Aus der
Klinik für Gastroenterologie, Hepatologie und Endokrinologie der
Medizinischen Hochschule Hannover
Die Rolle der Autophagie
bei akuter und chronischer Hepatitis bis hin zur Tumorgenese
im Fah-Mausmodell
DISSERTATION
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der
Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von
Alina Michael aus Hannover
Hannover 2019
Angenommen vom
Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 23.09.2019
Gedruckt mit Genehmigung
der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Professor Dr. med. Michael P. Manns Betreuer der Arbeit: Professor Dr. med. Arndt Vogel Referent: PD Dr. med. Albert Heim
Koreferent: Prof.‘in Dr. rer. nat. Christine Falk
Tag der mündlichen Prüfung: 23.09.2019 Prüfungsausschuss:
Vorsitz: Prof. Dr. med. Reinhold Ernst Schmidt 1. Prüfer: PD Dr. med. Bernhard Schmidt 2. Prüfer: Prof.‘in Dr. med. Bettina Wedi
Inhaltsverzeichnis
I. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ... V II. ABBILDUNGSVERZEICHNIS ... VIII III. TABELLENVERZEICHNIS ... IX
1 EINLEITUNG ... 1
1.1 Leber ... 1
1.1.1 Topographie und Anatomie ... 1
1.1.2 Pathophysiologie der Leberschädigung ... 3
1.1.3 Akutes Leberversagen ... 3
1.1.4 Hepatozelluläres Karzinom ... 3
1.2 Das Fah-Knockout-Modell ... 5
1.2.1 Hereditäre Tyrosinämie (HT1) ... 5
1.2.2 Modell für das Hepatozelluläre Karzinom ... 6
1.3 Atg7 und Autophagie ... 7
1.3.1 Ablauf ... 8
1.3.1.1 Initiationsmembran und Phagopore ...8
1.3.1.2 Elongation und Maturation der Initiationsmembran zum Autophagosomen ...9
1.3.1.3 Fusion zum Autophagolysosomen ...9
1.3.2 Regulation der Autophagie ... 10
1.3.3 Autophagie und Karzinogenese ... 11
1.3.3.1 Tumorsuppressive Rolle der Autophagie ... 12
1.3.3.2 Tumorfördernde Rolle der Autophagie ... 13
1.3.3.3 Autophagie in der hepatozellulären Karzinogenese ... 14
1.3.4 Das Atg7-Knockout-Modell ... 14
1.4 Zielsetzung ... 16
2 MATERIAL UND METHODEN ... 17
2.1 Material ... 17
2.1.1 Chemikalien ... 17
2.1.2 Kits ... 19
2.1.3 Antikörper ... 19
2.1.3.1 Antikörper: Immunhistochemie ... 19
2.1.3.2 Antikörper: Immunfluoreszenz ... 19
2.1.3.3 Antikörper: Western Blot... 20
2.1.4 qRT-PCR (TaqMan®) ... 20
2.1.5 DNA-Primer ... 21
2.1.6 Pufferlösungen ... 21
2.1.6.1 PBS (1 x) (phosphate buffered saline) ... 21
2.1.6.2 TBS (10 x) (tris buffered saline) ... 21
2.1.7 Verbrauchsmaterialien ... 21
2.1.8 Software... 22
2.1.9 Geräte ... 22
2.2 Tierexperimente ... 23
2.2.1 Mausstämme ... 23
2.2.2 Tierhaltung ... 24
2.2.3 Medikamentenapplikation ... 24
2.2.4 Probenentnahme ... 25
2.3 Mikroskopie ... 25
2.3.1 Fixierung, Einbettung und Erstellen von Paraffinschnitten ... 25
2.3.2 Histologische Färbungen ... 26
2.3.2.1 HE-Färbung ... 26
2.3.2.2 Pikro-Sirius-Rot-Färbung ... 26
2.3.3 Immunhistochemische Färbungen ... 27
2.3.3.1 Ki67-, BrdU- und p-Histon H3-Antikörper-Färbung ... 27
2.3.3.2 P21-Antikörper-Färbung ... 29
2.3.4 Immunfluoreszenz Färbungen ... 30
2.3.4.1 TUNEL-Assay ... 30
2.3.4.2 β-Catenin-Antikörper-Färbung ... 31
2.4 Protein Biochemie ... 32
2.4.1 Bestimmung der Blutparameter ... 32
2.4.2 Hydroxyprolinmessung aus Lebergewebe ... 32
2.4.3 Proteinisolation aus Lebergewebe ... 33
2.4.4 Proteinmessung nach Bradford ... 34
2.4.5 SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese (PAGE) und Western Blotting ... 34
2.4.6 Coomassie-Brillant-Blau-Färbung ... 37
2.4.6.1 Ladekontrollen für Proteinuntersuchungen mittels Western Blotting und Coomassie- Brillant-Blau-Färbung ... 37
2.5 Molekularbiologie ... 38
2.5.1 Genotypisierung durch Polymerase Kettenreaktion (PCR) ... 38
2.5.2 Gelelektrophorese ... 39
2.5.3 RNA-Isolation ... 40
2.5.4 cDNA-Synthese mittels Reverser Transkriptase PCR (RT-PCR)... 41
2.5.5 Quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) ... 42
2.6 Statistik und Präsentation ... 42
3 ERGEBNISSE ... 43
3.1 Atg7-Knockout mittels Alb.Cre-Rekombinase führt zu Autophagieverlust . 43 3.2 Atg7-abhängige Veränderungen der physischen Parameter, Leberhistologie und Serumparameter bei Leberschädigung ... 44
3.2.1 Physische Parameter, Glucose- und Triglyceridstoffwechsel bei akuter Leberschädigung ... 44
3.2.2 Physische Parameter, Glucose- und Triglyceridstoffwechsel bei früher chronischer Leberschädigung ... 47
3.2.3 Physische Parameter, Glucose- und Triglyceridstoffwechsel bei später chronischer Leberschädigung ... 51
3.2.4 Atg7-Verlust führt zu stärkerer Leberschädigung mit Hepatomegalie, Hypertrophie, Cholestase und Fibrose ... 55
3.3 Atg7-abhängiger Einfluss auf Apoptose und oxidativer Stress bei Leberschädigung ... 58
3.3.1 Apoptose und oxidativer Stress bei akuter Leberschädigung ... 58
3.3.2 Apoptose und oxidativer Stress bei früher chronischer Leberschädigung... 60
3.3.3 Apoptose und oxidativer Stress bei später chronischer Leberschädigung ... 62
3.3.4 Atg7 reguliert Apoptose und die Antwort auf oxidativen Stress in Abhängigkeit vom Zustand der Leberschädigung ... 65
3.4 Atg7-abhängige hepatozelluläre Proliferation bei Leberschädigung ... 65
3.4.1 Proliferation bei akuter Leberschädigung ... 65
3.4.2 Proliferation bei früher chronischer Leberschädigung... 68
3.4.3 Proliferation bei später chronischen Leberschädigung ... 70
3.4.4 Atg7 beeinflusst die Expression von p21-RNA während der Leberschädigung... 73
4 DISKUSSION ... 74
4.1 Methodik ... 74
4.2 Ausmaß der Leberschädigung bei Autophagieverlust ... 76
4.3 Fibrose als Defektheilung bei langanhaltendem Autophagieverlust ... 78
4.4 HCC-Entstehung als Spätkomplikation bei Autophagieverlust ... 79
4.5 Oxidativer Stress als Auslöser der Leberschädigung bei Autophagieverlust 80 4.6 Apoptoseinduktion als Reaktion auf die Leberschädigung bei Autophagieverlust ... 82 4.7 Proliferation als Reaktion auf die Leberschädigung bei Autophagieverlust
84
4.8 Fazit und Ausblick ... 88
5 ZUSAMMENFASSUNG ... 89
6 LITERATURVERZEICHNIS... 91
IV. DANKSAGUNG ... X
V. CURRICULUM VITAE ... XI
VI. ERKLÄRUNG NACH § 2 ABS. 2 NR. 6 UND 7 PROMO ... XII
I. Abkürzungsverzeichnis
Abkürzung Erklärung
(q)PCR (Quantitative) Polymerase-Kettenreaktion;
engl. (quantitative) polymerase chain reaction
4E-BP1 engl. initiation factor 4E (eIF-4E) binding protein-1 (Gen/Protein) A. Arterie; lat. Arteria
AEC 3-Amino-9-Ethylcarbazole
AKT engl. protein kinase B (Protein)
Alb Albumin
ALT Alanin-Aminotransferase
AMPK engl. AMP-activated protein kinase
AP Alkalische Phosphatase
ASH Alkoholische Steatohepatitis; engl. alcoholic steatohepatitis
AST Aspartat-Aminotransferase
Atg Autophagieverwandtes Gen; engl. Autophagy related genes (Gen) ATG Autophagieverwandtes Gen; engl. Autophagy related genes (Protein)
ATP Adenosintriphosphat
Bp Basenpaare
BSNQ 1,4-naphthoquinone derivatives-2-butylsulfinyl-1,4-naphthoquinone CC Cholangizelluläres Karzinom; engl. cholangiocarcinoma
Cdkn1 p21; engl.cyclin dependent kinase inhibitor 1A (Gen) cDNA Komplementäre DNA; engl. complementary DNA
CMA Chaperon-vermittelte Autophagie; engl. chaperone-mediated autophagy
Cre Rekombinase
Cre/ IoxP engl. cyclization recombination/ floxed = flanked by IoxP dH2O Destilliertes Wasser
DM Fettfreie Trockenmilch; engl. dry milk
DNA Desoxyribonukleinsäure; engl. deoxyribonucleic acid dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat
dUTP Markiertes Deoxyuridine
E1/E2 Ubiquitin-aktivierendes Enzym 1/2
ER Endoplasmatisches Retikulum
ERK 1/2 Extrazelluläre-singalreguliernde Kinase 1/2 (Protein)
FAA Fumarylazetoazetat
FAH Fumarylazetoazetat-Hydrolase (Protein) Fah Fumarylazetoazetat-Hydrolase (Gen)
FIP 200 engl. FAK family kinase-interacting protein (200 kDa) G0/G1/G2-Phase Abschnitte der Interphase
GABARAP engl. gamma-aminobutyric acid receptor-associated protein GAPDH Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (Protein)
HCC Hepatozelluläres Karzinom; engl. hepatocellular carcinoma
HE Hämatoxylin-Eosin
HGD Homogentisinsäure-Dioxigenase
HO-1 Hämoxygenase-1 (Gen/Protein)
HOPS engl. homotypic fusion and protein sorting complex
HP Hydroxyprolin
HPD 4-Hydrxyphenylpyruvat-Dioxygenase
HRP Meerrettichperoxidase
HT1/2/3 Hereditäre Tyrosinämie Typ 1/2/3
IF Immunfluoreszenz
Ig Immunglobulin
IHC Immunhistochemie
IL Interleukin
in vitro / in vivo im Lebenden / im Reagenzglas
IVC Individuell belüfteter Käfig; engl. individual ventilated cage KEAP-1 engl. kelch-like ECH-associated protein 1
KG Körpergewicht
LAVES Niedersächsischen Landesamtes für Verbraucherschutz und
Lebensmittelsicherheit
LC3-I/-II engl. microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3-I/-II
LG Lebergewicht
Lig. Band; lat. Ligamentum
LPS Lipopolysaccharid
MAA Maleylazetoazetat
MAI Maleyazetoazetat-Isomerase
M-Phase Mitose-Phase
mTor engl. Mammalian target of rapamycin (Gen) mTOR engl. Mammalian target of rapamycin (Protein) Mx1 Interferon-induziertes GTP-bindendes Protein Mx1
n Anzahl der Einzelproben
NaCl Natriumchlorid
NASH Nichtalkoholische Fettleberhepatitis; engl. non-alcoholic steatohepatitis NQO-1 NAD(P)H-Dehydrogenase [Quinone] 1 (Gen/ Protein)
NRF2 engl. factor erythroid 2-related factor 2 (Protein)
NTBC 2-(2-Nitro-4-Trifluor-methyl-Benzoyl-1,3,Cyclohexandion OSNQ 2-octylsulfinyl-1,4-naphthoquinone
p- Phosphoryliert
P21 Genprodukt von pCdkn1/p21 (Protein) p38 MAPK p38-mitogenaktivierte Proteinkinase (Gen) P38 MAPK P38-mitogenaktivierte Proteinkinase (Protein) p53 p53; engl. Tumor protein p53 (Gen)
P53 Genprodukt von p53 (Protein)
PAGE SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese
PAS Präautophagosomenstrutkur
PBC Primär biliäre Cholangitis
PEI Perkutane Ethanolinjektion
PI3K Phosphoinositide 3-kinase PI3P Phosphatidylinositol 3-phosphat PI4P Phosphatidylinositol 4-phosphat PIP-3 Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphat pIpC engl. polyinosinic-polycytidylic acid
PVDF Polyvinylidenfluorid
RAB7 engl. ras-related protein 7
RAPTOR engl. regulatory-associated protein of mTOR
RFA Radiofrequenzablation
RHEB engl. Ras homolog enriched in brain
Rn18s engl. 18S ribosomal RNA
RNA Ribonukleinsäure; engl. ribonuclein acid
ROS Reaktive Sauerstoffspezies; engl. reactive oxygen species RT Echtzeit; engl. realtime
S6 Ribosomales Protein S6 (Gen/Protein)
SAPK/ JNK engl. stress-activated phosphp-kinase/ cJun N-terminale Kinasen SDS engl. sodium dodecyl sulfate
Ser Serin
SNAP-29 engl. synaptosomal-associated protein 29
SNARE engl. soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor attachment receptor protein
TAT Tyrosin-Aminotransferase
TG Triglycerid
Thr Threonin
TNF-α Tumornekrosefaktor α
TSC2 engl. tuberous sclerosis complex 2
TUNEL engl. terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end-labeling
Tyr Tyrosin
ULK-1/-2 engl. uncoordinated-51-like kinase-1/-2 V./ Vv. Vene; lat. Vena / Venen; lat. Venae
VAMP8 engl. vesicle-associated membrane protein 8
VPS15 engl. vacuolar protein sorting-associated protein 15 VPS33A engl. vacuolar protein sorting-associated protein 33A VPS34 engl. class III PI 3-kinase
βME β-Mercaptoethanol
II. Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1.1 Makroskopische Abbildung der Leber ... 1
Abbildung 1.2 Schematische Darstellung des Leberazinus ... 2
Abbildung 1.3 Schematische Darstellung des Tyrosinmetabolismus ... 5
Abbildung 1.4 Elongation und Maturation durch Atg-Gene ... 9
Abbildung 1.5 Schematischer Überblick der Autophagieregulation durch mTORC1 ... 10
Abbildung 1.6 Rolle der Autophagie in der Tumorgenese ... 11
Abbildung 2.1 NTBC-Applikation in den verschiedenen Schädigungszuständen ... 24
Abbildung 2.2 Ladekontrolle für Proteinuntersuchungen ... 38
Abbildung 3.1 LC3-I/II- und P62-Proteinexpression ... 43
Abbildung 3.2 Akute Leberschädigung: Physische Parameter, Glucose- und Triglyceridstoffwechsel 44 Abbildung 3.3 Akute Leberschädigung: Leberhistologie und Serum-Leberparameter ... 46
Abbildung 3.4 Frühe chronische Leberschädigung: Physische Parameter, Glucose- und Triglyceridstoffwechsel ... 48
Abbildung 3.5 Frühe chronische Leberschädigung: Leberhistologie und Serum-Leberparameter ... 49
Abbildung 3.6 Späte chronische Leberschädigung: Physische Parameter, Glucose- und Triglyceridstoffwechsel ... 51
Abbildung 3.7 Späte chronische Leberschädigung: Leberhistologie und Serum-Leberparameter ... 53
Abbildung 3.8 Zusammenfassung: Physische Parameter, Leberhistologie und Serumparameter ... 57
Abbildung 3.9 Akute Leberschädigung: Apoptose und oxidativer Stress ... 58
Abbildung 3.10 Frühe chronische Leberschädigung: Apoptose und oxidativer Stress ... 61
Abbildung 3.11 Späte chronische Leberschädigung: Apoptose und oxidativer Stress ... 63
Abbildung 3.12 Akute Leberschädigung: Proliferation ... 66
Abbildung 3.13 Frühe chronische Leberschädigung: Proliferation ... 69
Abbildung 3.14 Späte chronische Leberschädigung: Proliferation ... 71
Abbildung 3.15 p21-RNA-Expression im Verlauf ... 73
Abbildung 4.1 Rolle der Autophagie bei akuter und chronischer Hepatitis im Fah-Modell ... 88
III. Tabellenverzeichnis
Tabelle 2:1 Chemikalien ... 17
Tabelle 2:2 Kits ... 19
Tabelle 2:3 Antikörper: Immunhistochemie ... 19
Tabelle 2:4 Antikörper: Immunfluoreszenz ... 19
Tabelle 2:5 Antikörper: Western Blot ... 20
Tabelle 2:6 TaqMan® Gen-Sonden ... 20
Tabelle 2:7 TaqMan® Sonstiges ... 21
Tabelle 2:8 DNA-Primer ... 21
Tabelle 2:9 Verbrauchsmaterialien... 21
Tabelle 2:10 Software ... 22
Tabelle 2:11 Geräte ... 22
Tabelle 2:12 Färbebedingungen: Ki67, BrdU und p-Histon H3 ... 27
Tabelle 2:13 Färbebedingungen: P21 ... 30
Tabelle 2:14 Färbebedingungen: β-Catenin ... 32
Tabelle 2:15 Hydroxyprolinmessung ... 33
Tabelle 2:16 Total Protein Lysis-Puffer (1x) ... 34
Tabelle 2:17 Zusammensetzung der SDS-Gele ... 35
Tabelle 2:18 Elektrophoreseprobenpuffer (ESB) 4x ... 35
Tabelle 2:19 Pufferbedingungen beim Western Blotting ... 36
Tabelle 2:20 Antikörperbedingungen beim Western Blotting ... 36
Tabelle 2:21 Puffer bei der DNA-Extraktion ... 39
Tabelle 2:22 PCR-Bedingungen ... 39
Tabelle 2:23 PCR-Zyklusabfolge ... 39
Tabelle 2:24 Präfinalen Primer-Mix ... 41
Tabelle 2:25 Finaler Primer-Mix ... 41
Tabelle 2:26 TaqMan® Fast Advanced Master-Mix ... 42
Tabelle 3:1 Modifizierter histologischer Aktivitätenindex (mHAI) nach Ishak ... 54
1 Einleitung
1.1 Leber
Die Leber ist das zentrale Stoffwechselorgan des Körpers. Als solches ist es an nahezu allen biochemischen Stoffwechselkreisläufen beteiligt. Einerseits stellt sie Proteine (z.B.
Gerinnungsfaktoren, Albumin) oder Hormonvorstufen (z.B. 25-Hydroxycholecalciferol, Angiotensinogen) her. Anderseits dient sie auch als Speicherort für Eisen, Fette, Vitamine und Zucker. Darüber hinaus ist die Leber essentiell wichtig für die Homöostase des Körpers durch Entgiftung verschiedenster endogener und exogener Substanzen mittels Biotransformation.
Die Endprodukte werden dann wiederum über die Galle ausgeschieden. Diese dient zusätzlich der Emulsion von Fetten im Dünndarm und hat somit auch einen großen Stellenwert bei der Verdauung dieser Stoffe.
Abbildung 1.1 Makroskopische Abbildung der Leber, Schrift modifiziert nach Preuße, Giebel 2009 Dargestellt von A) ventral und B) dorsal. A. Arteria Lig.: Ligamentum. V. Vena. Vv. Venae.
1.1.1 Topographie und Anatomie
1Die Leber ist ein ca. 1,5 kg schweres, parenchymatöses Organ, welches intraperitoneal im rechten Oberbauch lokalisiert ist. Kranial grenzt sie an das Zwerchfell (Diaphragma), mit dem sie an der Area nuda verwachsen ist. Die Gallenblase (Vesicae biliaris), die rechte Niere und Nebenniere und die rechte Colonflexur liegen der Leber von kaudal an. Medial hat die Leber Kontakt mit dem oberen Verdauungstrakt aus Ösophagus, Magen und Duodenum. Die Leber an sich ist schmerzfrei, nur die sie umgebenden Bindegewebshülle (Glisson-Kapsel) besitzt Schmerzrezeptoren. Eingeteilt wird die Leber in vier Lappen (Lobus dexter, sinister, quadratus
1 Wenn nicht anders angegeben: Manns, Cieplik et al. 2016 und Lüllmann-Rauch 2012
und caudatus) mit wiederum insgesamt acht Segmenten. Diese lassen sich makroskopisch von außen nicht abgrenzen und richten sich nach ihrer jeweiligen Blutversorgung durch Pfortader und Lebervene. Die Leberpforte besteht aus dem Ductus choledochus, der A.
hepatitica propria und der V. portae. Der arterielle Blutstrom des Organs speist sich aus der A. hepatica und der V. portae. Die A. hepatica versorgt die Leber mit sauerstoffreichem Blut aus dem großen Blutkreislauf, während über die V. portae nährstoffreiches, aber sauerstoffarmes Blut aus dem Verdauungstrakt der Leber zugeführt wird. Sie erhält dabei nur 25% ihres Blutes aus dem großen Kreislauf, während die restlichen 75% aus dem Pfortaderkreislauf stammen. Das Blut wird im Anschluss an die Leberpassage über die Vv.
hepaticae in die V. cava inferior geleitet.
Abbildung 1.2 Schematische Darstellung des Leberazinus, Schrift und Sprache modifiziert nach Adams, Eksteen 2006
Mikroskopisch lassen sich zwischen den sechseckigen Leberläppchen Portalfelder, bestehend aus je einem Zufluss der A. hepatica und V. portae sowie den in den Ductus choledochus abfließenden Gallengang, erkennen. Unter funktionellen Gesichtspunkten wird das Lebergewebe in Leberazini eingeteilt. Ein Leberazinus wird durch das Drainagegebiet eines Portalfeldes bestimmt. Das Blut fließt vom Portalfeld kommend über den Sinusoiden an den Hepatozyten vorbei in die Zentralvene, welche in die Vv. hepaticae drainiert. Dabei vermischt sich das nährstoffreiche Blut der V. portae mit dem sauerstoffreichen Blut aus der A. hepatica.
Durch das gefensterte Endothel der Sinusoide entsteht ein zweiter Raum, der Disse’sche Raum, zwischen Sinusoidendothel und Hepatozyten. Hier findet der Austausch zwischen Hepatozyten und Blut statt. Der dem Disse’schen Raum entgegengesetzte Hepatozytenpol grenzt zur Drainage der Gallenflüssigkeit an den Gallengang. Im Disse’schen Raum sind Fibroblasten ähnliche Zellen, genannt Ito-Sternzellen, lokalisiert. Diese speichern im Ruhezustand Vitamin A. Unter zellulärem Stress bilden sie das Bindegewebe, was zur Leberfibrose führt. Außerdem finden sich hier leberspezifische Makrophagen, die Kupffer- Sternzellen.
1.1.2 Pathophysiologie der Leberschädigung
2Einer Schädigung der Leber können verschiedene Ätiologien zu Grunde liegen. So unterscheidet man zwischen einer infektiösen, medikamentösen, toxischen oder autoimmunen Genese. Darüber hinaus können auch verschiedene hereditäre Defekte, Vorerkrankungen (z.B. Steatosis hepatis), Gallestau (Cholestase) oder Blutstau (Stauungsleber) die Leber schädigen. Bei ungeklärter Ursache spricht man von „kryptogen“. Je nach Verlauf wird eine akute von einer chronischen Leberschädigung unterschieden. Von der letztgenannten spricht man bei einer Hepatitis, welche länger als sechs Monate andauert. Bei anhaltender Schädigung kommt es zum Umbau des Leberparenchyms mit Vermehrung des Bindegewebes. Dies führt über eine noch reversible Fibrose zu einer meist irreversiblen Zirrhose der Leber. Der Verlauf ist fließend und erstreckt sich in den meisten Fällen über mehrere Jahre. Die Bindegewebsvermehrung ist der Versuch des Organismus, die Schädigung lokal zu begrenzen. Bei Elimination der auslösenden Faktoren ist Restitutio ad integrum möglich. Bei Persistenz der auslösenden Faktoren kommt es hingegen zu einer progrienten Vermehrung des Bindegewebes, bis die Leber völlig von harten, Läppchen übergreifenden Bindegewebssepten durchzogen ist.
1.1.3 Akutes Leberversagen
3Das akute Leberversagen ist ein drastisches und lebensgefährdendes Krankheitsbild, welches durch das Auftreten von Ikterus, hepatischer Enzephalopathie und Koagulopathie gekennzeichnet ist. In der Vorgeschichte besteht keine chronische Lebererkrankung oder sekundäre Ursache (z.B. Schock). Dadurch wird das akute Leberversagen von der Zirrhose als Endstadium verschiedener chronischer Lebererkrankungen mit ihren möglichen Komplikationen abgegrenzt. Man teilt das akute Leberversagen chronologisch entsprechend dem Zeitabstand zwischen Ikterus und Enzephalopathie in hyperakut (< 7 Tage), akut (< 4 Wochen) oder subakut (5-12Wochen) ein. Es handelt sich um eine seltene Erkrankung mit jährlich nur 200-500 Fällen in Deutschland (Canbay, Tacke et al. 2011). Ätiologisch stehen Medikamente, toxische und virale Ursachen im Vordergrund. Häufig wird aber auch keine Ursache gefunden (Hadem, Tacke et al. 2012). Sollten Ursachenelimination und organsupportive Maßnahmen nicht ausreichen, ist die Lebertransplantation die einzige Therapiemöglichkeit.
1.1.4 Hepatozelluläres Karzinom
Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist mit einem Anteil von 90% der häufigste primär maligne Tumor der Leber. Das seltenere Cholangiokarzinom (CCC) entspricht fast gänzlich den restlichen 10%. Weniger als 1% der primär malignen Lebertumore geht auf seltene epitheliale oder kombinierte Tumore bzw. Hepatoblastome zurück (Schmidt, Vogel 2016). Als fünfthäufigste Tumorerkrankung des Mannes und siebthäufigste Tumorerkrankung der Frau
2 Wenn nicht anders angegeben: Manns, Cieplik 2016
3 Wenn nicht anders angegeben: Koch, Trautwein et al. 2017
weltweit sowie zweithäufigste zum Tode führende Tumorerkrankung im Jahr 2012, ist das HCC von großer klinischer Relevanz (Ferlay, Soerjomataram et al. 2013). Dabei ist das HCC zwar v.a. in Entwicklungsländern (Ost- und Südostasien, Subsahara-Afrika) häufig (Ferlay et al. 2013), jedoch handelt es sich auch um einen der wenigen Tumore in Deutschland mit steigender Inzidenz und Mortalität (Barnes, Kraywinkel et al. 2016). Ein HCC entsteht in 70%
auf dem Boden einer Leberzirrhose. Das jährliche Risiko für einen Patienten mit Leberzirrhose, ein HCC zu entwickeln, beläuft sich auf 1-6% pro Jahr (Schmidt, Vogel 2016). Die wichtigsten Risikofaktoren für die Tumorgenese eines HCC sind Virushepatitiden (Hepatitisvirus B und C), chronischer Alkoholabusus (Alkoholische Fettleber, ASH) und das metabolische Syndrom (Nichtalkoholische Fettleber, NASH). Je nach Region und Ethnie sind sie unterschiedlich verteilt (Ozakyol 2017). Daneben können aber auch Intoxikation mit dem Aflatoxin B1, seltene genetische Erkrankungen, langjährige Autoimmunhepatitiden oder die primäre biliäre Zirrhose (PBC) das Risiko einer Leberzirrhose erhöhen. Der klinische Verlauf ist meist durch die zugrundeliegende Lebererkrankung bestimmt. Erst im fortgeschrittenen Stadium kommt es zu Symptomen durch den Tumor wie abdominellen Oberbauchschmerzen, B-Symptomatik, Übelkeit und Ikterus (Schmidt, Vogel 2016). Für die Behandlung unterscheidet man je nach Tumorstadium kurative (Resektion, Transplantation oder lokal ablative Verfahren) von palliativen (Transarterielle Chemoembolisation, systemische Therapie) Therapieoptionen.
Trotz dieser diversen Therapiemöglichkeiten ist die Prognose insgesamt schlecht. Das durchschnittliche Gesamtüberleben beträgt elf Monate (Greten, Papendorf et al. 2005).
Aufgrund der unspezifischen Klinik wird die Mehrzahl der Patienten erst in einem fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert und nur 20% können chirurgisch mittels Resektion oder Transplantation versorgt werden. Bei Inoperabilität in einem frühen Stadium wird mittels lokal ablativen Verfahren (Radiofrequenzablation RFA, perkutane Ethanolinjektion PEI) therapiert (Dimitroulis, Damaskos et al. 2017), in fortgeschrittenen Stadien ist der Therapieansatz hingegen palliativ. Die Chemotherapie ist wenig erfolgsversprechend bei Patienten mit HCC; die Ansprechrate ist gering und das Überleben wird nicht verlängert (D.
Kim, Talati et al. 2017). Stattdessen rücken andere molekulare Angriffsziele in den Blickpunkt, wie beispielsweise Sorafinib, ein Multikinaseinhibitor, welcher bereits seit 2006 zur systemischen Erstlinientherapie des HCCs zugelassen ist. Er konnte in einer großen internationalen, placebokontrollierten Multicenter-Phase-III-Studie (SHARP) einen Überlebensvorteil gegenüber der Placebogruppe zeigen (Llovet, Ricci et al. 2008). In den letzten Jahren folgten verschiedene weitere Medikamente wie beispielsweise Regorafenib oder Lenvatinib, welche in der Erst- oder Zweitlinientherapie des HCCs zum Einsatz kommen (Ikeda, Morizane et al. 2018, Zhu, Baron et al. 2016). Diese Ansätze zeigen, dass die molekularen Grundlagen der Tumorgenese des HCCs der Schlüssel für zukünftige Therapieansätze sein könnten.
1.2 Das Fah-Knockout-Modell
1.2.1 Hereditäre Tyrosinämie (HT1)
Durch Defekte verschiedener Enzyme des Tyrosinabbaus kommt es zu der autosomal- rezessiven Erbkrankheit der hereditäre Tyrosinämie. Je nach betroffenem Enzym werden drei Unterformen der hereditären Tyrosinämie unterschieden: Typ 1 (HT1), Typ 2 (HT2) und Typ 3 (HT3). Die schwerste Form ist die HT1 mit einer Prävalenz von 1:125.000 in Europa. In anderen Regionen der Welt wie der Türkei, Indien oder Quebec ist die Erkrankung häufiger (A. Das 2017).
Die Aminosäure Tyrosin wird in mehreren Schritten in der Leber und der Niere zu Fumarat und Azetoazetat abgebaut (Abbildung 1.3).
Durch einen Defekt der Fumarylazetoazetat-Hydrolase (FAH) bei der HT1, dem letzten Enzym des Tyrosinabbaus, kommt es zu einer Akkumulation der Tyrosinmetaboliten Maleylazetoazetat (MAA) und Fumarylazetoazetat (FAA) in Leber und Nieren. MAA und FAA verursachen intrazellulär oxidativen Stress (Jorquera, Tanguay 2001, Jorquera, Tanguay 1997) und wirken sowohl in vitro (Jorquera, Tanguay 1997) als auch in vivo (Manning, Al Dhalimy et al. 1999) auf noch nicht geklärte Weise als Mutagen. Als mögliche mutagene Wirkungen von FAA werden direkte Alkylierung der DNA (Grompe et al. 2001, Grompe et al.
1993, Lindblad, Lindstedt et al. 1977) oder Schädigung von DNA-Reparaturproteinen diskutiert (Bliksrud, Ellingsen et al. 2013, Grompe et al. 2001, Jorquera, Tanguay et al. 1997). Die Folge ist eine Hepatitis durch toxisches FAA. Bei HT2 und HT3 ist entweder die Tyrosinaminotransferase (TAT) oder die 4-Hydroxyphenylpyruvat-Dioxygenase (HPPD) defekt. Beide Enzyme wirken weiter proximal im Tyrosinabbau und ihr Defekt führt zu einer starken Akkumulation von Tyrosin im Blut. Es kommt dabei zu einer Leberschädigung (G. A.
Abbildung 1.3 Schematische Darstellung des Tyrosinmetabolismus
Die mitwirkenden Enzyme sind die Tyrosin-Aminotransferase (TAT); 4-Hydroxyphenylpyruvat-Dioxygenase (HPPD);
Homogentisinsäure-Dioxigenase (HGD); Maleyazetoazetat- Isomerase (MAI) und Fumarylazetoazetat-Hydrolase (FAH).
Dysfunktion verschiedener Enzyme führen zu den verschiedenen Unterformen der hereditären Tyrosinämie:
Hereditäre Tyrosinämie Typ 1 (HT1) bei Defekt von FAH, hereditäre Tyrosinämie Typ 2 (HT2) bei Defekt der TAT und hereditäre Tyrosinämie Typ 3 (HT3) bei Defekt der HPPD.
HT1 wird durch die Gabe von 2-(2-Nitro-4-Trifluor-methyl- Benzoyl-1,3-Cyclohexandion (NTBC) behandelt, welches das Enzym HPPD inhibiert und damit die Akkumulation von toxischen Metaboliten unterbindet.
Mitchell, Grompe et al. 2001). Die Erkrankung HT1 verläuft entweder akut oder chronisch. Bei einer akuten Verlaufsform tritt der Tod meist nach wenigen Lebenswochen durch Leberversagen ein (G. A. Mitchell et al. 2001). Bei der milder verlaufenden, chronischen Form sind neben der Leberschädigung noch renale und neurologische Defekte im Verlauf von Monaten bis Jahren zu beobachten (Russo, O'Regan 1990, G. Mitchell, Larochelle et al. 1990).
Hepatozelluläre Karzinome sind häufig im Krankheitsverlauf, sodass ein Drittel der Erkrankten ein HCC in den ersten fünf Lebensjahren entwickelt (Russo, O'Regan 1990). Lange Zeit konnte die HT1 nur durch eine phenylalalin- und tyrosinarme Ernährung unzureichend behandelt werden und die progriente Leberzellschädigung somit nur verlangsamt werden (Bain, Purkiss et al. 1990). Als letzte Möglichkeit stand eine Lebertransplantation vor dem zweiten Lebensjahr zur Verfügung (F. J. van Spronsen, Berger et al. 1989). Lindstedt et al. publizierte 1992 erstmals eine verbesserte Behandlungsstrategie durch den Einsatz von 2-(2-Nitro-4- Trifluormethyl-Benzoyl)-1,3-Cyclohexandion (NTBC) (Lindstedt, Holme et al. 1992). NTBC hemmt die 4-Hydroxyphenylpyruvat-Dioxygenase (HPPD), was die Akkumulation von FAA stark reduziert und den Krankheitsverlauf verzögert. 90% der Patienten sprechen auf die Therapie an und abnehmende Mortalität sowie Inzidenz von HCC in jungen Patienten unterstreichen den Nutzen der NTBC-Therapie. Nichtsdestotrotz kommt es im Langzeitverlauf weiterhin zu neurologischen und hepatischen Komplikationen. Der Erfolg der Therapie hängt insbesondere von einem frühen Beginn der NTBC-Therapie ab (van Ginkel, Jahja et al. 2016, van Ginkel, Gouw et al. 2015, F. van Spronsen, Bijleveld et al. 2005).
1.2.2 Modell für das Hepatozelluläre Karzinom
Das Fah-Knockout-Mausmodell (Fahexon5) mit spezifischem Ausschalten der Fumarylazetoazetat-Hydrolase (FAH) wurde 1993 von M. Grompe eingeführt. NTBC- unbehandelte Fah-/- Mäuse starben bereits wenige Stunden nach der Geburt, obwohl zu diesem Zeitpunkt keine morphologischen Unterschiede sichtbar waren. Zur Feststellung der Todesursache wurden alle Mäuse 12 h post partum getötet. In den Blutproben der homozygoten Tiere 6 h post partum wurden als Ausdruck einer starken Leberschädigung eine Hypoglykämie und erhöhte AST-Level nachgewiesen. Elektronenmikroskopische Aufnahmen gaben weitere Hinweise auf ein Leberversagen als Todesursache: Es lag ein kompletter Verlust des intrazellulären Glykogens und ein vollständiger Funktionsverlust des Endoplasmatischen Retikulums vor (Grompe et al. 1993). Durch die Gabe von 100% NTBC präpartal (subkutan) und post partum (oral) einmal täglich konnte der Tod der homozygoten Mäuse kurz nach der Geburt abgewendet werden. Unter dieser Therapie zeigten die Fah-/- Mäuse keine Zeichen der Leberschädigung mit normalen AST- und Bilirubinwerten (direkt) im Blut. Histologisch konnten in den Lebern von Fah-/- Tieren, die fünf bis elf Monate kontinuierlich mit 100% NTBC behandelt wurden, keine Nekroseherde, Entzündungszeichen oder Atypien festgestellt werden. Erst nach Absetzten der NTBC-Behandlung kam es innerhalb von zwei Wochen zu einem Anstieg der Laborparameter mit Hinweis auf eine Leberschädigung (Grompe, Lindstedt et al. 1995). Bei 100% NTBC-Therapie wurden innerhalb von zwölf Monaten Beobachtungszeit keine HCCs in Fah-/- Tieren entdeckt (nicht veröffentlichte Daten).
Das Auftreten und die Schwere der Leberschädigung sind in diesem Modell NTBC-abhängig.
Das akute Leberversagen der akuten HT1-Verlaufsform kann durch komplettes Absetzten der NTBC-Behandlung ausgelöst werden (Buitrago Molina, Marhenke et al. 2013, Marhenke, Lamlé et al. 2008,).Eine chronische Leberschädigung wird durch eine verminderte Gabe von 2,5% NTBC nachempfunden. Erste HCCs treten in diesem Modell nach sechs Monaten auf (Buitrago Molina et al. 2013). Das Fah-Mausmodell ist seit mehreren Jahren zur Untersuchung der humanen HT1 bzw. des HCC mit einem beschleunigten Krankheitsverlauf im Tiermodell etabliert.
1.3 Atg7 und Autophagie
Autophagie, aus dem Griechischen αùτός (autos = selbst) und φαγεîν (phagein = essen), ist neben dem Ubiquitin-Proteasomen-System ein weiterer wichtiger Abbaumechanismus von zelleigenem Material. Dieser Stoffwechselvorgang wurde erstmals 1963 beschrieben (De Duve 1963). Autophagie läuft in jeder Zelle auf einem basalen Level ab. In den letzten Jahren wurde es immer klarer, dass der Prozess der Autophagie nicht allein als zellulärer Recyclemechanismus dient, sondern vielfältig in verschiedenste Stoffwechselwege eingreift.
Sie sichert die Aufrechterhaltung der Zellhomöostase und kann vielfältig, beispielsweise durch Hormone, Wachstumsfaktoren oder Aminosäuremangel, induziert werden (Mizushima 2007).
Als wichtiger Dreh- und Angelpunkt der Zellhomöostase verwundert es daher nicht, dass sich Störungen bei verschiedensten Lebererkrankungen wie Virushepatitis, NASH, alkoholischer Lebererkrankung, Fibrose, Zirrhose oder hepatozellulärem Karzinom beobachten lassen (Rautou, Mansouri et al. 2010).
Man unterscheidet drei große Unterformen: Makroautophagie, Mikroautophagie und Chaperon-vermittelte Autophagie (chaperon-mediated Autophagy; CMA) (J. Schneider, Cuervo 2014). Bei der CMA werden zelleigene Proteine mit dem spezifischen Aminosäuremotiv KFERQ von Hitzeschockproteinen in das Lysosomen transportiert und dort degradiert (Kaushik, Cuervo 2012, Dice 1990, Chiang, Terlecky et al. 1989). Im Zuge der Mikroautophagie werden die abzubauenden Zellbestandteile direkt durch Ausstülpungen des Lysosomens umschlossen und so in dessen Lumen aufgenommen und abgebaut (Marzella, Ahlberg et al. 1981, Marzella, Ahlberg et al. 1980, De Duve, Wattiaux 1966). Die Makroautophagie, auf die sich diese Arbeit bezieht und die gemeinhin als Autophagie bezeichnet wird, ist die bisher am besten untersuchte Unterform. Im Zuge der Makroautophagie bildet sich ein Organell mit Doppelmembran, das Autophagosom, welches dabei abzubauende Zytosolbestandteile (z.B. Proteine, Lipide, Glykogen oder Organellen) einschließt und durch Fusion mit einem Lysosomen deren Abbau einleitet. Der Vorgang wurde lange als unselektiv beschrieben. In den letzten Jahren hat sich jedoch immer deutlicher herausgestellt, dass bestimmte Zellbestandteile hochselektiv erfasst werden, wie beispielsweise Mitochondrien (Mitophagie), Fette (Lipophagie) oder Pathogene (Xenophagie) (Stolz, Ernst et al. 2014).
1.3.1 Ablauf
Der Prozess der Autophagie läuft in mehreren Schritten ab: (1) Initiationsmembran und Phagopore, (2) Elongation und Maturation der Initiationsmembran zum Autophagosomen und (3) Fusion mit dem Lysosomen mit Degradation im Autolysosomen.
Der Ablauf der Autophagie wird durch ca. 30 Atg-Gene koordiniert, darunter auch Atg7 (Mizushima, Yoshimori et al. 2011, Klionsky, Cregg et al. 2003). Die in Hefen erstmals beschriebenen Atg-Gene finden sich auch bei Säugetieren (Longatti, Tooze 2009). 15 der Atg- Gene, zu denen auch Atg7 zählt, sind dabei entscheidend für die Bildung der Autophagosomenmembran (Nakatogawa, Suzuki et al. 2009). In den Jahren seit ihrer Entdeckung wurden verschiedenste Theorien aufgestellt, wie sich die Doppelmembran des Autophagosomen bildet und woher die Membranbausteine stammen. Der Ursprung der Membran bietet bis heute Anreiz zu Diskussionen (Ktistakis, Tooze 2016). So werden verschiedene Organellen als Quelle der Phagoporenmembran diskutiert: Endoplasmatisches Retikulum (Hayashi Nishino, Fujita et al. 2010, Ylä Anttila, Vihinen et al. 2009), Golgi-Komplex (van der Vaart, Reggiori 2010), Plasmamembran (Ravikumar, Moreau et al. 2010a, Ravikumar, Moreau et al. 2010b), Mitochondrien (Hailey, Rambold et al. 2010) oder Endosomen (Longatti, Tooze 2012). Deswegen wird aktuell angenommen, dass es mehr als ein Spenderorganell gibt. Dies würde auch die Tatsache erklären, dass die Proteinzusammensetzung der Autophagosomenmembran mit keinem der genannten Organellen eindeutig übereinstimmt (Rubinsztein, Shpilka et al. 2012). Je nach Autophagiestimulus könnten verschiedene Organellen unterschiedliche Anteile liefern (Roberts, Ktistakis 2013).
1.3.1.1 Initiationsmembran und Phagopore
Die Autophagosomenbildung wurde erstmals in Hefen beobachtet, wo sie in der Nähe des Endoplasmatischen Retikulums mittels einer sogenannten Präautophagosomenstruktur (PAS) abläuft und auf diesen Ort beschränkt ist, wohingegen sich in Säugetieren mehrere Autophagosomen an verschiedensten Orten im Zytosol bilden (Rubinsztein et al. 2012).
Speziell unter Nährstoffmangel lässt sich in Säugetieren die Bildung der Phagopore an einem PI3P-reichen Ort nah des Endoplasmatischen Retikulums, genannt Omegasomen, beobachten (Axe, Walker et al. 2008). Dabei wird momentan jedoch davon ausgegangen, dass es sich um einen vieler möglicher Bildungswege und -orte handelt (Roberts, Ktistakis 2013).
In Säugetierzellen wurden zwei ATG1-Homologe gefunden, ULK (uncoordinated-51-like kinase)-1 und -2, wobei ULK-1 für die Autophagie wichtiger zu sein scheint (Roberts, Ktistakis 2013, Mizushima et al. 2011). Dieses formt zusammen mit mATG13, FIP200 und ATG101 den ULK-Komplex, welcher als einer der frühsten Induktoren der Autophagie angesehen wird (Roberts, Ktistakis 2013), bei ausreichender Nährstoffzufuhr jedoch durch mTORC1 (mammalian TORC1) inaktiviert wird (Hosokawa, Hara et al. 2009, Jung, Jun et al. 2009).
Mittels ULK-1 wird ATG14L zur Stelle des Omegasomen gelenkt (Itakura, Mizushima 2010).
ATG14L fördert bei Säugetieren die Bildung des VPS34-Komplexes-1, bestehend aus VPS34 (PI3K, Phosphoinositide 3-kinase), Beclin-1 (ATG6) und VPS15, welcher entscheidend für die
Bildung von PIP-3 im Omegasomen ist. PIP-3 zählt dabei als entscheidender Faktor für die weitere Autophagosomenbildung (Roberts, Ktistakis 2013, Matsunaga, Morita et al. 2010, Axe et al. 2008).
1.3.1.2 Elongation und Maturation der Initiationsmembran zum Autophagosomen Die weitere Elongation und Maturation der Membran wird durch zwei Ubiquitin-ähnliche Konjugationssysteme koordiniert (Abbildung 1.4): Dem ATG5-ATG12-ATG16- und dem LC3- PE-Konjugationssystem. Beide Systeme sind auf ATG7 angewiesen. So wird LC3-I (ATG8) durch ATG7 (E1-Enzym) aktiviert, auf ATG3 (E2-Enzym) übertragen und dann kovalent an PE (Phosphatidylethanolamin) gebunden, was als LC3-II bezeichnet wird und als Autophagosomenmarker verwendet werden kann (Biazik, Ylä Anttila et al. 2015). ATG12 wird ebenfalls durch ATG7 (E1-Enzym) aktiviert, auf ATG10 übertragen (E2-Enzym) und schließlich kovalent an ATG5 konjugiert. Nach der Bindung von ATG16 fungiert das ATG5-ATG12- ATG16-Konjugationssystem als E3-Enzym für die Bildung von LC3-II (Ravikumar, Sarkar et al. 2010). Erst durch diese Schritte kommt es zur Elongation und Maturation der Autophagosomenmembran.
Abbildung 1.4 Elongation und Maturation durch Atg-Gene, Schrift und Sprache modifiziert nach Ravikumar et al. 2010
Folglich kann in Atg7-defizienten Mäusen (Atg7f/fAlb.cre+) über den beschriebenen Stoffwechselweg keine Autophagie ablaufen, da für beide Konjugationssysteme dieses Genprodukt benötigt wird. Dabei ist jedoch nicht auszuschließen, dass es auch Atg7- unabhängige Autophagiewege gibt (Juenemann, Reits 2012, Nishida, Arakawa et al. 2009).
1.3.1.3 Fusion zum Autophagolysosomen
Die Fusion zwischen Autophagosomen und Lysosomen wird durch verschiedenste Stimuli und Proteine reguliert. Im Folgenden einige Beispiele: LC3, RAB7 mittels FYVE/ FYCO1, SKD1, GABARAP mittels Formation von PI4P auf den Autophagosomen, Rekrutierung von VPS33A mittels HOPS (homotypic fusion and protein sorting complex) (H. Wang, Sun et al. 2015, Wartosch, Günesdogan et al. 2015, Pankiv, Alemu et al. 2010, Nara, Mizushima et al. 2002).
Es wurde nachgewiesen, dass das SNARE-Protein Syntaxin 17 für die Fusion von Autophagosomen und Endosomen/ Lysosomen nötig ist. Es interagiert dabei mit SNAP-29, VAMP8 und ATG14 (Diao, Liu et al. 2015, Itakura, Kishi Itakura et al. 2012).
1.3.2 Regulation der Autophagie
Die Autophagie als wichtiger Stoffwechselvorgang wird vielfältig reguliert. Der bestuntersuchte Regulationsmechanismus ist der mTOR-Signalweg. mTOR greift in verschiedenste Signalwege der Zelle ein und gilt als Sensor des zellulären Energiehaushaltes.
Im Falle einer positiven Energiebilanz wird mTORC1, neben mTORC2 der zweite mTOR- Komplex, aktiviert und phosphoryliert ULK-1, welches so inaktiviert wird. Dadurch wird die Initiation und Bildung der Phagopore unterbunden und Autophagie auf ein basales Level reduziert (vgl. 1.3.1.1) (Efeyan, Zoncu et al. 2012, Hosokawa et al. 2009). mTORC1 selbst wird durch intra- und extrazelluläre Signalwege vielfältig reguliert. So haben Insulin und eine erhöhte intrazelluläre Aminosäurekonzentration einen aktivierenden Einfluss auf die mTOR- Aktivität, wohingegen Glukagon hemmend wirkt. Durch Insulin kommt es über den Insulinrezeptor zu einer Aktivierung von (PI3K-)AKT, was wiederum über mehrere Zwischenschritte zu einer Aktivierung von mTOR führt. Der Wirkmechanismus von Glukagon ist noch nicht ausreichend geklärt (Czaja, Ding et al. 2013, Laplante, Sabatini 2012).
Bei Energiemangel wird AMPK als ein weiterer zellulärer Energiesensor aktiviert (Hardie 2007). AMPK stimuliert die Autophagie durch die Hemmung von mTOR über unterschiedliche Signalwege. So aktiviert AMPK TSC2, einen mTOR-Inhibitor oder inhibiert RAPTOR, einen Bestandteil des mTORC1 (Gwinn, Shackelford et al. 2008, Inoki, Zhu et al. 2003). Unter Glucosemangel phosphoryliert AMPK auch direkt ULK-1 an Position Ser 137/Ser 777 und aktiviert so den Autophagiekomplex. mTORC1 ist zu diesem Zeitpunkt inaktiv. Bei Glucoseüberschuss ist mTORC1 aktiviert und verhindert die direkte Aktivierung von ULK-1 mittels AMPK durch die Phosphorylierung an Position Ser 757. Folglich beeinflussen sich mTORC1 und AMPK auch wechselseitig (J. Kim, Kundu et al. 2011). Neben den Regulationswegen über mTOR werden aber in verschiedenen Zusammenhängen auch mTORC1-unabhängige Regulationsmechanismen beschrieben (Sarkar, Floto et al. 2005, Kanazawa, Taneike et al. 2004, Mordier, Deval et al. 2000). Das p53-Gen als Wächter des
Abbildung 1.5 Schematischer Überblick der Autophagieregulation durch mTORC1 mTOR ist der bestuntersuchte Inhibitor der Autophagie in Abhängigkeit von der Nährstoffversorgung der Zelle. Anabole Signale, wie Insulin oder hohe Level an Aminosäuren, führen über verschiedene Signalwege zu einer Aktivierung von mTORC1 und reziproker Hemmung der Autophagie. Katabole Signale wie Glukagon und Stress haben einen gegenteiligen Effekt. Grün: Aktivierung der Autophagie. Rot:
Hemmung der Autophagie. AS: Aminosäuren.
Genoms ist ein weiterer, gut untersuchter Regulator der Autophagie. Nach der Aktivierung von nuklear vorliegendem P53 aufgrund von zellulärem Stress werden verschiedene Stressantworten auf zellulärem Level aktiviert wie beispielsweise Zellzyklusarrest, Apoptose oder auch Autophagie (Mathiassen, De Zio et al. 2017). Diese Induktion der Autophagie wird unter anderem auf die Aktivierung von stressinduzierten Transkriptionsfaktoren zurückgeführt, die beispielsweise zur Aktivierung von AMPK oder TSC2 führen (Feng, Hu et al. 2007).
Darüber hinaus werden auch ULK-1 und ULK-2 im Zuge der P53-Antwort aktiviert, welche dann entscheidend für die Initiation der Autophagosomenmembran sind (vgl. 1.3.1.1) (Gao, Shen et al. 2011). Interessanterweise wurden aber auch schon Beobachtungen gemacht, welche eine wechselseitige Interaktion zwischen ATG7 und P53 mit folgender Induktion von p21 vermuten lassen (I. Lee, Kawai et al. 2012).
Folglich ist die Autophagie ein stark regulierter Stoffwechselweg mit Einfluss auf verschiedenste physiologische und pathologische Abläufe in der Leber, welche entweder mTORC1-abhängig oder mTORC2-unabhängig ablaufen.
1.3.3 Autophagie und Karzinogenese
Die Entstehung maligner Tumorzellen aus normalen Zellen wird durch die sogenannten zehn
„Hallmarks of cancer“ definiert, welche zuletzt 2011 von Hanahan und Weinberg aufgestellt wurden. Zu diesen zählen, neben weiteren, eine gesteigerte, unkontrollierte und potentiell unendliche Tumorzellproliferation und eine Apoptoseresistenz. Tumorzellen weisen Mutationen in ihrem Genom mit resultierender Störung von Kontrollmechanismen und Feedbacksystemen auf. Dies bereitet den Grund für eine Störung der gesamten Zellhomöostase und möglicher unkontrollierter maligner Expansion (Hanahan, Weinberg 2011).
Abbildung 1.6 Rolle der Autophagie in der Tumorgenese, Schrift, Sprache und Layout modifiziert nach Sun, Guo et al. 2013
Autophagie spielt eine Doppelrolle in der Tumorgenese des HCC. Im Initiationsstadium verhindert Autophagie die Tumorgenese durch verminderte Zellproliferation, geringere Inflammation und DNA-Stabilisierung. Dies beruht auf einer geringeren Akkumulation von ROS durch Autophagie. Bei manifestem Tumor fördert Autophagie das Tumorwachstum. Die übermäßige ROS-Akkumulation wird verhindert und damit die Tumorzellapoptose vermieden.
Gleichzeitig werden Nährstoffe durch Selbstdigestion für weitere Zellproliferation bereitgestellt. Dies verhindert wiederum die Tumorzellapoptose.
Der Autophagie als wichtiger Stoffwechselweg zur Aufrechterhaltung der Zellhomöostase werden in diesem Zusammenhang sowohl fördernde als auch hemmende Funktionen in der Tumorgenese zugeschrieben (Abbildung 1.6). So schützt einerseits der Abbau von geschädigten Organellen und Zellbestandteilen vor einer Zellschädigung aufgrund von zellulärem Stress, andererseits können Tumorzellen durch eben diese Bereitstellung von Nährstoffen ihren erhöhten Energiebedarf für weiteres Wachstum tilgen (Ávalos, Canales et al. 2014). In den letzten Jahren konnte dem Mechanismus der Autophagie in Abhängigkeit zum jeweiligen Kontext und Tumorstadium eine tumorsuppressive oder onkogene Rolle zugeordnet werden (White 2015, White 2012). So kann Autophagie als zweischneidiges Schwert in der Tumorentstehung angesehen werden, welches in frühen Stadien die Initiation von Tumoren verhindert und in fortgeschrittenen Stadien mit manifestem Tumor diesen in seinem Wachstum unterstützt (Czaja et al. 2013).
1.3.3.1 Tumorsuppressive Rolle der Autophagie
In frühen Stadien der Tumorentstehung wird Autophagie heute eine tumorsuppressive Wirkung zugeschrieben, weil das Tumorwachstum durch verschiedene Mechanismen unterdrückt werden kann (Ávalos et al. 2014). Hierbei sei der Zusammenhang zwischen gesteigerten ROS (Reactive oxygen species) durch geschädigte oder gealterte Mitochondrien und der Mitophagie hervorgehoben. Mitochondrien sind die Kraftwerke der Zelle und bilden den Großteil an ATP für ihren Stoffwechsel (Saraste 1999). Bei Schädigung von Mitochondrien kann es zur erhöhten Ansammlung von ROS, proapoptotischen Signalen und unnützen ATP- Verbrauch kommen, was wiederum weitere Zellschädigung bedingt und somit auch die Hepatozyten schädigt (I. Kim, Rodriguez Enriquez et al. 2007, Lemasters 2005, Dawson, Gores et al. 1993). Hohe Produktionsraten an ROS haben DNA-Mutationen, Oxidationen von Proteinen sowie Lipiden und Veränderungen von Ionenkanälen als Konsequenz. Daraus ergibt sich eine zunehmende zelluläre Instabilität und damit ein erhöhtes Risiko einer Tumorentstehung (Z. Wang, Li et al. 2016, Goetz, Luch 2008, Valko, Izakovic et al. 2004).
Innerhalb der Zelle entsteht ROS in verschiedenen Organellen, beispielsweise im Verlauf der Atmungskette in den Mitochondrien, wobei die Mitochondrien den Löwenanteil liefern (Zhao, Qu et al. 2016). Durch Abbau eben dieser Zellorganellen durch Mitophagie schützt Autophagie die Zelle vor weiterer Schädigung (Chourasia, Boland et al. 2015). Folglich ist die Autophagierate bei vermehrter Mitochondrienschädigung mit vermehrtem ROS-Aufgebot erhöht (Hewitt, Korolchuk 2016). Neben dem Abbau von geschädigten Mitochondrien wird mittels Mitophagie auch die Menge an Mitochondrien dem gegenwärtig gegebenen Stoffwechselbedarf der Zelle angepasst (Youle, Narendra 2011, Lemasters 2005). Deshalb gilt, dass das Ausmaß der Mitophagie in engen Grenzen dem momentanen Bedarf angepasst werden muss, da sowohl übermäßige, als auch verminderte Mitophagie zu Zellschädigung führen kann. Autophagie führt weiterhin auf einem basalen Level zu einem Abbau von anderen Organellen, die beschädigt sind und somit wiederum Hepatozyten schädigen können. Die Organellenanzahl wird außerdem auf diesem Weg den gegenwärtigen Bedürfnissen der Zelle angepasst (J. Schneider, Cuervo 2014). Entzündliche Prozesse tragen durch Infiltration von Entzündungszellen und der Ausschüttung von Zytokinen mit folgender vermehrter Proliferation zur Entartungstendenz der Zellen bei. Es folgt eine gesteigerte Angiogenese und Infiltration
ins umgebende Gewebe, was zusätzlich das Tumorwachstum unterstützt. (Candido, Hagemann 2013). Bei Autophagieinhibition zeigte sich eine erhöhte Nekroserate innerhalb von Tumoren (Degenhardt, Mathew et al. 2006). Autophagie könnte also antiinflammatorisch bei chronischer Leberschädigung wirken und so das Tumorwachstum durch Abschwächung der lokalen Inflammation hemmen (Mallat, Lodder et al. 2014, Morselli, Galluzzi et al. 2009).
1.3.3.2 Tumorfördernde Rolle der Autophagie
Im Gegensatz zu den bereits genannten Argumenten lassen sich in späteren Tumorstadien auch supportive Mechanismen der Autophagie für das Tumorwachstum feststellen. So erlaubt die Nährstoffbereitstellung mittels Autophagie das Wachstum auch unter widrigen Bedingungen wie Hypoxie, Ischämie und Nährstoffmangel. Nährstoffmangel im Zuge des Fastens ist der bestcharakterisierte Auslöser der Autophagie. Durch diese können Aminosäuren zur Sicherung der Energieversorgung der Hepatozyten freigesetzt werden. Unter ausreichender Energiezufuhr beträgt der stündliche Proteinumsatz der Leber durch Autophagie 1,5% der totalen Leberproteinmenge. Im Zuge der unterbundenen Nährstoffzufuhr steigert sich dieser Umsatz auf 4,5%, sodass nach 48 h Fasten bis zu 36% der Leberproteine durch Autophagie umgesetzt wurden (Mortimore, Hutson et al. 1983, Schworer, Shiffer et al.
1981). Die schnelle Bereitstellung von Energie in Form von Aminosäuren innerhalb der ersten Stunden des Fastens ist physiologisch v.a. für Neugeborene wichtig, um die Zeit zwischen der transplazentalen Versorgung und der Laktation zu überbrücken. Autophagie-defiziente Mäuse versterben wenige Tage nach der Geburt, da nicht genügend freie Aminosäuren zur ATP- Synthese bereitgestellt werden können (Kuma, Hatano et al. 2004). Die Hochregulation der Autophagie innerhalb der ersten 4-6 h des Fastens ist für die Hepatozyten überlebensnotwendig, um ihren Energiebedarf durch Abbau von Aminosäuren und anderen Substraten aufrechterhalten zu können (Czaja et al. 2013). Daraus lassen sich Rückschlüsse auf die Bedeutung der Autophagie für den Tumor folgern. Die für die hohe Proliferation notwendigen Metabolite und das benötigte ATP werden mittels Autophagie zur Verfügung gestellt. Diese Überlegungen entsprechen auch der Tatsache, dass häufig eine Hochregulation der Autophagie in Tumorzellen beobachtet wird (Ávalos et al. 2014, White 2012). Die Interaktionen zwischen Autophagie und der Einleitung des Zelltodes durch Apoptose sind vielfältig und noch nicht vollends verstanden. Beide können unabhängig oder in wechselseitiger Beeinflussung zum Zelltod führen (K. Wang 2015). Autophagie ist eine frühzeitige Zellreaktion auf Stress und beginnt bereits vor der Induktion der Apoptose. Somit ist die Autophagie der Apoptose vorgeschaltet und beeinflusst diese. Als Grundüberlegung gilt, dass Autophagie das Überleben der Zelle mittels Energieversorgung durch Selbstdigestion sichert. Dies wirkt der Apoptose entgegen und verhindert, dass manifeste Tumorzellen zu Grunde gehen und somit weiter proliferieren können (Sun et al. 2013). Somit kann dem Prozess der Autophagie in fortgeschrittenen Tumorstadien eine tumorfördernde Funktion zugeschrieben werden, da das Überleben der Tumorzelle gefördert wird. Beispielhaft sind Lungentumore, welche eine Aktivierung des Tumoronkogens K-Ras aufweisen, für ihr weiteres Wachstum geradezu auf Autophagie angewiesen (Guo, Karsli Uzunbas et al. 2013, Guo, Chen et al. 2011).
1.3.3.3 Autophagie in der hepatozellulären Karzinogenese
Die Entstehung von hepatozellulären Karzinomen ist ein Vorgang in mehreren Schritten, welcher durch Untergang gesunder Leberzellen und einer darauffolgenden Entzündungsreaktion beginnt. Im weiteren Verlauf kommt es zu einer kompensatorisch erhöhten Hepatozytenproliferation und bedingt durch die Entzündung zu einer Zirrhose, auf deren Grundlage sich eine HCC entwickeln kann (Z. Wang, Han et al. 2014). Verschiedenste Autoren beschreiben die Rolle der Autophagie in der HCC-Entstehung als ähnlich zwiespältig wie in den vorangegangenen Kapiteln beschrieben (L. Liu, Liao et al. 2017, Y. Lee, Jang 2015).
So wirkt die Autophagie initial als tumorsuppressiver Mechanismus. In gesunden Zellen schützt Autophagie durch Abbau von geschädigten Zellorganellen und Proteinen die Zelle gegen Entartung. Sobald jedoch ein manifester Tumor besteht, fördert Autophagie dessen Fortschreiten durch Bereitstellung der benötigten Nährstoffe wie Aminosäuren, Fettsäuren und Glukose (Czaja et al. 2013). In Atg7-defizienten Mäusen zeigte sich die spontane Bildung von gutartigen Leberadenomen (Takamura, Komatsu et al. 2011). Bei Beclin-1+/- Tieren, die somit teilweise Autophagie-defizient waren, kam es häufiger zur HCC-Entstehung (Qu, Yu et al.
2003). Bei bestehendem Tumor verändert sich die Rolle der Autophagie jedoch, da hier der Schutz der Tumorzellen gegen ROS, Apoptose und die Förderung der Invasion und Metastasierung im Vordergrund steht (Toshima, Shirabe et al. 2014, Li, Yang et al. 2013, Song, Guo et al. 2011). So könnten unterschiedliche Autophagiemarker in verschiedenen genetischen Subtypen des HCCs bald als prognostische Marker eingesetzt werden. Ding, Shi et al. berichteten von einer inversen Korrelation zwischen HCC-Aggressivität und Autophagieaktivität, gemessen an der Expression von Beclin-1, was in diesem Fall bedeutet, dass eine verminderte Autophagie in Zusammenhang mit einem schlechteren Outcome in vitro und in vivo steht (Ding, Shi et al. 2008). In einer anderen Studie korrelierte die Menge an LC3- II mit der Tumorgröße und bei fortgeschrittenen HCCs (> 3 cm) mit dem Hypoxiegrad. Zudem konnte LC3-II in diesen Tumoren als unabhängiger Prognosemarker für ein Tumorrezidiv postuliert werden (Toshima et al. 2014). Mit unserem derzeitigen Wissen kann jedoch noch nicht erklärt werden, unter welchen Konditionen und zu welchem Zeitpunkt sich der Funktionswechsel der Autophagie bezüglich Tumorgenese und Tumorwachstum vollzieht und aus einem tumorsuppressiven ein tumorsupportiver Mechanismus wird. So rückt therapeutisch zunehmend die Frage in den Vordergrund, ob die Autophagie zum Zeitpunkt der Intervention unterdrückt oder gefördert wird (J. Schneider, Cuervo 2014).
1.3.4 Das Atg7-Knockout-Modell
Bei homozygoter Deletion des Atg7-Gens verstarben die Atg7-/- Tiere kurz nach der Geburt.
Diese homozygoten Atg7-/- Tiere zeigten zum Zeitpunkt ihrer Geburt keinerlei Krankheitszeichen. Sie fielen allein durch ein verringertes Körpergewicht, verglichen mit heterozygoten oder Wildtyp-Tieren, auf, verstarben aber einen Tag post partum. Komatsu et al. als auch Kuma et al. schlussfolgerten bei Atg5-/- Tieren, dass der Tod aufgrund von Nährstoffmangel bei erhöhtem Bedarf kurz nach der Geburt eintritt. Diese Hypothese wird durch den Umstand unterstrichen, dass das Aminosäurelevel im Blut der Atg7-/- Tiere signifikant niedriger war als bei den Kontrollgruppen (Komatsu et al. 2005, Kuma et al. 2004).
In unserem Modell werden homozygote Atg7-Knockout-Mäuse verwendet, bei denen selektiv mittels Cre/IoxP-System (Kos 2004) das Atg7-Gen gefloxt wird. Dies ist die Voraussetzung, um das Gen durch die Aktivierung einer Rekombinase gezielt auszuschalten. Die verwendete Cre-Rekombinase steht unter der Kontrolle des leberspezifischen Albuminpromoters (Alb.Cre). Somit ist der Schritt der Elongation und Maturation der Autophagosomenmembran nur in der Leber unterbunden. Homozygot gefloxte Atg7f/f Mäuse wurden gesund und ohne pathologischen Phänotyp geboren.
Das ATG7-Protein konnte nachgewiesen werden, was bedeutet, dass ATG7 funktionsfähig in den Atg7f/f Tieren gebildet wurde. Die Expression von Albumin steigert sich innerhalb der ersten Lebenswochen und ist nach 6 Wochen maximiert. Ab diesem Zeitpunkt wird kein ATG7- Protein mehr exprimiert (Postic, Magnuson 2000). Die ersten Untersuchungen des Atg7f/f Modells wurden an Atg7f/f Mx1.Cre Tieren mit einem leber- und nierenspezifischen Atg7- Knockout nach intraperitonealer Injektion von pIpC durchgeführt. Im Anschluss konnte weder Atg7-RNA noch ATG7 in den Atg7f/f Mx1.Cre+ Lebern nachgewiesen werden. Die Lebern der Atg7f/f Mx1.Cre+ Tiere waren 90 Tage nach der pIpC-Injektion stark hypertrophiert. Diese Hepatomegalie beruhte auf einer Hepatozytenhypertrophie mit Störung der Lappenstruktur und vereinzelten Councilman Bodies. Aufgrund der hepatozellulären Schädigung waren die Leberenzyme AST, ALT und AP erhöht. LC3-positive Stellen wurden in den Atg7f/f Mx1.Cre+
Proben nachgewiesen, diese waren aber nicht in der typischen Ringstruktur angeordnet wie in der Kontrollgruppe. Zwar kam es zu einer Hochregulation aller LC3-Formen, jedoch fand in den Atg7f/f Mx1.Cre+ Lebern keine Umwandlung von LC3-I in LC3-II statt (Komatsu et al.
2005). In anderen Untersuchungen wurden vergleichbare Veränderungen auch in Atg7f/f Alb.Cre+ Lebern nachgewiesen. Die sich entwickelnde starke Hepatomegalie im Verlauf von mehreren Monaten ging mit starker hepatischer Dysfunktion und Entzündung einher. Beides fand genauso Ausdruck in immunhistochemischen Färbungen und erhöhten Level an Leberenzymen wie AST, ALT und ALP. Ab einem Alter von sieben Monaten traten erste Mikrotumore diffus verteilt in den Mäuselebern auf. Die Anzahl und Größe der Tumore der Atg7f/fAlb.cre+ nahm im weiteren Verlauf zu. Pathologisch handelte es sich bei allen Tumoren um benigne hepatozelluläre Adenome (Inami, Waguri et al. 2011). Ab einem Alter von 16-19 Monaten waren die Lebern fast komplett mit Tumoren überzogen. Dieser Phänotyp war identisch mit dem von Atg5f/f CAG.Cre+ Mäusen (Takamura et al. 2011). Beim Mx1.Cre- Knockout konnten schon 20 Tage nach pIpC-Injektion unter dem Elektronenmikroskop abnormale, konzentrische Membranen und Ansammlungen von Peroxisomen und deformierten Mitochondrien nachgewiesen werden, was als verringerter Organellenabbau gewertet wurde. Außerdem konnten keine Autophagosomenstrukturen während des Fastens in diesen Tieren nachgewiesen werden (Komatsu et al. 2005). Hingegen lagerten sich vermehrt Ubiquitin- und P62-positiv markierte Proteine ab. Die Akkumulation von P62 wurde auch in Atg5-Knockout-Tieren beobachtet. Komatsu et al. schlussfolgerte daraus den Abbau von P62 mittels Autophagie (Komatsu et al. 2007).
Das Atg7-Knockout-Modell ist ein etabliertes Modell für Untersuchungen bei leberspezifischen Autophagieverlust. Es ist unabhängig von Medikamentengaben und kann als stabil betrachtet werden.
1.4 Zielsetzung
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Einfluss der Autophagie während akuter und chronischer Leberschädigung bis hin zur Tumorgenese des hepatozellulären Karzinoms zu untersuchen.
Eine solche Betrachtung ist notwendig, da das hepatozelluläre Karzinom eines der häufigsten Karzinomerkrankungen weltweit ist. Außerdem ist das HCC eines der wenigen Tumorentitäten in Deutschland mit steigendender Inzidenz und Mortalität. Die Behandlungsmöglichkeiten sind jedoch in vielen Fällen auf palliative Behandlungsansätze beschränkt und neue Therapiestrategien sind dringend nötig. Autophagie wurde in den letzten Jahren zunehmend in Zusammenhang mit verschiedenen Erkrankungen der Leber gebracht. Leider sind die molekularen Grundlagen, durch welche Autophagie Einfluss auf den Krankheitsverlauf nimmt, bisher unzureichend verstanden. Um das Verständnis dieser zu erweitern, ist weitere Forschungsarbeit nötig.
Langfristig soll diese Untersuchung einen Beitrag zum besseren Verständnis der molekularen Mechanismen, durch die Autophagie den Verlauf von Lebererkrankungen beeinflusst, leisten.
Durch Kombination von Fah-/- Tieren mit hereditärer Tyrosinämie Typ 1 und Atg7f/fAlb.Cre+
Tieren mit Autophagie-Knockout konnten entsprechende immunhistochemische Färbungen, proteinbiochemische und molekulare Untersuchungsverfahren während der akuten und chronischen Leberschädigung durchgeführt werden.
Ziele der hier vorgestellten Untersuchungen waren:
1) Bestimmung der Autophagie als hepatoprotektiver oder hepatodestruktiver Mechanismus während der akuten und im Verlauf der chronischen Leberschädigung 2) Bestimmung der Rolle der Autophagie in der Regulation der Proliferation und Apoptose
während der akuten und im Verlauf der chronischen Leberschädigung 3) Beschreibung des Einflusses der Autophagie auf den zellulären Stress 4) Bestimmung der Rolle der Autophagie während der Tumorgenese
2 Material und Methoden
Wenn nicht anders im Text kenntlich gemacht, wurden die aufgeführten Methoden von mir, Alina Michael, durchgeführt. Andere mitwirkende Personen wurden an entsprechender Stelle angegeben.
2.1 Material
2.1.1 Chemikalien
Tabelle 2:1 Chemikalien
Substanz Hersteller Artikel Nr.
Acrylamid/Bis Lösung, 30%ig Bio Rad 1610158
Agarose UltraPure Invitrogen 15510.27
Ammoniumperoxidsulfat (APS) Roth 9592.3
Borsäure (H3BO3) Sigma-Aldrich B6768
Bovines Serumalbumin (BSA) Cell Signaling 9888
BrdU Sigma-Aldrich B5002
Bromophenol Blau (BPB) Sigma-Aldrich B5525
Chloramin T Sigma-Aldrich 857319
Citratazetat Merck 8.18707.1000
cOmpleteTM Protease Inhibitor Cocktail Roche 11697498001
Dimethylbenzaldehyd Sigma-Aldrich D2004-25G
Direkt-Rot 80 (Sirius Red) Sigma-Aldrich 365548
Dithiothreitol (DTT) Promega V315A
Entellan® Merck 1.07961.0100
Eosin-Y-Lösung, wässrig Sigma-Aldrich DANN110.232
Essigsäure, 99%ig JT Baker 6052
Ethanol, 99%ig JT Baker 8025
Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz, dehydriert (EDTA)
Sigma-Aldrich E6635 Ethylene glycol-bis(2-aminoethyl-ether)-
N,N,N´,N´-tetraacetic acid (EGTA)
Sigma-Aldrich E-3989
Everolimus (RAD001) Novartis
Faramount wässriges Deckelungsmedium Dako S3025
Formalaldehydlösung, 3,5 – 3,7%ig Otto Fischar 2652965
Glycerol Sigma-Aldrich G8773
HEPES 1M, pH 7.6 Sigma-Aldrich H0887
Hydroxyprolin Sigma-Aldrich M-5534
Isopropanol / 2-Propanol JT Baker 8067
Kaliumchlorid (KCl) Sigma-Aldrich P5405
Ketanest® S 25 mg/ml, (Esketaminhydrochlorid) Pfizer 39946.00.00 MassRuler DNA-Ladefärbung (6X) Thermo Fisher R0621
Meyers Hämalaunlösung Merck 109249
Methanol (CH3OH) JT Baker 8045
Methoxyethanol Sigma-Aldrich E5378-1GA
Natriumcitrat, dehydriert Sigma-Aldrich S1804
Natriumazetat Merck 1.06267.1000
Natriumborhydrid (NaBH4) Sigma-Aldrich 71320
Natriumchlorid (NaCl) Sigma-Aldrich 71376
Natriumdodecylsulfat (SDS) Lösung, 10%ig AppliChem A0676
Natriumfluorid (NaF) Sigma-Aldrich S7920
Natriumorthovanadate (Na3VO4) Sigma-Aldrich S6508 Natriumpyrophosphatdecahydrat (NaPPi) Sigma-Aldrich S6422
Natronlauge, 1 M (NaOH) Roth K021.1
Normales Pferdeserum Biozol/ Vector S-2000
Normales Ziegenserum Biozol/ Vector S-1000
NP-40 Calbiochem D00 013 935
NTBC (2-(2-Nitro-4-trifluormethyl-benzoyl)-1,3- cyclohexandion)
Swedish Orphan Biovitrum
PageRuler Prestained Protein Ladder Thermo Fisher 26616 PBS (10x), pH 7.2 (phosphate buffered saline) Gibcol Life
Technologies
70013-016
Perchlorsäure Merck 519.10000
Periodsäure (H5IO5) Sigma-Aldrich P0430
Pirkinsäure (2,4,6-Trinitrophenol) Fluka 74069
Protein Assay Dye-Reagenz Bio Rad 5000006
Proteinase K Merck 1245680500
Salzsäure (HCl), 32%ig Roth P074.3
TEMED (Tetramethylethylendiamin) Fluka 87689
Tris-Pufferlösung pH (0,5M) Amresco J832
Tris-Pufferlösung pH 8.8 (1,5M) Amresco J831
Tris-Glycine Puffer Konzentrat 10x VWR Chemicals M114 Trocken Milch, fettfrei (Dry Milk) Cell Signaling 9999
Tween®-20 Sigma-Aldrich P5927
Ultra Pure Bovines Serum Albumin (BSA) Cell Signaling 9998S
UltraPure™ Tris-Puffer Invitrogen 15504-020
Wasserstoffperoxid (H2O2)-Lösung, 30%ig Sigma-Aldrich 216763
Western Lightning® Plus ECL Perkin Elmer NEL104001EA
Xylol JT Baker 8080
β-Glycerophosphate Sigma-Aldrich G-6376
β-Mercaptoethanol (βME) Sigma-Aldrich 63689
2.1.2 Kits
Tabelle 2:2 Kits
Substanz Hersteller Artikel Nr.
AEC-Kit Life Technologies SK-4200
Antigen-Wiederherstellungspuffer, zitronensäurebasiert
Vector Laboratories
H-3300
Avidin/Biotin-Kit Vector
Laboratories
SP-2001
HRP-Streptavidin Plus Invitrogen 50-420Z
In Situ Cell Death Detection-Kit, Fluorescein Sigma-Aldrich 5024514
NucleoSpin® RNA II Macherey-Nagel 740955
Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis-Kit Roche 05 091 284 001
Vectashield Eindeckelungsmedium mit Dapi Vector Laboratories
H-1200
Vector® Mouse-on-Mouse® (M.O.M.) Biozol Diagnostica BMK-2202
2.1.3 Antikörper
2.1.3.1 Antikörper: Immunhistochemie
Tabelle 2:3 Antikörper: Immunhistochemie
Substanz Hersteller Artikel Nr.
Amersham Monoklonal-Anti-Bromo-deoxyuridine (clone BU-1)
GE Healthcare RPN202
Ki67-Antigen-Hase-Polyklonal-Antikörper Vector Laboratories VP-K451
P21-Antikörper (M-19)-G Santa Cruz
Biotechnology
sc-471-G Phospho-Histone H3 (Ser10) Antigen-Hase-
Antikörper
Cell Signaling 9701 Hase-Anti-Ziege-IgG (H+L) Biotin-XX-Konjugat Life Technologies A10518 Ziege-Anti-Hase-IgG (H+L) Biotin-XX-Konjugat Life Technologies B-2770 Ziege-Anti-Maus-IgG (H+L) Biotin-XX-Konjugat Life Technologies B-2763 2.1.3.2 Antikörper: Immunfluoreszenz
Tabelle 2:4 Antikörper: Immunfluoreszenz
Substanz Hersteller Artikel Nr.
β-Catenin-Antikörper (E-5) Santa Cruz Biotechnology sc-7963 Ziege-Anti-Maus-IgG (H+L) Alexa Fluor® 488-
Konjugat
Life Technologies A-11001 Ziege-Anti-Ratte-IgG (H+L) Alexa Fluor® 488-
Konjugat
Life Technologies A-11006
