Probengewinnung und -behandlung 1. Blutentnahme

Die Blutentnahme erfolgte aus der Vena cephalica oder der Vena saphena mit sterilen Einmal-Injektions-Kanülen (1,1 × 30 mm) am stehenden Hund. Dabei wurden die betreffenden Gefäße nicht oder nur kurzzeitig leicht gestaut. Nach Verwerfung der ersten Blutstropfen wurde das frei nachfließende Blut in mit Antikoagulanz beschickten Probengefäßen aufgefangen. Dies betraf für die Untersuchung der kapillären In-vitro-Blutungszeit eine mit Zitronensäure-Natriumzitrat-Puffer (0,129 mol/l Zitrat) beschickte 2,9-ml-Monovette und gegebenenfalls zusätzlich für die Untersuchung der Plättchenaggregation (und der Willebrandfaktor-Konzentration) ein mit 1 ml 0,11 molarer Natriumzitrat-Lösung (1 Teil) befülltes Polyethylen-Zentrifugenröhrchen, welches bis zur 10 ml-Markierung mit Blut (9 Teile) gefüllt wurde. Nach Verschluß der Röhrchen wurde vorsichtig geschwenkt, um eine vollständige Durchmischung des Blutes mit dem Antikoagulanz zu gewährleisten. Für die Bestimmung weiterer hämatologischer und klinisch-chemischer Meßgrößen wurden außerdem 1 ml Kalium-EDTA-Blut und zweimal 1 ml Lithium-Heparinat-Blut (15 I.E.

Heparin/ml) entnommen.

3.2. Probenverarbeitung und Gewinnung von plättchenreichem und plättchenfreiem Plasma

Die Gewinnung von plättchenreichem Plasma (PRP) zur Messung der Thrombozytenaggregation erfolgte aus dem in dem 10 ml Polyethylen-Zentrifugenröhrchen aufgefangenen Zitratblut durch 30-minütige Zentrifugation in der Kühlzentrifuge bei 20°C und 150 × g. Der plättchenreiche Überstand wurde in ein Polyethylen-Zentrifugenröhrchen abpipettiert und für die Thrombozytenzählung bereitgehalten. Um plättchenfreies Plasma (PFP) zu erhalten, wurde ein Teil des PRP nochmals 10 min bei 10.000 × g zentrifugiert,

der Überstand ebenfalls abpipettiert und in Eppendorf-Reaktionsgefäßen aufbewahrt.

Zum Erhalt einer einheitlichen Thrombozytenzahl von 300.000/µl im PRP wurde zunächst die Thrombozytenzahl im PRP mit dem automatischen Blutzellzählgerät bestimmt. Bei Werten < 300.000/µl wurde ein Auf-konzentrieren durch nochmaliges hochtouriges Zentrifugieren (2000 x g, 10 Minuten), Abpipettieren eines Teiles des Plasmaüberstandes und Resuspension der absedimentierten Thrombozyten erzielt. Bei PRP mit einer Thrombo-zytenzahl > 300.000/µl erfolgte durch Zugabe von PFP zum PRP die Einstellung der Thrombozytenzahl auf 300.000/µl. Beispiel: Thrombozytenzahl: 320.000/µl:

→ 300 µl PRP + 20 µl PFP.

Das zur Aggregationsmessung verwendete PRP wurde nach der Thrombozytenzahlkontrolle innerhalb von 4 Stunden verwendet und währenddessen bei Raumtemperatur gelagert.

Aus dem Lithiumheparinatblut wurde durch Zentrifugation für 2 Minuten bei 10.000 × g entsprechendes Plasma zur Messung klinisch-chemischer Meßgrößen hergestellt.

4. Methoden

4.1. Thrombozytenzahl und andere Meßgrößen des Blutbildes

Die Thrombozytenzahl sowie der Hämatokrit und die Leukozytenzahl wurden mit dem halbautomatischen Hämatologiesystem Sysmex F-800 nach zweistufiger Verdünnung mit dem Auto-Dilutor AD-260 gemessen. Als Hämolysemittel wurde Quicklyser-II eingesetzt.

4.2. Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100

Die Untersuchung mit dem Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100 erfolgte in der Regel in einem Zeitraum von 30 - 60 Minuten nach Blutentnahme. Die Meßzellen, welche bei 4°C gelagert wurden, wurden vor Beginn der Messung für 15 Minuten bei Raumtemperatur aufbewahrt. Danach wurde eine Meßzelle (Kollagen/ADP-Meßzelle) in die Position A der Kassette des Plättchen-funktionsanalysengerätes eingesetzt, nach vorherigem vier- bis fünfmaligen vorsichtigen Schwenken der Blutprobe 1000 µl Blut aus der Probe in das Probenreservoir der in der Kassette befindlichen Meßzelle pipettiert und über die integrierte Tastatur des Gerätes der Testlauf gestartet. Nach Ausgabe der Ergebnisse erfolgte die Entsorgung dieser Meßzelle und der Test wurde mit der

zweiten Meßzelle (Kollagen/Epinephrin-Meßzelle) in analoger Weise durchgeführt.

4.3. Kapilläre In-vivo-Blutungszeit

Die kapilläre In-vivo-Blutungszeit wurde mit zwei unterschiedlichen Methoden bestimmt:

Zur Messung der kapillären In-vivo-Blutungszeit entsprechend der von NOLTE et al. (1997) beschriebenen Methode wurde der Hund in Seitenlage verbracht.

Nach Rasur des Punktionsgebietes, des Übergangs von behaarter Haut und Ballenhorn der seitlichen Zehe der Vordergliedmaße, wurde eine Blutdruckmanschette über Radius und Ulna dieser Gliedmaße angelegt, auf das geschorene Hautareal eine hyperämisierende Salbe aufgetragen und eine Stoppuhr gestartet. Nach Ablauf von einer Minute wurde die Salbe mit einem Mulltupfer entfernt und die Blutdruckmanschette mit einem Druck von 70 mm Hg aufgeblasen. Nach Ablauf einer weiteren Minute erfolgte 1-3 mm oberhalb der Ballengrenze zweimalig im Abstand von ½ cm eine Punktion mit einer automatischen Blutlanzette. Bei Aufrechterhaltung der Druckverhältnisse wurden die frei fließenden Blutperlen alle 15 sec vorsichtig mit einem Mulltupfer abgesaugt. Die Zeit von der Punktion bis zum vollständigen Versiegen der Blutungen wurde als kapilläre In-vivo-Blutungszeit gemessen und aus den beiden sich ergebenden Werten der Mittelwert gebildet. Diese Methode wird zur Vereinfachung im weiteren als „kapilläre Blutungszeit“ bezeichnet.

Zudem wurde die kapilläre In-vivo-Blutungszeit mit einer Modifikation der zuvor beschriebenen Technik in Anlehnung an die beim Menschen teilweise verwendete subaquale Methode gemessen. Die Bestimmung erfolgte in analoger Weise (einminütige Hyperämisierung und Ablauf einer weiteren Minute unter den entsprechenden Druckverhältnissen) am sitzenden Hund. Hierbei wurde die Vorderpfote nach Punktion in ein Gefäß mit 37°C warmem Wasser gehalten.

Die kapilläre In-vivo-Blutungszeit entsprach bei dieser Methode der Zeit von der Punktion bis zum Abreißen der Blutsäule im Wasserbad. Diese Methode wird im weiteren als „subaquale Blutungszeit“ bezeichnet.

4.4. Thrombozytenaggregation nach der BORN-Methode

Die Messung der Thrombozytenaggregation basierte auf der Methode von BORN (1962) an einem 2-Kanal-Aggregometer mit rechnergestützter Kurven-analyse.

Für die vorliegende Studie wurden folgende Endkonzentrationen der Aggregationsstimulanzien im Testansatz verwendet:

• ADP: 0,025 mol/l

• Kollagen: 10 µg/ml

Das in Trockensubstanz vorliegende ADP wurde zur Herstellung einer Lösung mit einer Konzentration von 0,525 mol/l ADP (Endkonzentration im Testansatz:

0,025 mol/l) mit 381 µl Aqua bidest in Lösung gebracht. Für die Herstellung des Kollagenreagenzes mit einer Konzentration von 210 µg/ml (Endkonzentration im Testansatz: 10 µg/ml) wurden 21 µl einer Kollagenreagenzstammlösung (1 mg/ml) zu 79 µl des im Testkit enthaltenen Puffers gegeben. Die ADP-Lösung war bei Kühlschranktemperatur 5 Tage lagerbar, vor der Verwendung wurde sie zur Erwärmung 10 Minuten bei Zimmertemperatur aufbewahrt. Die Kollagen-Lösung wurde für jeden Arbeitstag frisch angesetzt.

Zu Beginn jeder Messung erfolgte die Eichung des Aggregometers mit zwei Standards auf 100 % Aggregation (PFP) und 0 % Aggregation (PRP). Der Ansatz für die Eichung auf 100 % Aggregation enthielt 200 µl PFP + 10 µl einer isotonen NaCl-Lösung für die ADP-induzierte Aggregation bzw. 200 µl PFP + 10 µl des Kollagenreagenz-Puffers für die Kollagen-induzierte Aggregation. Der Ansatz für die Eichung auf 0 % Aggregation setzte sich aus 200 µl PRP + 10 µl isotoner NaCl-Lösung (Kollageninduzierte Aggregation: 200 µl PRP + 10 µl Kollagenreagenz-Puffer) zusammen.

Für die Messung der Thrombozytenaggregation wurden jeweils 200 µl PRP in die Küvetten der beiden Meßkanäle pipettiert und die Registrierung gestartet.

Nach zweiminütiger Inkubationszeit bei 37°C wurde die Aggregation mit jeweils 10 µl der aggregationsauslösenden Substanzen (Kollagen, ADP) induziert. Während der Messung über 12 Minuten erfolgte ein ständiges Rühren der Testansätze mit einem Magnetrührer bei 1000 U/min. Aggregationseintritt und -ablauf wurden bei einer Papiergeschwindigkeit von 7,5 mm/min aufgezeichnet. Die Ausmessung der Aggregationskurve nach den Meßgrößen Aggregationsmaximum (%) und maximaler Gradient (%/min) erfolgte automatisch durch das Gerät. Der anschließenden Auswertung der so erhaltenen Daten wurde der laborinterne Referenzbereich (SCHULZE 1998) zugrunde-gelegt:

• ADP: 0,025 mol/l: Referenzbereich des Aggregationsmaximums: 80-98 %

• Kollagen: 10 µg/ml: Referenzbereich des Aggregationsmaximums: 80- 96 %

4.5. Klinisch-chemische Messungen

Die Messung der Blutplasmakonzentration von Harnstoff, Kreatinin, Gesamteiweiß und Gesamtbilirubin sowie der Enzymaktivität der Alanin-Amino-Transferase, der Glutamat-Dehydrogenase und der Alkalischen Phospha-tase erfolgten aus Lithiumheparinatplasma mit kommerziellen Testkits nach Standardmethoden im Analysenautomaten Hitachi 704. Die Kalibration wurde mit einem universellen humanen Kalibrationsserum durchgeführt. Die bei jeder Messung mitgeführten Qualitätskontrollen mit Precinorm U lagen stets im angegebenen Kontrollbereich.

4.6. Bestimmung der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit und der Prothrombinzeit, der Faktor-VIII:C-Aktivität und der Willebrandfaktor-Konzentration

Die Messung der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit und der Prothrombinzeit sowie der Faktor-VIII:C-Aktivität erfolgte am Koagulometer nach SCHNITGER und GROSS.

Zur Messung der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit wurde zunächst das Reagenz Pathromtin® durch Lösen der Kaolin-Suspension in der lyophilisierten Lipidkomponente hergestellt. Als Testansatz wurden - gemäß Testanleitung - 100 µl Aktivatorreagenz mit 100 µl plättchenarmen Plasmas für genau zwei Minuten bei 37°C inkubiert. Durch Zugabe von 100 µl auf 37°C vorgewärmter Kalziumchloridlösung (0,025 mol/l) erfolgte die weitere Aktivierung der Gerinnungskaskade, gleichzeitig wurde die Stoppuhr am Gerät gestartet und die Zeit bis zur Fibrinbildung bestimmt (Ergebnis in Sekunden).

Zur Bestimmung der Prothrombinzeit wurde die Probe zunächst vorverdünnt (1 Teil plättchenarmes Plasma + 19 Teile Verdünnungsmedium). Daraufhin wurden 100 µl dieser vorverdünnten Probe zusammen mit 100 µl Fibrinogenlösung zwei Minuten bei 37°C inkubiert. Nach Ablauf dieser zwei Minuten wurden 100 µl Reagenzlösung hinzupipettiert. Durch gleichzeitiges Starten der Stoppuhr am Gerät erfolgte die Messung der Zeit bis zur Fibrinbildung, das Meßergebnis in Sekunden wurde über eine Referenzkurve in Prozent Aktivität der Norm umgerechnet.

Zur Messung der Faktor-VIII:C-Aktivität wurden 100 µl Aktivatorreagenz der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit zu einer Mischung von 50 µl plättchenarmen Probenplasmas und 50 µl eines humanen Plasmas mit

Faktor-VIII-Mangel zugefügt. Nach einer Inkubation von genau 3 Minuten bei 37°C wurden 100 µl einer auf 37°C vorgewärmten Kalziumchloridlösung (0,025 mol/l) hinzupipettiert und die Gerinnungszeit gemessen. Das Meßergebnis in Sekunden wurde über eine Referenzkurve in Prozent Aktivität der Norm umgerechnet (MISCHKE 2001).

Die Bestimmung der Willebrandfaktor-Konzentration erfolgte am Hitachi 704 unter Anwendung eines Tests mit polyklonalen Antikörpern gegen humanen Willebrandfaktor (STA LIA vWF, Roche Diagnostics GmbH Mannheim).

Dieser Test basiert auf einer Messung der Zunahme der optischen Dichte bei Agglutination von Willebrandfaktor-Antigen und den spezifischen Antikörpern.

Die Adaptation des Gerätes (Probenvolumen: 20 µl, Reagenz 1: 185 µl, Reagenz 2: 150 µl, Zweipunktmessung der Trübungsänderung bei 546 nm zwischen den Meßpunkten 19 und 32) erfolgte entsprechend der Testvorschrift für humanes Probenmaterial. Als Standard (100 % Aktivität) diente Hundepoolplasma.

5. Versuchsaufbau von In-vivo- und In-vitro-Experimenten 5.1. Präzisionsanalyse (Kollagen/ADP-Meßzelle)

Zur Überprüfung der Präzision wurde von fünf klinisch gesunden Hunden Blut entnommen und nach Ablauf von 30 Minuten jeweils fünf Messungen mit der Kollagen/ADP-Meßzelle durchgeführt. Bestimmt wurden Verschlußzeit und Gesamtvolumen. Hierzu wurde das Blut eines Probanden auf fünf Portionen aufgeteilt und jede Portion vor der Messung vorsichtig geschwenkt.

5.2. Chargenprüfung (Kollagen/ADP-Meßzelle)

Zur Prüfung des Einflusses der Meßzellencharge auf das Testergebnis der Kollagen/ADP-Meßzelle wurde von 8 klinisch gesunden Hunden ein größeres Volumen an Zitrat-gepuffertem Blut entnommen und jeweils unter Verwendung folgender Chargen der Kollagen/ADP-Meßzelle in wechselnder Reihenfolge die Verschlußzeit und das Gesamtvolumen bestimmt: 125, 130, PCA-132, PCA-134, PCA-141, PCA-146.

5.3. Einfluß der Lagerung (Kollagen/ADP- und Kollagen/Epinephrin-Meßzelle)

Zur Prüfung des Einflusses der Lagerung der Blutprobe auf die Meßergebnisse wurde von fünf klinisch gesunden Hunden ein größereres Volumen an

Zitrat-gepuffertem Blut entnommen und sofort nach Entnahme sowie nach 0,5, 1, 1,5, 2, 3, 4, 6, 8 und 24 Stunden mit beiden Meßzellen die Verschlußzeit und das Gesamtvolumen bestimmt. Hierzu wurde das Blut eines Probanden auf 11 Portionen aufgeteilt und jede Portion vor der Messung vorsichtig geschwenkt.

5.4. Einfluß des Hämatokrits (Kollagen/ADP-Meßzelle)

Für die Beurteilung des Einflusses des Hämatokrits auf die Verschlußzeit wurde von fünf klinisch gesunden Hunden Blut entnommen und aus einem Anteil jeder Blutprobe jeweils PRP (und PFP) hergestellt. Basierend auf den Ergebnissen des Mikrohämatokrits des EDTA-Blutes erfolgte dann durch Zugabe von PRP eine Einstellung auf verschiedene Hämatokritwerte (40, 30, 25, 20, 15, 10 %). Zuvor wurde die Thrombozytenzahl im PRP durch Zugabe von PFP auf die Thrombozytenzahl der jeweiligen Blutprobe eingestellt. Die Messung der Verschlußzeit und des Gesamtvolumens erfolgte mit der Kollagen-ADP-Meßzelle.

5.5. Einfluß von Desmopressin (DDAVP) bei einem Hund mit Willebrandfaktor-Mangel (Kollagen/ADP-Meßzelle)

Bei dem ersten Patienten (Dobermann) der oben angegebenen Hunde mit Willebrand-Krankheit wurde nach subkutaner Gabe von 0,4 µg/kg KGW DDAVP der Verlauf der Verschlußzeit und des Gesamtvolumens (Kollagen/ADP-Meßzelle) im Vergleich zur Willebrandfaktor-Konzentration verfolgt (Messungen nach 5 Minuten, 30 Minuten, 60 Minuten, 2 Stunden, 4 Stunden, 6 Stunden und 22 Stunden).

5.6. Einfluß der intravenösen Injektion von Azetylsalizylsäure beim gesunden Hund (Kollagen/ADP-Meßzelle und Kollagen/Epinephrin-Meßzelle)

Um die Veränderung der Verschlußzeit und des Gesamtvolumens bei Azetylsalizylsäure-induzierter Thrombozytopathie zu untersuchen, wurde von zehn klinisch gesunden Hunden vor und zwei Stunden nach einer intravenösen Injektion von 20 mg/kg Körpergewicht Azetylsalizylsäure (Aspisol) Blut entnommen. Die Messung der Verschlußzeit und des Gesamtvolumens erfolgte bei diesem Versuch sowohl mit der Kollagen/ADP- als auch mit der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle.

5.7. Einfluß des In-vitro-Zusatzes von Azetylsalizylsäure beim gesunden Hund (Kollagen/ADP-Meßzelle und Kollagen/Epinephrin-Meßzelle)

Zur Beurteilung des Einflusses von Azetylsalizylsäure wurden ferner die Verschlußzeit und das Gesamtvolumen bei beiden Meßzelltypen nach In-vitro-Zusatz von Azetylsalizylsäure in verschiedenen Konzentrationen zu jeweils 5 bis 11 Proben gesunder Hunde gemessen. Nach Messung der jeweiligen Ausgangswerte der Verschlußzeit und des Gesamtvolumens (Kollagen/ADP-Meßzelle und Kollagen/Epinpehrin-(Kollagen/ADP-Meßzelle) erfolgte eine Zugabe von 20 µl bzw. 3 µl des unverdünnten Handelspräparates (Aspisol) / ml Blut (Endkonzentration: 2 mg bzw. 0,3 mg Azetylsalizylsäure / ml Blut) je Probe und eine Bestimmung der Verschlußzeiten und Gesamtvolumina nach 15 Minuten, 60 Minuten und 120 Minuten bzw. bei der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle entsprechend den Ergebnissen nur nach 15 Minuten. Als Kontrolle wurde eine Probe mit dem Zusatz von 20 µl bzw. 3 µl NaCl / ml Blut mitgeführt und nach 120 Minuten (Kollagen/ADP-Meßzelle) bzw. 15 Minuten (Kollagen/Epi-nephrin-Meßzelle) gemessen.