Bei zellulärem Stress kommt es zur Akkumulation von fehlerhaft gefalteten Proteinen und veralteten Organellen. Dies führt durch Kapazitätsüberschreitung des Endoplasmatischen Retikulums (ER) zu einer vermehrten Bildung von freien Sauerstoffradikalen (ROS) (Dara, Ji et al. 2011), was wiederum Schäden an der DNA, RNA oder den Proteinen verursacht und die Tumorgenese begünstigt.
Diesem Vorgang wirkt Autophagie entgegen, sodass bei Autophagieverlust entsprechende pathologische Veränderungen in verschiedenen Geweben wie beispielsweise Gehirn oder Leber beobachtet wurden (Komatsu, Waguri et al. 2007, Komatsu, Waguri et al. 2005). Ein solch akkumulierendes Protein ist P62. P62 wirkt im Atg7-Modell leberschädigend, da gezeigt werden konnte, dass Atg7f/fMx1.p62-/- Mäuse eine deutlich geringere Leberschädigung aufwiesen als der Einzelknockout Atg7f/fMx1 (Komatsu, Waguri et al. 2007). P62 bindet an das kelch-like ECH-associated protein 1 (KEAP-1) und führt so zu einer Aktivierung von factor erythroid 2-related factor 2 (NRF2). NRF2 induziert anschließend eine oxidative Stressantwort mit erhöhter Lipogenese, Inflammation, Apoptoseinduktion und Expression von HO-1 und NQO-1 (Furfaro, Traverso et al. 2016, Shelton, Jaiswal 2013, Dara, Ji et al. 2011). In humanen HCCs ist sowohl die Gesamtüberlebenszeit als auch der krankheitsfreie Zeitraum bei einer hohe NRF2-Expression signifikant geringer (M. Zhang, Zhang et al. 2015). Spannenderweise zeigte der Atg7-Einzelknockout in früheren Untersuchungen einen höheren Grad der Leberschädigung, ausgedrückt durch stärkere Hepatomegalie, Hepatozytenhypertrophie, vermehrte zelluläre Infiltration und höhere AST- und AP-Werte als Atg7f/fMx1 Nrf2 -/-Doppelknockout-Mäuse. Diese Beobachtungen belegen, dass eine durch P62-KEAP-1-Wechselwirkung verursachte NRF2-Überaktivierung bei Autophagiedefizienz im Atg7-Modell eine Ursache der auftretenden Leberschädigung ist (Komatsu, Kurokawa et al. 2010). Im Gegensatz dazu wirkt NRF2 im Fah-Modell hepatoprotektiv und reduziert die durch FAA verursachte Toxizität deutlich. Im Modell der akuten Hepatitis verstarben Fah-/- Nrf2 -/-Doppelknockout-Tieren innerhalb weniger Tage nach NTBC-Entzug. Es wurden vermehrt apoptotische Zellen sowie erhöhten Level an Serum-Transaminasen und verschiedenen, inflammatorischen Zytokinen wie TNF-α oder IL-6 beobachtet. Im Gegensatz dazu überlebten Fah-/- Einzelknockout-Tiere mehrere Wochen ohne NTBC. Die akute Entzündungsreaktion war somit in 0% Fah-/- Nrf2-/- Lebern deutlich stärker ausgeprägt als in 0% Fah-/- Lebern mit daraus resultierender, erhöhter Sterblichkeit. Auch Fah-/- Nrf2-/- Tiere, die fünf bis sechs Monate mit 100% NTBC oder einer reduzierten Dosis von 10% NTBC behandelt wurden, entwickelten eine stärker ausgeprägte chronische Hepatitis als die Fah-/- Kontrolltiere. Es konnte
nachgewiesen werden, dass Nrf2-Defizienz im 10% Fah-Modell zu einer stärkeren oxidativen Schädigung durch FAA führte. Im Verlauf von neun Monaten unter 10% NTBC-Behandlung entwickeln 100% der Fah-/- Nrf2-/- Tiere HCCs, wohingegen nur 10% der Fah-/- Kontrolltiere im gleichen Zeitraum Tumore entwickelten. Somit wirkt Nrf2 einerseits im 0% Fah-Modell der akuten Leberschädigung entgegen und verzögert bei chronischer Leberschädigung die Hepatokarzinogenese durch FAA-Toxizität (Marhenke, Lamlé et al. 2008). Spannenderweise wirkt NRF2 somit hepatoprotektiv im Fah-Modell, wohingegen es in Atg7-Modell eine Schädigung bedingt. NRF2 war in den 0% Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre- Tieren, gemessen an der Expression von P62 und KEAP-1, stärker exprimiert als in den Autophagie-defizienten 0%
Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre+ und Atg7f/fAlb.Cre+ Tieren. Wie aus dem Fah-Modell bekannt war die akute Hepatitis durch NRF2-Aktivierung in der erst genannten Gruppe deutlich milder ausgeprägt. Im Gegenteil dazu zeigte sich während der chronischen Schädigung kein Unterschied in der NRF2-Aktivierung zwischen den Autophagie-defizienten Tieren, Atg7f/fAlb.Cre+ und 2,5% Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre+, und den Autophagie-fähigen 2,5% Fah -/-Atg7f/fAlb.Cre- Tieren. Gleichwohl war die Leberschädigung in den Autophagie-defizienten Gruppen prägnanter und es kam zu einer deutlich akzellerierten Tumorentwicklung im Doppelknockout. Folglich kann gesagt werden, dass Autophagie mittels einer gesteigerten NRF2-Produktion im 0% Fah-Modell die akute Hepatitis abschwächt, während der chronischen Leberschädigung jedoch keine protektive Wirkung hat. Interessanterweise hat dieser Sachverhalt jedoch keine Auswirkung auf die HO-1- und NQO-1-Expression, welche in allen drei zuvor genannten Gruppen zum Zeitpunkt der akuten Hepatitis und der frühen chronischen Schädigung gleich war. HO-1 und NQO-1 lagen folglich unabhängig von der Autophagiehemmung in erhöhten Mengen im 0% Fah-Modell vor. Eine solche Induktion von HO-1 war aus dem 0% Fah-Modell bereits aus vorherigen Untersuchungen bekannt (Bergeron, Jorquera et al. 2006). Während sich die Aktivierung von NRF2 im Verlauf der chronischen Hepatitis nicht wesentlich zwischen den beiden Gruppen, 2,5% Fah -/-Atg7f/fAlb.Cre+ und 2,5% Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre-, unterschied, fiel eine verminderte HO-1-Induktion bei Autophagiedefizienz nach fünf Monaten in den 2,5% Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre+ Tieren auf. Einerseits wurde im Rahmen verschiedener Arten der Leberschädigung eine schützende Rolle von HO-1 beschrieben (Chang, Xue et al. 2015), anderseits ist eine Hochregulation von HO-1 für verschiedenen Tumorentitäten bekannt. Dies wurde in Zusammenhang mit einer erhöhten Invasivität, stärkeren Therapieresistenz und schlechteren Prognose gebracht (D. Ma, Fang et al. 2015, Tsai, Wang et al. 2012, Sass, Leukel et al. 2008), was auf eine Rolle bei der Tumorgenese und Tumorprogression hinweist (Nitti, Piras et al. 2017). Daraus kann
geschlossen werden, dass HO-1 je nach Schädigungsgrad eine leberschützende oder -schädigende Wirkung inne zu haben scheint. Daher war die Abnahme von HO-1 in den 2,5%
Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre+ Tieren zum Zeitpunkt der Tumorentstehung umso überraschender, weil hier eine Hochregulation von HO-1 zu erwarten gewesen wäre. Diese HO-1-Regulation durch Autophagie scheint NRF2-unabhängig abzulaufen, wobei weitere Untersuchungen zu Bestätigung dieses Punktes nötig wären. Eine verminderte Phosphorylierung von P38 bei gehemmter Autophagie stach außerdem nach fünfmonatiger 2,5% NTBC-Behandlung ins Auge. Für eine durch HO-1 regulierte P38-Aktivierung wird eine tumorsuppressive Wirkung diskutiert (Orlik, Schüngel et al. 2015). Im Verlauf der chronischen Leberschädigung im
Fah-Modell scheint die Autophagie Einfluss auf die Hochregulation des HO-1/ P38-Signalwegs zu nehmen. Weitere Untersuchungen sind jedoch nötig, um diese Hypothese zu bestätigen und die genauen Zusammenhänge zu klären.
4.6 Apoptoseinduktion als Reaktion auf die Leberschädigung bei Autophagieverlust
Aufgrund der Leberschädigung kommt es vermehrt zum Vorgang der Apoptose, unter dem man den von der Zelle selber eingeleiteten Zelltod versteht. Sie ist entscheidend für die Entsorgung beschädigter Zellen, um die Zellhomöostase aufrecht zu erhalten (Wyllie, Kerr et al. 1980). Eine antiapoptotische Wirkung der Autophagie wurde bereits in verschiedenen in vitro (S. Chen, Dobrovolsky et al. 2014) und in vivo (Ni, Bockus et al. 2012) Modellen beschrieben. Die vorliegenden Experimente belegten darüber hinaus eine antiapoptotische Funktion der Autophagie im Fah-Modell sowohl in der akuten wie auch in der chronischen Leberschädigung.
Mitogen-aktivierte-Proteinkinase (MAP-Kinasen) spielen eine entscheidende Rolle bei der Signalvermittlung diverser extrazellulärer Stimuli ins Zellinnere, um entsprechende Zellantworten auszulösen. Dabei werden die MAP-Kinasen durch verschiedene Signalkaskade durch vorgeschalteten Kinasen mittels Phosphorylierung aktiviert (Chen, Gibson et al. 2001). Durch ihre große Bandbreite an Signalen und Regelwegen haben die MAP-Kinasen somit ebenfalls Einfluss auf die Apoptoseregulation in den Hepatozyten. JNK, induziert durch verschiedene Stimuli wie oxidativen Stress, Ischämie oder Acetaminophen, wird in diesem Kontext eine proapoptotische Funktion über den mitochondrialen Apoptoseweg zugeschrieben (Nakagawa, Maeda 2012). Bei akuter Leberschädigung im 0% Fah-Modell konnten bei Autophagiedefizienz erhöhte Mengen an aktivierter Caspase-3 nachgewiesen werden, wohingegen der JNK/cJUN-Signalweg nicht aktiviert war. Folglich zeigte sich eine JNK/cJUN-unabhängige Apoptoseinduktion bei Autophagieverlust im 0% Fah-Modell. Im Gegensatz dazu beschrieben Amir et al. eine Erhöhung von aktiviertem JNK und aktivierter Caspase-3 in Atg7hep Mäusen innerhalb weniger Stunden nach Injektion von GaIN/LPS (Amir, Zhao et al. 2013). Bei oxidativen Stress, ausgelöst durch Menadion, schlugen die Autophagie-defiziente Hepatozyten ebenso vermehrt den Apoptoseweg ein, einhergehend mit einer vorausgehenden Überaktivierung des (JNK)/cJUN-Signalwegs (Wang, Singh et al.
2010). Somit scheint die Autophagie bei akuter Leberschädigung zwar antiapoptotisch zu wirken, diese Wirkung beruht jedoch im Gegensatz zu anderen Modellen der akuten Leberschädigung im Fah-Modell nicht auf einer Aktivierung des (JNK)/cJUN-Signalwegs.
Während bei akuter Leberschädigung, ausgelöst durch LPS-Gabe, im p38α-/- Knockout-Modell eine antiapoptotischer Effekt von P38 beschrieben wurde (Nakagawa, Maeda 2012), konnte im 0% Fah-Modell in Abhängigkeit von der Autophagie keine Korrelation mit der Apoptoseinduktion gezeigt werden. So war das P38-Level in den 0% Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre+ und den 0% Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre- Tieren gleich, wohingegen mehr Caspase-3 in den Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre+ Mäusen zu finden war. Ähnlich verhielt es sich mit der Expression von ERK1/2, für welches in vorherigen Untersuchungen eine proapoptotische Rolle beschrieben wurde. So
kam es nach Gabe von Astaxanthin unter anderem durch ERK1/2-Inaktivierung zu einer Abnahme der Apotoserate in Mäuselebern, die zuvor mit Acetaminophen behandelt wurde.
Die Acetaminophen-Gabe induzierte dabei zuvor eine akute Leberschädigung (J. Zhang, Zhang et al. 2017). Autophagie wirkt somit während der akuten Leberschädigung im 0% Fah-Modell weder durch P38- oder ERK1/2-Regulation antiapoptotisch.
Wie schon während der akuten Leberschädigung konnte diese Arbeit eine antiapoptotische Rolle der Autophagie während der chronischen Leberschädigung belegen. Außerdem konnte einer Korrelation zwischen der Aktivierung des JNK/cJUN-Signalweges und der Apoptoseinduktion, ausgedrückt durch aktivierte Caspase-3, im Verlauf der chronischen Leberschädigung im 2,5% Fah-Modell nachgewiesen werden. In den 2,5% Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre+ Mäusen kam es im Verlauf der chronischen Leberschädigung zu einer Abnahme der JNK- und aktivierten Caspase-3-Expression bei steigender Inzidenz von malignen HCCs im Vergleich zu den Atg7f/fAlb.Cre+ Tieren, wo sich benigne Adenome bildeten. Autophagie scheint also im 2,5% Fah-Modell antiapoptotisch und HCC-suppressiv zu wirken. Eine Ursache für den Übergang von benignen Adenomen in den Atg7f/fAlb.Cre+ Tieren zu malignen HCCs in den 2,5% Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre+ Mäusen könnte unter anderem auf einer Regulation der Apoptose durch JNK beruhen. Die 2,5% Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre+ Tiere hatten zum frühen Zeitpunkt der chronischen Schädigung eine stärkere JNK-Aktivierung als die Atg7f/fAlb.Cre+ Tiere, während die cJUN-Aktivierung vergleichbar war. Insgesamt war die Apoptoseinduktion zu diesem Zeitpunkt ebenfalls vergleichbar zwischen den beiden Gruppen, gemessen an TUNEL-positiven Zellen und aktivierter Caspase-3. Zum Zeitpunkt nach fünf Monaten gab es hingegen weniger aktivierte Caspase-3 in den 2,5% Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre+
Tieren als in den Atg7f/fAlb.Cre+ Tieren. Das et al. beschrieben eine tumorsuppressive Wirkung von JNK in JNK-defizienten Hepatozyten nach einer Behandlung mit dem Karzinogen DEN (Diethylnitrosamin). Die entsprechenden Zellen wiesen eine geringere Apoptoserate bei gesteigerter Proliferation und eine akzelerierte HCC-Entwicklung als der Wildtyp auf (Das, Garlick et al. 2011). In den hier durchgeführten Untersuchungen zeigte sich jedoch während der chronischen Leberschädigung eine in den Atg7f/fAlb.Cre+ und 2,5% Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre+
Lebern vergleichbare p-JNK-Expression. Autophagie wirkt somit hier nicht durch JNK antiapoptotisch und tumorsuppressiv. Geringere Mengen an P38 wurden in humanen HCC-Proben nachgewiesen. Dies korrelierte negativ mit einer erhöhten HCC-Größe. Nach der Gabe von BSNQ oder OSNQ in humane Hep3B-Zellen folgte eine Apoptoseinduktion mit gleichzeitiger Hochregulation von P38 (C. Liu, Shen et al. 2018). P38 wurde daher in Zusammenhang mit Apotoseinduktion in HCC-Zellen gebracht. ERK1/2-Überaktivierung verhinderte die Apoptose, ausgelöst durch TGF-β, von HCC-Zellen. Entsprechend kam es bei ERK-Inhibition zu einem Anstieg der Apoptoserate in HepG2-Zellen. Diese Apoptoseresistenz gegenüber TGF-β ist ein entscheidender Schritt in der HCC-Entstehung (Caja, Sancho et al.
2009). Die hier vorliegenden Ergebnisse geben weder für P38 noch für ERK1/2 klare Hinweise auf eine Regulation der Apoptoseinduktion im 2,5% Fah-Modell durch Autophagie.
Autophagie reguliert die Apoptoseinduktion sowohl während der akuten als auch während der chronischen Leberschädigung negativ im Fah-Modell. Weitere Untersuchungen wären an dieser Stelle nötig, um die beeinflussenden Signalwege aufzudecken.
4.7 Proliferation als Reaktion auf die Leberschädigung bei Autophagieverlust
In geschädigtem Gewebe ist eine erhöhte Proliferationsrate als Kompensationsmechanismus des geschädigten Gewebes ein häufig beobachtetet Phänomen. Ist der Schaden gravierend, gehen vermehrt Zellen zugrunde und führen somit ebenfalls zu einer erhöhten Apoptoseinduktion (vgl. 4.1).
Die in dieser Arbeit gezeigten Ergebnisse ließen eine antiproliferative Wirkung der Autophagie durch verschiedene Proliferationsmarker während der akuten als auch im Verlauf der chronischen Leberschädigung erkennen. So war die Proliferationsrate zu allen Zeitpunkten in den Autophagie-defizienten Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre+ und Atg7f/fAlb.Cre+ Gruppen signifikant höher als in den übrigen Gruppen. Dies korreliert für den Atg7f/fAlb.Cre+ Genotyp mit anderen Experimenten meiner Arbeitsgruppe mit Atg7f/fMx.Cre+ Tieren, welche ebenfalls eine erhöhte Proliferationsrate im Vergleich zu Wildtyptieren zeigten (unveröffentlichte Daten). Für das 0%
Fah-Modell ist für Fah-/- Tiere ein kompletter Proliferationsstopp durch P21-Hochregulation bereits bekannt (Buitrago Molina, Marhenke et al. 2013). Daher war es umso spannender, dass in den Schnitten der 0% Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre+ viele proliferierende Hepatozyten gefunden werden konnten. Im 2,5% Fah-Modell erfolgte bei Autophagiedefizienz ebenfalls eine vermehrte Hepatozytenproliferation in den 2,5% Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre+ Tieren im Vergleich zur 2,5% Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre- Gruppe. In vitro Untersuchungen von Tumorzellen des Kolonkarzinoms unterstrichen ebenfalls eine antiproliferative Wirkung der Autophagie (Wu, Wu et al. 2008).
Cyclin D1 ist ein Marker der Proliferation und wirkt am Übergang von G0-/S-Phase. Aufgrund dieser wichtigen Funktion wird Cyclin D1 durch eine Vielzahl verschiedener Signalwege in der Zelle reguliert, darunter auch Autophagie. So wiesen Wu et al. eine inverse Korrelation zwischen Cyclin D1-Expression und Autophagieaktivität mit einem insgesamt schlechteren Gesamtüberleben der entsprechenden Patienten nach. Es konnte zudem belegt werden, dass Cyclin D1 Autophagie-selektiv mittels Bindung von P62 und Degradation im Lysosomen abgebaut wurde. Dadurch kam es zu einer verminderten hepatozellulären Proliferation und Tumorentwicklung (Lan, Wu et al. 2018). Mit diesen Ergebnissen übereinstimmend kam es im Fah-Modell ebenfalls zu einer Hochregulation von Cyclin D1 bei inaktiver Autophagie in den Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre+ Tieren im Vergleich zu den Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre- Tieren. Mit dieser Hochregulation korrelierend kam auch die erhöhte HCC-Inzidenz in den 2,5% Fah -/-Atg7f/fAlb.Cre+ Mäusen. Die diskutierte Leberschädigung führte zu DNA-Schäden mit Bildung von P21. P21 wirkt durch Inhibition von Cyclin D1 antiproliferativ (Casimiro, Velasco Velázquez et al. 2014). Das 0% Fah-Modell ist bekannt für eine Abhängigkeit der p21-Induktion zur jeweiligen Vorschädigung mit jedoch geringfügig erhaltener Cyclin D1-Bildung. Es kommt dabei zu einem vollständigen Proliferationsstopp in den 0% Fah-/- Tieren. Im Gegensatz dazu fanden sich durchaus proliferierende Hepatozyten in den Proben der 2,5% Fah-/- Tiere nach 4-wöchiger NTBC-Therapie (Buitrago Molina, Marhenke et al. 2013). Die 0% Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre+ Hepatozyten proliferierten spannenderweise im Gegensatz zu den Leberzellen
der 0% Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre- Mäuse. Autophagiedefizienz bewirkt also eine Aushebelung des Proliferationsstopps durch eine verminderte p21-Induktion im 0% Fah-Modell. Damit einhergehend war auch die Menge an Cyclin D1 in den 0% Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre+ Proben erhöht, was zu erhöhten Proliferationsraten führte. Vergleichbare Verhältnisse waren auch bei Autophagiedefizienz im 2,5% Fah-Modell zu beobachten, jedoch in geringerer Ausprägung.
Die Runterregulation von p21 bei Autophagiedefizienz findet im Fah-Modell auf transkriptioneller Ebene statt. Autophagie scheint also im Fah-Modell mittels transkriptioneller Hochregulation von p21 antiproliferativ zu wirken. Eine solche Regulation von p21 durch Autophagie bei zellulärem Stress durch H2O2-induziertem ROS wurde durch Luo et al. in Fibroblasten beschrieben. Hier kam es zu einer Hochregulation von p21 durch Autophagie.
Die p21-Level der Atg7f/fAlb.Cre+ Mäuse sind bei vergleichbaren Proliferationsraten und Cyclin D1-Mengen noch niedriger als bei den Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre+ Tieren. Bei Autophagieverlust durch Atg5-Knockdown nahm die Proteinmenge an P21 ab, während die p21-mRNA unverändert blieb (Luo, Zou et al. 2011). Eine mögliche Schaltstelle der Regulation könnte P53 sein, da P53 der bestuntersuchteste Regulator von P21 ist. Bisherige Ergebnisse deuten jedoch darauf hin, dass P53 einerseits Autophagie induzieren kann, andererseits auch durch Autophagie unterdrückt wird (White 2016). Gleichwohl kam es auch zu der Beobachtung, dass ATG7 unabhängig von seiner E1-ähnliche Enzymaktivität unter metabolischen Stress in embryonalen Mäusefibroblasten durch Interaktion mit P53 die P21-Aktivität induzierte (I. Lee, Kawai et al. 2012). P21 wird darüber hinaus auch P53-unabhängig reguliert (Abbas, Dutta 2009). Weitere Untersuchungen sind nötig, um herauszufinden, ob die in den Atg7-defizienten Hepatozyten beobachtete P21-Runterregulation im Fah-Modell abhängig oder unabhängig von P53 abläuft und ob diese im Fall einer P53-Interaktion durch ATG7 Autophagie-abhängig oder Autophagie-unabhängig erfolgt. Wiederum sollten auch andere Proteine als Schaltstelle der P21-Regulation durch Autophagie in Betracht gezogen werden.
In Abhängigkeit von der Intensität der Leberschädigung kommt es in verschiedenen proliferationsregulierenden Signalwegen zu Veränderungen. mTOR als wichtiger Sensor für den Energiehaushalt wird eine entscheidende Rolle in der Regulation von Zellwachstum und Proliferation in Hepatozyten zugeschrieben (Buitrago Molina, Pothiraju et al. 2009). Es wird durch verschiedenste anabole Stimuli wie beispielsweise Nährstoffzufuhr, Wachstumsfaktoren, aber auch Zellstress aktiviert (Czaja, Ding et al. 2013, Laplante, Sabatini 2012). Außerdem ist mTOR der bestuntersuchteste Regulator der Autophagie (Efeyan, Zoncu et al. 2012, Hosokawa, Hara et al. 2009). p-S6 und 4E-BP1 werden wiederum durch mTOR reguliert (Magnuson, Ekim et al. 2012). Weder p-S6 als 4E-BP1 zeigten in den vorliegenden Experimenten einen klaren Zusammenhang zur Cyclin D1-Menge. Dies ist insoweit interessant, da zwar auf der einen Seite für 4E-BP1 eine untergeordnete Rolle in der mTOR-vermittelten Hepatozytenproliferation vermutet, p-S6 jedoch auf der anderen Seite eine entscheidende Rolle zugesprochen wurde. Nach partieller Hepatektomie folgte auf die Gabe von Rapamycin, einem mTOR-Inhibitor, die Hypophosphorylierung von S6, während sich kein Effekt auf 4E-BP1 zeigte. Darüber hinaus konnte demonstriert werden, dass die Proliferationsrate in S6K1-/-S6K2-/- Hepatozyten vermindert war und diese Proliferationsabnahme durch zusätzliche Gabe von Rapamycin nur geringfügig gesteigert werden konnte. S6K-Inhibition bedingte also eine ähnliche Proliferationshemmung wie
Rapamycin. Auf eine Hemmung von S6K folgte eine geringere Cyclin D1-Proteinmenge,
bedingt durch eine verminderte, S6K1-abhängige Ccnd1-mRNA-Transkription oder -Stabilisation. Cyclin D1 wird aus Ccnd1-mRNA translatiert. p-S6 wird durch S6K1/2
phosphoryliert und wirkt proliferationsfördernd (Espeillac, Mitchell et al. 2011). So beobachteten Buitrago et al., dass mTOR-Aktivierung, ausgedrückt durch S6-Phosphorylierung, geradezu notwendig für Hepatozytenproliferation und Tumorentstehung im Fah-Modell war (Buitrago Molina, Marhenke et al. 2013). Im Hinblick auf die Rolle der Autophagie im Fah-Modell scheint dies jedoch nicht zuzutreffen. So kommt es trotz fehlendender Korrelation von mTOR und p-S6 in den Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre+ Lebern zu einer erhöhten Proliferation im Vergleich zu den Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre- Tieren.
Aufgrund der generell entscheidenden Rolle des mTOR-Signalwegs für verschiedenste Stoffwechselvorgänge der Zelle wird dieser vielseitig reguliert. Der PI3K/AKT/mTOR-Signalweg ist einer dieser gut charakterisierter mTOR-Regulationswege, dem im Kontext der HCC-Entstehung eine tumorunterstützende Funktion zugeschrieben wird (Liu, Liao et al.
2017). AKT als Schlüsselprotein dieses Signalweges hemmt einen mTOR-Inhibitor mit resultierendem, negativem Effekt auf die Autophagie. So kam es nach Behandlung mit BKM120, welches die Phosphorylierung von AKT durch Inhibition von PI3K verhindert, in der transgenetischen YPF-LC3 Huh7-Zelllinie zu einer Autophagieinduktion. Gleichzeitig folgte auf die BKM120-Gabe eine Abnahme der Hepatozytenproliferation und des HCC-Wachstums in in vitro und in vivo (Kirstein, Boukouris et al. 2013). Die hier vorliegenden Ergebnisse gaben jedoch keinen Hinweis auf eine Korrelation zwischen AKT- und mTOR-Aktivität. So war p-AKT als aktive Form im 0% Fah-Modell gar nicht reguliert und lag in den 2,5% Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre+
Proben in geringerer Mengen vor als in den 2,5% Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre- Mäusen. Es nahm dabei jedoch keinen Einfluss auf die mTOR-Expression. Obwohl mTOR für die Proliferation im Fah-Modell grundlegend notwendig ist, scheint Autophagie darüber hinaus mTOR-unabhängig antiproliferativ zu wirken. Die hier gezeigten Ergebnisse sprechen dabei für eine Autophagie-abhängige Bildung von P21 auf Transkriptionsebene als Ursache.
Weitere Upstream-Regulation erfolgt durch die MAP-Kinase. ERK1/2 wird eine positive Regulation von Proliferation, Zellüberleben und Differenzierung zugesprochen. So werden verschiedenste Zellzyklus regulierende Proteine, wie Cyclin D1 oder P21, durch ERK1/2 reguliert. Es verwundert daher nicht, dass die MEK-ERK-Aktivierung ein häufig beobachtetes
Weitere Upstream-Regulation erfolgt durch die MAP-Kinase. ERK1/2 wird eine positive Regulation von Proliferation, Zellüberleben und Differenzierung zugesprochen. So werden verschiedenste Zellzyklus regulierende Proteine, wie Cyclin D1 oder P21, durch ERK1/2 reguliert. Es verwundert daher nicht, dass die MEK-ERK-Aktivierung ein häufig beobachtetes