Altersverteilung der Patienten
3.9. Besonderheiten der Allel spezifischen Taq-Man PCR
3.9. Besonderheiten der Allel spezifischen Taq-Man PCR
Aufgrund der Multiplexfähigkeit im Sonden-Design können mit Hilfe der TaqMan PCR auch Allele mit nur einer Punktmutation unterschieden werden. Die Lage der Taqman-Sonde wird in diesem Fall durch den Single Nucleotide Polymorphism vorgegeben.
Bei der Optimierung eines Allel-spezifischen TaqMan Assays werden unterschiedliche Annealing/Extension Temperaturen verglichen, da bei niedrigen Temperaturen ein höheres Gesamtsignal erwartet wird, jedoch die Gefahr besteht, dass die zwei Allele nicht mehr voneinander zu differenzieren sind. Bei höheren Temperaturen resultiert ein schwächeres Gesamtsignal, wobei die Spezifität verbessert wird. Falls der Polymorphismus in einer der Sonden eine Abnahme des A/G-Gehaltes bewirkt, so empfiehlt es sich, die betroffene Sonde um ein bis zwei Basen zu verlängern, um den niedrigeren Tm dieser Sonde zu kompensieren.
Die Platzierung der Punktmutation innerhalb der Sondensequenz sollte möglichst in der Mitte der Sonde erfolgen, da dort der destabilisierende Effekt einer Fehlpaarbildung am stärksten ist.
Der Mix für die Taqman PCR:
2x Puffer 12,5 µl Sense-Primer 17,37 µmol 0,43 µl Anti-Sense Primer 12,56 µmol 0,60 µl BOTMR-Sonde 0,56 µl Fam-Sonde 0,65 µl H20 5,26 µl
Probenansatz:
H20 4,9 µl Probe (template) 0,1 µl
Die Spezifität der Reaktion ist bei einem 1-Nuleotid-Unterschied im Rahmen eines Single Nukleotid Polymophism entscheidend für die Qualität der Analyse. Es sollen zweifelsfrei Homozygote des Typ A, Heterozygote des Typ A/G und Homozygote des Typ G für 49 A/G CTLA-4 erkannt werden.
Zu diesem Ziel sind folgende Schritte der Sicherstellung einer spezifizischen Amplifikation eingehalten worden:
- Auswahl der Primer und der farbkodierten Oligonukleotide bei gemeinsam optimierter Annealing Temperatur mittels computergesteuerter Primer Auswahl (Programm Primer Express 1.0 der Firma Applied Biosystems)
- Vermeidung von Primer-Dimer und Hairpin Anlagerungen der Oligonukleotide durch Positionierung und Sequenzüberprüfung (Programm DNAStar)
- Vermeidung der unerwünschten Co-Amplifikation von Isogenen und unbekannten EST-DNA-Sequenzen im Genom über BLAST-Search in der Datenbank des National Center for Biotechnology Information, National Institutes of Health, USA (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gquery/gquery.fcgi)
3. Material und Methoden
- Farbcodierung des SNP an der Position 49 durch Bindung von FAM an A und BoTMR an G als letztes Nukleotid der fluorogenen Sonde.
- Überprüfung der Trennschärfe von Homozygoten und Heterozygoten in der Multiplex-PCR
Abbildung 3.2.: Taq-Man Ansatz Farbstoff FAM
Die Abbildung 3.2. zeigt den Taq-Man Ansatz für den Farbstoff FAM (3-fach Bestimmung), welcher das Allel A repräsentiert. Die obere Kurve ist somit dem homozygoten Genotyp AA zuzuordnen, die mittlere Kurve dem heterozygoten Genotyp AG und die untere Kurve dem homozygoten Genotyp GG.
Abbildung 3.3.: Taq-Man Ansatz Farbstoff BoTMR
Die Abbildung 3.3. zeigt den zweiten Farbstoff BoTMR (3-fach Bestimmung), welcher das Allel B repräsentiert. Dementsprechend zeigt die obere Kurve den Genotyp GG, die mittlere Kurve den Genotyp AG und die untere Kurve den Genotyp AA.
Die Abbildungen der Amplifikationen zeigen eine optimale Trennschärfe der einzelnen Sondenbindungen und ermöglichen somit sowohl in der BoTMR, als auch in der FAM Bestimmung eine sichere und genaue Trennung von heterozygoten und homozygoten Allelträgern.
3. Material und Methoden
3.10. Geräte
• Eppendorf MasterCycler 5330plus
• Gel Doc 1000 BIO RAD (UV-Kamera)
• Power PAC 300 BIO RAD (Spannungsgerät für Gelelektrophorese)
• ABI PRISM TM 7700 Sequenze Detection Systems (7700 SDS) Perkin-Elmer Corporation Applied Biosystems
• Beckman AllegraTM 21R Centrifuge
• Eppendorf Centrifuge 5415C
• Gene Quant Photometer RNA/DNA Calculator Pharmacia Biotech
• MS 1 Minishaker IKA®
• Epson STYLUS Color 640
• KERN 510 Waage Kern & Sohn GmbH, Albstadt, Germany
• GFL Gesellschaft für Labortechnik –80 °Celsius Gefriertruhe
• Liebherr Comfort –20 °Celsius Gefrierschrank
• Liebherr Economy Kühlschrank
• Moulinex® FM 1510 E Mikrowelle
• GFL Gesellschaft für Labortechnik 1083 Wasserbad
3.11. Hilfsmittel
• MicroAmp® Optical Tubes (Part Number 8010-933) Applied Biosystems Foster City, CA 94404
• MicroAmp® Optical Caps (Part Number 8010-0935) Applied Biosystems Foster City, CA 94404
• MicroAmp® Optical 96-Well Plate (Part Number 8010-0560) Applied Biosystems Foster City, CA 94404
• Cellstar® PP-Röhrchen, steril 15ml Greiner Labortechnik Lot.No 99300196 Cat.No 188.271
• TUBES MICROCENTRIFUGE Polypropylene Volume: 0,65 ml, Graduated SIGMA® CHEMICALS CO. P.o. St.Louis, USA, Lot 10B203281
• TUBES MICROCENTRIFUGE Polypropylene Volume: 1.7ml, Graduated
SIGMA® CHEMICALS CO. P.o. St.Louis, USA, Lot 10B203406
• Filter tip DNa-RNase free 10E greiner Labortechnik
• Filter tip DNa-RNase free 100E greiner Labortechnik
• Filter tip DNa-RNase free 1000E greiner Labortechnik
• Eppendorf Pipette 2,5 l
• Eppendorf Pipette 10 l
• Eppendorf Pipette 100 l
• Eppendorf Pipette 1000 l
• Gelkammer BIO RAD SUB-CELL® GT
• Gelkammer BIO RAD WIDE MINI SUB-CELL® GT
• Labsystems Pipette 0,5 – 10 µl
• Labsystems Pipette 5 – 40 µl
• Labsystems Pipette 40 – 200 µl
• Labsystems Pipette 200 – 1000 µl
• filter tip 10, 100, 1000 µl greiner labortechnik DNA/RNAse free
• Safeseal-Tips 2,5 µl Biozym Diagnostik GmbH
• pipette tips Sarstedt LOT 0109/1058011, Nümbrecht, Germany
• CELL-STAR® PP-Test tubes, sterile 15ml greiner labortechnik
3.12. Reagentien
• TaqMan® Unisversal PCR Master Mix Part Number 4304437 Lot Number B07654
Applied Biosystems Branchburg, New Jersey, USA
• Aqua ad iniectabilia Braun 100 ml 25/12211273/1100
• AL-Puffer und AW1/2 Puffer von OIAamp Blood & Tissue Test Kit (10) Cat. No.
29990
• AGAROSE, GENETIC TECHNOLOGY GRADE ICN Biomedicals, Inc. Ohio, USA
• ETHIDIUM BROMIDE SIGMA® CHEMICALS St Louis, USA
• Laufpuffer: 1-molarer Tris-Acetat-Puffer
• NuSieve™, FMC Bioproducts
• sample buffer Ansatz: 50mg Bromphenolblau + 25 Saccharose + 0,1ml 0,5%
3. Material und Methoden
EDTA auf 50ml mit H2O auffüllen
• Taq-DNA Polymerase Gibco BRL ®
• Puffer: 10x PCR Buffer von Gibco BRL ®
• Gel-Puffer: Natriumacetat wasserfrei MERCK + Ethylenediamine Tetraacetic ACID Electrophoresis Grade Cat. No. 800683 Lot. No. 71019
• Mineral Oil light white oil, SIGMA Chemicals, St. Louis, USA
• 1 kb Standard DNA ladder Gibco BRL®
• Ampuwa® 1000ml plastipur® Fresenius Kabi Deutschland GmbH (für Taqman)
• dGTP 2´-Desoxyguanosin-5´-triphosphat >98% 100mM Lösung Gibco BRL®
• dATP 2´-Desoxyadenosin-5´-triphosphat >98% 100mM Lösung Gibco BRL®
• dTTP Thymidin-5´-triphosphat >98% 100mM Lösung Gibco BRL®
• dCTP 2´-Desoxycytidin-5´-triphosphat >98% 100mM Lösung Gibco BRL®