems Pipette 0,5 – 10 µl

• Labsystems Pipette 5 – 40 µl

• filter tip 10, 100, 1000 µl greiner labortechnik DNA/RNAse free

• Safeseal-Tips 2,5 µl Biozym Diagnostik GmbH

• pipette tips Sarstedt LOT 0109/1058011, Nümbrecht, Germany

• CELL-STAR® PP-Test tubes, sterile 15ml greiner labortechnik

3.12. Reagentien

• TaqMan® Unisversal PCR Master Mix Part Number 4304437 Lot Number B07654

Applied Biosystems Branchburg, New Jersey, USA

• Aqua ad iniectabilia Braun 100 ml 25/12211273/1100

• AL-Puffer und AW1/2 Puffer von OIAamp Blood & Tissue Test Kit (10) Cat. No.

29990

• AGAROSE, GENETIC TECHNOLOGY GRADE ICN Biomedicals, Inc. Ohio, USA

• ETHIDIUM BROMIDE SIGMA® CHEMICALS St Louis, USA

• Laufpuffer: 1-molarer Tris-Acetat-Puffer

• NuSieve™, FMC Bioproducts

• sample buffer Ansatz: 50mg Bromphenolblau + 25 Saccharose + 0,1ml 0,5%

(36)

EDTA auf 50ml mit H2O auffüllen

• Taq-DNA Polymerase Gibco BRL ®

• Puffer: 10x PCR Buffer von Gibco BRL ®

• Gel-Puffer: Natriumacetat wasserfrei MERCK + Ethylenediamine Tetraacetic ACID Electrophoresis Grade Cat. No. 800683 Lot. No. 71019

• Mineral Oil light white oil, SIGMA Chemicals, St. Louis, USA

• 1 kb Standard DNA ladder Gibco BRL®

• Ampuwa® 1000ml plastipur® Fresenius Kabi Deutschland GmbH (für Taqman)

• dGTP 2´-Desoxyguanosin-5´-triphosphat >98% 100mM Lösung Gibco BRL®

• dATP 2´-Desoxyadenosin-5´-triphosphat >98% 100mM Lösung Gibco BRL®

• dTTP Thymidin-5´-triphosphat >98% 100mM Lösung Gibco BRL®

• dCTP 2´-Desoxycytidin-5´-triphosphat >98% 100mM Lösung Gibco BRL®

3.13. Computer Software

• ABI PRISM TM Sequence Detection Software (Version 1.6)

• Microsoft® Word 2000 (9.0.3821 SR-1)

• Microsoft® Exel 2000 (9.0.3821 SR-1)

• Microsoft® Powerpoint 2000 (9.0.3821 SR-1)

• Primer Express 1.0, Applied Biosystems

• DNA Star

(37)

4. Ergebnisse

Technische Realisation:

Die Technik der TaqMan PCR war bezüglich des CTLA-4 Polymorphismus A/G an Position 49 in Exon 1 mit den genannten Primern und Sonden erfolgreich. Nach einigen Anpassungen der eingesetzten Primerkonzentrationen ließen sich mit Hilfe dieser PCR- Technik die homozygoten AA / GG und die heterozygoten AG Genotypen zweifelsfrei unterscheiden. (siehe TaqMan Abb. 3.2. und 3.3. im Kapitel Material und Methoden).

Die Auswertung am TaqMan ließ keine Zweifel an dem Genotyp der jeweiligen Probe zu. Dennoch wurden mit jeder Probe jeweils ein Ansatz mit dem Farbstoff FAM und ein weiterer Ansatz mit dem Farbstoff BoTMR angelegt und die Ergebnisse miteinander verglichen. Zeigte eine Probe eine hohe Absorption im FAM Ansatz, so wies sie eine niedrige im BoTMR Ansatz auf (AA Genotyp) und umgekehrt. Zeigte sich im FAM Ansatz eine mittlere Absorption, so wies auch der BoTMR Ansatz eine mittlere Absorption auf (heterozygoter Genotyp).

Der Polymorphismus des AA Genotyps wurde bei 32 Kindern, AG bei 38 und GG bei 15 Transplantierten gefunden (Tab. 4.1.).

Allel AA AG GG

Anzahl Patienten

32 38 15

Tabelle 4.1.: Verteilung der Allele

(38)

4. Ergebnisse

4.1. Akute Abstoßungen in den einzelnen Genotypen

Bei 48 Nierentransplantationen wurde keine akute Abstoßung beobachtet, 22 Patienten hatten eine akute Abstoßung, 7 zwei akute Abstoßungen, 6 drei und 2 hatten mehr als drei akute Abstoßungen.

Die Abstoßungen wurden initial mit Steroidpulsbehandlung therapiert, drei Kinder benötigten eine FK Rescue Behandlung. 6 Transplantate gingen durch akute Abstoßungen verloren.

Um die Frage nach einem Zusammenhang zwischen dem CTLA-4 Polymorphismus an Position 49 in Exon 1 und dem klinischen Verlauf nach Transplantation zu beantworten, wurden die Patienten auf 3 Gruppen verteilt (Tab. 4.2.) (Abb. 4.1.):

1. Gruppe: keine Abstoßung 2. Gruppe: 1 Abstoßung 3. Gruppe: >1 Abstoßung.

Aufgrund von Ergebnissen aus anderen Arbeitsgruppen, die das Allel G mit dem erhöhten Auftreten von Autoimmunerkrankungen in Verbindung bringen (39) (24, 40, 45), wurde eine niedrige Immunreaktivität bei dem Allel A im Vergleich zu dem Allel G angenommen.

Keine Abstoßung 1 Abstoßung > 1 Abstoßung

AA 15 10 7

AG 24 8 6

GG 9 4 2

Tabelle 4.2.: Häufigkeit der Abstoßungen in den jeweiligen Genotypen

(39)

47

31

22 63

21 16

60

27

13

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

0 1 >1

Abstoßungen

%

AA AG GG

Abbildung 4.1.: Prozentuale Häufigkeit der akuten Abstoßungen im jeweiligen Genotyp

Die prozentuale Häufigkeit der akuten Abstoßungen in Relation zum CTLA-4 Polymorphismus 49 A/G ist in Abbildung 4.1. dargestellt. Der Anteil der Patienten, die keine Abstoßungsperiode erfuhren, belief sich auf ca. 56,5% (48 von 85 Patienten). Der Genotyp AA trat in der Gruppe ohne Abstoßungen seltener auf, als die Genotypen AG und GG, allerdings zeigte sich keine Signifikanz (Abb. 4.1.). Über alle Abstoßungsgruppen gerechnet, zeigte sich kein signifikanter Verteilungsunterschied der Häufigkeiten zwischen den drei Genotypen (χ²AA = 2,55, df = 2, p = n.s.; χ²AG = 1,92, df

= 2, p = n.s.; χ²GG = 2,47, df = 2, p = n.s.)

Patienten mit höherer Inzidenz akuter Abstoßungen zeigten eine nicht unterschiedliche Verteilung in den AA, AG und GG Genotypen.

(40)

4. Ergebnisse

63% 60%

47%

37% 40%

53%

0 10 20 30 40 50 60 70 80

AA AG GG

%

keine Abstoßungen Abstoßungen

Abbildung 4.2.: Prozentualer Anteil der akuten Abstoßungen je Allel

Im Genotyp AA zeigte sich zwischen den Gruppen „keine Abstoßung“ vs.

„Abstoßungen„ eine nahezu gleiche Verteilung. In den Genotypen AG und GG zeigten sich dagegen häufiger „keine Abstoßungen“ und seltener „Abstoßungen“.

Zwischen den Gruppen mit und ohne Abstoßungen zeigte sich im Genotyp AG ein signifikanter Unterschied der Verteilungshäufigkeiten (p < .05.; Abb. 4.2.). Im Genotyp AG zeigten 63% der Patienten keine Abstoßungsepisoden, 37% waren der Gruppe mit Abstoßungen zuzuordnen.

Im Genotyp GG zeigte sich kein signifikanter Unterschied in den Verteilungshäufigkeiten.

(41)

4.2. Vorhersage eines erfolgreichen Steroidentzugs mittels des CTLA-4 Polymorphismus 49 A/G

Bei 65 Patienten konnte der Steroidentzug für eine Dauer von mindesten 3 Monaten durchgeführt werden, 59 Patienten konnten bis zu einem Jahr ohne Steroide behandelt werden, 50 Kinder im Langzeitverlauf (> 1 Jahr).

Ein erfolgreicher Steroidentzug wurde definiert als ein Verzicht auf Steroide für mehr als 6 Monate.

Insgesamt konnte ein erfolgreicher Steroidentzug bei 24 von insgesamt 32 Patienten mit AA-Allel, bei 24 von insgesamt 38 Patienten mit AG-Allel und bei 12 von insgesamt 15 Patienten mit GG-Allel durchgeführt werden. Dieses ergab folgende prozentuale Verteilung:

Erfolgreicher Steroidentzug

75%

63%

80%

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

AA AG GG

P ro z e n t

Abbildung 4.3.: Prozentualer Anteil eines erfolgreichen Steroidentzugs in bezug auf die jeweiligen Genotypen

(42)

4. Ergebnisse

Im Genotyp AA und AG zeigten sich nahezu gleiche prozentuale Verteilungshäufigkeiten in Bezug auf den erfolgreichen Steroidentzug. Im Genotyp AG zeigte sich mit 63% ein geringerer Anteil an Patienten mit erfolgreichem Steroidentzug.

Aus der Abbildung 4.3. geht kein signifikanter Einfluss der CTLA-4 Allele auf den Erfolg eines Steroidentzuges bei den nierentransplantierten Kindern hervor (χ² = 2,10, df = 2, p = n.s.)

4.3. Geschlechtsspezifische Unterschiede in der Inzidenz akuter Abstoßungen und der Verteilung der A/G Polymorphismen

Abbildung 4.4. zeigt die geschlechterspezifische Verteilung der Genotypen ohne akute Abstoßungsreaktion.

AA-Allel AG-Allel GG-Allel

♂ 9 14 8

♀ 6 10 1

Tabelle 4.3. Geschlechterverteilung in den Allelen ohne akute Abstoßung

(43)

keine Abstoßungen

♂ 89

♂ 60 ♂ 58

♀ 11

♀ 40 ♀ 42

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

AA AG GG

Genotyp

%

♂

♀

Abbildung 4.4.: Geschlechterspezifische Verteilung der Genotypen ohne akute Abstoßungsreaktionen

In der Gruppe der Patienten ohne akute Abstoßungsreaktionen zeigte das männliche Geschlecht in allen 3 Genotypen eine höhere Verteilungshäufigkeit. Im Genotyp GG zeigte sich ein signifikanter Verteilungsunterschied zwischen den Geschlechtern (89 % Männer gegenüber 11 % Frauen; p < .05). In den Genotypen AA und AG konnten keine signifikanten Unterschiede in der geschlechterspezifischen Verteilung gefunden werden (Abb. 4.4.).

♂ 6 3 2

♀ 4 5 2

Tabelle 4.4. Geschlechterverteilung in den Allelen mit einer akuten Abstoßung

(44)

4. Ergebnisse

1 Abstoßung

♂ 50

♂ 38

♂ 60

♀ 50

♀ 62

♀ 40

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

AA AG GG

Genotyp

%

♂

♀

Abbildung. 4.5.: Geschlechterspezifische Verteilung der Genotypen mit einer akuten Abstoßungsreaktion

In den Gruppen der Patienten mit einer akuten Abstoßung (Abb. 4.5.) zeigten sich im Genotyp AA eine höhere Verteilungshäufigkeit im männlichen Geschlecht, im Genotyp AG eine höhere Verteilungshäufigkeit im weiblichen Geschlecht. Diese Verteilungen zeigten allerdings keinen signifikanten Unterschied.

♂ 4 3 1

♀ 3 3 1

Tabelle 4.5. Geschlechterverteilung in den Allelen mit mehr als einer akuten Abstoßungsreaktion

(45)

> 1 Abstoßungen

♂ 50 ♂ 50

♂ 57 ♀ 50 ♀ 50

♀ 43

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

AA AG GG

Genotyp

%

♂

♀

Abbildung. 4.6.: Geschlechterspezifische Verteilung der Genotypen mit mehr als einer akuten Abstoßungsreaktion

In den Gruppen der Patienten mit zwei und mehr akuten Abstoßungen (Abb. 4.6.) zeigten sich innerhalb der Genotypen keine signifikanten Verteilungsunterschiede der Geschlechter.

(46)

5. Diskussion

5.1. Eigene Ergebnisse

Bei der immunologischen Reaktion einer Abstoßung nach Transplantation sind viele verschiedene Signalwege beteiligt. Die vorliegende Studie untersuchte den Einfluss des single-strand Polymorphismus A/G an Position 49 in Exon 1 auf CTLA-4 in 85 nierentransplantierten Kindern.

Bestünde die Möglichkeit, einem Genotyp des CTLA-4 an Position 49 im Exon 1 eine geringere Abstoßungswahrscheinlichkeit oder eine erhöhte Möglichkeit einer erfolgreichen steroidfreien Medikation vorauszusagen, so könnte dieser SNP ein Entscheidungskriterium in der Transplantationsmedikation werden.

Dazu stand eine Patientenklientel aus der pädiatrischen Arbeitsgruppe in München zur Verfügung, die im Rahmen einer engmaschig kontrollierten und individualisierten Therapie bei einem hohen Prozentsatz der Empfänger die Steroide entziehen konnten (64) (65).

In der Patientenklientel konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Genotypen in Bezug auf die Anzahl der Abstoßungsepisoden gefunden werden.

Betrachtet man den jeweiligen Genotyp und stellt die Patienten ohne Abstoßungsgeschehen der Gesamtheit der Patienten mit Abstoßungen gegenüber, so zeigte sich beim Genotyp AG ein signifikanter Unterschied (63 % keine Abstoßungen, 37 % Abstoßungen). Auch im Genotyp GG gab es ein erhöhtes Vorkommen von Patienten ohne Abstoßungen (60 % keine Abstoßungen, 40 % Abstoßungen), dies allerdings ohne statistische Signifikanz. Im Genotyp AA dominierte die Anzahl der Patienten mit Abstoßungen (47 % keine Abstoßungen, 53 % Abstoßungen), ebenfalls ohne Signifikanz.

Daraus resultierte die Frage, ob der Genotyp AG protektiv für eventuelle Abstoßungen nach Nierentransplantation sein kann. Gendzekhadze et al. zeigten ein erhöhtes Vorkommen von steroid-resistenten Verläufen des Genotyps CTLA-4 +49A in akuten Abstoßungsepisoden bei erwachsenen nierentransplantierten Patienten (66). Studien, die einen signifikanten Unterschied in den absoluten Abstoßungsepisoden aufwiesen,

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fanden wir nicht. Aufgrund des kleinen N (N= Fallzahl: 85 Patientenverläufe) könnten bei einer größeren Fallzahl auch Zusammenhänge im Genotyp GG signifikant werden, die derzeit durch kleine Effektstärken nicht zum Tragen kommen. Somit stellt sich die Frage, ob dem Allel G generell ein protektiver Effekt in Hinsicht auf mögliche Abstoßungen zu unterstellen ist bzw. ob das Allel A Abstoßungsreaktionen eher begünstigt. Diese Fragestellung sollte in weiteren Studien mit einer größeren Fallzahl untersucht werden.

Weiter konnte der CTLA-4 SNP keine Unterschiede in dem Erfolg einer steroidfreien Posttransplantationsmedikation zeigen. Während beim Genotyp GG 80 % der Patienten einem erfolgreichen Steroidentzug unterzogen wurden, zeigten sich beim Genotyp AG lediglich 63 %, die Daten zeigten allerdings keine statistische Signifikanz.

Bezüglich der geschlechtspezifischen Unterschiede der Häufigkeit der Abstoßungsperioden fiel im Genotyp GG eine statistisch signifikant höhere Anzahl an männlichen Probanden ohne Abstoßungsepisoden auf (GG ♂ 89 % vs. ♀ 11 %). Da der Genotyp GG in unserer Patientengruppe relativ selten auftrat, 15 von 85 Patientenverläufe bezogen sich auf einen GG-Genotyp, ist offen, in wie weit sich dieses geschlechtsspezifische Ergebnis in der Realität widerspiegelt.

In der Gruppe ohne Abstoßungsreaktionen trat in allen Genotypen eine männliche Dominanz auf, diese war zwar für die Genotypen AA und AG nicht signifikant, dennoch eröffnet sich ist die Frage, ob das männliche Geschlecht protektiv für akute Abstoßungsreaktionen sein könnte. Zhang et al. zeigten in ihrer Patientenkohorte eine fast dreimal höhere Wahrscheinlichkeit für eine akute Abstoßung bei nierentransplantierten weiblichen Patienten im Gegensatz zu männlichen Patienten (67).

Schäffer et al. zeigten in ihrer Studie mit Nieren- und Pankreastransplantierten Patienten, dass männliche Empfänger von Organen eines männlichen Spenders ein geringeres Risiko besitzen eine akute Abstoßungsreaktion zu entwickeln, als Empfänger von Organen eines weiblichen Spenders (68). Somit ist es durchaus möglich, dass dem männlichen Geschlecht eine protektive Eigenschaft in Bezug auf akute Abstoßungen zukommt.

In der Gruppe mit einer Abstoßung zeigten die weiblichen Patienten des Genotyps AG ein höheres Auftreten als die männlichen (AG ♂ 38 % vs. ♀ 62 %), jedoch ohne statistische Signifikanz. In der Gruppe mit zwei und mehr Abstoßungsperioden zeigten sich in den einzelnen Genotypen durchgehend ähnliche Verteilungsmuster bezüglich weiblicher und männlicher Patienten.