Rekombinante Wirkstoffe

(1)

Rekombinante Wirkstoffe

Prof. Dr. Theo Dingermann

Institut für Pharmazeutische Biologie Goethe-Universität Frankfurt Dingermann@em.uni-frankfurt.de

Dienstag, 25. Mai 2010

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Das Problem mit dem N-Terminus

von rekombinanten Proteinen

(3)

Interferon gamma 1b

Die Aminosäuresequenz von Interferon gamma-1b unterscheidet sich vom maturen humanen Interferon gamma durch ein zusätzliches N-terminales Methionin (rot) und einC-terminales Arginin (grün)

(4)

Interferon alfa 2a

Interferon alfa-2a wird in Escherichia coli als 166 Aminosäuren langes, nicht- glycosyliertes Protein gebildet.

Das zusätzliche N-terminale Methionin wird überwiegend durch eine

Methionylaminopeptidase (MAP) aus E. coli abgespalten und während der Produktion entfernt.

Gly (G) 97 %

Ala (A) 96 %

Pro (P) 88 %

(5)

Wachstumshormon Valtropin ^®

Methionin-Aminopeptidase

MAP I spaltet N-terminale Methionin-Reste ab, wenn die nachfolgende Aminosäure klein und ungeladen ist. Das Enzym gehört zu der Familie der Metalloproteinasen und benötigt Cobald als Co-Faktor

Expression in S. cerevisiae

(6)

Insulin

(7)

Wachstumshormone Genotropin ^®

In Escherichia coli wird die Expression der cDNA für hGH vom Promotor des Gens der alkalischen Phosphatase (phoA) gesteuert. Zusätzlich enthält die

Expressionscassette eine Shine-Dalgarno-Sequenz des trp-Operons (trp-SD) sowie die 5’-Sequenz des Gens für das hitze-stabile Enterotoxin II (STII). Dieser Bereich umfasst eine weitere Shine-Dalgarno-Sequenz sowie das Signalpeptid des

Enterotoxins. Nach der Transkription entsteht ein Fusionsprotein STII-rhGH, das an die Cytoplasmamembran geschleust wird und nach Abspaltung des Signalpeptids als humanes Somatropin im Periplasma des Bakteriums vorliegt.

(8)

Wachstumshormone Norditropin ^®

Dipepitidylaminopeptidase I

DAP I spaltet vom N-Terminus her Dipeptide ab, kann allerdings keine

Peptidbindungen hydrolysieren, in denen die Aminosäure Prolin involviert ist. Auch

Dipeptide, die an ihrem N-Terminus die basischen Aminosäuren Arginin oder Lysin

(9)

Wachstumshormone Norditropin ^®

(10)

Wachstumshormone

Norditropin ^®

(11)

Authentizität hielt man lange dann für besonders wichtig, wenn Präparate zur Substitutions- bzw. Dauertherapie eingesetzt wurden.

(12)

Authentizität hielt man lange dann für besonders wichtig, wenn Präparate zur Substitutions- bzw. Dauertherapie eingesetzt wurden.

• Insulin

(13)

Authentizität hielt man lange dann für besonders wichtig, wenn Präparate zur Substitutions- bzw. Dauertherapie eingesetzt wurden.

• Insulin

• Gerinnungsfaktor VIII

(14)

Authentizität hielt man lange dann für besonders wichtig, wenn Präparate zur Substitutions- bzw. Dauertherapie eingesetzt wurden.

• Insulin

• Gerinnungsfaktor VIII

• Somatropin

(15)

Authentizität hielt man lange dann für besonders wichtig, wenn Präparate zur Substitutions- bzw. Dauertherapie eingesetzt wurden.

• Insulin

• Gerinnungsfaktor VIII

• Somatropin

• ß-Interferon

(16)

Authentizität hielt man lange dann für besonders wichtig, wenn Präparate zur Substitutions- bzw. Dauertherapie eingesetzt wurden.

• Insulin

• Gerinnungsfaktor VIII

• Somatropin

• ß-Interferon

• α-Interferon

(17)

Authentizität hielt man lange dann für besonders wichtig, wenn Präparate zur Substitutions- bzw. Dauertherapie eingesetzt wurden.

• Insulin

• Gerinnungsfaktor VIII

• Somatropin

• ß-Interferon

• α-Interferon

• einige Antikörper

(18)

Authentizität hielt man lange dann für besonders wichtig, wenn Präparate zur Substitutions- bzw. Dauertherapie eingesetzt wurden.

• Insulin

• Gerinnungsfaktor VIII

• Somatropin

• ß-Interferon

• α-Interferon

• einige Antikörper

Heute gilt Authentizität nicht mehr als Wert an sich. Was zählt sind

möglichst optimale Wirksamkeit und Verträglichkeit.

(19)

Pharmakokinetische Eigenschaften

• 3 schnell wirksam

• 101 normal wirksam

• 16 verzögert wirksam

Rekombinante Wirkstoffe

(20)

Pharmakokinetische Eigenschaften

• 3 schnell wirksam

• 101 normal wirksam

• 16 verzögert wirksam

Rekombinante Wirkstoffe

(21)

Insulin-Analoga

(22)

Insulin-Analoga

(23)

Insulin-Analoga

(24)

schnell wirksam:

Insulin-Analoga

(25)

schnell wirksam:

Insulin lispro Insulin aspart Insulin glulisin

lang wirksam:

Insulin glargin Insulin detemir

Insulin-Analoga

(26)

schnell wirksame

Insulin-Analoga

(27)

schnell wirksame Insulin-Analoga

(28)

schnell wirksame

Insulin-Analoga

(29)

schnell wirksame Insulin-Analoga

(30)

Pharmakokinetische Eigenschaften

• 3 schnell wirksam

• 101 normal wirksam

• 16 verzögert wirksam

Rekombinante Wirkstoffe

(31)

Pharmakokinetische Eigenschaften

• 3 schnell wirksam

• 101 normal wirksam

• 16 verzögert wirksam

Rekombinante Wirkstoffe

(32)

lang wirksame

Insulin-Analoga

(33)

lang wirksame Insulin-Analoga

(34)

lang wirksame

Insulin-Analoga

(35)

lang wirksame Insulin-Analoga

(36)

Einschub:

Insulin-Synthesen

(37)

Einschub:

Insulin-Synthesen

(38)

Semisynthese von Human-Insulin

(39)

Semisynthese von Human-Insulin

(40)

Semisynthese von Human-Insulin

(41)

Semisynthese von Human-Insulin

(42)

Semisynthese von Human-Insulin

(43)

Insulin-Bedarf

(44)

1 Diabetiker 50 Schweine pro Jahr

Insulin-Bedarf

(45)

1 Diabetiker 50 Schweine pro Jahr

Insulinverbrauch 5-6 Tonnen pro Jahr (weltweit)

Insulin-Bedarf

(46)

Rekombinante Wirkstoffe

Rekombinante Wirkstoffe

Prof. Dr. Theo Dingermann

Institut für Pharmazeutische Biologie Goethe-Universität Frankfurt Dingermann@em.uni-frankfurt.de

Das Problem mit dem N-Terminus

von rekombinanten Proteinen

Interferon gamma 1b

Die Aminosäuresequenz von Interferon gamma-1b unterscheidet sich vom maturen humanen Interferon gamma durch ein zusätzliches N-terminales Methionin (rot) und einC-terminales Arginin (grün)

Interferon alfa 2a

Interferon alfa-2a wird in Escherichia coli als 166 Aminosäuren langes, nicht- glycosyliertes Protein gebildet.

Das zusätzliche N-terminale Methionin wird überwiegend durch eine

Methionylaminopeptidase (MAP) aus E. coli abgespalten und während der Produktion entfernt.

Gly (G) 97 %

Ala (A) 96 %

Pro (P) 88 %

Wachstumshormon Valtropin ®

Methionin-Aminopeptidase

MAP I spaltet N-terminale Methionin-Reste ab, wenn die nachfolgende Aminosäure klein und ungeladen ist. Das Enzym gehört zu der Familie der Metalloproteinasen und benötigt Cobald als Co-Faktor

Expression in S. cerevisiae

Insulin

Wachstumshormone Genotropin ®

In Escherichia coli wird die Expression der cDNA für hGH vom Promotor des Gens der alkalischen Phosphatase (phoA) gesteuert. Zusätzlich enthält die

Expressionscassette eine Shine-Dalgarno-Sequenz des trp-Operons (trp-SD) sowie die 5’-Sequenz des Gens für das hitze-stabile Enterotoxin II (STII). Dieser Bereich umfasst eine weitere Shine-Dalgarno-Sequenz sowie das Signalpeptid des

Enterotoxins. Nach der Transkription entsteht ein Fusionsprotein STII-rhGH, das an die Cytoplasmamembran geschleust wird und nach Abspaltung des Signalpeptids als humanes Somatropin im Periplasma des Bakteriums vorliegt.

Wachstumshormone Norditropin ®

Dipepitidylaminopeptidase I

DAP I spaltet vom N-Terminus her Dipeptide ab, kann allerdings keine

Peptidbindungen hydrolysieren, in denen die Aminosäure Prolin involviert ist. Auch

Dipeptide, die an ihrem N-Terminus die basischen Aminosäuren Arginin oder Lysin

Wachstumshormone Norditropin ®

Wachstumshormone

Norditropin ®

Authentizität hielt man lange dann für besonders wichtig, wenn Präparate zur Substitutions- bzw. Dauertherapie eingesetzt wurden.

Authentizität hielt man lange dann für besonders wichtig, wenn Präparate zur Substitutions- bzw. Dauertherapie eingesetzt wurden.

• Insulin

Authentizität hielt man lange dann für besonders wichtig, wenn Präparate zur Substitutions- bzw. Dauertherapie eingesetzt wurden.

• Insulin

• Gerinnungsfaktor VIII

Authentizität hielt man lange dann für besonders wichtig, wenn Präparate zur Substitutions- bzw. Dauertherapie eingesetzt wurden.

• Insulin

• Gerinnungsfaktor VIII

• Somatropin

Authentizität hielt man lange dann für besonders wichtig, wenn Präparate zur Substitutions- bzw. Dauertherapie eingesetzt wurden.

• Insulin

• Gerinnungsfaktor VIII

• Somatropin

• ß-Interferon

Authentizität hielt man lange dann für besonders wichtig, wenn Präparate zur Substitutions- bzw. Dauertherapie eingesetzt wurden.

• Insulin

• Gerinnungsfaktor VIII

• Somatropin

• ß-Interferon

• α-Interferon

Authentizität hielt man lange dann für besonders wichtig, wenn Präparate zur Substitutions- bzw. Dauertherapie eingesetzt wurden.

• Insulin

• Gerinnungsfaktor VIII

• Somatropin

• ß-Interferon

• α-Interferon

• einige Antikörper

Authentizität hielt man lange dann für besonders wichtig, wenn Präparate zur Substitutions- bzw. Dauertherapie eingesetzt wurden.

• Insulin

• Gerinnungsfaktor VIII

• Somatropin

• ß-Interferon

• α-Interferon

• einige Antikörper

Heute gilt Authentizität nicht mehr als Wert an sich. Was zählt sind

möglichst optimale Wirksamkeit und Verträglichkeit.

Pharmakokinetische Eigenschaften

• 3 schnell wirksam

• 101 normal wirksam

• 16 verzögert wirksam

Rekombinante Wirkstoffe

Pharmakokinetische Eigenschaften

• 3 schnell wirksam

• 101 normal wirksam

• 16 verzögert wirksam

Rekombinante Wirkstoffe

Insulin-Analoga

Wachstumshormon Valtropin ^®

Wachstumshormone Genotropin ^®

Wachstumshormone Norditropin ^®

Wachstumshormone Norditropin ^®

Norditropin ^®