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Methodische und klinische Untersuchungen mit dem Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100 beim Hund
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von Anke Helene Keidel
aus Nordhorn
Hannover 2001
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. R. Mischke
1. Gutachter: Prof. Dr. R. Mischke
2. Gutachter: Priv.-Doz. Dr. H.-J. Schuberth Tag der mündlichen Prüfung: 19.11.2001
Meinen Eltern
B. Literaturübersicht 15
1. Physiologie der primären Hämostase 15
1.1. Rolle im Blutstillungssystem 15
1.2. Entwicklung der Thrombozyten 15
1.3. Struktur der Thrombozyten 15
1.4. Membranständige Rezeptoren der Thrombozyten 16
1.5. Ablauf der primären Hämostase 17
1.5.1. Adhäsion 17
1.5.2. Formwandel und Sekretion 18
1.5.3. Aggregation, Stabilisation des primären Plättchenpfropfs
19 1.5.4. Thrombusretraktion, Auflösung des Plättchenpfropfs 19
2. Störungen der primären Hämostase 21
2.1. Thrombozytopenie 21
2.2. Thrombozytopathien bei ausgewählten Erkrankungen 22
2.2.1. Willebrand-Erkrankung 22
2.2.2. Azetylsalizylsäure-induzierte Thrombozytopathie 24
2.2.3. Urämie 24
2.2.4. Hepatopathien, portosystemischer Shunt 25
2.2.5. Canine Leishmaniose 27
2.2.6. Leukämie 28
2.2.7. Malignes Lymphom 29
2.2.8. Multiples Myelom 30
3. Labormethoden zur Überprüfung der
Thrombozytenfunktion
31
3.1. Kapilläre In-vivo-Blutungszeit 31
3.2. Thrombozytenaggregation 32
3.3. Messung der Plättchenadhäsion 33
3.4. Resonanzthrombographie 33
3.5. Durchflußzytometrie 34
3.6. Plättchenfunktionsanalysengeräte 35
3.6.1. Geräteaufbau 35
3.6.2.4. Einfluß der Meßzellcharge 41 3.6.2.5. Einfluß der Lagerdauer der Probe vor der Messung
und der Temperatur von Probe und Filter
42 3.6.3. Referenzbereiche, Einfluß von Geschlecht und Alter 43
3.6.4. Einfluß der Thrombozytenzahl 48
3.6.4.1. Thrombozytopenie-adaptiertes Vorläufergerät 49 3.6.4.2. Überprüfung der Wirkung von Thrombozytentrans-
fusionen bzw. des therapeutischen Einsatzes von Phospholipiden
49 3.6.5. Nachweis angeborener und erworbener
Thrombozytenfunktionsstörungen
50
3.6.5.1. Willebrand-Erkrankung 50
3.6.5.2. Andere hereditäre Thrombozytopathien 52
3.6.5.3. Erworbene Thrombozytopathien 53
3.6.5.4. Erfassung einer Plättchenaktivierung 54 3.6.6. Einfluß von Thrombozytenfunktionshemmern und
Antikoagulanzien
55
3.6.6.1. Azetylsalizylsäure 55
3.6.6.1.1. Einfluß von 1-Deamino-(8-D-Arginin)-Vasopressin auf die durch Azetylsalizylsäure verlängerte
Verschlußzeit
57
3.6.6.2. Sonstige 57
3.6.7. Einfluß des Hämatokrits bzw. einer Hämodilution durch Infusionslösungen
59
3.6.8. Einfluß der Leukozytenzahl 60
3.6.9. Plasmatische Gerinnungsstörungen 60
3.6.10. Biokompatibilität 61
C. Untersuchungsgut, Material und Methodik 62
1. Material 62
1.1. Geräte und Bezugsquellen 62
1.2. Reagenzien, Arzneimittel, Abkürzungen und Bezugs- quellen
63 1.3. Verbrauchsmaterial und Bezugsquellen 64
2.2.2. Willebrand-Erkrankung 67
2.2.3. Urämie 68
2.2.4. Hepatopathien, Ikterus 68
2.2.5. Portosystemischer Shunt 68
2.2.6. Leishmaniose 69
2.2.7. Akute lymphatische Leukämie 69
2.2.8. Chronische lymphatische Leukämie 70
2.2.9. Malignes Lymphom 70
2.2.10. Multiples Myelom 71
2.2.11. Hyperfibrinolyse 71
2.2.12. Cumarinvergiftung 71
2.2.13. Hämophilie A 72
3. Probengewinnung und -behandlung 72
3.1. Blutentnahme 72
3.2. Probenverarbeitung und Gewinnung von plättchen- reichem und plättchenfreiem Plasma
72
4. Methoden 73
4.1. Thrombozytenzahl und andere Meßgrößen des Blutbildes
73 4.2. Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100 73
4.3. Kapilläre In-vivo-Blutungszeit 74
4.4. Thrombozytenaggregation nach der BORN-Methode 74
4.5. Klinisch-chemische Messungen 76
4.6. Bestimmung der aktivierten partiellen Thrombo-
plastinzeit und der Prothrombinzeit, der FaktorVIII:C- Aktivität und der Willebrandfaktor-Konzentration
76
5.3. Einfluß der Lagerung (Kollagen/ADP- und Kollagen/Epinephrin-Meßzelle)
77 5.4. Einfluß des Hämatokrits (Kollagen/ADP-Meßzelle) 78 5.5. Einfluß von Desmopressin (DDAVP) bei einem Hund
mit Willebrand-Faktor-Mangel (Kollagen/ADP- Meßzelle)
78 5.6. Einfluß der intravenösen Injektion von Azetylsalizyl-
säure beim gesunden Hund (Kollagen/ADP-Meßzelle und Kollagen/Epinephrin-Meßzelle)
78 5.7. Einfluß des In-vitro-Zusatzes von Azetylsalizylsäure
beim gesunden Hund (Kollagen/ADP-Meßzelle und Kollagen/Epinephrin-Meßzelle)
79
6. Statistische Auswertung 79
D. Ergebnisse 80
1. Referenzwerte für Verschlußzeit und Gesamtvolumen 80 2. Referenzwerte der In-vivo-Blutungszeit 82 3. Referenzwerte der Thrombozytenzahl und des
Hämatokrits
83
4. Präzisionsanalyse 83
5. Einfluß der Meßzellcharge 84
6. Einfluß der Lagerung 85
7. Einfluß des Hämatokrits 88
8. Einfluß der Thrombozytenzahl 89
9. Willebrand-Erkrankung 96
10. Einfluß der intravenösen Injektion von Azetylsalizylsäure beim gesunden Hund
99 11. Einfluß des In-vitro-Zusatzes von Azetylsalizylsäure
bei Blutproben von gesunden Hunden
102
12. Urämie 107
13. Hepatopathien 111
13.1. Ikterus 113
14. Portosystemischer Shunt 113
15. Leishmaniose 118
20. Hyperfibrinolyse 134 21. Cumarinvergiftung und Hämophilie A 137
E. Diskussion 140
F. Zusammenfassung 150
G. Summary 153
H. Literaturverzeichnis 156
I. Tabellarischer Anhang 192
ASS = Azetylsalizylsäure ATP = Adenosintriphosphat BZ 1 = Blutungszeit 1
BZ 2 = Blutungszeit 2
Ca = Kalzium
CaCl2 = Kalziumchlorid
cAMP = zyklisches Adenosinmonophosphat cGMP = zyklisches Guanosinmonophosphat
cm = Zentimeter
DDAVP = 1-Deamino-(8-D-Arginin)-Vasopressin
dl = Deziliter
Epi = Epinephrin
F-VIII:C = Faktor-VIII:C-Aktivität g = gravitas, Erdbeschleunigung
GP = Glykoprotein
GV = Gesamtvolumen
HE = Hämatoxilin-Eosin HTK = Hämatokrit
I.E. = Internationale Einheiten
kD = kiloDalton
kg = Kilogramm
l = Liter
M = Mol
mbar = Millibar
mg = Milligramm
mm = Millimeter
mmol = Millimol
n = Anzahl
NO = Stickstoffmonoxid NaCl = Natriumchlorid
PFP = plättchenfreies Plasma
PGG2 = Prostaglandinendoperoxid G2 PGH2 = Prostaglandinendoperoxid H2
PRP = plättchenreiches Plasma r = Korrelationskoeffizient
Tab. = Tabelle
Thrz. = Thrombozytenzahl TXA2 = Thromboxan A2 VK = Variationskoeffizient
VLA = very late lymphocyte-activation antigen-Gruppe VZ = Verschlußzeit
WF:Ag = Willebrandfaktor-Konzentration WF:RCo = Ristocetin-Kofaktoraktivität
µg = Mikrogramm
µl = Mikroliter
µm = Mikrometer
µM = Mikromol
A. Einleitung
Die kapilläre Blutungszeit ist ein wesentlicher Screeningtest der Hämostase und überprüft die Bildung des primären Plättchenpfropfs. Ihre Messung ist insbesondere bei Verdacht auf Plättchenfunktionsstörungen indiziert, wobei die kapilläre Blutungszeit - bei physiologischer Thrombozytenzahl - verlängert ist (NOLTE et al. 1994). Neben der In-vivo-Messung, wofür auch für den Hund ein praktikables Verfahren zur Verfügung steht (NOLTE et al. 1997), hat mittlerweile die In-vitro-Blutungszeitmessung in speziellen Geräten einen wesentlichen Stellenwert bei der Erkennung und Verlaufskontrolle von Thrombozytenfunktionsstörungen beim Menschen erlangt (u.a.:
KRETSCHMER et al. 1989; ESCOLAR et al. 1999; CATTANEO et al. 1999).
Diese Methode zeichnet sich gegenüber der Messung der kapillären Blutungszeit am Patienten insbesondere durch eine bessere Standardisierbarkeit und einen geringeren personellen Aufwand aus (MÜLLER et al. 1997). Für den Hund sind der zugänglichen Literatur allerdings bislang nur wenige Daten im Zusammenhang mit dieser Methode zu entnehmen (SCHWARZ et al. 1997).
Daher waren die Ziele der vorliegenden Arbeit:
1. Basierend auf einer größeren Tierzahl sollten Referenzbereiche für die Analysen mit dem Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100 beim Hund erstellt werden.
2. Es sollte der Einfluß von Meßzellcharge, der Lagerung des Probenmaterials, des Hämatokrits und der Thrombozytenzahl sowie von Azetylsalizylsäure auf die In-vitro-Blutungszeit beim Hund untersucht werden.
3. Bei Erkrankungen, die beim Menschen und/oder Hund mit Thrombo- zytenfunktionsstörungen assoziiert sind (z.B. Urämie, Hepatopathien, akute Leukämie), sollten Messungen der In-vitro-Blutungszeit beim Hund erfolgen.
4. Schließlich sollte anhand von Hunden mit plasmatischen Gerinnungs- störungen die Spezifität der Methode zur Aufdeckung von Störungen der primären Hämostase getestet werden.
B. Literaturübersicht
1. Physiologie der primären Hämostase 1.1. Rolle im Blutstillungssystem
Das Hämostasesystem kann als ein Dreikomponentensystem aufgefaßt werden.
Diese drei Komponenten sind die zellulären und humoralen Bestandteile des zirkulierenden Blutes, die Komponenten der Gefäßwand und die Vasomotorik (MÜLLER-BERGHAUS 1997). Als wesentlicher Bestandteil des komplexen Hämostaseapparats erfüllen Blutplättchen dabei eine Reihe wichtiger Funktionen. So tragen sie unter anderem zur Aufrechterhaltung der Gefäß- wandintegrität bei, sorgen bei einer Verletzung durch Bildung eines hämostatisch wirksamen Pfropfs für die primäre Blutstillung und fördern die Aktivierung des Gerinnungssystems (SCHARF 1997). Veränderungen in Thrombozytenzahl oder -funktion sind eine wesentliche Ursache für Blutungen bei domestizierten Tieren und ergeben eine große Bandbreite erworbener oder kongenitaler Erkrankungen (DAVENPORT et al. 1982).
1.2. Entwicklung der Thrombozyten
Die Zellreihe der Thrombozytopoese geht aus pluripotenten hämatopoetischen Stammzellen des Knochenmarks hervor. Unter dem Einfluß des Wachstumsfaktors Thrombopoetin entwickeln sich aus den Stammzellen die Megakaryoblasten und aus diesen über einige Zwischenstufen die Megakaryozyten (WEISS 1975; SCHNEIDER u. GATTERMANN 1996).
Durch Invagination der Megakaryozytenmembran und anschließende Fragmentierung entstehen aus einem kernhaltigen Megakaryozyten 1000-2000 kernlose Thrombozyten (WEISS 1975). Die Lebensdauer der Thrombozyten beträgt beim Menschen im Mittel 10 Tage (SCHALM et al. 1975), beim Hund liegt sie zwischen 5 und 7 Tagen (JAIN 1993). Die normale Thrombozytenzahl des peripheren Blutes beträgt beim Hund 150.000-500.000/µl (MISCHKE 1997), überalterte Thrombozyten werden durch das Monozyten-Makrophagen- System in der Leber eliminiert.
1.3. Struktur der Thrombozyten
Thrombozyten zirkulieren in der Blutbahn im Ruhezustand in einer diskoiden Form (SCHARF 1997). Beim Hund beträgt ihr Durchmesser 1,3-4,7 µm, ihre Dicke 0,5 µm (JAIN 1975). Bei Aktivierung machen sie einen
charakteristischen Formwandel durch. Sie verlieren ihre Scheibenform, werden nahezu kugelförmig und stülpen Pseudopodien aus (BLOCKMANS et al. 1995;
WHITE 1996).
Elektronenmikroskopisch können vier Regionen der Thrombozyten unter- schieden werden:
• Die periphere Zone besteht aus der Plasmamembran und ihr assoziierten Strukturen. Die als Glykokalix bezeichnete Schicht stellt die äußere Hülle des Plättchens dar. Sie ist reich an Glykoproteinen, die als Rezeptoren für Plättchenagonisten und adhäsive Proteine dienen. Die mittlere Schicht der peripheren Zone wird repräsentiert durch die phospholipidreiche Plasmamembran mit dem Aufbau einer typischen Einheitsmembran (WHITE 1979). Der unter der Plasmamembran liegende Bereich bildet die dritte Schicht dieser Zone. Dieser vermittelt eine Signaltransduktion zwischen Rezeptoren und Plättcheninnerem beziehungsweise zwischen zytoplasmatischen Strukturen und der Plättchenoberfläche. Über Invaginationen der Plasmamembran, das sogenannte offene kanalikuläre System, steht die Oberfläche mit dem Plättcheninneren in Verbindung (SCHARF 1997).
• Die Sol-Gel-Zone stellt die Matrix des Plättchenzytoplasmas dar. Sie enthält drei Fasersysteme: die submembranösen Filamente, die Mikrotubuli und die Mikrofilamente (FOX 1993; WHITE 1994). Die Komponenten der strukturellen Zone halten die diskoide Form des ruhenden Thrombozyten aufrecht und sind aktiv an der Formveränderung des aktivierten Plättchens beteiligt (GAWAZ 1999).
• Die Organellenzone umfaßt die a-Granula, einige dichte Granula („dense bodies“), wenige Mitochondrien, Peroxisomen und Lysosomen.
• Die Membranzone besteht aus dem dichten tubulären System und dem offenen kanalikulären System (WHITE 1996).
1.4. Membranständige Rezeptoren der Thrombozyten
Adhäsion und Aggregation der Thrombozyten werden über membranständige Rezeptoren der Thrombozyten vermittelt (DE GROOT u. SIXMA 1990;
SCHRÖR 1991; BLOCKMANS et al. 1995; WHITE 1996). Diese lassen sich unterscheiden in zur Familie der Integrine und zur Familie der Nonintegrine gehörende Rezeptoren:
• Zur Familie der Integrine zählen die very late lymphocyte-activation antigen-Gruppe (VLA) und die Zytoadhäsine. Die Gruppe der VLA umfaßt den Glykoprotein(GP)Ia-IIa-Rezeptor, einen Rezeptor für Kollagen, den GPIc-IIa-Rezeptor, einen Rezeptor für Fibronektin, und
den GPIc`-IIa-Rezeptor, einen Rezeptor für Laminin. Zu den Zytoadhäsinen gehören der GPIIb-IIIa-Rezeptor, ein Rezeptor für Fibrinogen, Willebrandfaktor, Fibronektin und Vitronektin, und der avGPIIIa-Rezeptor, ein Rezeptor für Vitronektin. Während die übrigen Rezeptoren auch auf anderen Zellen vorkommen, ist die Expression des GPIIb-IIIa-Rezeptors auf das Megakaryozyten-Plättchen-System be- schränkt (DE GROOT u. SIXMA 1990; SCHARF 1996).
• Zur Familie der Nonintegrine zählen der GPIb-Rezeptor, der auf den Plättchen als Komplex mit GPIX und GPV vorliegt und ein Rezeptor ist für den Willebrandfaktor und Thrombin, und der GPIV-Rezeptor, ein Rezeptor für Kollagen und Thrombospondin (DE GROOT u. SIXMA 1990; BLOCKMANS et al. 1995; SCHARF 1996).
Neben aktivierenden Rezeptoren finden sich auch inhibierende Rezeptoren auf der Membran der Thrombozyten, zum Beispiel für Prostaglandine und Adenosin. Diese sind über stimulatorische G-Proteine an eine Adenylatzyklase gekoppelt, deren Stimulation zur Bildung des Botenstoffs cAMP und dadurch zur Aktivierung einer Proteinkinase A führt. Daraufhin erfolgt durch Phosphorylierungsreaktionen eine Hemmung der Plättchenaktivierung durch Antagonisierung der Agonisten-induzierten Erhöhung der zytosolischen Kalzium-Konzentration. Zudem wird die Plättchenaktivierung durch Dephosphorylierung des sogenannten „47kD-Proteins“ und der leichten Ketten des Myosins gehemmt. Ein weiterer inhibitorischer Botenstoff ist cGMP, welches durch Stimulation der löslichen Guanylatzyklase gebildet wird. Diese Stimulation kann durch Stickstoffmonoxid aus dem Endothel sowie NO- Donatoren erfolgen (SCHRÖR 1991).
1.5. Ablauf der primären Hämostase 1.5.1. Adhäsion
Der erste Schritt der primären Hämostase ist die Adhäsion von noch ruhenden Blutplättchen an die verletzte Gefäßwand. Bei hohen Scherraten wird dieser initiale Kontakt vermittelt durch den GPIb-V-IX-Rezeptor der Plättchenoberfläche und den an die exponierte Gefäßwandmatrix gebundenen Willebrandfaktor (DE GROOT u. SIXMA 1990; RUGGERI 1994; SIXMA et al.
1995; SCHARF 1996; WHITE 1996; ROSENFELD u. GRALNICK 1997), welcher erst bei hohen Scherraten in multimerischer Form vorliegt (RUGGERI 1994; MÜLLER-BERGHAUS 1997). Bei niedrigen Scherkräften sollen die Plättchen über den GPIa-IIa-Rezeptor auch direkt an exponiertes Kollagen des
Gefäßsubendothels anhaften können (SCHARF 1996; ROSENFELD u.
GRALNICK 1997). Nach DE GROOT und SIXMA (1990) ist bei niedrigen Scherraten Fibronektin das Haupadhäsivprotein. Über weitere Ligand-Rezeptor- Interaktionen erfolgt eine Stabilisierung der Plättchenadhäsion (SIXMA 1995;
GAWAZ 1999).
1.5.2. Formwandel und Sekretion
Durch Kopplung der membranständigen Rezeptoren mit intrazellulären Messengersystemen kommt es durch Bindung eines Agonisten am jeweiligen Rezeptor zu einer Erhöhung intrazellulärer Botenstoffe und dadurch zu einer Stimulation der Thrombozyten, die sich in Formwandel, Sekretion oder Aggregation äußert (PACKHAM 1983; SCHARF 1996; ROSENFELD u.
GRALNICK 1997). Eine Stimulation der Rezeptoren führt zur Aktivierung von Phospholipase A2 sowie Phospholipase C mit Bildung und Freisetzung von folgenden intrazellulären Botenstoffen aus Membranphospholipiden:
Arachidonsäure, Inositol-1,4,5-Triphosphat und Diazylglyzerol. Aus der Arachidonsäure entstehen über den Zyklooxygenaseweg Prostaglandin- endoperoxide (PGG2/PGH2) und Thromboxan A2 (TXA2). Sie binden am PGH2/TXA2-Rezeptor und stimulieren darüber die Plättchensekretion.
Diazylglyzerol aktiviert die Proteinkinase C, welche zur Phosphorylierung eines
„47kD-Proteins“ und damit zur Induzierung der Plättchensekretion und -aggre- gation führt. Außerdem kommt es durch transmembranösen Einstrom durch rezeptorabhängige Kalziumkanäle und durch Inositol-Triphosphat - induzierte Freisetzung von Kalzium aus intrazellulären Speichern zu einer Erhöhung der zytosolischen Kalzium-Konzentration. Dies führt unter anderem zu einer Aktivierung der Myosin-light-chain-Kinase, welche durch Phosphorylierung der leichten Ketten des Myosins neben einer Verstärkung der Plättchensekretion vor allem den Formwandel („shape change“) der Thrombozyten katalysiert (SCHRÖR 1991).
Die bei der Sekretion freigesetzten Granulainhaltsstoffe können sowohl
„autokrin“ den Aktivierungsvorgang verstärken als auch durch Stimulation noch ruhender Thrombozyten diese aus der Zirkulation rekrutieren und zur Aggregation mit schon adhärenten Plättchen anregen. Das Endstadium der Adhäsion ist erreicht, wenn der Thrombozyt vollkommen über dem Subendothel ausgespreizt ist (GAWAZ 1999).
1.5.3. Aggregation, Stabilisation des primären Plättchenpfropfs
Durch Signaltransduktion des aktivierten Thrombozyten wird auch der Rezeptor GPIIb-IIIa stimuliert. Dieser liegt auf ruhenden Plättchen in einer inaktiven Form vor. Bei Plättchenaktivierung erfolgt eine Konformationsänderung dieses Rezeptors, womit die Freilegung von Bindungsstellen für Fibrinogen und andere adhäsive Plasmaproteine einhergeht (DE GROOT u. SIXMA 1990; RUGGERI 1994; SIXMA et al. 1995; SCHARF 1996; ROSENFELD u. GRALNICK 1997). Dem GPIIb-IIIa-Rezeptor kommt bei der Aggregation zentrale Bedeutung zu. Daneben ist er auch am Spreizungsprozeß wesentlich beteiligt.
Bei der Aggregation, der Koadhäsion zwischen zwei Thrombozyten, unterscheidet man zwei Phasen: die primäre und die sekundäre Aggregation.
Während der primären reversiblen Phase werden die Thrombozyten über Fibrinogenbrücken locker miteinander verbunden. Die Bindung von Fibrinogen an das GPIIb-IIIa ist dabei streng abhängig von Ca2+-Ionen. Im weiteren Verlauf kommt es zu einer Degranulation der Plättchen und einer Verfestigung der Fibrinogenbindung an der Thrombozytenoberfläche (sekundäre, irreversible Aggregation) (GAWAZ 1999).
Bei Aktivierung der Thrombozyten kommt es neben den genannten Veränderungen zudem zu Änderungen der Phospholipidorientierung im Bereich der Plasmamembran, welche die Anlagerung von Gerinnungsfaktoren und die Bildung eines katalytischen Prothrombinasekomplexes an der aktivierten Oberfläche (Plättchenfaktor 3) erlauben. Dieses führt zur gesteigerten Thrombinbildung in der Umgebung eines Plättchenaggregates und damit zur Konsolidierung des hämostastischen Pfropfs durch Fibrinvernetzung (GAWAZ 1999).
1.5.4. Thrombusretraktion, Auflösung des Plättchenpfropfs
Während der Stabilisation des Plättchenpfropfs erfolgt durch das gebildete Thrombin neben der Polymerisierung von Fibrinogen zu Fibrin an der Außenseite der Aggregate bereits eine Retraktion des Pfropfs. Zusätzlich führt die Aktivierung von Aktomyosin in den Plättchen zu einer zentripetalen Kontraktion. So ziehen Fibrinfäden und die Aktomyosinkontraktion den Plättchenthrombus bzw. die Plättchenaggregate zusammen, und das in den Zwischenräumen befindliche Serum wird ausgepreßt. In dieser Phase wird auch der Inhalt der Lysosomen der Plättchen freigesetzt, wodurch wahrscheinlich eine limitierte Proteinverdauung einsetzt. Dies ist der erste Schritt in Richtung Transformation vom aktiven Blutstillungspfropf in den passiven Überrest, der
im Rahmen der Gefäßwandreparatur, u.a. mit Hilfe der Fibrinolyse, beseitigt wird (HEMKER u. POLIWODA 1997).
Im Rahmen der Fibrinolyse erfolgt eine weitere Auflösung des Gerinnsels durch das proteolytische Enzym Plasmin, welches aus einem inaktiven zirkulierenden Proenzym, dem Plasminogen hervorgeht (ASTRUP u. THORSEN 1972;
COLLEN u. LIJNEN 1995). Die Umwandlung von Plasminogen zu Plasmin kann durch eine Vielzahl von Aktivatoren initiiert werden (ASTRUP u.
THORSEN 1972). Die Aktivierung des Plasminogensystems unterliegt hierbei einer feinregulierten Steuerung, in die sowohl Endothelzellen als auch Blutplättchen eingeschaltet sind (MÜLLER-BERGHAUS 1997; OSTENDORF et al. 1997). Die Blutplättchen enthalten Plasminogenaktivatoren, können Plasminogen auf ihrer Oberfläche binden und andererseits Plasminogen- aktivator-Inhibitor und a2-Antiplasmin sezernieren, so daß an den Thrombo- zyten sowohl fibrinolysefördernde als auch -hemmende Effekte beobachtet werden können (COLLER 1990).
2. Störungen der primären Hämostase 2.1. Thrombozytopenie
Die Thrombozytopenien lassen sich entsprechend ihrer Pathogenese nach Bildungsstörungen, Verlust bzw. Umsatz- oder Verteilungsstörungen unterscheiden, wobei jeder dieser Störungen noch einmal verschiedene Ursachen zugrunde liegen können (FELDMAN et al. 1988). Eine epidemiologische Studie über 987 thrombozytopenische Hunde ergab folgende Verteilung: Bei 5 % der Hunde lag eine immunbedingte Thrombozytopenie vor (zu dieser Gruppe wurden auch Hunde mit systemischem Lupus erythematosus, Pemphigus und rheumatoider Arthritis gezählt), bei 13% eine Neoplasie- assoziierte, bei 23 % eine inflammatorisch oder infektiös bedingte Thrombo- zytopenie, 59 % zeigten Mischformen (GRINDEM et al. 1991).
Zu den möglichen einer Thrombozytopenie zugrundeliegenden Infektionen zählen beim Hund neben der Ehrlichiose unter anderem auch die Leishmaniose und die Staupe (RUSSEL u. GRINDEM 2000). Zu den mit der Thrombozytopenie assoziierten Neoplasien zählen unter anderem die Leukämie, das maligne Lymphom und das multiple Myelom (MADEWELL et al. 1980;
GRINDEM et al. 1994).
Die immunvermittelte Thrombozytopenie muß nach SCOTT (2000) unterteilt werden in die primäre (idiopathische oder autoimmune) Form und in die sekundäre Form. Letztere kann auftreten bei systemischen autoimmunen Erkrankungen, bei Neoplasien, Infektionen oder auch nach Einnahme bestimmter Arzneimittel. Zusätzlich zur Thrombozytopenie liegt bei der sekundären Form nicht selten auch eine immunvermittelte hämolytische Anämie vor (SCOTT 2000). Zudem wurde bei der immunbedingten Thrombozytopenie (bzw. idiopathischen thrombozytopenischen Purpura) sowohl beim Hund (KRISTENSEN et al. 1994) als auch beim Menschen (HEYNS et al. 1978;
STUART et al. 1981; CLANCY et al. 1992) auch ein qualitativer Defekt der Plättchen beschrieben. In der experimentellen Untersuchung von KRISTENSEN et al. (1994) wurde hierzu normales plättchenreiches Hundeplasma mit Serum bzw. Immunglobulin G von Hunden mit immunbedingter Thrombozytopenie inkubiert und die Plättchenaggregation bestimmt. Hierbei ergab sich bei der Mehrzahl der untersuchten Proben ein reduziertes Aggregationsmaximum im Vergleich mit einer Kontrollgruppe. Die Ursache der angedeuteten Plättchenfunktionsstörung sehen KRISTENSEN et al. (1994) hierbei in den zirkulierenden Antikörpern. Demgegenüber steht eine Untersuchung von HARKER und SLICHTER (1972) beim Menschen, in der bei Patienten mit chronischer immunvermittelter Thrombozytopenie, die laut LEWIS und
MEYERS (1996) mit der des Hundes vergleichbar ist, eine Blutungszeit gemessen wurde, die für den jeweils vorliegenden Grad der Thrombozytopenie unverhältnismäßig kurz war. Dieses wurde mit dem Vorliegen einer jungen Plättchenpopulation mit verstärkter hämostastischer Kompetenz begründet (HARKER u. SLICHTER 1972).
2.2. Thrombozytopathien bei ausgewählten Erkrankungen 2.2.1. Willebrand-Erkrankung
Die Willebrand-Erkrankung ist die am weitesten verbreitete erbliche Blut- stillungsstörung beim Menschen (RICK 1994). Sie besitzt unterschiedliche Ausprägungen, die mit einer qualitativen oder quantitativen Abnormalität des Willebrandfaktors einhergehen (SADLER 1994; FRESSINAUD u. MEYER 1996). Auch beim Hund ist diese Krankheit bereits in über 50 Rassen diagnostiziert worden (BROOKS 1992). Neben den erblichen Formen der Krankheit existieren sowohl beim Menschen als auch beim Hund erworbene Formen (THOMAS 1996). Da dieser Faktor unter anderem durch seine plättchenagglutinierende Eigenschaft eine entscheidende Rolle in der Hämostase spielt, wirkt sich ein Defekt des Willebrandfaktors vor allem auf die thrombozytenabhängige Blutstillung aus (MEYER u. GIRMA 1993; THOMAS 1996; RUGGERI 1997). Dieses wurde neben anderen Funktionstests in zahlreichen Untersuchungen durch Bestimmung der kapillären In-vivo- Blutungszeit sowohl beim Hund (JERGENS et al. 1987) als auch beim Menschen belegt (u.a.: HARKER u. SLICHTER 1972; WEIPPERT- KRETSCHMER et al. 1995; FRESSINAUD et al. 1996, 1997, 1998). Die Differenzierung der verschiedenen Typen des Willebrand-Syndroms erfordert die Durchführung mehrerer diagnostischer Tests. Eine Übersicht über eine Differenzierung verschiedener Typen des Willebrand-Syndroms beim Menschen anhand verschiedener Tests ist Tabelle 1 zu entnehmen.
Tab. 1: Klassifikation des Willebrand-Syndroms (nach ZIMMERMAN u.
RUGGERI 1982).
diagnostische Test-
systeme Typ I Typ II A Typ II B Typ III In-vivo-Blutungszeit verlängert verlängert verlängert verlängert
Plättchenzahl normal normal normal o.
vermindert normal F-VIII:C vermindert vermindert
o. normal vermindert stark vermindert WF:Ag vermindert vermindert
o. normal
vermindert o. normal
stark vermindert WF:RCo vermindert stark
vermindert
vermindert
o. normal fehlt Ristocetin-induz.
Plättchenaggregation
vermindert o. normal
fehlt o.
vermindert erhöht fehlt Multimerstruktur
normal aber generell vermindert
Fehlen der großen und
mittleren Multimeren
Fehlen der großen Multimeren
variabel Zweidimensionale
Elektrophorese normal pathologisch pathologisch variabel Erbgang autosomal
dominant
autosomal dominant
autosomal dominant
autosomal rezessiv F-VIII:C = Faktor-VIII:C-Aktivität; WF:Ag = Willebrandfaktor-Konzentration;
WF:RCo = Ristocetin-Kofaktoraktivität; induz. = induziert
2.2.2. Azetylsalizylsäure-induzierte Thrombozytopathie
Der Effekt der beim Menschen häufig und beim Hund seltener als Thrombo- zytenaggregationshemmer eingesetzten Azetylsalizylsäure auf die Thrombo- zytenfunktion ist weitestgehend geklärt: Die Azetylsalizylsäure führt zu einer irreversiblen Azetylierung und hiermit Inaktivierung des Enzyms Zyklooxygenase (COX-I) und bewirkt so eine Hemmung des Prostaglandinstoffwechsels und damit der Thromboxanbildung (u.a.: SMITH u.
WILLIS 1971; ROTH u. SIOK 1978; MAJERUS 1983; SCHRÖR 1991;
GAWAZ 1999). Die dadurch entstehende Beeinträchtigung der primären Hämostase ist in zahlreichen Untersuchungen unter anderem anhand der kapillären In-vivo-Blutungszeit sowohl beim Menschen (MIELKE et al. 1969;
RAJAH et al. 1978; MIELKE 1982, 1983) als auch beim Hund (THOMAS et al.
1979; JERGENS et al. 1987; NOLTE 1988a, 1994a, b, 1997) bestätigt worden.
So wurde zum Beispiel in der Studie von NOLTE et al. (1994b) durch Azetylsalizylsäure experimentell bei gesunden Hunden eine thrombozyten- spezifische Blutungsneigung erzeugt und anhand der Messung der kapillären In- vivo-Blutungszeit der therapeutische Effekt verschiedener Behandlungs- möglichkeiten von thrombozytenabhängigen Hämostasestörungen überprüft.
Die Untersuchungen zum Einfluß der Azetylsalizylsäure auf die In-vitro- Blutungszeit sind im Kapitel 3 angeführt.
2.2.3. Urämie
Bei der Urämie wird beim Menschen (DAVIS et al. 1972; MANNUCCI et al.
1983; REMUZZI et al. 1983, 1990; DI MINNO et al. 1985; CASTILLO et al.
1986; WARE et al. 1989) wie auch beim Hund (JERGENS et al. 1987; HARRIS u. KRAWIEC 1990) regelmäßig eine Blutungsneigung (bzw. eine Verlängerung der In-vivo-Blutungszeit) beobachtet. Der Literatur sind vor allem für den Menschen eine Reihe von Faktoren zu entnehmen, die an dieser Blutungs- neigung beteiligt sein sollen wie die eventuell bestehende Thrombozytopenie, Gerinnungsfaktormängel und Plättchenfunktionsstörungen (EBERST u.
BERKOWITZ 1994). Eine Plättchenfunktionsstörung wurde in mehreren Untersuchungen durch die Bestimmung der kapillären In-vivo-Blutungszeit sowohl bei urämischen Menschen (HARKER u. SLICHTER 1972; REMUZZI et al. 1977, 1978; MANNUCCI et al. 1983; DI MINNO et al. 1985; CASTILLO et al. 1986; GORDGE et al. 1988; WARE et al. 1989) als auch bei urämischen bzw. azotämischen Hunden (JERGENS et al. 1987; BRASSARD et al. 1994;
BRASSARD u. MEYERS 1994) belegt. So zeigte sich zum Beispiel in einer
Studie von JERGENS et al. (1987) bei 5 von 6 Hunden mit Urämie eine deutlich verlängerte kapilläre In-vivo-Blutungszeit.
Die der Urämie-induzierten Plättchendysfunktion zugrundeliegenden Mecha- nismen sind noch nicht vollständig geklärt. In mehreren Studien ergab sich eine beeinträchtigte Plättchenadhäsion sowohl beim Menschen (TURNEY et al.
1981; CASTILLO et al. 1986; ESCOLAR et al. 1990) als auch beim Hund (BRASSARD et al. 1994). Deren Ursache ist zumindest beim Menschen nach ESCOLAR et al. (1990) in einer gestörten Interaktion zwischen dem Willebrandfaktor und dem GPIIb-IIIa-Rezeptor zu suchen. In einer experimentellen Untersuchung mit azotämischen Hunden fand sich jedoch kein Hinweis auf eine strukturelle oder funktionelle Abnormalität dieses Faktors (BRASSARD u. MEYERS 1994). Weiterhin wurde in einigen Fällen beim Menschen ein abnormaler Prostaglandinmetabolismus der Thrombozyten (REMUZZI et al. 1978, 1983; SMITH u. DUNN 1981; DI MINNO et al. 1985;
JACOBSSON et al. 1985) oder auch der Endothelzellen (resultierend in einer erhöhten Prostazyklinaktivität) (REMUZZI et al. 1977) nachgewiesen.
Erklärungsversuche hierfür bezogen sich bei den Thrombozyten auf einen funktionellen Defekt der Zyklooxygenase (REMUZZI et al. 1983;
JACOBSSON et al. 1985) beziehungsweise auf eine Hemmung des Arachidonsäuremetabolismus durch Substanzen des urämischen Plasmas (SMITH u. DUNN 1981). Ebenfalls belegt in Untersuchungen beim Menschen wurden eine verminderte Verfügbarkeit des Plättchenfaktors 3 durch urämische Toxine wie Guanidinbernsteinsäure (HOROWITZ et al. 1967) sowie eine abweichende Kalzium-Homöostase der Plättchen (WARE et al. 1989). Auch die Retention von Harnstoff und Harnstoffmetaboliten soll zu einer Beeinträchtigung der Thrombozytenfunktion beim Menschen führen (DAVIS et al. 1972). Als weitere Mediatoren der urämischen Blutung entdeckten REMUZZI et al. (1990) das Stickstoffmonoxid und WALKOWIAK et al. (1994) Protein-Degradationsprodukte, welche die Fibrinogenbindung der Thrombozyten hemmen. REMUZZI et al. (1990) führten hierzu eine experimentelle Studie an Ratten durch, WALKOWIAK et al. (1994) fanden diese Protein-Degradationsprodukte im Plasma urämischer Menschen.
Weiterhin stellten WINKELMANN et al. (1986) eine Inhibition der DNA- Replikation der Thrombozyten des Menschen unter dem Einfluß der Urämie fest.
2.2.4. Hepatopathien, portosystemischer Shunt
Bei Lebererkrankungen findet sich neben einer regelmäßig verminderten Thrombozytenzahl (Mensch u.a.: TOGHILL et al. 1977; VIOLI et al. 1994;
PEREIRA et al. 1995; Hund: MISCHKE et al. 1998b) auch eine funktionelle Beeinträchtigung der primären Hämostase. Letzteres ist aus Untersuchungen sowohl beim Menschen (MAURER u. CAUL 1972; BALLARD u. MARCUS 1976; RUBIN et al. 1979; OWEN et al. 1981; VIOLI et al. 1994) als auch beim Hund (BOWEN et al. 1988; SCHULZE 1989; WILLIS et al. 1989) zu entnehmen. Die Thrombozytenfunktionsstörung wurde in den Untersuchungen beim Menschen unter anderem anhand einer veränderten Plättchenaggregation (MAURER u. CAUL 1972; BALLARD u. MARCUS 1976; RUBIN et al. 1979;
OWEN et al. 1981) sowie in den Studien von BALLARD und MARCUS (1976) und VIOLI et al. (1994) anhand einer verlängerten kapillären In-vivo- Blutungszeit belegt. In den Studien beim Hund fand ebenfalls die Plättchenaggregation Anwendung (BOWEN et al. 1988; SCHULZE 1989;
WILLIS et al. 1989). In diesen Studien ergaben sich reduzierte Aggregationsmaxima mit den Agonisten Kollagen und ADP (BOWEN et al.
1988; SCHULZE 1989) bzw. mit Kollagen und Arachidonsäure (WILLIS et al.
1989).
Die für die Thrombozytopathie bei Lebererkrankungen verantwortlichen Mechanismen sind noch nicht vollständig geklärt. Der Literatur sind vorwiegend für den Menschen Erklärungsversuche zu entnehmen, unter anderem ein Coating der Thrombozytenoberfläche durch Fibrin(ogen)spaltprodukte, die durch die primäre Aktivierung des fibrinolytischen Systems in einer erhöhten Konzentration vorliegen (Mensch: THOMAS et al. 1967; BALLARD u.
MARCUS 1976; Hund: REAGAN u. REBAR 1995). Weiterhin wird eine veränderte Lipidzusammensetzung der Thrombozytenmembran, resultierend in einer reduzierten Arachidonsäureverfügbarkeit, als Ursache für eine Plättchen- funktionsstörung angegeben (OWEN et al. 1981). Auch die Plasma- konzentration von Bilirubin (SUVANSRI et al. 1969; MAURER u. CAUL 1972) und eine erhöhte Konzentration an Gallensäuren (BOWEN et al. 1988) werden als inhibitorische Elemente angeführt, wobei Bilirubin durch Hemmung ATP-ADP-abhängiger Systeme der Thrombozyten zu Abnormalitäten von Plättchenfunktion und -morphologie führen soll (SUVANSRI et al. 1969).
Daneben sehen VIOLI et al. (1994) eine weitere mögliche Ursache für eine beeinträchtigte primäre Hämostase in der bei ihren Patienten festgestellten Hypofibrinogenämie.
Auch beim portosystemischen Shunt konnte eine Beeinträchtigung der primären Hämostase festgestellt werden. So beobachteten WILLIS et al. (1989) in ihrer Studie bei Hunden mit portosystemischem Shunt eine im Vergleich mit einer Kontrollgruppe reduzierte Aggregationsneigung in vitro nach Stimulation mit Kollagen (Endkonzentration im Testansatz: 5 µg/ml) und Arachidonsäure (Endkonzentration im Testansatz: 50 µg/ml). Ebenso wies der in der Arbeit von
SCHULZE (1998) untersuchte Hund mit portosystemischem Shunt deutlich reduzierte Aggregationsmaxima nach Stimulation mit Kollagen bzw. ADP in verschiedenen Endkonzentrationen auf. Als eine mögliche Ursache dieser Plättchenfunktionsstörung beim portosystemischen Shunt führen SHINYA et al.
(1996) die bei diesem Krankheitsbild häufig vorliegende Hyperammonämie an.
In ihrer Studie an Ratten ergab sich bei Blutproben von Tieren, bei denen experimentell eine Hyperammonämie erzeugt worden war, eine reduzierte Thrombin-induzierte Plättchenaggregation im Vergleich mit Blutproben von gesunden Kontrolltieren.
2.2.5. Canine Leishmaniose
Das Krankheitsbild der Leishmaniose ist bei Hunden häufig verbunden mit klinischen Anzeichen einer gestörten Hämostase wie Epistaxis (FERRER 1994) und Hämaturie (BINHAZIM et al. 1992; FERRER 1994). Verantwortlich für diese Hämostasestörung könnten eine Vaskulitis (PUMAROLA et al. 1991), eine disseminierte intravasale Gerinnung (FONT et al. 1994), eine Thrombo- zytopenie (FERRER 1994) oder auch Plättchenfunktionsstörungen (MORENO et al. 1998; VALLADARES et al. 1998) sein. So belegten MORENO et al.
(1998) in ihrer Studie an 26 Hunden mit Leishmaniose eine Beeinträchtigung der primären Hämostase anhand der Messung der kapillären In-vivo- Blutungszeit. Diese war bei den infizierten Hunden gegenüber der Kontrollgruppe signifikant verlängert, zudem innerhalb der Leishmaniose- Gruppe signifikant länger bei Hunden mit einer Kreatininkonzentration
>1,5mg/dl gegenüber Hunden mit im Referenzbereich liegender Kreatininkonzentration. Hingegen wiesen die kapillären In-vivo-Blutungszeiten von Hunden mit hohen und Hunden mit normalen Plasma-Konzentrationen der Alanin-Amino-Transferase keine deutlichen Unterschiede auf. Keine signifikanten Unterschiede ergaben sich in der Thrombozytenzahl zwischen gesunden und erkrankten Hunden. Auch VALLADARES et al. (1998) untersuchten die Plättchenfunktion bei experimentell mit Leishmania infantum infizierten Hunden anhand der Plättchenaggregation mit Kollagen als Aggregationsinduktor, wobei sich ein deutlich reduziertes Aggregationsmaximum ergab.
Als kausale Faktoren der Plättchenfunktionsstörung bei der Leishmaniose des Hundes werden die gegebenenfalls vorliegende Urämie (MORENO et al. 1998) sowie die in mehreren Studien belegte erhöhte Plasmakonzentration zirkulierender Immunkomplexe (u.a.: SLAPPENDEL 1988; LOPEZ et al. 1996) diskutiert.
2.2.6. Leukämie
Beim Menschen wie beim Hund mit Leukämie wurde neben Veränderungen der plasmatischen Gerinnung (Mensch: GRALNICK et al. 1972; FRENCH u.
LILLEYMAN 1979; GUARINI et al. 1980; SPEISER et al. 1990;
TÖRNEBOHM et al. 1992; TALLMAN et al. 1993; Hund: MISCHKE et al.
1998a) sehr häufig auch eine Thrombozytopenie (Mensch: GRALNICK et al.
1972; FRENCH u. LILLEYMAN 1979; Hund: MATUS et al. 1983; COUTO 1985; HENRY et al. 1996) beobachtet. Letztere wird unter anderem durch die Verdrängung der Megakaryozyten im Knochenmark und die Splenomegalie verursacht (gilt nicht bei chronischen Leukämien) (SPEISER et al. 1990;
MISCHKE et al. 1998a). Darüber hinaus wurde - jedoch bislang nur beim Menschen - auch eine Beeinträchtigung der Plättchenfunktion festgestellt (PUI et al. 1982; WOODCOCK et al. 1984; MOHRI 1986; NARESH et al. 1993). So fand sich in diesen Studien bei Patienten mit akuter bzw. chronischer myeloischer Leukämie (u.a. auch akuter megakaryoblastischer Leukämie) sowie akuter lymphoblastischer Leukämie eine abnormale Plättchenaggregation und Plättchenfreisetzungsreaktion bzw. eine veränderte In-vivo-Blutungszeit.
Der kausale Hintergrund dieser somit in Verbindung mit verschiedenen Leukämieformen auftretenden Plättchenfunktionsstörung ist jedoch noch nicht hinreichend geklärt. Vermutlich liegen auch hier verschiedene Ursachen zugrunde. COWAN et al. (1975) belegten in einer Untersuchung bei Patienten mit akuter bzw. chronischer myeloischer Leukämie neben verschiedenen ultrastrukturellen Veränderungen der Thrombozyten eine verminderte intrazelluläre Adeninnukleotid-Konzentration sowie eine beeinträchtigte Kollagen-induzierte Freisetzungsreaktion von Adeninnukleotiden. Ein Storage- Pool-Defekt wurde auch in anderen Studien bei Patienten mit chronischer myeloischer Leukämie festgestellt (GERRARD et al. 1978; PARETI et al. 1982;
MOHRI 1986). JUBELIRER et al. (1980) und PARETI et al. (1982) wiesen eine Beeinträchtigung des Arachidonsäuremetabolismus bei chronischer myeloischer Leukämie nach. Zudem wurde über das Vorkommen der erworbenen Form der Willebrand-Erkrankung bei chronischer lymphatischer bzw. myeloischer Leukämie berichtet (MANNUCCI et al. 1984; MOHRI 1986; RINDER et al.
1997).
Auch beim Hund wurden in einer Studie bei experimentell durch Bestrahlung erzeugter myeloischer Leukämie morphologische Veränderungen der Thrombo- zyten beobachtet (SEED et al. 1977). So waren im peripheren Blut Riesenplättchen und Megakaryozytenfragmente nachzuweisen, von denen einige große Einschlußkörperchen und eine zentrale Vereinigung von Granula, Kanälen und Anteilen des tubulären Systems enthielten. Es sind der
zugänglichen Literatur bislang jedoch keine Untersuchungen zu Plättchenfunktionsstörungen bei der Leukämie des Hundes zu entnehmen.
2.2.7. Malignes Lymphom
Wie bei der Leukämie sind auch beim malignen Lymphom neben Veränderungen der Thrombozytenzahl (Mensch: UESUGI et al. 1997; Hund:
HELFAND 1988; GRINDEM et al. 1994) Störungen der Plättchenfunktion beschrieben worden (Mensch: BERTOLINO et al. 1991; MALIK et al. 1998;
Hund: MCNIEL et al. 1997; THOMAS u. ROGERS 1999). So wurde in einer Fallstudie bei einem Menschen mit Blutungssymptomatik, milder Thrombozyto- penie sowie stark beeinträchtigter Plättchenaggregation und -freisetzungs- reaktion ein Non-Hodgkin-Lymphom diagnostiziert (BERTOLINO et al. 1991).
In einer anderen Fallbeschreibung eines Menschen mit Hodgkin-Lymphom wies der Patient zunächst keine Blutungssymptomatik auf. Einige Monate nach Therapieende traten jedoch spontan Ekchymosen und rektale Blutungen auf. Die erst zu diesem Zeitpunkt durchgeführten Plättchenfunktionstests ergaben eine beeinträchtigte Plättchenaggregation sowie eine verlängerte In-vivo-Blutungs- zeit (MALIK et al. 1998). Bei letztgenanntem Patienten war die lympho- proliferative Erkrankung assoziiert mit einer erworbenen Thrombasthenie. Eine weitere mögliche Ursache einer Plättchenfunktionsstörung beim Non-Hodgkin- Lymphom stellt zumindest beim Menschen das Vorliegen einer erworbenen Willebrand-Erkrankung dar, welche bei 10% der Patienten mit Non-Hodgkin- Lymphom auftreten soll (RINDER et al. 1997).
Andererseits wurde bei Menschen mit verschiedenen nicht näher differenzierten hämatologischen Tumorerkrankungen auch eine erhöhte Plättchenreaktivität beobachtet (DAVIS et al. 1969). Auch beim Hund ist eine Steigerung der Plättchenaggregation und/oder Plättchensekretion bei lymphoproliferativen Erkrankungen beschrieben worden (MCNIEL et al. 1997; THOMAS u.
ROGERS 1999). So ergaben sich in der Studie von THOMAS und ROGERS (1999) bei Hunden mit einem multizentrischen Lymphom mit allen verwendeten Agonisten (Plättchenaktivierender Faktor, ADP, Kollagen) deutlich höhere Aggregationsmaxima im Vergleich zur Kontrollgruppe (gesunde Hunde). In diese Untersuchung gingen 15 Hunde mit unbehandeltem multizentrischen Lymphom ein, die weder Veränderungen der Thrombozytenzahl noch klinische Anzeichen einer Blutgerinnungsstörung aufwiesen. Neben der Vollblut- aggregometrie wurde die Freisetzung von ADP aus den dichten Granula überprüft, wobei sich jedoch zwischen den Patienten und der Kontrollgruppe kein signifikanter Unterschied ergab. Ähnliche Ergebnisse (unter anderem höhere Aggregationsmaxima der Kollagen-induzierten Aggregation im
Vergleich mit einer Kontrollgruppe gesunder Hunde) wurden für die Plättchenaggregation bei Hunden mit verschiedenen Tumorerkrankungen - darunter auch hämatologische wie das Lymphom - von MCNIEL et al. (1997) erzielt. Sie führen als mögliche Ursache dieser Hyperaggregabilität eine veränderte Lipidzusammensetzung der Plasmamembran, das Vorliegen vorwiegend junger Plättchen oder ein Ansteigen aggregationsinduzierender Faktoren im Serum an.
2.2.8. Multiples Myelom
Bei dem multiplen Myelom, einer beim Menschen wie beim Hund selten auftretenden Neoplasie der Plasmazellen, wurde in Untersuchungen beim Menschen neben anderen Störungen des Gerinnungssystems auch eine beeinträchtigte Thrombozytenfunktion nachgewiesen (KASTURI u. SARAYA 1978; DI MINNO et al. 1986; ROBERT et al. 1993). Daß auch beim Hund eine Störung der primären Hämostase an der häufig beobachteten Blutungsneigung bei Myelompatienten beteiligt ist, deckten einige Studien übereinstimmend unter anderem anhand der Messung der kapillären In-vivo-Blutungszeit auf, welche gegenüber den Referenzwerten deutlich verlängert war (SHEPARD et al. 1972;
HAMMER u. COUTO 1994; RUIZ DE GOPEGUI et al. 1994; MISCHKE et al.
2000). Darüber hinaus ergaben sich in diesen Untersuchungen Beein- trächtigungen der Plättchenadhäsivität (SHEPARD et al. 1972) sowie der Plättchenaggregation (reduzierte Aggregationsmaxima mit den Aggregations- induktoren ADP, Kollagen und Thrombin) (MISCHKE et al. 2000).
Der kausale Hintergrund dieser Plättchenfunktionsstörungen ist noch nicht hinreichend geklärt. Eine unspezifische Anlagerung von Paraproteinen an die Thrombozytenoberfläche wird als eine mögliche Ursache angeführt (SHULL et al. 1978; MANNUCCI et al. 1984; DI MINNO et al. 1986; BICK 1992; RUIZ DE GOPEGUI et al. 1994). Aber auch Thrombozytenmembrandefekte (GEORGE u. NURDEN 1994; SCHARF 1996), eine erworbene Willebrand- Erkrankung (GLASPY 1992; RINDER et al. 1997), erworbene Speicherdefekte sowie Störungen im Arachidonsäure- (EY u. GOODNIGHT 1990) oder Glykogenmetabolismus (AGAM et al. 1977) werden diskutiert.
3. Labormethoden zur Überprüfung der Thrombozytenfunktion
Zur Analyse der Thrombozytenfunktion existieren für den Menschen eine Vielzahl von Testsystemen bzw. -verfahren, von denen viele auch beim Hund bereits in verschiedenen Untersuchungen Anwendung fanden. Die einzelnen Methoden unterscheiden sich unter anderem im Aufwand für die Probenvorbereitung oder auch in der Aussagekraft. Während einige spezifisch die Plättchenfunktion überprüfen wie zum Beispiel die Plättchenaggregation, geben andere einen Überblick über den Ablauf der gesamten Hämostase wie zum Beispiel die Thrombelastographie und die Resonanzthrombographie. Im folgenden werden einige der auch beim Hund häufiger angewendeten und der aktuellen Methoden erläutert.
3.1. Kapilläre In-vivo-Blutungszeit
Mit der kapillären In-vivo-Blutungszeit ist es sowohl möglich, einen Thrombozytenmangel als auch eine Thrombozytenfunktionsstörung (bei normaler Thrombozytenzahl) zu diagnostizieren (NOLTE et al. 1994b). Seit der ersten Beschreibung (DUKE 1910) wurden zahlreiche weitere Methoden zur Bestimmung der kapillären In-vivo-Blutungszeit entwickelt, von denen heute beim Menschen das Verfahren nach Ivy modifiziert nach MIELKE et al. (1969) bevorzugt wird (WITT u. PATSCHEKE 1997; GAWAZ 1999). Die Blutungszeit umfaßt bei all diesen Methoden die Zeitspanne, in der es nach einer Hautinzision zum Blutungsstillstand kommt (GAWAZ 1999). Bei der Methode nach MIELKE et al. (1969) wird nach Anlegen einer Stauung von 40mm Hg am Oberarm mit einem entsprechenden Gerät („Template“) am Unterarm ein Schnitt von 1 mm Tiefe und 9 mm Länge gesetzt und das aus dieser Wunde austretende Blut im Abstand von 30 sec mit einem Filterpapier so lange abgesaugt, bis ein Stillstand der Blutung eingetreten ist. Modifikationen dieser Methode unterscheiden sich durch Verwendung anderer Geräte zur Durchführung der Hautinzision („Simplate I“, „Simplate II“) von der erstbeschriebenen Methode nach MIELKE et al. (1969) in erster Linie in Länge und Art des Schnittes (MIELKE 1984; WITT u. PATSCHEKE 1997). Bei einer entsprechenden subaqualen Methode wird eine Inzision am Ohrläppchen gesetzt, das Ohrläppchen in ein Wasserbad von 37°C getaucht und die Zeit bis zum Abreißen des niedersinkenden Blutfadens gemessen (WITT u.
PATSCHEKE 1997).
Auch für den Hund wurden verschiedene Techniken zur Bestimmung der kapillären In-vivo-Blutungszeit beschrieben, die sich unter anderem in Tiefe und Lokalisation der Inzision unterscheiden (BROOKS u. CATALFAMO 1993). Zu
diesen Techniken zählen zum Beispiel die Bestimmung der Blutungszeit an der Mundhöhlenschleimhaut (u.a.: JERGENS et al. 1987; BROOKS u.
CATALFAMO 1993; SCHERMERHORN et al. 1994) und die von NOLTE et al. (1997) beschriebene Methode. Bei letztgenanntem Verfahren wird der unsedierte Hund in Seitenlage verbracht. Nach Rasur des Punktionsgebietes, des Übergangs von behaarter Haut und Ballenhorn der seitlichen Zehe der Vordergliedmaße, wird eine Blutdruckmanschette über Radius und Ulna dieser Gliedmaße angelegt, auf das geschorene Hautareal eine hyperämisierende Salbe aufgetragen und eine Stoppuhr gestartet. Nach Ablauf von einer Minute wird die Salbe mit einem Mulltupfer entfernt und die Blutdruckmanschette mit einem Druck von 70 mmHg aufgeblasen. Nach Ablauf einer weiteren Minute erfolgt 1- 3 mm oberhalb der Ballengrenze zweimalig im Abstand von ½ cm eine Punktion mit einer automatischen Blutlanzette. Bei Aufrechterhaltung der Druckverhältnisse werden die frei fließenden Blutperlen alle 15 sec vorsichtig mit einem Mulltupfer abgesaugt. Die Zeit von der Punktion bis zum vollständigen Versiegen der Blutungen wird als kapilläre In-vivo-Blutungszeit gemessen und aus den beiden sich ergebenden Werten der Mittelwert gebildet (Referenzbereich nach ADAMIK u. MISCHKE 1998: 0,75 – 2,25 min).
Zur Anwendung kam diese Methode zum Beispiel in einem Blutungsmodell, an dem unterschiedliche Therapieverfahren zur Behandlung thrombozyten- abhängiger hämorrhagischer Diathesen untersucht wurden (AMMELOUNX u.
NOLTE 1987; NOLTE et al. 1988a; NOLTE et al. 1994a, b). Hierbei wurde durch intravenöse Applikation von Azetylsalizylsäure bei klinisch gesunden Hunden eine Thrombozytopathie mit verlängerter kapillärer Blutungszeit und irreversibler Aggregationshemmung hervorgerufen.
3.2. Thrombozytenaggregation
Zu den aggregometrischen Verfahren zur Bestimmung der Thrombozyten- funktion zählen unter anderem das turbimetrische Verfahren nach BORN (1962) und die Vollblutaggregometrie (GAWAZ 1999). Erstgenannte Methode beruht auf der photometrischen Erfassung der Trübungsabnahme im plättchenreichen Plasma nach Zusatz von aggregationsauslösenden Substanzen wie ADP, Kollagen oder Thrombin. Die Transmissionsänderung wird als Kurve aufgezeichnet (BORN 1962).
Die Born-Methode fand beim Hund neben den im vorhergehenden Abschnitt bereits erwähnten Studien (NOLTE et al. 1988a, 1994a) auch in verschiedenen anderen klinischen (SCHULZE 1998) wie experimentellen (NOLTE u.
MISCHKE 1995; KLEIN et al. 1999; MISCHKE u. NIMMERFALL 2000) Studien Anwendung. Letztere betrafen unter anderem die Überprüfung des
Einflusses von Lagerungsdauer und/oder Lagerungsbedingungen auf die Qualität von Vollblut bzw. Thrombozytenkonzentraten (NOLTE u. MISCHKE 1995; KLEIN et al. 1999).
Die Vollblutaggregometrie oder Impedanzmethode basiert auf der Messung von Änderungen des elektrischen Widerstandes zwischen zwei Platinelektroden infolge der Anlagerung von Thrombozyten bei Stromfluß (CARDINAL u.
FLOWER 1980; GAWAZ 1999). Die Ergebnisse sind denen der optischen Messung vergleichbar (GAWAZ 1999).
Auch diese Methode kam bereits in verschiedenen Untersuchungen beim Hund zum Einsatz (FORSYTHE et al. 1989; BARR et al. 1992; GRAUER et al. 1992;
SCHERMERHORN et al. 1994; SOLOVIEV et al. 1999). So wurden zum Beispiel in der Studie von FORSYTHE et al. (1989) Untersuchungen zur Vollblutaggregometrie bei Hunden mit Urämie durchgeführt, in der Studie von BARR et al. (1992) wurde der Einfluß einer Sedation mit Azepromazin und darauffolgender Anästhesie auf die Thrombozytenaggregation und die Adenosintriphsophat-Freisetzung der Plättchen überprüft.
3.3. Messung der Plättchenadhäsion
Zur Messung der Plättchenadhäsion sind verschiedene Techniken beschrieben worden, von denen nur wenige spezifisch die Plättchenadhäsion erfassen, die Mehrheit dagegen die Plättchenadhäsion und -aggregation bestimmt (WILLIAMS et al 1985). Bei diesen Tests wird Blut oder plättchenreiches Plasma verschiedenen Oberflächen ausgesetzt (MOOLTEN u. VROMAN 1949;
ZBINDEN u. TOMLIN 1969; MASON u. GILKEY 1971; GEORGE 1972;
CAZENAVE et al. 1973). Das am häufigsten verwendete Testverfahren ist der Glasperlen-Säulen-Test oder Thrombozytenretentionstest (HELLEM 1960). Der Nachteil dieser Methode gegenüber anderen Plättchenfunktionstests liegt in der schwierigen Standardisierbarkeit und der geringen Spezifität in der Erfassung einer Plättchenadhäsionsstörung (WILLIAMS et al. 1985; YARDUMIAN et al.
1986).
Auch beim Hund fand dieser Plättchenfunktionstest Anwendung. So wurde in der Studie von SHEPARD et al. (1972) bei einem Hund mit Myelom neben einer verlängerten In-vivo-Blutungszeit auch eine reduzierte Plättchenadhäsion gemessen.
3.4. Resonanzthrombographie
Die Resonanzthrombographie, die im erweiterten Sinn zu den Globaltests der Hämostase zählt, zeichnet ebenso wie die Thrombelastographie den gesamten
Gerinnungsablauf in Form einer Kurve auf. Sie registriert durch einen in Orbitalbewegung schwingenden Stempel die dreidimensionale Scherbean- spruchung des Thrombus. Als Meßgröße wird der Radius der Orbitalbewegung verwandt, der vom variablen Resonanzeffekt der entstehenden elastischen Fibrinstruktur abhängt (MISCHKE 1997). Die Resonanzthrombographie stellt eine Weiterentwicklung der Thrombelastographie dar, ermöglicht eine Unter- scheidung des Effektes der Fibrinbildung und der Thrombozytenaktivität (HARTERT 1981, 1983; MISCHKE 1997) und läßt so eine gewisse Aussage über die Thrombozytenfunktion zu.
In verschiedenen Arbeiten beim Menschen erwies sich die Resonanz- thrombographie grundsätzlich zur Aufdeckung von Thrombozytopenien und Thrombozytopathien sowie zur Effektivitätskontrolle einer Thrombozyten- substitution als geeignet (HILLER u. SCHAAL 1981; HILLER et al. 1982;
ANDERS et al. 1985). Jedoch wurde über das Auftreten falsch negativer Ergebnisse bei einer Thrombozytenzahl = 25.000/µl berichtet (HARTERT 1983). In einer systematischen Untersuchung beim Hund (MISCHKE u.
ADAMIK 1998) wurde die geringe Sensitivität der Resonanzthrombographie zum Nachweis einer Thrombozytopenie aufgedeckt. Beim Menschen führten weiterhin die Thrombasthenie und Thrombozytosen zu einem von der Norm abweichenden Kurvenbild des Resonanzthrombogramms. Keine Veränderung der Meßparameter ergab sich bei Menschen mit Thrombopathien mit defekter Aggregation oder Adhäsion (HILLER et al. 1982). Über die Aussage der Methode bei Thrombozytenfunktionsstörungen des Hundes lassen sich der zugänglichen Literatur keine Angaben entnehmen.
3.5. Durchflußzytometrie
Bei der Durchflußzytometrie werden die in einer Suspension befindlichen Zellen unter Messung des Absorptionsspektrums nach Kontakt mit einem Laserstrahl einzeln analysiert. Das Streulicht und die Intensität der Fluoreszenz werden durch spezifische Photodioden registriert (GIVAN 1992; GRINDEM 1996;
GAWAZ 1999). So kann die Größe und die Granularität der Plättchen sowie die Oberflächenexpression von Antigenen nach Bindung eines fluorochrom- konjugierten Antikörpers bestimmt werden (GAWAZ 1999).
Diese Methode ermöglicht zum Beispiel in Verbindung mit fluorochrom- markierten, monoklonalen Antikörpern oder Substanzen die Analyse spezifischer Veränderungen der aktivierten Plättchenoberfläche. Zudem kann der aus den Plättchengranula sezernierte Inhalt, die Bindung von Liganden und der intrazelluläre Kalziumstrom nach Stimulation der Thrombozyten durch einen Agonisten quantifiziert werden (RINDER 1998; GAWAZ 1999).
Die Durchflußzytometrie fand bereits in verschiedenen Untersuchungen zur Plättchenfunktion beim Hund Anwendung (BOUDRAUX et al. 1994, 1996a, b;
PENG et al. 1994). So wurde zum Beispiel in der Studie von PENG et al. (1994) anhand der Durchflußzytometrie der Einfluß von Interleukin-6 auf die Plättchenfunktion beim Hund untersucht. Hierzu wurde durch Thrombin bzw.
Plättchenaktivierenden Faktor eine Plättchenaktivierung induziert und diese anhand der Expression von P-Selektin auf der Plättchenoberfläche durch Bindung eines monoklonalen Antikörpers bestimmt. In der Untersuchung von BOUDREAUX et al. (1996a) wurde neben anderen Methoden anhand der Durchflußzytometrie die Thrombasthenie Typ I bei einem Hund diagnostiziert.
Hierbei kamen verschiedene canine bzw. kreuzreagierende humane monoklonale Antikörper gegen die Plättchenglykoproteine aIIb und ß3 zur Anwendung.
3.6. Plättchenfunktionsanalysengeräte 3.6.1. Geräteaufbau
Die Konstruktion des für den Routinegebrauch zur Verfügung stehenden Plättchenfunktionsanalysengerätes PFA-100 baut auf der Technik des Vorläufergerätes Thrombostat 4000 (VDG, von der Goltz, Seeon, Deutschland) auf.
Das Konzept des Vorläufergerätes Thrombostat 4000 wurde von Kratzer und Born im Jahre 1985 entworfen und 1991 von von der Goltz zu einem Meßgerät weiterentwickelt (KRATZER u. BORN 1985; KRATZER et al. 1985; KUNDU et al. 1994, 1995; MAMMEN et al. 1995). Die meisten der hervorstechenden Nachteile des Thrombostat 4000 konnten bei der Konstruktion des neuen Systems behoben werden, wie z.B.:
• Das Gerät Thrombostat 4000 arbeitete mit Einweg-„Filtern“, die Kapillaren wurden jedoch mehrmals verwendet, was eine aufwendige Reinigung und Trocknung bedeutete, die bei mangelhafter Ausführung zu fehlerhaften Testergebnissen führte. Während der Bedienung und nach Beendigung des Tests kam der Benutzer in Kontakt mit der Blutprobe, was vor allem bei humanem Probenmaterial ein potentielles Gesundheitsrisiko darstellte. Das Plättchenfunktionsanalysengerät PFA- 100 arbeitet hingegen mit die Kapillare enthaltenden Einweg-Meßzellen, die nach der Messung ohne Kontakt zur Blutprobe entsorgt werden (KUNDU et al. 1995; MAMMEN et al. 1995).
• Die Patronen des Gerätes Thrombostat 4000 enthielten nur Kollagen. Eine Lösung aus Adenosin-Diphosphat (ADP), Epinephrin, Natriumchlorid
oder Kalciumchlorid wurde vor dem Test von außen zugegeben im Gegensatz zu den Meßzellen des Plättchenfunktionsanalysengerätes PFA- 100, die alle bioaktiven Bestandteile in der Membran enthalten (ALSHAMEERI u. MAMMEN 1995; KUNDU et al. 1995; MAMMEN et al. 1995).
• Insgesamt war die Benutzung des Vorläufergerätes Thrombostat 4000 sehr arbeitsintensiv und daher kostspielig, weswegen es nie als Instrument für den Routinegebrauch im Labor betrachtet wurde (KUNDU et al. 1995;
MAMMEN et al. 1995).
Das Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100 wurde zur In-vitro-Bestimmung der primären Hämostase in Zitratblutproben entwickelt (KUNDU et al. 1994, 1995; MAMMEN et al. 1995) und enthält folgende wichtige Bestandteile: 1.
System zum Probentransport und zur Inkubation, 2. System zur Vakuumkontrolle, 3. System zur Datenverwaltung, 4. Instrumentenkontrolle und 5. System zur Zugabe der Starterlösung. Das Gerät kann im selbständigen Modus ohne Anschluß an einen externen Computer oder computergesteuert mit Hilfe der Datenmanager-Software eines externen Computers betrieben werden.
Optional erhältlich ist ein Strichkodelesegerät (KUNDU et al. 1995).
Abb. 1: Vereinfachte Darstellung der Funktionselemente des Plättchenfunktions- analysengerätes PFA-100 (aus: Bedienungsanleitung für PFA-100).
Die Meßzelle des Plättchenfunktionsanalysengerätes PFA-100 simuliert das verletzte Blutgefäß und besteht aus einem Probenreservoir und einer Kapillare, an deren Ende sich eine biologisch aktive Membran mit einer zentralen Öffnung befindet (KUNDU et al. 1994, 1995; COMP et al. 1997; CATTANEO et al.
1999b) (Abb. 1). Durch die Kapillare wird das Vollblut unter konstantem Vakuum aus dem Probenreservoir zur Membran angesaugt. Die Kapillare ahmt dabei die Durchflußbedingungen in einem Blutgefäß nach. Die Membran ist mit Kollagen und ADP bzw. bei einem zweiten Meßzellentyp mit Kollagen und Epinephrin beschichtet (KUNDU et al. 1994, 1995; CARCAO et al. 1997;
FRESSINAUD et al. 1997; HEILMANN et al. 1997; RAND et al. 1998;
CATTANEO et al. 1999b). Aufgrund der Stimulation mit diesen biologischen Wirkstoffen und der hohen Scherkräfte lagern sich die Thrombozyten am Rand der Membranöffnung an und aggregieren auf der Kollagenoberfläche (KUNDU et al. 1994, 1995, 1996; RAND et al. 1998).
An der Bildung der Plättchenaggregate ist hierbei der Willebrandfaktor maßgeblich beteiligt, was durch elektronenmikroskopische und immunologische Untersuchungen der Aggregate belegt wurde (POUJOL et al. 1998). Der entstehende Plättchenthrombus verengt die Öffnung immer mehr, bis sie vollständig verschlossen ist (HEILMANN et al. 1997; WILMER et al. 1997;
RAND et al. 1998; CATTANEO et al. 1999b). Das Analysengerät überwacht den Durchfluß des Blutes kontinuierlich. Sobald er zum Stillstand kommt, ist der Test beendet. Das Testergebnis gibt in Form der Verschlußzeit die Zeit vom ersten Membrankontakt der Probe bis zum vollständigen Membranverschluß an (KUNDU et al. 1994, 1995; CARCAO et al. 1997; FRESSINAUD et al. 1997;
WILMER et al. 1997; HEILMANN et al. 1997). Neben dieser Meßgröße, welche die In-vitro-Blutungszeit darstellt, kann das Gesamtvolumen des Blutes, das während der Messung durch die Kapillare fließt, optional ausgedruckt werden (DE HAAN u. KOLDE 1996).
Abb. 2: Schematische Darstellung der Bestandteile der Meßzellen des Plättchen- funktionsanalysengerätes PFA-100 (A-Außenansicht, B-Querschnitt) (aus:
KUNDU et al. 1995).
Die Meßzellen des Plättchenfunktionsanalysengerätes sind Einwegartikel. Die einteiligen Patronen bestehen aus einer Behälter/Kapillaren-Konstruktion und einem Gehäuse bzw. Probenreservoir (Abb. 2A, 2B). Die Behälter/Kapillaren- Konstruktion enthält einen Polypropylenbehälter, in den eine biologisch aktive Membranscheibe eingefügt ist. Im Zentrum der Membranscheibe befindet sich eine durch eine mechanische Präzisions-Stanzvorrichtung erzeugte Öffnung von 147 µm Durchmesser. Eine Polypropylen-Nabe, welche eine Kapillare aus rostfreiem Stahl enthält (innerer Durchmesser: 200 µm), ist durch Ultraschall am Boden des Behälters befestigt. Eine dünne Trennmembran aus Plastik, die sich am oberen Teil des Probenreservoirs befindet, verhindert den Kontakt des Blutes mit der Kapillare während der Inkubationszeit. Zu Beginn einer Bestimmung wird die Kapillare mit Hilfe des Vakuumanschlusses durch die Trennmembran in das Probenreservoir hinabgezogen. Nach der Passage durch die Öffnung sammelt sich das Abfallblut in dem Behälter; die gesamte Meßzelle wird am Ende der Bestimmung verworfen (KUNDU et al. 1995).
Die biologisch aktive Membran ist eine Standard-Nitrozellulosefiltrations- membran mit einer mittleren Porengröße von 0,45 µm. Die Bluteintrittsseite der Membran ist mit 2 µg fibrillärem Kollagen Typ I aus der Pferdesehne und 10 µg Adrenalinbitartrat (Epinephrin) oder 50 µg Adenosin 5`-Diphosphat (ADP) beschichtet (KUNDU et al. 1994, 1995; RAND et al. 1998).
Behälter/Kapillaren- Konstruktion
Meßzellen-
Typenbezeichnung Proben-
Einfüllöffnung
Gehäuse/Proben- Reservoir
Vakuumanschluß Behälter/Kapillaren- Konstruktion
beschichtete Membran Kapillare Blutprobe Gehäuse/Proben- Reservoir
A B
Die PFA-100-Meßzellen werden in eine Kassette eingesetzt, welche das Inkubationssystem zur Erwärmung der Probe auf 37°C vor der Analyse enthält.
Die Kassette wiederum wird in ein Karussell gestellt, welches sich zu Beginn der Messung dreht und die Meßzellen so unter den Vakuumanschluß im Inneren des Geräts plaziert. Eine isotonische Standardlö sung mit 0,9 % Kochsalz dient als Starterlösung, von der eine festgelegte Menge vor Beginn der Inkubationszeit an die Membran der Meßzellen abgegeben wird, um ADP oder Epinephrin in Lösung zu bringen. Am Ende des Testablaufs kehrt das Karussell in seine Ausgangsposition zurück, so daß die gebrauchten Patronen entfernt und entsorgt werden können. Die Proben können einzeln oder doppelt gemessen werden. Bei der Erhebung von Doppelwerten werden die Proben nacheinander gemessen (KUNDU et al. 1995).
3.6.2. Präanalytische Untersuchungen
Der zugänglichen Literatur sind zu präanalytischen Untersuchungen mit dem Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100 ausschließlich Ergebnisse für den Menschen zu entnehmen. Für den Hund liegen hierzu bislang keine Ergebnisse vor.
3.6.2.1. Geräteparameter
KRETSCHMER et al. (1990) und DIETRICH et al. (1995a) untersuchten am Vorläufergerät verschiedene Variablen, welche die Meßergebnisse beim Menschen beeinflussen, und empfahlen bestimmte Standardisierungen für die Routineanwendung und Modifikationen für den speziellen Gebrauch.
Geräteparameter mit statistisch signifikantem Einfluß waren der Durchmesser der Filteröffnung und der Kapillare, die Aggregationsreagenzien und ihre Konzentration, die Methode der Kapillartrocknung und der Aspirationsdruck (DIETRICH et al. 1995a). Bezüglich dieser getesteten Parameter gaben DIETRICH et al. (1995a) folgende Standardisierungsempfehlungen für den Routinegebrauch: Die Öffnung der Kollagen-beschichteten Filter sollte 150 µm, der Aspirationsdruck 40 mbar betragen. Ebenso erforderlich sei eine sorgfältige Fixation einer sauberen und trockenen Kapillare, die eine Länge von 32 mm und einen Innendurchmesser von 200 µm aufweisen sollte, und der Zusatz von 40 µl CaCl2 (2 mmol/l) oder 40 µl ADP (4 mmol/l) auf die Mitte des Filters. Zudem sollte vor der Messung eine Erwärmung der im Kühlschrank aufzubewahrenden Filter und der Blutprobe für 4 Minuten bei 37°C erfolgen (DIETRICH et al.
1995a).
Weitere Untersuchungen am Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100 wie am Vorläufergerät betrafen die Möglichkeit der aufeinanderfolgenden Bestimmung von zwei Proben im Verlauf einer Messung bei gleichzeitigem Verbringen der befüllten Meßzellen in die Meßkammern (Postion A und Position B). Im Hinblick auf eine eventuell stattfindende Sedimentation der zuletzt bestimmten Probe (Position B) führten mit Humanblut durchgeführte Studien zu unterschiedlichen Ergebnissen. Während in einer Arbeit zum Plättchen- funktionsanalysengerät PFA-100 mit der Kollagen/ADP-Meßzelle signifikante Unterschiede der Verschlußzeiten zwischen den beiden Positionen festgestellt wurden - ohne Angabe genauer Werte - (KARGER et al. 1997), zeigten sich in anderen Untersuchungen bei beiden Meßzellen keine klinisch relevanten Unterschiede (MAMMEN et al. 1995; WILMER et al. 1997; MAMMEN et al.
1998). Ein Vergleich der Meßergebnisse der beiden Kanäle des Vorläufergeräts ergab in einer anderen Untersuchung mit ADP als Primer ebenfalls keine signifikanten Unterschiede (ALSHAMEERI u. MAMMEN 1995).
3.6.2.2. Einfluß der verwendeten Probengefäße und -zusätze
Vergleichende Untersuchungen beim Menschen am Plättchenfunktions- analysengerät PFA-100 zu verschiedenen Blutsammelsystemen und Antikoagulanzien ergaben im wesentlichen übereinstimmende Ergebnisse. In verschiedenen Untersuchungen führte die Verwendung des Vacutainers mit 0,129 M gepuffertem Natriumzitrat zu höheren Verschlußzeiten im Vergleich mit Vacutainern, die mit 0,105 M gepuffertem Natriumzitrat beschickt waren (MAMMEN et al. 1995; HEILMANN et al. 1997; SIO et al. 1997). So wurde in einer Studie für die Kollagen/Epinephrin-Meßzelle mit 0,105 M Natriumzitrat ein Referenzbereich von 84-153 sec (Mittelwert: 113 sec) ermittelt, mit 0,129 M Natriumzitrat hingegen ein Referenzbereich von 89-165 sec (Mittelwert: 124 sec). In der gleichen Studie wurde für die Kollagen/ADP-Meßzelle mit 0,105 M Natriumzitrat ein Referenzbereich von 61-105 sec (Mittelwert: 80 sec) erarbeitet, während dieser bei Verwendung von 0,129 M Natriumzitrat bei 66- 115 sec (Mittelwert: 87 sec) lag (HEILMANN et al. 1997).
Ein ganz entscheidender Unterschied zeigte sich für die Thrombozyten- funktionsanalyse bei Patienten unter Azetylsalizylsäure-Therapie. Hierbei wurde die durch Azetylsalizylsäure induzierte Hemmwirkung erheblich sensitiver erfaßt mit Blutproben, die mit 129 mmol/l gepuffertem Natriumzitrat antikoaguliert waren, im Vergleich zu Proben, denen 106 mmol/l gepufferte Natriumzitratlösung zugesetzt wurde (VON PAPE et al. 1999). Zudem ergab sich in dieser Studie in einem gemessenen Zeitintervall von < 1 Minute bis 60 Minuten nach Blutentnahme bei 3,2%igem (106 mmol Natriumzitrat/l Blut)
