Rekombinante Wirkstoffe
Prof. Dr. Theo Dingermann
Institut für Pharmazeutische Biologie Goethe-Universität Frankfurt Dingermann@em.uni-frankfurt.de
„Praktische“ Definitionen
Gentechnik
Unmittelbare neukombination von DNA am isolierten Molekül bzw.
Molekülgemischen (Isolierte DNA ⇒ Rekombination ⇒ Reintegration in eine Zelle): In-vitro-Technologie
„Praktische“ Definitionen
Gentechnik
Unmittelbare neukombination von DNA am isolierten Molekül bzw.
Molekülgemischen (Isolierte DNA ⇒ Rekombination ⇒ Reintegration in eine Zelle): In-vitro-Technologie
Biotechnik
Zellbiologische Verfahren unter Ausnutzung der vorhandenen biologischen Informations- (DNA) und Syntheseausstattung (Enzyme) der Zellen ohne Isolierung des Genoms und anschließender Manipulation am isolierten Genom: In-vivo-Technologie
„Praktische“ Definitionen
Gentechnik
Unmittelbare neukombination von DNA am isolierten Molekül bzw.
Molekülgemischen (Isolierte DNA ⇒ Rekombination ⇒ Reintegration in eine Zelle): In-vitro-Technologie
Biotechnik
Zellbiologische Verfahren unter Ausnutzung der vorhandenen biologischen Informations- (DNA) und Syntheseausstattung (Enzyme) der Zellen ohne Isolierung des Genoms und anschließender Manipulation am isolierten Genom: In-vivo-Technologie
Biochemie
Isolierung, Aufreinigung und Modifikation von Biomolekülen, wobei die
Modifikation der Biomoleküle meistens mit Hilfe von Enzymen bewerkstelligt wird: In-vitro-Technologie
natürliches Ausgangsprotei
n
Herstellung rekombinanter Proteine
natürliches Ausgangsprotei
n
Herstellung rekombinanter Proteine
Zielgen
natürliches Ausgangsprotei
n
Herstellung rekombinanter Proteine
Zielgen isoliertes Zielgen
GENTECHNIK
natürliches Ausgangsprotei
n
Herstellung rekombinanter Proteine
Zielgen
neukombiniertes Zielgen isoliertes Zielgen
GENTECHNIK
natürliches Ausgangsprotei
n
Herstellung rekombinanter Proteine
Zielgen
neukombiniertes Zielgen
GVO
isoliertes Zielgen GENTECHNIK
natürliches Ausgangsprotei
n
Herstellung rekombinanter Proteine
Zielgen
neukombiniertes Zielgen
Kultivierung GVO des GVO
isoliertes Zielgen GENTECHNIK
natürliches Ausgangsprotei
n
Herstellung rekombinanter Proteine
Zielgen
neukombiniertes Zielgen
Rekombinantes GVO Protein
BIOTECHNIK
Kultivierung des GVO
isoliertes Zielgen GENTECHNIK
natürliches Ausgangsprotei
n
Herstellung rekombinanter Proteine
Zielgen
neukombiniertes Zielgen
Rekombinantes GVO Protein
BIOTECHNIK
Isoliertes rekombinantes
Protein
Kultivierung des GVO
isoliertes Zielgen GENTECHNIK
natürliches Ausgangsprotei
n
Herstellung rekombinanter Proteine
Zielgen
neukombiniertes Zielgen
Rekombinantes GVO Protein
BIOTECHNIK
Eventuell modifiziertes
Protein BIOCHEMIE Isoliertes
rekombinantes Protein
Kultivierung des GVO
isoliertes Zielgen GENTECHNIK
Genetische Informations- einheit = universell verständlich in allen biologischen Organismen
”Target"- Organismus
”Quell"- Organismus
Rekombinante Proteine
Mechanismen der Transkription/Translation
Genetische Informations- einheit = universell verständlich in allen biologischen Organismen
Kontrolleinheiten = extrem spezifisch
”Target"- Organismus
”Quell"- Organismus
Rekombinante Proteine
Promotor 1 TF 1 POL
"genetic engineering"
Ziel- organis-
mus
Quell- organis-
mus
Kontrollregionen Informationseinheit
(Expressions-)Vektor
Selektionscassette
Transgener Organismus
(GVO)
Extraktion und
Reinigung
Produktion rekombinanter Protein
Proteine
einfach,
nicht glykosyliert
Proteine
komplex, glykosyliert einfach,
nicht glykosyliert
Proteine
E. coli oder Hefe
komplex, glykosyliert einfach,
nicht glykosyliert
Proteine
E. coli oder Hefe
CHO-Zellen oder BHK-Zellen
Pflanzenzellen oder humane/Maus-Zellen komplex,
glykosyliert einfach,
nicht glykosyliert
Proteine
E. coli
Sehr sicher, aber zu unflexibel für
„komplexe“
Proteine
Robust und sicher, aber schlecht ge- eignet für Proteine mit anspruchsvollen Zuckergerüsten
S. cerevisiae
Zellen, die fast alles können und extrem häufig verwendet werden
CHO-Zellen humane Zellen
Zellen, die fast alles können, die allerdings die höchsten Anfor- derungen an die Sicherheit stellen
Pflanzenzellen
Bisher nur in der Forschung einge- setzt. Keine Erfah- rungen im Bereich Arzneimittel
Die richtige Wahl der Produktionszelle
• Bacculovirus-System
• Vibrio colerae Stamm213
• E. coli
• S. cerevisiae
• Maus (SP2/0)
• Maus (NS/0)
• Maus (C127)
• Maus-Hybridoma
• CHO
• BHK
• Ziege
• HEK 293
• Humane B-Zelllinie
• Humanzelle (HAT-1080)
Wirtssysteme
Die Bestimmungen dieser Monographie gelten im Zusammenhang mit den jeweiligen einzelnen Monographien des Arzneibuches über DNA- rekombinationstechnisch hergestellte Produkte. Die Anforderungen betreffen nicht notwendigerweise Produkte, die nicht Gegenstand solcher Monographien sind.
Die Monographie gilt nicht für modifizierte lebende Organismen, die für die direkte Anwendung am Menschen und am Tier vorgesehen sind, beispielsweise als Lebendimpfstoffe.
DNA-rekombinationstechnisch hergestellte Produkte
Producta ab ADN recombinante
Definition
DNA-rekombinationstechnisch hergestellte Produkte werden durch genetische Modifikation hergestellt, bei der die kodierende DNA für das benötigte Produkt gewöhnlich mit Hilfe eines Plasmids oder viralen Vektors in einen geeigneten Mikroorganismus oder eine geeignete Zellinie eingeführt wird, in denen diese DNA exprimiert und in Protein translatiert wird. Das gewünschte Produkt wird dann durch Extraktion und Reinigung gewonnen. Die vor der Aufnahme des Vektors vorliegende Zelle oder der Mikroorganismus wird als Wirtszelle bezeichnet, die im Herstellungsprozess verwendete stabile Verbindung der beiden als Wirt-Vektor-System.
DNA-rekombinationstechnisch hergestellte Produkte
Producta ab ADN recombinante
Definition Herstellung
Klonierung und Expression
Charakterisierung der Wirtszelle einschließlich der Herkunft, des Phänotyps und Genotyps sowie der Zellkulturmedien
Dokumentation der Klonierungsstrategie für das Gen und Charakterisierung des rekombinanten Vektors
Charakterisierung des Wirts-Vektor-Systems
Zellbanksystem
Herstellung mit begrenzter Passage Kontinuierliche Herstellung
Validierung der Zellbänke Kontrolle der Zellen
Validierung des Herstellungsprozesses Extraktion und Reinigung
Charakterisierung des Bulkproduktes
Gleichförmigkeit der Produktion Aminosäure-Zusammensetzung
Partielle Aminosäuresequenzanalyse Peptidmustercharakterisierung
Bestimmung der Molekülmasse
Retention des Expressionskonstrukts Gesamtprotein
Chemische Reinheit
Von Wirtszellen stammende Proteine
Aus Wirtszelle oder Vektor stammende DNA
Hybridisierungsanalyse
Sequenzunabhängige Techniken
Prüfung auf Identität, Prüfung auf Reinheit und Gehaltsbestimmung
Lagerung Beschriftung
DNA-rekombinationstechnisch hergestellte Produkte
Producta ab ADN recombinante
Der legale Markt:
• 120 zugelassene Wirkstoffe
• 23 Indikationsgruppe
Rekombinante Wirkstoffe
• Angiogenesehemmer
• Antiasthmatika
• Antianämika
• Antidiabetika (Wirkstoffe zur Aufrechterhaltung der Glucose-Homöostase)
• Antiinfektiva und Atemwegstherapeutika
• Antipsoriatika
• Antirheumatika/Antiinflammatorika
• Antithrombotika/Antikoagulanzien/Fibrinolytika
• Gerinnungsfaktoren
• Hämolyse-Inhibitor
• Hormone bei Fertilitätsstörungen
• Immunmodulatoren bei Multipler Sklerose
• Immunsuppressiva zur Transplatat-Abstoßungsprophylaxe
• Impfstoffe
• Knochenwachstumsfaktoren
• Mukoviszidose-Therapeutika
• Osteoporose-Therapeutika
• Sepsis-Therapeutika
• Substitutionstherapeutika bei lysosomalen Speicherkrankheiten
• Thrombozytenwachstumsfaktor
• Tumortherapeutika
• Wachstumshormone
• Wundheilungstherapeutikum
Rekombinante Wirkstoffe
Auf den ersten Blick liegt es nahe:
– diese Wirkstoffe entsprechen einem natürlichen, humanen Vorbild
Rekombinante Arzneimittel
Humane, naturidentische Wirkstoffe
Rekombinante Wirkstoffe
Der zweite Blick zeigt:
– eine erhebliche Zahl dieser Wirkstoffe entspricht nicht einem natürlichen,
humanen Vorbild
Auf den ersten Blick liegt es nahe:
– diese Wirkstoffe entsprechen einem natürlichen, humanen Vorbild
Rekombinante Wirkstoffe
Warum Modifikationen an
authentischen Biomolekülen?
Warum Modifikationen an authentischen Biomolekülen?
Einige Modifikationen sind Konzessionen an die technische Machbarkeit – durchaus u.U. mit einem signifikanten Zusatzgewinn (Kasse-1 Biotechs)
Warum Modifikationen an authentischen Biomolekülen?
Einige Modifikationen sind Konzessionen an die technische Machbarkeit – durchaus u.U. mit einem signifikanten Zusatzgewinn (Kasse-1 Biotechs) Einige Modifikationen sind in der Tat naturidentische Wirkstoffe
(Kasse-2 Biotechs)
Warum Modifikationen an authentischen Biomolekülen?
Einige Modifikationen sind Konzessionen an die technische Machbarkeit – durchaus u.U. mit einem signifikanten Zusatzgewinn (Kasse-1 Biotechs) Einige Modifikationen sind in der Tat naturidentische Wirkstoffe
(Kasse-2 Biotechs)
Einige Modifikationen machen die Moleküle besser als die natürlichen Vorbilder, auch weil sie den signifikanten Unterschieden eines
physiologischen und eines therapeutischen Delivery‘s Rechnung tragen (Kasse-3a Biotechs)
Warum Modifikationen an authentischen Biomolekülen?
Einige Modifikationen sind Konzessionen an die technische Machbarkeit – durchaus u.U. mit einem signifikanten Zusatzgewinn (Kasse-1 Biotechs) Einige Modifikationen sind in der Tat naturidentische Wirkstoffe
(Kasse-2 Biotechs)
Einige Modifikationen machen die Moleküle besser als die natürlichen Vorbilder, auch weil sie den signifikanten Unterschieden eines
physiologischen und eines therapeutischen Delivery‘s Rechnung tragen (Kasse-3a Biotechs)
Einige Modifikationen sind ganz einfach „neu erfunden“
(Kasse-3b Biotechs)
Authentisch vs. modifiziert:
•40 „authentisch“
•48 modifiziert
•4 Maus-Antikörper
•1 Ratte-Antikörper
•6 chimerisierte Antikörper
•12 humanisierte Antikörper
•5 „humane“ Antikörper
•1 humanisiertes Fab-Fragment
•4 „Kunstprotein“
Rekombinante Wirkstoffe
Pharmakokinetische Eigenschaften
• 3 schnell wirksam
• 101 normal wirksam
• 16 verzögert wirksam
