3.3 Atg7-abhängiger Einfluss auf Apoptose und oxidativer Stress bei
3.3.3 Apoptose und oxidativer Stress bei später chronischer Leberschädigung
-/-Atg7f/fAlb.Cre+ Lebern gebildet und in geringerem Umfang ebenfalls in Atg7f/fAlb.Cre+ Proben.
Außerdem fanden sich geringe Menge in den 100% Fah-/- und Atg7f/fAlb.Cre- Gruppen. cJUN wird in den beiden vermehrt p-JNK-exprimierenden Gruppen, 2,5% Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre+ und Atg7f/fAlb.Cre+, am meisten gebildet (Abbildung 3.10 C). Es überrascht nicht, dass eine erhöhte p-cJUN-Akkumulation (Abbildung 3.10 C) in eben diesen Proben gemessen wurde, hingegen nicht in denen der 100% Fah-/-, Atg7f/fAlb.Cre- und 2,5% Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre- Tiere.
Hier fehlt der wichtige cJUN-Regulator p-JNK, welcher cJUN phosphoryliert und dieses auf diesem Weg aktiviert. cJUN wird in geringem Ausmaß auch in 2,5% Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre- Tieren gebildet. In den 100% Fah-/- und Atg7f/fAlb.Cre- Mäusen war kein cJUN nachweisbar. Die P38-Menge (Abbildung 3.10 C) war in alle Gruppen gleich. Eine P38-Aktivierung durch Phosphorylierung (Abbildung 3.10 C) war in den 100% Fah-/- und Atg7f/fAlb.Cre- Lebern detektierbar, wohingegen p-P38 in geringerem Umfang in den 2,5% Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre+
Proben vorliegt und fast vollkommen in den 2,5% Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre- und Atg7f/fAlb.Cre+
Proben fehlt. Der höchste Umfang an ERK1/2 (Abbildung 3.10 C) war in den 2,5% Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre+ und Atg7f/fAlb.Cre+ Gruppen vorhanden. Des Weiteren war ERK1/2 in 2,5%
Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre- Proben stärker detektierbar als in den beiden Kontrollgruppen 100%
Fah-/- und Atg7f/fAlb.Cre-. Es kann festgehalten werden, dass 2,5% Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre+ und 2,5% Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre- Tiere ähnlich viel p-ERK1/2 (Abbildung 3.10 C) aufweisen. Die Mengen sind vergleichbar mit denen der 100% Fah-/- und Atg7f/fAlb.Cre+ Genotypen.
Atg7f/fAlb.Cre- Proben hatten die höchste Menge an p-ERK.
Atg7-Inaktivierung zum frühen Zeitpunkt der chronischen Hepatitis bedingte in den Fah -/-Tieren eine vermehrte Aktivierung des Apoptoseweges. Trotz niedrigerer Apoptoserate ist P62 als Auslöser von oxidativem Stress Atg7-unabhängig in den Fah-/- Mäusen erhöht. Dieser Umstand überrascht, ist P62 doch ein Abbausubstrat der Autophagie, welches somit Atg7-abhängig abgebaut wird. Sowohl HO-1 als auch NQO-1 als Antwort auf oxidativen Stress sind Atg7-unabhängig hochreguliert im 2,5% Fah-Modell. Im Hinblick auf spätere Kapitel (vgl. 3.3.3) ist zu beachten, dass die aktivierte MAP-Kinase p-P38 bei Atg7-Verlust in den Fah-/- Tieren stärker gebildet wird als bei intaktem Atg7.
3.3.3 Apoptose und oxidativer Stress bei später chronischer Leberschädigung
Im Verlauf der chronischen Leberschädigung kommt es zu einer zunehmenden Hepatomegalie und Entstehung von HCCs (vgl. 3.2.3). Chronische Leberschädigung im Fah-Modell mit NTBC-Behandlung über drei Monate führt zu leicht erhöhter Apoptoseinduktion (Buitrago Molina et al. 2013), wohingegen Atg5-Insuffizienz die Apoptose stark fördert (Ni et al. 2014). Es war von Interesse, zwischen dem früheren Zeitpunkt der chronischen Hepatitis (4 Wochen suboptimale NTBC-Therapie) und dem Zeitpunkt der Tumorgenese (fünf Monate suboptimale NTBC-Therapie) nach zellulären Veränderungen durch länger bestehenden oxidativen Stress zu suchen.
Abbildung 3.11 Späte chronische Leberschädigung: Apoptose und oxidativer Stress
Atg7-Defizienz führte zur Apoptoseinduktion in Fah-/- Tieren mit chronischer Leberschädigung. Interessanterweise nahmen die Expression von HO-1 und die Aktivität von P38 beide bei Atg7-Inaktivierung im Fah-Modell ab, während NQO-1 im Zuge der Antwort auf oxidativen Stress unabhängig von der Atg7-Aktivität gebildet wurde. Vergleich von Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre+ und Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre- nach einer Behandlung mit 2,5% NTBC über fünf Monate. Kontrollen sind ebenfalls dargestellt (100% Fah-/-, Atg7f/fAlb.Cre+ und Atg7f/fAlb.Cre-). A) Darstellung von repräsentativen TUNEL-Assay-Bildern. Der Messbalken entspricht 100 μm. B) Western Blot-Untersuchung zu Bestimmung von Proteinen mit Aktivität während Apoptose und oxidativen Stress. n = 4. *: F: Fah-/-. F100: 100% Fah-/-. A+:
Atg7f/fAlb.Cre+. A-: Atg7f/fAlb.Cre-. FA+: Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre+. FA-: Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre-.
Wie aus der TUNEL-Assay (Abbildung 3.11 A) hervorging, wurden sowohl in den 2,5% Fah -/-Atg7f/fAlb.Cre+, 2,5% Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre-, 100% Fah-/- als auch Atg7f/fAlb.Cre+ Schnitten vereinzelt apoptotische Hepatozyten beobachtet; dabei am meisten in den 2,5% Fah -/-Atg7f/fAlb.Cre+ Präparaten. Neben diesen wurden in den Schnitten der 2,5% Fah -/-Atg7f/fAlb.Cre+ Proben auch viele Infiltratszellen angefärbt. In dieser Gruppe konnte zudem wieder ein starker Kontrast zwischen Tumor- und Nicht-Tumorgewebe erkannt werden (nicht gezeigt). In den Atg7f/fAlb.Cre- Schnitten ließen sich keine Zellen anfärben. Die Ergebnisse der TUNEL-Assay konnten wie schon in den vorherigen Kapiteln mittels aktivierter Caspase-3-Western Blot (Abbildung 3.11 B) besser differenziert werden. So wurde überraschenderweise am meisten von diesem Protein in den Atg7f/fAlb.Cre+ Lebern nachgewiesen. 2,5% Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre+ Lebern hatten auch ein erhöhtes Level an aktivierter Caspase-3, jedoch weniger als die zuvor genannte Gruppe. Die übrigen Gruppen zeigten sehr geringe Mengen an aktivierter Caspase-3.
Wie schon in den vorherigen Kapiteln (vgl. 3.3.1) wurde das Augenmerk auf den Regulationsmechanismus der oxidativen Stressantwort rund um P62 und KEAP-1 gelegt. Das Degradationssubstrat der Autophagie, P62, wurde in den 2,5% Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre+, 2,5%
Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre-, 100% Fah-/- und Atg7f/fAlb.Cre+ Gruppen nachgewiesen (Abbildung 3.11 B). In den Atg7f/fAlb.Cre- Tieren war es hingegen nur minimal nachweisbar. Zum späten Zeitpunkt der chronischen Leberschädigung war KEAP-1 in den verschiedenen Gruppen ähnlich verteilt exprimiert wie P62 (Abbildung 3.11) In den 100% Fah-/- Tieren war weniger KEAP-1 nachweisbar. Es wurde wieder die Expression der hochregulierten Antwortproteine bei oxidativem Stress, HO-1 und NQO-1, bestimmt. Die 2,5% Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre- Mäuse hatten eine erhöhte HO-1-Proteinmenge gegenüber allen anderen Gruppen (Abbildung 3.11 B). In dieser Versuchsreihe ließ dabei die geringe Expression von HO-1 in den 2,5% Fah-/-
Atg7f/fAlb.Cre+ Mäusen aufhorchen, welche am wenigsten von allen Gruppen bildeten. Mit deutlicher weniger Proteinmenge nach den 2,5% Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre- Tieren folgte die Atg7f/fAlb.Cre+ Gruppe bezüglich der HO-1-Expression. 100% Fah-/- und Atg7f/fAlb.Cre- Mäuse bildeten weniger HO-1 als die vorhergenannten Gruppen. Ein anderes Bild zeigte sich in der Untersuchung der NQO-1-Proteinmenge (Abbildung 3.11 B). Hier wiesen 2,5% Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre+ und 2,5% Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre- eine ähnliche Proteinmenge auf. Es kann festgehalten werden, dass bei Atg7-Inaktivität und bzw. oder Fah-abhängigem Leberschaden eine erhöhte Menge NQO-1 nachweisbar war. Die 100% Fah-/- Tiere bildeten noch sehr geringe Menge an NQO-1. Im Gegensatz dazu war NQO-1 in Atg7f/fAlb.Cre- Tiere nicht nachweisbar.
Um Rückschlüsse auf mögliche ursächliche vorgeschaltete Regulationsmechanismen zu erlangen, wurden abermals die MAP-Kinasen bestimmt. Ihre jeweilige Bedeutung für verschiedenen zellulären Funktionen wurde in vorherigen Kapiteln (vgl. 3.3.1) erläutert. Die Atg7-defizienten 2,5% Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre+ und Atg7f/fAlb.Cre+ Tiere exprimierten p-JNK (Abbildung 3.11 B). Die Genotypen 2,5% Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre-, 100% Fah-/- und Atg7f/fAlb.Cre- bildeten im Kontrast dazu kein p-JNK. Die größte Menge cJUN wurde in den Lebern der Atg7f/fAlb.Cre+ Tiere nachgewiesen (Abbildung 3.11 B). In etwas geringerer Menge fand sich das Protein in den 2,5% Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre- Lebern. In den 2,5% Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre+ Proben lag cJUN ebenfalls vor, dabei wiederum in geringerer Menge als in den zuvor genannten Gruppen. Am wenigsten wurde cJUN in den Kontrollgruppen 100% Fah-/- und Atg7f/fAlb.Cre- gefunden. Kongruent mit der cJUN-Menge wurde am meisten p-cJUN in Atg7f/fAlb.Cre+ Tieren nachgewiesen, gefolgt von 2,5% Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre- und 2,5% Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre+ Mäusen (Abbildung 3.11 B). In den Gruppen 100% Fah-/- und Atg7f/fAlb.Cre- wurde kein p-cJUN gefunden. P38 wurde in den 2,5% Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre+, 2,5% Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre- und Atg7f/fAlb.Cre+ Proben stärker exprimiert als in den anderen Kontrollgruppen, 100% Fah-/- und Atg7f/fAlb.Cre- (Abbildung 3.11 B). Eine interessante Entdeckung war, dass die 2,5% Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre+ Tiere am wenigsten P38 von allen Gruppen in den untersuchten Proben phosphorylierten (Abbildung 3.11 B). In den beiden Gruppen 2,5% Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre- und Atg7f/fAlb.Cre+ zeigte sich im Vergleich zu den 100% Fah-/- und Atg7f/fAlb.Cre- Tieren ebenfalls eine verminderte Aktivierung von P38. Die Genotypen 2,5% Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre+, 2,5% Fah -/-Atg7f/fAlb.Cre- und Atg7f/fAlb.Cre+ wiesen gleich viel ERK1/2 auf (Abbildung 3.11 B). Die weiteren Gruppen, 100% Fah-/- und Atg7f/fAlb.Cre-, exprimierten ERK1/2 in geringerer Menge.
Bei der Untersuchung der p-ERK1/2-Expression (Abbildung 3.11 B) in den Lebern fiel ins Auge, dass 2,5% Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre- Lebern vermehrt dieses Protein aufwiesen. Die 2,5%
Fah-/- Atg7f/fAlb.Cre+ und Atg7f/fAlb.Cre- Tiere bildeten weniger p-ERK1/2 als die zuvor genannte Gruppe. In den 100% Fah-/- und Atg7f/fAlb.Cre+ Mäusen wurde ebenfalls p-ERK1/2 nachgewiesen, jedoch in geringerer Menge als in den beiden vorherigen Gruppen.
Bei Atg7-Defizienz ist die Apoptoserate in den Fah-/- Tieren zum späten Zeitpunkt der chronischen Hepatitis erhöht. HO-1 als Marker für oxidativer Stress als auch aktiviertes p-P38 lagen bei Atg7-Verlust im Fah-Modell weniger vor, womit sich das Verhältnis von HO-1 im Vergleich zur frühen chronischen Schädigung gewandelt hat (vgl. 3.3.2).