2.5.1 Genotypisierung durch Polymerase Kettenreaktion (PCR)
Die Genotypisierung der gezüchteten Mäuse wurde mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und anschließender Agarose-Gelelektrophorese (vgl. 2.5.2) durchgeführt.
Um ausreichende Mengen an DNA zum gelelektrophoretischen Nachweis zur Verfügung zu haben, wurden Gewebeproben durch Ohrstanzen entnommen. Diese wurden isoliert und mittels anschließender PCR vervielfältigt. Während der PCR wird ein einzelnes DNA-Molekül innerhalb mehrfacher Zyklen von Denaturierung, Primeranlagerung und DNA-Synthese durch DNA-Polymerasen exponentiell vervielfältigt. Durch Verwendung genspezifischer Primer kann der Knockout bzw. die erfolgreiche Insertion der Cre/IoxP Region der untersuchten Gene nachgewiesen werden. Die Methode wurde erstmals 1986 beschrieben (Mullis, Faloona et al.
1986).
Zur DNA-Extraktion wurde ein 2-3 mm großes Stück des Ohres über Nacht bei 56°C in 260 µl des DNA-Extraktionspuffer (Tabelle 2:21) zur Inkubation belassen. Im Falle einer Regenotypisierung wurde anstatt des Schwanzstücks ein Teil eingefrorene Leber verwendet.
Die Probe wurde für 5 min bei 96°C erhitzt und anschließend 50 µl gesättigtes NaCl hinzugegeben, um die Lyse zu beenden. Nach Durchmischung der Probe wurde diese für 10 min bei 16,100 x g (4°C) zentrifugiert. Der DNA-Überstand wurde in einem neuen Reagenzglas mit 200 µl Isopropanol durch mehrmaliges Wenden vermischt. Anschließend wurde wiederum 10 min bei 16,100 x g (4°C) zentrifugiert. Der flüssige Überstand wurde verworfen und 200 µl kaltes 70%iges Ethanol zum Waschen auf das DNA-Pellet gegeben. Das Ethanol wurde abpipettiert und das Pellet an der Luft getrocknet. Nach Trocknung wurde das Pellet in 100 µl TE-Puffer (Tabelle 2:21) gelöst und für 30 min bis 1 h bei 50°C belassen.
Die folgende PCR zur DNA-Vermehrung lässt sich in drei sich wiederholende Arbeitsschritte unterteilen. Die PCR startet mit der Denaturierung der DNA-Doppelstränge durch starkes Erhitzen (1) (Tabelle 2:24). Dadurch wird es den Primern und der Polymerase erst möglich, sich bei anschließender Temperaturreduktion an die DNA zu binden (2). Nach abermaliger Erhöhung der Temperatur wird die DNA durch die Polymerase durch Einbau der
dazugegebenen dNTPs verdoppelt (3). Die Zyklusabfolge für die verschiedenen Gene wird nachfolgend dargestellt. Es wurde ein Mastercycler® epgradient (Eppendorf) verwendet.
Tabelle 2:21 Puffer bei der DNA-Extraktion
Lysis-Puffer 10 mM Tris/HCl, 200 mM NaCl, 2 mM EDTA in demineralisiertem Wasser (pH 8,2)
DNA-Extraktionsbuffer 200 µl Lysis Puffer, 10 µl Proteinkinase K (20 U), 50 µl 10% SDS TE-Puffer 10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA in demineralisiertem Wasser (pH 8,0)
Tabelle 2:22 PCR-Bedingungen
Zyklusanzahl von Schritt 1-3 35x 38x 32x
2.5.2 Gelelektrophorese
Die qualitative Auswertung der PCR erfolgte mittels einer gelelektrophoretischen DNA-Auftrennung. Dabei wurden die gebildeten negativ geladenen DNA-Stränge ihrer Größe nach im elektrischen Feld aufgetrennt, wodurch ein entsprechendes Bandenmuster entstand.
Dieses konnte durch Kopplung der DNA an einen Fluoreszenzfarbstoff sichtbar gemacht werden. Dabei wurde das Sub-Cell® GT Agarose Gel Elektrophorese System (Bio Rad) verwendet.
Der Nachweis von Atg7 und Alb.cre wurde mittels eines 1-%igen Agarose-Gels erbracht, für Fah wurde ein 1,5%iges Gel verwendet. Zur Herstellung der Gele wurde 0,5 x TBE-Puffer verwendet. Dieser wurde aus 44,5 mM Borsäure, 1 mM EDTA (pH 8,3) und 44,5 mM Tris/HCl
hergestellt. Nach Zugabe der entsprechenden Menge Agarosepulver wurde das Gemisch erhitzt. Zwischendurch wurde der Kolben geschwenkt. Nach Abkühlen des Gels wurde GelStar Nukleinsäure Gel-Färbemittel (1:40000) hinzugegeben, bevor es in eine Gelelektrophorese-Kammer gegossen wurde. Diese wurde mit 0,5 x TBE-Puffer befüllt. Bei den Proben Fah-/- und Atg7-/- wurden zur Anfärbung 3 µl MassRuler DNA-Ladefärbung (6x) je Probe hinzugegeben, bevor die Taschen mit 10 µl Probe befüllt wurden und die Gelelektrophorese gestartet wurde.
Bei einer Leistung von 180 W lief das 1%ige Gel 25 min und das 1,5%ige Gel 35 min im Standard Power Pack P25. Die Dokumentation erfolgte mittels GeneGenius Bio Imaging System (Syngene) mit GeneSnap (Version 6.03.01). In der Gelelektrophorese konnte bei den Fah-/- Mäusen ein DNA-Fragment bei 240 bp beobachtet werden, wohingegen bei den Fah+/+
Wildtyp-Tieren eine DNA-Ansammlung bei 180 bp zu sehen war. Bei den Atg7f/f Mäusen war eine Bande bei 550 bp, bei Atg7+/+ Wildtyp-Mäusen bei 1500 bp zu finden. Sowohl bei der Fah- als auch bei der Atg7-PRC waren bei heterozygoten Tieren beide Banden sichtbar. Bei Alb.cre+ Mäusen fanden sich die Nachweisbande bei 450 bp. Bei Alb.cre- Mäusen war keine Bande nachweisbar.
Genotypisierung mit PCR und Gelelektrophorese wurden durch Dr. rer. nat. Laura Elisa Buitrago-Molina, Dipl. Biologin Dorothee Römermann und MTA Agnes Haase durchgeführt.
2.5.3 RNA-Isolation
Für folgende Versuche wurde reine RNA aus Lebergewebe isoliert. Es wurden jeweils n=4 Proben der Genotypen Atg7f/fAlb.cre+, Fah-/- Atg7f/fAlb.cre+ und Fah-/- Atg7f/fAlb.cre- untersucht. Dies wurde gemäß der Anleitung des NucleoSpin® RNA II-Kits (Handbuch, Stand Juli 2010) durchgeführt.
Dafür wurden 25-35 mg gefrorenes Lebergewebe in ein Gemisch von 350 μl RA1-Puffer und 3,5 μl β-Mercaptoethanol gegeben und für 10 s mit mittels Ultraturax (Stufe 5) zerkleinert. Zur Filtration wurde das entstandene Lysat mittels NucleoSpin® Filter bei 11000 x g für 1 min zentrifugiert und in einem Reagenzgefäß aufgefangen. Dem Filtrat wurde im Anschluss 350 μl 70%iger Ethanol hinzugegeben und gut durchmengt. Das entstandene Lysat wurde in die NucleoSpin® RNA-Säule überführt und für 30 s bei 11000 x g zentrifugiert. Das Filtrat wurde verworfen. Die NucleoSpin® RNA-Säule wurde in ein weiteres Reaktionsgefäß überführt und 350 μl MDB (Membrane Desalting Buffer) in die NucleoSpin® RNA auf die entstandene Silica-Membran pipettiert. Nun wurde für 1 min bei 11000 x g zentrifugiert. Für jede Probe wurde ein DNase-Reaktionsgemisch aus 8 μl wiederhergestellter rDNase und 85 μl Reaktionspuffer für rDNase hergestellt und direkt auf die Silica-Membran gegeben. Nach 15 min Inkubationszeit bei Raumtemperatur folgten drei Waschschritte. Dafür wurden zuerst 200 μl RAW2-Puffer und dann 600 μl RA3-Puffer auf die Membran gegeben. Dazwischen wurde jeweils 30 s bei 11000 x g zentrifugiert. Nun wurde abermals 250 μl RA3-Puffer hinzugeben und für 2 min bei 11000 x g zentrifugiert. Zum Abschluss wurden 30 μl RNase-freies Wasser zum Eluieren der RNA auf die Membran gegeben und nochmals bei 11000 x g für 1 min zentrifugiert. Die RNA-Konzentration der entstandenen Lösung wurde mittels NanoDrop® ND-1000 Spectrophotometer (Peqlab Biotechnologie) gemessen und bei -80°C gelagert.
2.5.4 cDNA-Synthese mittels Reverser Transkriptase PCR (RT-PCR)
Aus der isolierten RNA wurde mittels Reverser Transkriptase-PCR (RT-PCR) für die anschließende quantitative RealTime-PCR (qPCR) komplementäre DNA (cDNA) hergestellt.
Dabei fand eine RNA-abhängige DNA-Polymerase (Reverse Transkriptase) Anwendung, die die RNA als Matrize für die cDNA-Bildung nutzt. Der Versuch wurde gemäß der Anleitung des Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis-Kit (Handbuch, Stand September 2012) durchgeführt.
Die RNA-Proben wurden auf Eis aufgetaut, durchmischt und für 5 s bei hoher Geschwindigkeit zentrifugiert. Nun wurde in einem nukleasefreien Reagenzgefäß der vorgegebene Primer-Mix mit einem Endvolumen von 20 μl je Probe hergestellt. Dabei wurde 1 μg RNA verwendet und entsprechend PCR Grade-Wasser aufgefüllt. Der Primer-Mix wurde in zwei Schritten hergestellt. Der präfinale Primer-Mix (Tabelle 2:24) wurde für 10 min bei 65°C zur Denaturierung der Sekundärstruktur der RNA und Anlagerung der Primer belassen und danach sofort auf Eis abgekühlt. Dann wurden dem präfinalen Primer-Mix weitere Komponenten hinzugefügt (Tabelle 2:25). Die Komponenten werden vermischt und für 30 min bei 50°C erhitzt. In dieser Zeit lagert sich die RNA-abhängige DNA-Polymerase (reverse Transkriptase) an die Primer an und schreibt diese in cDNA um. Darauf folgten 5 min bei 85°C zur finalen Elongation und abschließend 5 min auf Eis zum Reaktionsabbruch. Die cDNA-Ansätze wurden bei -20°C gelagert.
Tabelle 2:24 Präfinalen Primer-Mix
Substanz Volumen Stoffmengenkonzentration
RNA Variabel 1 μg
Anchored-oligo (dT)18 Primer, 50 pmol/ μl 1 μl 2,5 μM
PCR Grade-Wasser Variabel Auffüllung auf 11,4 μl
Tabelle 2:25 Finaler Primer-Mix
Substanz Volumen Stoffmengenkonzentration
Transcriptor High Fidelity Reverse-Transkritase-Reaction Buffer, 5 x
4 μl 1 x (8 mM MgCl2) Protector RNase-Inhibitor, 40 U/μl 0,5 μl 20 U
Deoxynukleotide-Mix, jeweils 10 mM 2 μl Jeweils 1 mM
DTT 1 μl 5 mM
Transcriptor High Fidelity Reverse-Transkriptase
1,1 μl 22 U
2.5.5 Quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR)
Mittels der quantitativen Real-Time-PCR (qPCR) wurde eine mögliche Genregulation von p21 auf posttranskriptioneller Ebene untersucht.
Zu Beginn wurde der TaqMan® Fast Advanced Master-Mix (Tabelle 2:26) angesetzt. Auf einer MicroAmp® 96-Well-Reaktionsplatte wurden je Tasche 2 μl cDNA-Ansatz und 18 μl TaqMan®
Fast Advanced Master-Mix pipettiert und nach Abdichtung zur Luftblasenreduktion kurz zentrifugiert. Dabei wurden Triplets je Probe für die Gene RnS18 und p21 durchgeführt. RnS18 diente als endogene Kontrollen. Die qPCR wurde mittels QuantStudio™ 12K Flex System (Applied Biosystems) durchgeführt.
Tabelle 2:26 TaqMan® Fast Advanced Master-Mix
Substanz Volumen
pro Reaktion
Finale Stoffkonzentration TaqMan® Fast Advanced Master-Mix (2 x) 10 μl 1 x
TaqMan® Gen-Sonden (20 x) 1 μl 1 x
Nukleasefreies Wasser (aus NucleoSpin® RNA II-Kit) 7 μl