Immunhistochemische Färbungen

Immunhistochemische Färbungen dienen dem spezifischen Nachweis von Proteinen und begründen sich auf dem Prinzip der Antigen-Antikörper-Reaktion. Dabei wurde die indirekte Methode der Detektion verwendet, bei der ein direkt ans Antigen gebundener primärer Antikörper mit einem weiteren sekundären Antikörper gekoppelt wird, welcher über ein Enzym zur Farbreaktion führt. Das Reaktionsprodukt lagert sich ab und kann als farbliche Ablagerungen unter dem Mikroskop nachgewiesen werden. Es besteht eine Korrelation zwischen Farbniederschlag und vorhandenem Protein.

2.3.3.1 Ki67-, BrdU- und p-Histon H3-Antikörper-Färbung

Alle drei Färbungen dienten der Bestimmung der Proliferationsrate. Das Antigen Ki67 ist im Zellkern lokalisiert, wo es während des gesamten Zellzyklus mit Ausnahme der G0- und früher G¹-Phase exprimiert wird. Dies bedeutet, dass in ruhende Zellen kein Ki67 detektiert wird (Yu, Woods et al. 1992, Gerdes, Lemke et al. 1984). Gerdes et al. beschrieben den Ki67-Antikörper im Jahr 1983 erstmals (Gerdes, Schwab et al. 1983). Bromodeoxyuridin (BrdU) ist ein Thymidinanalogon, welches als solches während der Replikation und der DNA-Reparatur anstelle von Thymidin in die DNA eingebaut wird. Das eingebaute BrdU kann mittels eines monoklonalen anti-Bromodeoxyuridine-Antikörpers detektiert werden (Muskhelishvili, Latendresse et al. 2003, Gonchoroff, Katzmann et al. 1986). Der monoklonale Anti-Bromodeoxyuridine-Antikörper wurde erstmals 1982 von Gratzer et al. beschrieben (Gratzner 1982). Histon H3 ist eine von insgesamt fünf verschiedenen Histonformen. Diese sind Teil des Chromatins und dienen der dichten Verpackung der DNA unter Bildung von Nukleasomen.

Histon H3 wird in der späten G2-Phase an Serin10 phosphoryliert. Die Dephosphorylierung beginnt in der späten Anaphase und ist in der Telophase abgeschlossen. Phosphoryliertes Histon H3 (p-Histon H3) liegt somit fast ausschließlich in der M-Phase vor. Ein solcher Antikörper wurde erstmals 1997 von Hendzel et al. beschrieben (Hendzel, Wei et al. 1997).

Bei den Färbungen Ki67 und BrdU wurde 0,05% Tween-20 in PBS (PBS-T) als Waschpuffer verwendet. Bei der p-Histon H3-Färbung wurde stattdessen 0,05% Tween-20 in TBS (TBS-T) verwendet. Aus Gründen der Übersichtlichkeit wird in der folgenden Beschreibung nur PBS-T als Waschpuffer genannt.

Tabelle 2:12 Färbebedingungen: Ki67, BrdU und p-Histon H3

Ki67 BrdU p-Histon H3

Nach der Deparaffinisierung folgte die Demaskierung in Antigen-Wiederherstellungspuffer (Tabelle 2:12) für 30-40 min bei 96°C in einem Wasserbad. Anschließend wurden die Schnitte zur Abkühlung bei Raumtemperatur belassen. Bei der BrdU-Färbung schloss sich ein weiterer Inkubationsschritt in 2 M HCL für 1 h an. Dies dient der Freilegung der BrdU-Antikörperbindungsstellen. Nach Waschung in dH2O erfolgte die Blockierung der endogenen Peroxidasen in einer 3%igen H²O² Lösung. Nach wiederholter Waschung in dH²O und PBS-T sowie Umrandung der Schnitte mittels eines fetthaltigen PapPens wurde bei Ki67 das Biotin-Streptavadin/HRP System verwendet, um durch Blockierung des endogenen Biotins als auch der Biotin- und Avidinrezeptoren im gesamten Gewebe die Sensitivität für den Antikörper nochmals zu erhöhen. Dazu wurde ein Tropfen Avidin Blockierungslösung mit 15 min Inkubationszeit in einer feuchten Dunkelkammer, sowie anschließend ein Tropfen Biotin Blockierungslösung mit gleicher Inkubationszeit auf dem Gewebe inkubiert. Dazwischen wurde wiederum in PBS-T gewaschen. Im Anschluss ließ man 60 μl der Blockierungslösung (Tabelle 2:12) für 30 min bei Ki67 und BrdU bzw. 1 h bei p-Histon H3 zur Blockierung unspezifischer Bindungsstellen in einer feuchten Dunkelkammer einwirken. Nach vorsichtigem Abklopfen der Blockierungslösung wurden 60 μl des verdünnten primären Antikörpers aufgetragen (Tabelle 2:12). Dieser wirkte in einer feuchten Dunkelkammer bei 4°C über Nacht ein. Nach Waschung in PBS-T wurde der verdünnte zweite Antikörper (Tabelle 2:12) in einer feuchten Dunkelkammer für 30 min inkubiert. Im Anschluss wurde ein Tropfen HRP-Streptavidin Plus für 30 min zur Inkubation aufgetragen. Die Meerrettichperoxidase (HRP) bindet an die Biotinbindestelle des sekundären Antikörpers. Im Anschluss wurden 60 μl Lösung auf die Schnitte gegeben, wodurch es zu einer roten Farbreaktion zwischen dem AEC-Substrat (3-Amino-9-Ethylcarbazole) und der Meerrettichperoxidase (HRP) kommt. Somit steht die Stärke der Farbreaktion in proportionalem Zusammenhang zu der Menge des gebundenen Antikörpers und folglich auch des gesuchten Proteins. Zwischen den Schritten wurde in PBS-T gewaschen. Die Farbreaktion wurde durch das Mikroskop beobachtet und nach ca. 4-6 min durch Gabe in dH²O abgestoppt. Als vorletzter Schritt erfolgte die Gegenfärbung in Meyers Hämatoxylin für 15 s und mit anschließender 10 min Einwirkzeit in

lauwarmen Leitungswasser. Nach Waschen in dH2O werden die Schnitte mittels Faramount wässriges Deckelungsmedium abgedeckt und bei Raumtemperatur verdunkelt zum Trocknen stehen gelassen.

2.3.3.1.1 Auswertung

Zur Bestimmung der Mitoserate wurde der Quotient aus angefärbten, sich teilenden Zellen und Gesamtzellzahl berechnet. Die benötigten Werte wurden durch Auszählung ermittelt. Dabei wurden repräsentative und per Zufall acht Fotos pro Präparat aufgenommen. In diesen wurden die angefärbten Hepatozyten und die Gesamtzahl an Hepatozyten ermittelt. Die Mitoserate wurde für jedes Foto einzeln bestimmt, dann wurde aus den acht Werten der Mittelwert bestimmt. Zur Auszählung wurde ImageJ (Version 1.48) verwendet.

2.3.3.2 P21-Antikörper-Färbung

Das Tumorsuppressorgen p21 wird vor allem in Folge einer p53-Hochregulation aktiviert und bewirkt einen Zellzyklusarrest durch Hemmung spezifischer Cyclin-abhängiger Kinase (CDK) während der G1-Phase als auch am G2-/M-Phase Kontrollpunkt. Die Hochregulation von p21 dient hier als Indikator der DNA-Schädigung mit Aktivierung von p53.

Nach dieser Deparaffinisierung folgte die Demaskierung in Antigen Wiederherstellungspuffer (Tabelle 2:13) für 30 min bei 96°C in einem Wasserbad. Anschließend wurden die Schnitte zur Abkühlung bei Raumtemperatur belassen. Nach Waschung in dH2O erfolgte die Blockierung der endogenen Peroxidasen mittels 3% Wasserstoffperoxids in dH²O. Nach wiederholter Waschung in PBS-T sowie Umrandung der Schnitte mittels eines fetthaltigen PapPens ließ man für 45 min 60 μl der Blockierungslösung (Tabelle 2:13) zur Blockierung unspezifischer Bindungsstellen in einer feuchten Dunkelkammer einwirken. Anschließend wurde aus den bereits beschrieben Gründen (vgl. 2.3.3.1) das Biotin-Streptavadin/HRP System verwendet.

Es folgte das Auftragen von einem Tropfen Avidin Blockierungslösung mit 15 min Inkubationszeit in einer feuchten Dunkelkammer sowie anschließend einem Tropfen Biotin Blockierungslösung mit gleicher Inkubationszeit. Dazwischen wurde wiederum in PBS-T gewaschen. Nach diesem Schritt wurde das Biotin vorsichtig abgeklopft und 60 μl des verdünnten primären Antikörpers aufgetragen (Tabelle 2:13). Dieser wirkte in einer Dunkelkammer bei 4°C über Nacht ein. Am zweiten Tag wurde der verdünnte zweite Antikörper (Tabelle 2:13) in einer feuchten Dunkelkammer nach Waschung in PBS-T für 30 min inkubiert. Anschließend wurde wiederum mit PBS-T gewaschen. Im Anschluss wurde ein Tropfen HRP-Streptavidin Plus für 15 min zur Inkubation aufgetragen. Es wurde abermals mit PBS-T gewaschen und 60 μl AEC-Lösung auf die Schnitte gegeben, wodurch es zu der spezifischen Farbreaktion zwischen der Meerrettichperoxidase und dem Streptavidin kam (vgl.

2.3.3.1). Die Farbreaktion wurde durch das Mikroskop beobachtet und nach ca. 10-15 min durch Überführung in dH2O abgestoppt. Als vorletzter Schritt folgte die Gegenfärbung in Meyers Hämatoxylin für 15 s und anschließender 10 min Waschung in lauwarmem Leitungswasser. Nach Waschen in dH2O wurden die Schnitte mittels Faramount wässriges Deckelungsmedium abgedeckt und bei Raumtemperatur verdunkelt zum Trocknen belassen.

Tabelle 2:13 Färbebedingungen: P21

P21

Antigen-Wiederherstellungspuffer

1 mM EDTA in Aqua bidest (pH 6)

Blockierungslösung 10% Pferdeserum in 0,05% Tween-20 in PBS

Waschpuffer 0.05% Tween-20 in PBS

Verdünnter primärer Antikörper Ziege-Anti-P21 (1:50) in 1% BSA/PBS-T Verdünnter sekundärer

Antikörper

Biotin-Hase-Anti-Ziege (1:100) in 1% BSA in 0,05% Tween-20 in PBS

2.3.3.2.1 Auswertung

Je Präparat wurden acht repräsentative Fotos per Zufall aufgenommen und die Genotypen miteinander verglichen.