Medizinische Hochschule Hannover
Institut für Toxikologie
Massenspektrometrie-basierte in vitro und in vivo Studien zu posttranslationalen Modifikationen von Arginin und Bestimmung der
Ganzkörper-Arginin-Dimethylierung am Menschen
INAUGURALDISSERTATION
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften - Doctor rerum naturalium -
(Dr. rer. nat.)
vorgelegt von
Alexander Bollenbach (Kustanaj)
Hannover, 2019
Angenommen durch den Senat: 16.12.2019
Präsident: Prof. Dr. med. Michael P. Manns
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. rer. nat. Dimitrios Tsikas Wissenschaftliche Zweitbetreuung: Prof. Dr. rer. biol. hum. Stefan Ückert
1. Referent/in: Prof. Dr. rer. nat. Dimitrios Tsikas 2. Referent/in: Prof. Dr. rer. biol. hum. Stefan Ückert 3. Referent/in: Prof. Dr. rer. nat. Falk Büttner
Tag der mündlichen Prüfung: 16.12.2019
Prüfungsausschuss
Vorsitz: Prof. Dr. rer. nat. Jürgen Alves 1. Prüfer/in: Prof. Dr. rer. nat. Dimitrios Tsikas 2. Prüfer/in: Prof. Dr. rer. biol. hum. Stefan Ückert 3. Prüfer/in: Prof. Dr. rer. nat. Falk Büttner
Zusammenfassung ... I Summary ... III Abkürzungsverzeichnis... V
1 Einleitung ... 1
1.1 Posttranslationale Modifikationen ... 1
1.2 Methylierung ... 3
1.3 Protein-Arginin N-Methyltransferase ... 7
1.4 Asymmetrisches Dimethyl-Arginin... 11
1.5 Symmetrisches Dimethyl-Arginin ... 14
1.6 Massenspektrometrie in Kopplung mit der Gaschromatographie oder Flüssigchromatographie ... 16
1.7 Zielsetzung ... 20
2 Veröffentlichungen ... 22
2.1 Publikation Nr. 1 ... 25
2.2 Publikation Nr. 2 ... 37
2.3 Publikation Nr. 3 ... 41
2.4 Publikation Nr. 4 ... 52
2.5 Manuskript Nr. 5 ... 63
2.6 Publikation Nr. 6 ... 78
2.7 Manuskript Nr. 7 ... 95
2.8 Manuskript Nr. 8 ... 112
3 Ausführliche Zusammenfassung und übergreifende Diskussion ... 133
3.1 GC-MS Analytik ... 133
3.2 Tierexperimentelle, klinische und klinisch-pharmakologische Studien ... 145
3.3 Untersuchungen zu asymmetrischer Dimethylierung in humanen Erythrozyten und
Effekte von dimethylierten Vasopressin-Analoga auf die Plättchenaggregation ... 154
3.4 Abschlussbetrachtung und Ausblick... 157
4 Referenzen ... 162
5 Anhang ... 184
5.1 Lebenslauf und Liste der Publikationen ... 184
5.2 Danksagung ... 188
5.3 Erklärung ... 189
I Alexander Bollenbach
Massenspektrometrie-basierte in vitro und in vivo Studien zu posttranslationalen Modifikationen von Arginin und Bestimmung der Ganzkörper-Arginin-Dimethylierung am Menschen
Es wurden GC-MS-Methoden zur indirekten quantitativen Bestimmung der Dimethylierung und der Citrullinierung von Arg-Resten in Proteinen in biologischen Proben entwickelt, validiert und in experimentellen, tierexperimentellen und klinischen Studien angewandt.
Diese Methoden basieren auf der HCl-katalysierten Freisetzung von asymmetrischem Dimethylarginin (ADMA) und Citrullin (Cit) aus Proteinen und ihrer quantitativen Analyse mittels GC-MS. Cit wird als die Summe von Cit und Ornithin (Cit+Orn) gemessen.
Die Serum-Konzentrationen von freiem ADMA bei älteren gesunden, mit Helicobacter pylori (Hp)-infizierten Personen unterschieden sich nicht von denen einer Kontrollgruppe aus Hp- negativen Personen. Bei Personen ohne Hp-Infektion wurde eine inverse Korrelation zwischen Arg-Dimethylierung und Citrullinierung beobachtet.
GC-MS-Untersuchungen an humanisierten T1DM IDDM-Ratten zeigten, dass nicht der Pankreas, sondern die Niere und die Milz eine größere Rolle in diesem T1DM-Modell spielen. Im Pankreas wurde eine positive Korrelation zwischen Arg-Dimethylierung und Citrullinierung gefunden.
Synthetische, mit LC-MS/MS charakterisierte Arg8-Vasopressin (V)-Peptide V-Arg, V-ADMA und V-SDMA dienten als Modell-Peptide in Untersuchungen zu biologischen Aktivitäten von Arg-dimethylierten Proteinen. V-Arg, V-ADMA und V-SDMA bestätigten die Eignung der GC-MS-Methode zur Quantifizierung der Arg-Dimethylierung. V-ADMA und V-SDMA induzierten die Plättchenaggregation mit unterschiedlichem Wirkprofil im Vergleich zu V- Arg. Die asymmetrische und symmetrische Arg-Dimethylierung von endogenen Peptiden und Proteinen kann ihre physiologischen Eigenschaften verändern.
II
MS-basierte Proteomics-Studien zeigten die Anwesenheit von zahlreichen Arg- dimethylierten Proteinen in lysierten humanen Erythrozyten. Das Strukturprotein Spektrin- α war eines der abundantesten asymmetrisch Arg-dimethylierten Proteine. Diese Ergebnisse wurden mittels GC-MS nach SDS-PAGE-Auftrennung, HCl-Verdau und Derivatisierung quantitativ bestätigt.
Für die Bestimmung der Ganzkörper-Dimethylierung von Arg-Resten in Proteinen wurde das PADiMeX-Konzept (Protein-Arginine-DiMethylation-IndeX) entwickelt. Es beruht auf der quantitativen Bestimmung von ADMA, DMA und SDMA, der End-Metabolite der Arg- Dimethylierung, im Urin. Zu diesem Zwecke wurde eine neuartige Derivatisierung von SDMA für die GC-MS-Analyse entwickelt und die Methode im Humanurin validiert. Das PADiMeX-Konzept wurde in einer Human-Studie validiert und in Human-Studien erfolgreich eingesetzt. Voraussetzung für die Anwendung dieses Konzeptes ist eine Fisch- freie Ernährung aufgrund ihres beträchtlichen Gehalts an DMA.
Fettreiche-Protein-Diät bewirkte bei gesunden übergewichtigen Männern keine Änderungen von PADiMeX und wies auf die Unabhängigkeit der Arg-Dimethylierung von fett-reicher Proteinnahrung hin.
Bei einer bi-ethnischen Population aus Südafrika wurden in zwei Studien keine Unterschiede in der Ganzkörper-Arg-Dimethylierung zwischen weißen und schwarzen Jungs (n = 80) sowie zwischen weißen und schwarzen Männern (n = 573) festgestellt. Die Ganzkörper-Arg- Dimethylierung nimmt mit dem Alter ab, sie ist jedoch unabhängig von der Ethnie.
Unterschiede im Wachstumshormonhaushalt und den Inflammationsparametern in den Ethnien können mögliche Ursachen für die Unterschiede in der Ganzkörper-Arg- Dimethylierung sein. Das Verhältnis von asymmetrischer zu symmetrischer Ganzkörper- Arg-Dimethylierung ist unabhängig vom Lebensalter und der Ethnie.
Die Untersuchungen an Nieren-Empfängern (n = 685) zeigten, dass die Niere ein wesent- liches Organ für die Regulation der Ganzkörper-Arg-Dimethylierung von Proteinen ist. Die Niere spielt eine wichtige Rolle für die Biosynthese, den Metabolismus und die Elimination von ADMA und DMA sowie für die Elimination von SDMA.
III Alexander Bollenbach
Mass spectrometry-based in vitro and in vivo studies towards posttranslational modifications of arginine and whole-body arginine dimethylation in humans
GC-MS methods were developed and validated for the quantification of dimethylation and citrullination of Arg-residues in proteins in biological samples. They were and applied in experimental, animal and clinical studies. These methods rely on the HCl-catalyzed release of asymmetric dimethylarginine (ADMA) and citrulline (Cit) from proteins and on their quantification by GC-MS. Cit was measured as the sum of Cit and ornithine (Cit+Orn).
The serum concentration of free ADMA did not differ between elderly healthy subjects with Helicobacter pylori (Hp) infection from those subjects of a control group without Hp-infection.
In the seronegative subjects there was an inverse correlation between Arg-dimethylation and Arg-citrullination
GC-MS investigations on a rat model of human T1DM revealed that not the pancreas but the kidney and the spleen play a major role in this model. In the pancreas, Arg-dimethylation und Arg-citrullination were positively correlated.
Synthetic Arg8-vasopressin (V) peptides V-Arg, V-ADMA and V-SDMA were characterized by LC-MS/MS and used as model-peptides in investigations on the biological activity of Arg- dimethylated proteins. V-Arg, V-ADMA und V-SDMA confirmed the utility of the GC-MS method for the quantification of Arg-dimethylation. V-ADMA and V-SDMA induced platelet aggregation yet with a different profile compared to V-Arg. These results indicate that asymmetric and symmetric Arg-dimethylation of endogenous peptides can change their physiological properties.
MS-based proteomic studies showed the presence of many Arg-dimethylated proteins in lyzed human erythrocytes. The structure protein spectrin-α was one of the most abundant asymmetrically Arg-dimethylated proteins. These results were confirmed by GC-MS analyses of SDS-PAGE separated and HCl-hydrolyzed proteins.
IV
For the quantification of the whole-body dimethylation of Arg-residues in proteins the PADiMeX concept (Protein-Arginine-DiMethylation-IndeX) was developed. It is based on the quantification of the end-metabolites of Arg-dimethylation ADMA, DMA and SDMA in urine. For this purpose, a new derivatization method for the derivatization of SDMA and its analysis by GC-MS was developed and validated in human urine. The PADiMeX concept was validated in a human study and successfully used in human studies. A requirement for the application of the PADiMeX concept is a fish-free diet because of its high DMA content.
High-fat protein meals taken by healthy overweight men had no impact on PADiMeX. Arg- dimethylation is independent of high-fat proteins.
In a bi-ethnic population from South-Africa no differences were found for the whole-body dimethylation of Arg-residues in proteins between white and black boys (n = 80) and neither between white and black men (n = 573). The whole-body Arg-dimethylation decreases with aging, but is ethnicity-independent. Differences in the hormonal status and in inflammation parameters between ethnics might be the reasons for some of the observed differences. The ratio of asymmetric to symmetric whole-body arginine demethylation is independent of age and ethnicity.
The investigations on renal transplant recipients (n = 685) proofed the kidney to be the main organ in regulation of whole-body dimethylation of proteins. The kidney plays a central role for the biosynthesis, metabolism and elimination of ADMA and DMA, as well as for the elimination of SDMA.
V
2D-DIGE two-dimensional difference gel electrophoresis Ac-ADMA Asymmetrisches Nα-Acetyl-Dimethylarginin Ac-SDMA Symmetrisches Nα-Acetyl-Dimethylarginin
ADMA Asymmetrisches Dimethylarginin (NG,NG-Dimethylarginin) AGXT2 Alanin-Glyoxylat Aminotransferase 2
Arg L-Arginin
ASOS Arterial Stiffnes in Offspring Study
ATP Adenosintriphosphat
BMI body-mass-index
CAD coronary artery disease
CAT cationic amino acid transporter
CI chemical ionization
Cit L-Citrullin
CKD chronical kidney disease
COMT Catechol-O-Methyltransferase CVD cardiovascular disease
Da Dalton
DC Dünnschichtchromatographie
DDAH NG,NG-Dimethylarginin Dimethylaminohydrolase
DMA Dimethylamin
DMGV α-Keto-δ-(NG,NG-Dimethylguanidino)-Valeriansäure DM´GV α-Keto-δ-(NG,N´G-Dimethylguanidino)-Valeriansäure DNA Desoxyribonukleinsäure
DNMT DNA-Methyltransferasen
DOT1 disruptor of telomeric silencing 1
EI Elektronen-Ionisation
ELISA enzyme-linked immunosorbent assay ERα estrogen receptor-α
ERK extracellular signal-regulated kinase
VI ESI electrospray ionization FAD Flavin-Adenin-Dinukleotid FOXO1 forkhead box protein O1
GAA Guanidinoacetat
GABR global arginine bioavailability ratio GAMT Guanidinoacetat-N-Methyltransferase GAR glycine- and arginine-rich
GC-MS Gaschromatographie-Massenspektrometrie GFR glomerular filtration rate
eGFR estimated glomerular filtration rate
hArg Homoarginin
Hcy Homocystein
HDL high-density-lipoprotein
Hp Helicobacter pylori
HPLC high-performance liquid chromatography IGF-1 insulin-like growth factor-1
IGF-1R insulin-like growth factor-1 receptor IGFBP-3 insulin-like growth factor binding protein-3
IL Interleukin
IDDM LEW.1AR1-iddm
JmjC Jumonji C
JMJD6 jumonji domain-containing-6
Ki Inhibitionskonstante
KM Michaelis-Menten Konstante
LC liquid chromatography
LOD limit of detection
MALDI matrix-assisted laser desorption/ionization MBP Myelin-basisches-Protein
MEP50/WDR77 methylosome protein 50/WD repeat domain 77 MMA NG-Monomethyl-Arginin
mRNA messenger Ribonukleinsäure
VII
NO Stickstoffmonoxid
NOHA NG-Hydroxy-L-Arginin NOS Stickstoffmonoxid-Synthase
eNOS endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase iNOS induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase nNOS neuronale Stickstoffmonoxid-Synthase
Orn L-Ornithin
PAD Protein-Arginin-Deiminase
PADiMeX Protein Arginine DiMethylation indeX
aPADiMeX asymmetric Protein Arginine DiMethylation indeX
a/sPADiMeX asymmetric/symmetric Protein Arginine DiMethylation indeX sPADiMeX symmetric protein Protein Arginine DiMethylation indeX toPADiMeX total protein Protein Arginine DiMethylation indeX PCI positive chemical ionization
PDX1 pancreatic and duodenal homeobox 1 PFBCl Pentafluorobenzoylchlorid
PFP Pentafluoropropionyl
PFPA Pentafluoropropionsäureanhydrid
PREDICT Prospective study on the Early Detection and Identification of Cardiovascular Disease and Hypertension
PRMT Protein Arginin Methyltransferase PTM Posttranslationale Modifikation
Q Quadrupol
RA Rheumatische Arthritis
RMT1 Protein-Arginin N-Methyltransferase 1 ROS reactive oxygen species
RSD relative standard deviation
RT Raumtemperatur
RT-PCR reverse-transcriptase polymerase chain reaction
VIII RTR renal transplant recipient
SAH S-Adenosylhomocystein
SAM S-Adenosylmethionin
SDMA Symmetrisches Dimethylarginin (NG,N´G-Dimethylarginin) SET su(var)3-9, Enhancer-of-zeste and Trithorax
SIM selected ion monitoring T1D type 1 diabetes
acT1D acute type 1 diabetes chT1D chronic type 1 diabetes cuT1D cured type 1 diabetes
ngT1D normoglycaemic type 1 diabetes T1DM Typ 1 Diabetes mellitus TGF-β transforming growth factor-β TLR toll-like-receptor
TNF-α Tumornekrosefaktor-α TOF time-of-flight
UPLC ultrahigh-performance liquid chromatography
UV Ultraviolett
V Vasopressin
V-ADMA Vasopressin-asymmetrisches Dimethylarginin V-Arg Vasopressin-Arginin
V-SDMA Vasopressin-symmetrisches Dimethylarginin
1
1 Einleitung
1.1 Posttranslationale Modifikationen
Es wird geschätzt, dass das humane Genom, auf einen haploiden Chromosomensatz bezogen, 3,1 Milliarden Basenpaare umfasst [1], welche bis zu 19000 Protein-kodierende Gene enthalten [2]. Die Verwendung von alternativen Promotoren und das alternative Spleißen von messenger Ribonukleinsäuren (mRNA) erhöhen bereits die daraus resultierende theoretische Anzahl an möglichen Proteinen um ein Vielfaches [3, 4]. Zusätzliche Diversität wird über posttranslationale Modifikationen (PTM) gewonnen, so dass das humane Proteom schätzungsweise aus über einer Million verschiedener Proteinspezies besteht [5].
PTM sind chemische Modifikationen, die die Aktivität, Lokalisation und Interaktion von Proteinen mit anderen biologischen Molekülen wie Proteinen, Nukleinsäuren, Fettsäuren und Kofaktoren beeinflussen und damit eine Schlüsselposition in der dynamischen Regulation der zellulären Aktivität einnehmen [6]. In den meisten Fällen erfolgen die PTM der Proteine an spezifischen Aminosäureresten durch enzymatische Katalyse. Es wird angenommen, dass bis zu 5 % des gesamten Proteoms aus Enzymen bestehen, die spezielle Zielsequenzen erkennen und für die ca. 200 verschiedenen PTM verantwortlich sind [7].
Doch nicht jedes Protein ist ausschließlich auf ein externes Enzym angewiesen, um posttranslational modifiziert zu werden. Eine Vielzahl an Proteinen enthalten in ihrer Proteinstruktur autokatalytische Domänen, die es ihnen ermöglichen, sich autark zu modifizieren und damit direkten Einfluss auf die Proteineigenschaften zu nehmen [8].
Des Weiteren lassen sich PTM in irreversible und reversible Reaktionen einteilen. Zu den irreversiblen Reaktionen gehört die proteolytische Spaltung von Peptidbindungen durch Proteasen, wodurch inaktive Proteinvorstufen wie beispielsweise das Prä-Pro-Insulin sukzessive in das aktive Insulin umgewandelt wird [9]. Bei den reversiblen Reaktionen werden chemische Gruppen durch die Knüpfung von kovalenten Bindungen auf Aminosäurereste enzymatisch übertragen und durch den entsprechenden enzymatischen Gegenspieler wieder entfernt. Mit zu den häufigsten reversiblen auf experimentellen Untersuchungen basierenden PTM gehören unter anderem die Phosphorylierung,
Einleitung 1
2
Acetylierung, N- und O-Glykosylierung, Amidierung, Hydroxylierung, Methylierung, Ubiquitinierung und die Citrullinierung, wobei die Phosphorylierung die mit Abstand am besten untersuchte PTM ist (Abbildung 1) [10].
PTM können in jedem Abschnitt eines Lebenszyklus eines Proteins erfolgen. So stehen beispielsweise N- und O-Glykosylierungen mit am Anfang des Lebenszyklus von Proteinen.
Phosphorylierungen, Acetylierungen und Methylierungen, die nach erfolgreicher Faltung und Lokalisation der Proteine stattfinden, beeinflussen deren biologische Aktivität;
Ubiquitinierungen leiten in der Regel das „Ende“ eines Proteins über den proteasomalen Abbau ein [11-15].
Abbildung 1: Darstellung ausgewählter posttranslationaler Modifikationen (PTM) sortiert nach der relativen Häufigkeit im Menschen basierend auf experimentellen Beobachtungen aus der Swiss-Prot- Datenbank. In rot ist neben der im Zentrum des Interesses der vorliegenden Arbeit stehenden PTM die Methylierung, auch deren Gegenspieler, die Citrullinierung dargestellt. Die logarithmische Skala auf der y-Achse sollte beachtet werden. Adaptiert von Ref. [10].
Durch das breite Wirkungsspektrum, das die PTM in der Lage zu entfalten sind, haben sie entscheidenden Einfluss auf die beiden Zustände des menschlichen Organismus: Gesundheit und Krankheit [12, 14]. „Fehlerhafte“ PTM führen damit zwangsläufig zur Dysregulation des empfindlichen Gleichgewichts im Organismus des Menschen und münden daher mitunter
3
in Erkrankungen des kardiovaskulären Systems, in Nierenerkrankungen, neurodegene- rativen Erkrankungen, Autoimmun-Erkrankungen sowie auch häufig in einer malignen Entartung der Zellen [16, 17]. Die Erforschung von posttranslational modifizierten Proteinen, die u.a. deren Aufreinigung, Detektion und die Identifikation der spezifischen PTM umfasst und einen wesentlichen Teil der Proteomics darstellt, ist technisch-analytisch höchst anspruchsvoll und mit der Entwicklung von ausgeklügelten massenspektro-metrischen Methoden und speziellen Computerprogrammen verbunden. Proteomics ist ein unverzichtbares wissenschaftliches Instrument, das es ermöglicht, die maßgeblichen Ursachen für die diversen Erkrankungen auf molekularbiologischer Ebene verstehen zu können [18].
Im Folgenden wird näher auf die Methylierung im Allgemeinen und speziell im Hinblick auf die Methylierung von Arginin-Resten in Proteinen als PTM eingegangen, da diese im Zentrum des Interesses der vorliegenden Arbeit steht.
1.2 Methylierung
Die Methylierung beschreibt formell die Übertragung einer CH3 (Methyl)-Gruppe auf ein Schwefel-, Kohlenstoff-, Sauerstoff- oder Stickstoffatom eines Moleküls.
S-Adenosylmethionin (SAM) fungiert dabei als universeller Methylgruppen-Donor im menschlichen Körper. SAM selbst wird in zwei enzymatischen Schritten generiert: Zunächst wird Methionin aus Homocystein (Hcy) durch die Methionin-Synthase (EC 2.1.1.13), welche Methylcobalamin (Vitamin B12)-abhängig eine Methylgruppe auf das Schwefelatom der SH-Gruppe von Homocystein überträgt, gebildet; anschließend wird Methionin mit Hilfe der Methionin-Adenosyltransferase (EC 2.5.1.6) und Adenosintriphosphat (ATP) in SAM umgewandelt [19, 20]. Das gebildete SAM kann nun von sämtlichen Methyltransferasen verwendet werden, um Methylgruppen auf niedermolekulare Substanzen wie Neurotransmitter oder Energiestoffwechsel-Metaboliten und auf hochmolekulare Substanzen wie die Desoxyribonukleinsäure (DNA) und Proteine zu übertragen.
Einleitung 1
4
Beispiele für Methylierungs-Reaktionen sind bei den Neurotransmittern, zu denen die Catecholamine gehören, die Mono-N-Methylierung von Noradrenalin zu Adrenalin, die durch die Noradrenalin N-Methyltransferase (EC 2.1.1.28) katalysiert wird. Adrenalin und Noradrenalin werden durch die Catechol-O-Methyltransferase (COMT, EC 2.1.1.6) katalysierte Mono-O-Methylierung dem weiteren metabolischen Abbau und der Elimination zugeführt [21-23]. Kreatin spielt eine wichtige Rolle im Energiestoffwechsel des Menschen.
Kreatin wird u.a. in der Niere und der Leber aus Guanidinoacetat (GAA) durch die Guanidinoacetat-N-Methyltransferase (GAMT, EC 2.1.1.2) katalysierte Mono-N- Methylierung von GAA gebildet [24, 25].
Eine wichtige Funktion nimmt die Methylierung im Zusammenhang mit der Regulation der menschlichen DNA ein. DNA-Methyltransferasen (DNMT) erkennen die Basenfolge CpG als Signalsequenz und übertragen in Folge dessen unter Verbrauch von SAM eine Methylgruppe auf das C5-Atom von Cytosin, wodurch das 5-Methylcytosin gebildet wird.
DNA-Regionen mit einem besonders hohen Anteil an CpG-Basenfolgen werden CpG-Inseln genannt. Diese liegen häufig hypomethyliert in Promotorbereichen von Genen vor und haben substanziellen Einfluss auf die Repression und Expression von bestimmten Genen.
Der Gesamteinfluss von Cytosin-Methylierungen und Histon-Modifikationen auf die Aktivität von Genen wird auch unter dem Oberbegriff der Epigenetik zusammengefasst.
Epigenetische Defekte, die sich als genomische Hypo- oder auch Hypermethylierung im Bereich von CpG-Inseln darstellen, sind häufig mit der malignen Entartung von Zellen und somit mit Krebs assoziiert [26]. Neuere Erkenntnisse über N-Methylierungen am N6-Atom von Adenin in Mäusen deuten ebenfalls auf eine mögliche N-Methylierung von Adenin im Menschen und damit verknüpft auf eine mögliche Bedeutung in der humanen DNA hin [27].
Die Methylierung der basischen Aminosäuren L-Lysin und L-Arginin ist im Zusammenhang mit der epigenetischen Regulation der Histone eine gut untersuchte PTM. Prinzipiell beeinflussen Methylierung und Demethylierung der Histone, in Abhängigkeit von dem entsprechenden Lysin oder Arginin, die Zugänglichkeit der DNA für die Transkriptionsmaschinerie der Zelle. Katalysiert werden diese beiden Reaktionen durch Histon-Methyltransferasen und -Demethylasen [28]. Im Allgemeinen erhöht die Übertragung einer Methylgruppe auf die terminale Aminogruppe von Lysin- oder auf die
5
Guanidinogruppe von Arginin-Resten in Proteinen die Hydrophobizität sowie die sterische Ausdehnung dieser Aminosäuren in Abhängigkeit vom Methylierungsgrad; sie beeinflusst jedoch nicht deren positive Ladung [29].
Für das Lysin wurden bisher zwei Enzymfamilien identifiziert, die das Lysin in Histonen und nicht-Histon-Proteinen an der ε-Aminogruppe einfach, zweifach oder dreifach methylieren können. Dazu gehören die Su(var)3-9, Enhancer-of-zeste and Trithorax (SET)- Domänen beinhaltenden Proteine [30] und Disruptor of telomeric silencing 1 (DOT1)-ähnliche Proteine [31]. Als Gegenspieler zur Lysin-Methylierung wurden die Flavin-Adenin- Dinukleotid (FAD)-abhängigen Aminoxidasen [32, 33] und die Jumonji C (JmjC)-Domänen beinhaltenden, Eisen- und 2-Oxoglutarat-abhängigen Dioxygenasen [34-36] als Enzym- familien klassifiziert.
Für das Arginin wurde im Gegensatz zum Lysin bisher nur die Familie der Protein-Arginin N-Methyltransferasen (PRMT) als methylierende Enzyme nachgewiesen. PRMT können Arginin-Reste in Proteinen entweder einfach zu NG-Monomethyl-Arginin-Resten oder zweifach zu NG,NG-Dimethyl-Arginin-Resten und zu NG,N‘G-Dimethyl-Arginin-Resten methylieren. Es wird daher zwischen asymmetrischer und symmetrischer NG-Dimethylierung unterschieden [37]. Bei den Enzymen, die NG-Methylarginin-Reste demethylieren, besteht noch kein abschließender Konsens über deren Identität und Funktion. In Anlehnung an die Lysin-demethylierende Familie der Dioxygenasen, wurde für das Arginin das Jumonji domain-containing-6 (JMJD6) Protein als eine Eisen-, 2-Oxoglutarat- und Ascorbinsäure-abhängige Dioxygenase entdeckt. Diese soll Mono- und sowohl symmetrische als auch asymmetrische Dimethylierungen an den Histonen H3 und H4 unter Abspaltung von Formaldehyd demethylieren [38]. Neuere massenspektrometrische Daten weisen dagegen auf eine Rolle von JMJD6 als Lysylhydroxylase im alternativen Spleißen hin [39, 40]. Darüber hinaus wurde die Familie der Protein-Arginin-Deiminasen (PAD, EC 3.5.3.15), speziell der PAD Subtyp 4, als Arginin demethylierendes Enzym für humane Histone postuliert [41]. Chemisch betrachtet, können die PAD jedoch nicht als Demethylasen bezeichnet werden, da sie eine Deiminierung von Arginin-Resten in Proteinen katalysieren und die demethylierenden Eigenschaften zudem in der Fachliteratur umstritten sind [42, 43].
Einleitung 1
6
Die Methylierung von weiteren Aminosäuren in Proteinen ist im Menschen nicht auszuschließen, wie die erst kürzliche Entdeckung von methylierten Histidin-Resten im β-Aktin von humanen Zellen durch zwei voneinander unabhängigen wissenschaftlichen Gruppen gezeigt hat [44, 45].
Der Hauptfokus im Bereich der Methylierung von Biomolekülen der letzten 50 Jahre lag eindeutig auf der DNA, wie Abbildung 2 eindrucksvoll zeigt. Die Methylierung von Lysin- und Arginin-Resten in Proteinen, in beiden Fällen hauptsächlich in Histonen, wurde deutlich weniger Aufmerksamkeit in der Forschung geschenkt (Abbildung 2). Diese Abbildung macht jedoch auch deutlich, dass das wissenschaftliche Interesse an Methylierungen von Arginin- und Lysin-Resten in Proteinen in den letzten Jahren unverhältnismäßig stärker als an der DNA-Methylierung angestiegen ist.
1971 1975
1979 1983
1987 1991
1995 1999
2003 2007
2011 2015
2019
Abbildung 2: Anzahl der Fachpublikationen in der PubMed-Datenbank in den Jahren 1971-2019 zur humanen DNA-, Lysin- und Arginin-Methylierung. Es wurden die Suchbegriffe „human DNA methylation“, „human lysine methylation“ und „human arginine methylation“ verwendet. Die logarithmische Skala auf der y-Achse sollte beachtet werden. Zugriff: 05.06.2019
7
Im nächsten Abschnitt wird vertiefend auf die Enzymfamilie der Protein-Arginin N- Methyltransferasen (PRMT) und auf deren Hauptprodukte, das asymmetrische Dimethyl- Arginin (ADMA) und das symmetrische Dimethyl-Arginin (SDMA) eingegangen.
1.3 Protein-Arginin N -Methyltransferase
Bei der Familie der PRMT handelt es sich um Enzyme, welche mit Hilfe von SAM als Kofaktor Arginin-Reste in Proteinen methylieren können. Das erste Mitglied der PRMT- Familie wurde bereits 1967 aus Kälberthymus isoliert und auf enzymatische Aktivität hin untersucht und klassifiziert [46]. Erst knapp 30 Jahre später verhalfen die Gensequenz des Protein-Arginin N-Methyltransferase 1 (RMT1) Gens aus Saccharomyces cerevisiae sowie die Isolation des murinen PRMT1-Proteins aus der Ratten-Fibroblasten Zelllinie RAT1 zur Identifizierung des humanen PRMT1 Gen Homologs [47-49] In den darauffolgenden Jahren wurden weitere Mitglieder der humanen PRMT-Familie identifiziert, welche fortführend durchnummeriert wurden. Mittlerweile sind im Menschen die PRMT1 bis 9 bekannt, die in Abhängigkeit von deren katalysierten Reaktionen in 3 Typen eingeteilt werden [37]. Die humanen PRMT1-4, 6 und 8 werden dem Typ I (EC 2.1.1.319) zugeordnet, welcher die Enzyme umfasst, die die Bildung von NG-Monomethyl-Arginin (MMA) und asymmetrischem NG,NG-Dimethyl-Arginin (ADMA) in Proteinen katalysieren. Die PRMT1 ist dabei die dominante Form. Dem Typ II (EC 2.1.1.320) gehören die PRMT5 und 9 an, welche die Bildung von MMA und symmetrischem NG,N´G-Dimethyl-Arginin (SDMA) in Proteinen katalysieren, wobei hierbei die PRMT5 das dominierende Enzym ist. Letztlich gibt es noch den Typ III (EC 2.1.1.321), dessen Vertreter die PRMT7 ist, und welcher nur die Mono-N- Methylierung von Arginin-Resten in Proteinen zu MMA katalysiert [50-52]. In Abbildung 3 sind die genannten Reaktionen schematisch für die 3 verschiedenen PRMT-Typen dargestellt.
Einleitung 1
8
O N R H R
HN NH H2N
O N R H R
HN NH HN
SAM SAH
PRMT Typ I, II, III
O N R H R
HN NH N
O N R H R
HN N HN
CH3
SAM
SAH PRMT Typ II
SAM
SAH PRMT Typ I
CH3 CH3
H3C
Arginin MMA
ADMA
SDMA
CH3
Abbildung 3: Schematische Darstellung der Arginin-Methylierung in Proteinen durch die PRMT Typen I, II und III. Arginin-Reste in Proteinen können im ersten Schritt durch die Protein Arginin N- Methyltransferase (PRMT) Typen I, II und III unter Verbrauch von S-Adenosylmethionin (SAM) und unter der Bildung von S-Adenosylhomocystein (SAH) jeweils zu Monomethyl-Arginin (MMA) methyliert werden. In einem zweiten Schritt kann MMA entweder durch den PRMT Typ I in asymmetrisches Dimethylarginin (ADMA) oder durch den Typ II in symmetrisches Dimethylarginin (SDMA) umgewandelt werden. Der Einfachheit halber wurde auf die Darstellung von Ladungen verzichtet.
Der Annahme folgend, dass grob geschätzt 70 % der Mono-Methylierungen und 85 % der asymmetrischen Dimethylierungen von Arginin-Resten in Proteinen in Saccharomyces cerevisiae auf die Aktivität der PRMT1 zurückzuführen sind und sich diese zentrale Rolle der PRMT1 in der Methylierung von Arginin-Resten ebenfalls in Proteinen von Säugetieren gezeigt hat, ist konsequenterweise auch von einer hohen Bedeutung der PRMT1 auf die
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Methylierung von Arginin-Resten in Proteinen im Menschen auszugehen [47, 53]. Nach der erfolgreichen Identifikation des humanen PRMT1 Gens, wurde innerhalb kurzer Zeit die Expression von 3 Spleiß-Varianten (Isoformen) des PRMT1 Gens mittels Reverse- Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (reverse-transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR) in verschiedenen Organen des menschlichen Körpers nachgewiesen. Darunter befanden sich unter anderem die Niere, die Lunge, die Milz, das Herz, das Gehirn und der Pankreas [54]. In weiterführenden Arbeiten wurde die Anzahl der humanen PRMT1 Isoformen auf 7 [55] und zuletzt auf bis zu 34 erweitert, wobei die Isoform 1 die dominante Form ist [56]. Die verschiedenen Isoformen katalysieren allesamt die Bildung von ADMA in Proteinen über das MMA als Vorstufe, unterscheiden sich jedoch hinsichtlich ihrer Verteilung in den jeweiligen Geweben des menschlichen Organismus, in der subzellulären Lokalisation (Zellkern oder Zytoplasma) sowie in der jeweiligen enzymatischen Affinität (KM) und Substratspezifität [55]. Die Expression der PRMT1 scheint vor allem im frühen Stadium des Lebens eine entscheidende Rolle zu spielen. Die Generierung von PRMT1 Doppel-knockout Mäusen führte bereits im Embryonenstadium zum Tod der Tiere. Das Fehlen des Proteins hatte in vitro aber keinen nennenswerten Einfluss auf die Zellviabilität von murinen embryonalen Stammzellen [57].
Kristallographische Daten des PRMT3-Proteins deuten darauf hin, dass die Dimerisierung der Enzyme ein konserviertes Element innerhalb der PRMT-Familie ist [58]. Bei der PRMT1 scheint die Dimerisierung eine notwendige Voraussetzung zu sein, um in eine katalytisch aktive Form überzugehen. Vermutlich ermöglicht erst die Dimerisierung der PRMT1 die Bindung des Kofaktors SAM an das Enzym [59]. Eine weitere Funktion, die die Dimerisierung erklären würde, ist die prozessive Natur des Enzyms. Die Isolation von in vivo methylierten Substraten wies fast immer eine vollständige Dimethylierung der Arginin- Reste in den Proteinen auf [60]. Für die PRMT6 konnte in vitro der hypothetische prozessive Mechanismus bestätigt werden [61].
Die PRMT1 erkennt unter anderem Arginine in Glycin-Arginin reichen (glycine- and arginine- rich, GAR) Regionen als Methylierungsmotiv, welches in mehreren RNA- und DNA- bindenden Proteinen vorkommt [62]. Die Signalsequenzen, die die PRMT1 erkennt, wurden durch massenspektrometrische Daten erweitert. Es konnte gezeigt werden, dass die negativ
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geladenen Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure in der -2 und -1 Region ungünstig für die Methylierung von Arginin-Resten in Proteinen oder Peptiden sind, während besonders ein Glycin oder Asparagin in der +1 Region und entweder ein weiteres Glycin, Arginin oder Alanin in der +2 Region für die Arginin-Methylierung erforderlich sind [63]. Basierend auf theoretischen Berechnungen erfolgt der zweite Methylierungsschritt von Arginin-Resten in Proteinen durch die PRMT1 schneller und ist zudem energetisch weniger aufwendig als der erste [64]. Außerdem zeigt die PRMT1 in einem breiten pH-Bereich von 6.0 bis 9.25 biologische Aktivität [65].
Durch die Dimethylierung von Arginin-Resten in Proteinen ergeben sich vielzählige Wechselwirkungen über die Tudor-Domäne mit anderen Proteinen. Die Tudor-Domäne wurde 1997 simultan von zwei Gruppen in Drosophila melanogaster beschrieben [66, 67]. Sie umfasst etwa 54 Aminosäuren und weist eine charakteristische Struktur aus 4 antiparallelen β-Faltblättern auf, welche die Ausbildung eines aromatischen Käfigs erlauben, die eine spezifische π-π-Wechselwirkung mit asymmetrisch oder symmetrisch dimethylierten Argininen ermöglicht. Im Menschen konnte sowohl eine Vielzahl an Tudor-Domänen beinhaltenden Proteinen als auch eine Vielzahl an mit Tudor-Domänen verwandten Domänen identifiziert werden, die sich in ihrer Spezifität zu asymmetrisch und symmetrisch dimethylierten Argininen in Proteinen und in deren Bindungsstärke unterscheiden [68-71].
Die Familie der PAD umfasst 5 Mitglieder, durchnummeriert von PAD1-4 und 6 und wird als direkter Konkurrent zur Familie der PRMT angesehen. Beide Familien konkurrieren um das gleiche Substrat: Arginin-Reste in Proteinen. Die 5 verschiedenen Isoformen der PAD werden unterschiedlich stark in verschiedenen Geweben exprimiert [72]. Sie katalysieren alle die Kalzium-abhängige Deiminierung von Arginin-Resten in Proteinen oder Peptiden zur nicht proteinogenen Aminosäure Citrullin. Diese Reaktion wird Citrullinierung genannt und stellt eine weitere PTM im menschlichen Organismus dar [73]. Bis heute konnte noch kein Enzym identifiziert werden, welches die Citrullinierung wieder rückgängig machen kann.
Daher ist die Frage danach, ob die Citrullinierung reversibel ist, vermutlich vorerst mit einem Nein zu beantworten. Ergebnisse aus in vitro Experimenten, in denen die Citrullinierung von Histonen durch die Gabe von Östrogen zunächst induziert wurde, zeigen, dass 10 min nach Beendigung des Versuchs, das Ausmaß der Histon-Citrullinierung
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wieder auf den Zustand vor Östrogen-Stimulation gesunken ist. Dies könnte auf das Vorhandensein einer „Decitrullinase“ hinweisen [41]. Eine in vitro Studie konnte zeigen, dass die PAD4 in der Lage ist, Monomethyl-Arginine in Citrullin-Peptide umzuwandeln. Das würde auf demethyliminierende Eigenschaften der PAD4 hindeuten [74]. Wahrscheinlicher ist jedoch, dass sowohl die Mono- als auch die Dimethylierung von Arginin-Resten in Proteinen oder Peptiden die Citrullinierung verhindern und inhibieren. In zusätzlichen in vitro Versuchen, in denen synthetische mono- und dimethylierte Peptide mit humanen und murinen PADs inkubiert wurden, konnten entgegen vorheriger Ergebnisse keine Citrullinierung der methylierten Peptide nachgewiesen werden [43, 75].
Die Citrullinierung wird darüber hinaus mit der Entstehung von Krebs [76] und mit der Entstehung von Autoimmunerkrankungen wie dem Typ 1 Diabetes mellitus (T1DM) oder der rheumatischen Arthritis (RA) in Verbindung gebracht [77, 78].
1.4 Asymmetrisches Dimethyl-Arginin
Proteine, die an ihren Arginin-Resten asymmetrisch dimethyliert vorliegen und durch proteolytische Spaltung im Proteasom abgebaut werden, setzen ADMA als freie Säure in das Zytoplasma der Zelle frei. Das intrazelluläre ADMA wird ebenfalls wie Arginin über die kationischen-Aminosäure-Transporter (cationic amino acid transporter, CAT) in den Blutkreislauf abgegeben und steht zumindest mit der erythrozytären ADMA-Konzentration im Gleichgewicht [79, 80]. Die Isoformen CAT-1 und CAT-2 gelten als die beiden relevantesten ADMA-Transporteure [81]. Als Referenzbereich für ADMA-Konzentrationen im Plasma von gesunden Menschen werden 0.40-0.60 µM angegeben [82]. Zudem zeigen Plasma-ADMA-Konzentrationen eine geschlechtsunabhängige positive Korrelation mit fortschreitendem Alter [83]. ADMA gilt als kardiovaskulärer und renaler Risikofaktor und erhöhte ADMA-Konzentrationen im Blutkreislauf sind mit erhöhter Morbidität und Mortalität assoziiert [84, 85]. Die negativen Effekte, die ADMA auf den menschlichen Organismus entfaltet, werden in der Fachliteratur mit der inhibitorischen Wirkung von ADMA auf die Stickstoffmonoxid (NO)-Synthase (NOS, EC 1.14.13.39) in Verbindung gebracht [86]. Von der NOS gibt es im Menschen 3 Isoformen, welche die Bildung von NO
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aus Arginin über das NG-Hydroxy-L-Arginin (NOHA) als Intermediat katalysieren: Die neuronale NOS (nNOS), die endotheliale NOS (eNOS) und die induzierbare NOS (iNOS).
Die 3 NOS Formen unterscheiden sich hinsichtlich ihrer zellulären Expression, der Affinität zum Substrat Arginin (KM) und auch hinsichtlich der Art und Weise wie sie durch ADMA sowie auch in welchem Ausmaß (Ki) sie durch ADMA gehemmt werden [87, 88]. Das ADMA wird zu etwa 15 bis 20 % unverändert über die Niere in den Urin ausgeschieden [89, 90].
1970 wurden ADMA und SDMA das erste Mal aus humanem Urin isoliert [91]. Beide werden auch als urämische Toxine bezeichnet [92]. Über 80 % des ADMA werden zum Großteil mit Hilfe der zytoplasmatischen NG,NG-Dimethylarginin-Dimethylaminohydrolase (DDAH, EC 3.5.3.18) zu Dimethylamin (DMA) und L-Citrullin hydrolysiert und anschließend über die Niere in den Urin ausgeschieden. Von der DDAH sind zwei Isoformen bekannt: Die DDAH-1, welche hauptsächlich im proximalen Tubulus der Niere, dem Gehirn, der Leber und im Pankreas exprimiert wird, und die DDAH-2, welche vorwiegend in den vaskulären Endothelzellen, dem Herzen und der Niere exprimiert wird [93, 94].
Weitere, bei weitem weniger abundante, Metabolisierungswege für ADMA stellen der enzymatische Abbau über die Alanin-Glyoxylat Aminotransferase 2 (AGXT2, EC 2.6.1.44) und über die Nα-Acetylierung von ADMA dar. Die AGXT2 wird hauptsächlich in der Niere exprimiert und ist ein mitochondriales Enzym, welches ADMA zur α-Keto-δ-(NG,NG- Dimethylguanidino)-Valeriansäure (DMGV) Pyridoxalphosphat-abhängig transaminiert [95-97]. Die Nα-Acetylierung von ADMA zu asymmetrischem Nα-Acetyl-Dimethylarginin (Ac-ADMA) ist eine Phase II-Reaktion, wodurch dessen Hydrophile erhöht wird. Diese beiden Wege der Eliminierung von ADMA spielen aber vermutlich nur eine untergeordnete Rolle, da im humanen Plasma und Urin nur nM-Konzentrationen von DMGV und Ac- ADMA vorkommen [98, 99]. In Abbildung 4 sind die verschiedenen Metabolisierungswege von ADMA und SDMA schematisch dargestellt.
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O N R H R
HN NH N CH3
H3C
O N R H R
HN N HN
CH3 CH3
O H2N OH
HN NH N CH3
H3C
O H2N OH
HN N HN
CH3 CH3
AGXT2
HN H3C CH3
O H2N OH
HN NH2 O
Urin Urin
DDAH-1/2
DMGV + DM´GV
Ac-ADMA + Ac-SDMA
SDMA ADMA DMA
Proteasom
Abbildung 4: Schematische Übersicht über die verschiedenen Metabolisierungs- und Eliminierungswege von ADMA und SDMA. ADMA und SDMA werden zunächst durch proteasomale Degradation von Proteinen, die ADMA- oder SDMA-Reste tragen, als freie Säuren freigesetzt. SDMA wird zu beinahe 100 % unverändert über die Niere in den Urin ausgeschieden. Ein geringer Anteil von SDMA wird einerseits mit Hilfe der Alanin-Glyoxylat Aminotransferase 2 (AGXT2) in α-Keto-δ-(NG,N´G-Dimethylguanidino)-Valeriansäure (DM´GV) umgewandelt und andererseits zu symmetrischem Nα-Acetyl-Dimethylarginin (Ac-SDMA) acetyliert und über die Niere in den Urin ausgeschieden. Etwa 80-85 % von ADMA werden durch die NG,NG-Dimethylarginin- Dimethylaminohydrolase (DDAH)-1 oder -2 zu L-Citrullin und Dimethylamin (DMA) hydrolysiert, wobei annähernd 100 % des DMA über die Niere in den Urin ausgeschieden werden. Die restlichen 10-15 % von ADMA werden größtenteils unverändert in den Urin ausgeschieden. Jeweils zu sehr kleinen Anteilen wird ADMA über die AGXT2 in α-Keto-δ-(NG,NG-Dimethylguanidino)-Valeriansäure (DMGV) oxidiert bzw. zu asymmetrischem Nα-Acetyl-Dimethylarginin (Ac-ADMA) acetyliert, die über die Niere in den Urin ausgeschieden werden. Die Dicke der Pfeile weist auf eine nicht Maß- getreue quantitative Ausscheidung von ADMA und SDMA hin.
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1.5 Symmetrisches Dimethyl-Arginin
Analog zum ADMA wird auch SDMA als freie Säure durch die proteolytische Spaltung von Proteinen, die symmetrisch dimethylierte Arginin-Reste tragen, gebildet. Dem SDMA wurde im Vergleich zum ADMA deutlich weniger Aufmerksamkeit in der Literatur geschenkt, wie Abbildung 5 zeigt. Hauptgrund dafür könnte sein, dass für SDMA zunächst keine inhibitorische Wirkung auf die NOS gezeigt werden konnte [86]. In den weiteren Jahren wurde lediglich bei suprapharmakologischen Konzentrationen von SDMA (im mM-Bereich) ein inhibitorischer Effekt auf den Arginin-Transport durch CAT gezeigt. Es wurde angenommen, dass SDMA zur Depletion von intrazellulärem Arginin führt, wodurch letztlich die Aktivität der NOS abnimmt [100]. Ergebnisse aus in vitro Untersuchungen mit SDMA-Konzentrationen im zweistelligen µM-Bereich deuten auf eine potentielle Entkopplung der NOS durch SDMA hin, wodurch die Entstehung von reaktiven Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS) nachgewiesen werden konnte [101]. Letztlich wurde erst von der Arbeitsgruppe um Tsikas et al. eine sehr schwache inhibitorische Wirkung von SDMA (bei 1 µM) auf die Aktivität einer murinen rekombinanten nNOS gezeigt [88, 102]. Es ist fraglich, ob diese schwachen Effekte von SDMA auf den CAT und die NOS-Aktivität die Assoziation von SDMA als unabhängiger Risikofaktor für all-cause- mortality und kardiovaskuläre Erkrankungen (cardiovascular disease, CVD) erklären können [85]. Vielmehr könnten die beobachteten negativen Effekte bei erhöhten SDMA- Konzentrationen mit SDMA als ein Surrogat Marker auf inflammatorische Prozesse innerhalb des menschlichen Organismus hinweisen. So konnte gezeigt werden, dass die PRMT5-Aktivität mit der Bildung von pro-inflammatorischen Zytokinen wie dem Interleukin (IL)-2 und IL-6 in vitro und im Menschen positiv assoziiert ist [101, 103]. Darüber hinaus konnte in einer ex vivo Studie gezeigt werden, dass die Bindung von 0.5 µM SDMA an 1 g high-density-lipoprotein (HDL) die HDL-Moleküle in eine veränderte biologische Form überführt, wodurch diese an toll-like-receptor (TLR)-2 Moleküle auf Endothelzellen binden und dadurch die Synthese von ROS und Entzündungsmediatoren induzieren können [104].
Für das freie SDMA finden sich ungefähr äquimolare Konzentrationen zu ADMA im Plasma (ca. 0.5 µM) und Urin (ca. 3 µM/mM Kreatinin) von gesunden Menschen [105]. Die Oxidation von SDMA erfolgt, ähnlich wie bei ADMA, über die mitochondriale AGXT2. Bei
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diesem enzymatischen Prozess wird SDMA unter Verwendung von Pyridoxalphosphat als Kofaktor zu α-Keto-δ-(NG,N´G-Dimethylguanidino)-Valeriansäure (DM´GV) transaminiert [95]. Des Weiteren kann SDMA zu symmetrischem Nα-Acetyl-Dimethylarginin (Ac-SDMA) acetyliert werden, welches über die Niere in den Urin ausgeschieden wird [99]. Diese beiden Metabolisierungswege von SDMA spielen jedoch nur eine untergeordnete Rolle in der Elimination von SDMA, da fast 100 % des SDMA in seiner unveränderten Form über die Niere in den Urin ausgeschieden werden (Abbildung 4) [91]. Aufgrund der starken Abhängigkeit der Elimination von SDMA von der Nierenfunktion wird SDMA als ein früher Indikator für eine veränderte glomeruläre Filtrationsrate (GFR) und als ein Marker für chronische Nierenerkrankungen (chronic kidney disease, CKD) verwendet [105-107].
1991
1995
1999
2003
2007
2011
2015
2019
Abbildung 5: Anzahl der Fachpublikationen in der PubMed-Datenbank in den Jahren 1991-2019 zu ADMA und SDMA im Menschen. Es wurden die Suchbegriffe „human ADMA“ und „human SDMA“
verwendet. Zugriff: 25.06.2019
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1.6 Massenspektrometrie in Kopplung mit der Gaschromatographie oder Flüssigchromatographie
Der Bereich, in denen die Konzentrationen von ADMA und SDMA im Blut (Plasma, Serum) als physiologisch angesehen werden, ist relativ schmal. Folglich ist die Verwendung von analytischen Methoden mit einer sehr hohen analytischen Sensitivität und Präzision für die verlässliche Bestimmung von relativ kleinen Veränderungen in den ADMA- und SDMA- Konzentrationen unabdingbar [108].
Gegenwärtig werden für die Quantifizierung von ADMA und SDMA die high-performance liquid chromatography (HPLC) [109], die liquid chromatography (LC) in Kopplung mit einem Massenspektrometer (MS) (LC-MS und LC-MS/MS) [110, 111], die ultrahigh-performance liquid chromatography (UPLC)-MS/MS [112], der enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA) [113]
und die gas chromatography (GC) in Kopplung mit MS (GC-MS und GC-MS/MS) verwendet [114]. Die HPLC-basierten Methoden sind sehr zeitintensiv und erfordern die chromatographische Trennung der beiden Konstitutionsisomere ADMA und SDMA, damit diese mittels Ultraviolett (UV)- oder Fluoreszenz-Detektor detektiert werden können. ELISA- Methoden dagegen neigen häufig dazu, die Konzentrationen von ADMA und SDMA zu überschätzen und zeigen nur eine moderate Korrelation mit den mit Hilfe der UPLC-MS/MS ermittelten ADMA- und SDMA-Konzentrationen [112, 115]. Im Vergleich dazu, erweist sich die GC-MS als eine vielseitige und zuverlässige Technik [116-119]. Hinsichtlich der chromatographischen Auftrennung ist die GC der LC bei weitem überlegen [120]. Ein der GC-MS innewohnender Nachteil ist jedoch, dass nur volatile Verbindungen analysiert werden können. Für die Analyse von thermolabilen, polaren und nicht-volatilen Substanzen wie z.B. der Aminosäuren, müssen diese vor der Analyse zunächst chemisch derivatisiert werden. Die Derivatisierung mit geeigneten Reagenzien verleiht ihnen Volatilität und Thermostabilität und bei geeigneter Wahl des Derivatisierungsmittels auch höhere analytische Sensitivität [121]. Für die Ionisation von Analyten werden bei der GC-MS hauptsächlich die klassische Elektronen-Ionisation (EI) und die neuere chemische Ionisation (CI) verwendet. Bei der EI-Methode werden die sich in der Gasphase der Ionenquelle befindenden Analytmoleküle direkt mit Elektronen, die standardmäßig eine kinetische Energie von 70 eV aufweisen, beschossen und in Kationen umgewandelt. Die Ionisation
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mittels EI ist eine „harte“ Ionisations-Methode und führt in der Regel zur Bildung zahlreicher Massenfragmente [122]. Die Summe der dabei entstehenden Fragmente ergibt ein Massenspektrum, welches wie ein individueller Fingerabdruck für jeden Analyten fungiert.
Der EI gegenüber steht die CI als „weiche“ Ionisations-Methode, bei der sehr wenige Massenfragmente entstehen. Bei der CI erfolgt die Ionisation des Analyten indirekt, indem die energetischen Elektronen in einem ersten Schritt ein Reaktandgas (auch Puffergas genannt) ionisieren. Meistens werden Methan und andere Alkane als Reaktandgase verwendet, bei weitem seltener Ammoniak und Wasser. Ionisiertes Reaktandgas bzw.
Sekundär-Elektronen ionisieren die gasförmigen elektrisch ungeladenen Analytmoleküle.
Dabei können positiv (positive CI, PCI) oder negativ (negative CI, NCI) geladene Analyt-Ionen entstehen. Sowohl bei der EI als auch bei der CI entstehen einfach geladene Ionen [123, 124].
Mit Hilfe eines Massenanalysators werden die ionisierten Analyten anhand ihres Masse- Ladungs-Verhältnisses (mass-to-charge ratio, m/z) aufgetrennt und zum Detektor hin durchgelassen. In der GC-MS werden hauptsächlich mit Quadrupolen (Q) oder in einem Flugrohr (time-of-flight, TOF) erzeugte elektrische Felder als Massenanalysatoren verwendet.
Die Quantifizierung erfolgt meist im selected-ion-monitoring (SIM)-Modus. Dabei werden meist zwei elektrische Felder alternierend erzeugt, so dass ausgesuchte Ionen des Analyten und des internen Standards (meist der Analyt selbst, markiert mit stabilen Isotopen) sich mit ihren spezifischen m/z-Verhältnissen auf stabilen Bahnen in Richtung Detektor bewegen [125].
Der Detektor ist in der Regel ein Elektronen- oder Photonen-Vervielfacher. Dazu werden die Ionen an der Konversionsdynode in Elektronen bzw. Photonen umgewandelt. Abhängig vom Gerätetyp kann ein Ion um einen Faktor von etwa einer Million „vervielfacht“ werden [125]. Durch das Hintereinanderschalten von meist zwei Massenanalysatoren und einer dazwischen liegenden Kollisionskammer (Tandem-Massenspektrometrie) kann die Spezifität enorm gesteigert werden [126]. In der Kollisionskammer (z.B. Q2) werden die am ersten Massenanalysator (z.B. Q1) selektierten Ionen (precursors) mit einem Kollisionsgas (meist Argon) zu den Produkt-Ionen fragmentiert (product ions). Mit dem zweiten Massenanalysator (z.B. Q3) werden bestimmte Produkt-Ionen selektiert und zum Detektor hin beschleunigt.
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Mittels computergestützter Fouriertransformation kann abschließend über das elektrische Signal auf das m/z-Verhältnis der Analyt-Ionen zurückgeschlossen werden [125].
In der vorliegenden Arbeit werden freies ADMA, freie Aminosäuren sowie aus Proteinen durch HCl-katalysierte freigesetzte Aminosäuren – letztere werden hier als proteinische Aminosäuren bezeichnet – in einem ersten Schritt mit Hilfe von methanolischer Salzsäure an der Carboxylgruppe zu ihren Methylestern (Me) verestert. In einem zweiten Schritt werden die Aminogruppen der Aminosäure-Methylester mit Hilfe von Pentafluoropropionsäure- anhydrid (PFPA) zu ihren Pentafluoropropionyl (PFP)-Derivaten amidiert (N-acyliert). Die verschiedenen Me-PFP-Derivate der Aminosäuren werden anschließend mit entsprechenden in situ generierten deuterierten Me-Analoga der Derivate als interner Standard versetzt und dann mittels NCI am GC-MS quantifiziert [127]. Aufgrund der Besonderheit von SDMA wurde dafür eine neue Methode entwickelt. Für die Quantifizierung von SDMA wird dieses mit einem käuflich erworbenen NG,N´G-di-[2H3]Methyl-L-Arginin (d6-SDMA) als interner Standard versetzt und mit PFPA derivatisiert. Dabei wird die Carboxylgruppe zu einem gemischten Anhydrid umgesetzt, während gleichzeitig die Aminogruppen amidiert werden.
Anschließend erfolgt die Quantifizierung von SDMA mittels GC-MS im NCI-Modus [128].
Das Dimethylamin (DMA) ist eine starke Base und bei Raumtemperatur (RT) ein Gas (Kochpunkt, 7 bis 9 °C). An sich ist DMA einer direkten GC-Analyse zugänglich. Für die quantitative Bestimmung von DMA im Urin wurde eine bestehende GC-MS-Methode adaptiert [140]. Urinproben werden mit einem kommerziell erhältlichem d6-DMA als interner Standard versetzt und endogenes DMA (d0-DMA) sowie d6-DMA werden mit Pentafluorobenzoylchlorid (PFBCl) zum Pentafluorobenzamid derivatisiert und gleichzeitig mit Toluol extrahiert (extraktive Amidierung). Die Quantifizierung von DMA aus Urinproben erfolgt mittels GC-MS nach PCI im SIM-Modus [129].
Die Kopplung der Flüssigchromatographie mit der Massenspektrometrie wurde wesentlich später als die Kopplung der Gaschromatographie mit der Massenspektrometrie entwickelt.
Naturgemäß ist die LC-MS-basierte Methodologie für die Analyse von theoretisch aller Klassen von nieder- und hochmolekularen Molekülen meist ohne besondere Probenvorbereitung sehr gut geeignet. LC-MS-basierte Methodologien sind heute unabdingbar in der Entschlüsselung des Proteoms und werden weiter unten etwas
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ausführlicher beschrieben. Die Bestimmung des humanen Proteoms kann mit verschiedenen biochemischen Methoden erfolgen. Neben auf Antikörpern basierenden Assays wie dem ELISA oder dem pull-down-Assay, bieten sich auch gelelektrophoretische Trennverfahren wie die SDS-PAGE gekoppelt mit einem Western Blot oder die zweidimensionale Differenz- Gelelektrophorese (two-dimensional difference gel electrophoresis, 2D-DIGE) an. Bei diesen genannten Methoden können jedoch nur jeweils einzelne Proteine oder nur ein kleiner Teil des Proteoms qualitativ und quantitativ bestimmt werden [130].
LC-MS-basierte Techniken zur Bestimmung des Proteoms, generell Proteomics genannt, sind state of the art [131]. Sie haben einen sehr hohen Durchsatz und erlauben schnelle, sensitive und umfangreiche Analysen des Proteoms. Die Massenspektrometrie im Bereich der Proteomics lässt sich ebenfalls wie bei der GC-MS grob in folgende Komponenten einteilen:
Chromatographie, Ionisierung, Separation am Massenanalysator, Detektion und Datenverarbeitung. Im Bereich der Proteomics finden die matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) und die electrospray ionization (ESI) aufgrund ihrer schonenden Art der Ionisierung von Peptiden und Proteinen Anwendung [132, 133]. Als Massenanalysatoren kommen bei den Proteomics neben dem TOF oder Q-Ionenfallen auch Orbitrap-Analysatoren zum Einsatz. Analog der GC-MS kann auch bei der LC-MS durch das Hintereinanderschalten von mehreren Massenanalysatoren und in der Regel dazwischen liegender Kollisionskammer die Spezifität erheblich gesteigert werden. Als Detektoren eignen sich ebenfalls Elektronen- oder Photonen-Vervielfacher, mit deren Hilfe letztlich das m/z-Verhältnis der jeweiligen Peptide gewonnen werden kann. Die anschließende Identifikation und relative Quantifizierung der Proteine erfolgt mittels eines Datenbank- abhängigen Algorithmus und spezieller Software wie z.B. MaxQuant [134]. Hinsichtlich MS- basierter Proteomics und Besonderheiten auf diesem Gebiet wird auf Übersichtsartikel verwiesen [135-139].
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1.7 Zielsetzung
Proteine, die posttranslational von den verschiedenen PRMT-Isoformen an der Guanidino- Gruppe (NG) von Arginin-Resten methyliert werden, setzen durch reguläre Proteolyse die nicht-proteinogenen Aminosäuren MMA, ADMA und SDMA frei. Diese methylierten Arginin-Derivate sind Inhibitoren aller bekannten NOS-Isoformen. Basierend auf dieser Eigenschaft wird generell angenommen, dass erhöhte Konzentrationen der freien Säuren im humanen Blut mit einer Inhibition der NO-Produktion in bestimmten Zellen assoziiert und folglich die Ursache diverser Erkrankungen insbesondere im kardiovaskulären System sind.
Die Identität, das Ausmaß und die biologische Bedeutung von NG-methylierten Proteinen sind dagegen wenig untersucht und unzureichend verstanden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, dazu einen Beitrag zu leisten.
Für die Realisierung der Ziele der vorliegenden Arbeit war es notwendig, zuverlässige GC- MS-Methoden zur Quantifizierung von SDMA und ADMA in biologischen Proben (Plasma, Serum, Urin, Gewebe) zu entwickeln und zu validieren. Aufgrund der aus analytischer Sicht sehr problematischen GC-MS-Messung von SDMA wurde eine neuartige Derivatisierung erstmalig entwickelt und erfolgreich eingesetzt. Für die GC-MS-Messung von ADMA, DMA und Aminosäuren wurden vorhandene Methoden adaptiert. Neu-entwickelte und adaptierte Methoden für freie Aminosäuren und für Aminosäuren in HCl-Proteolysaten wurden in vitro, in tierexperimentellen und in klinischen sowie klinisch-pharmakologischen Studien eingesetzt. Ziele dieser Studien war es, Effekte von Nahrung (fettreiche Proteine), Alter (Kinder, Erwachsene), Ethnie (Schwarz und Weiß) und Krankheit (chronische Nierenerkrankung, Nierentransplantation, Diabetes mellitus, Helicobacter pylori) auf die Arginin-Dimethylierung zu untersuchen. Dafür sollte ein neuartiges Konzept zur Ganzkörper-Arginin-Dimethylierung entwickelt werden.
Frühere Untersuchungen wiesen auf das Vorhandensein von Arginin-dimethylierten Proteinen in humanen Erythrozyten hin. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Identität dieser Proteine mittels Massenspektrometrie-basierter proteomischer Methoden nachzuweisen.
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Endogene Proteine und Peptide wie das Arginin-Vasopressin (antidiuretisches Hormon) und Angiotensin-I/II haben vielfältige physiologische Funktionen. Arginin-Vasopressin, mit einer einzigen Arginin-Gruppe, bietet sich als Modell-Peptid zur Untersuchung möglicher Effekte der Arginin-Dimethylierung auf physiologische Funktionen an. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten synthetische am Arginin-Rest asymmetrisch und symmetrisch dimethylierte Vasopressine auf die Plättchenaggregation ex vivo untersucht werden. Solche gut charakterisierten Modell-Peptide sind auch dafür geeignet, die GC-MS-Methoden zur Messung von ADMA und SDMA in Peptiden und Proteinen zu überprüfen.
Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, die prinzipielle Methylierung von nativem Arginin- Vasopressin und weiterer Peptide mittels kommerziell erhältlicher humaner rekombinanter PRMT-1 zu untersuchen.
Veröffentlichungen 2
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2 Veröffentlichungen
Publikation Nr. 1
Bollenbach A, Hanff E, Beckmann B, Kruger R, Tsikas D, GC-MS quantification of urinary symmetric dimethylarginine (SDMA), a whole-body symmetric L-arginine methylation index. Analytical biochemistry, 2018;556:40-44.
Beitrag des Autors: Eigenständige Entwicklung und Validierung der GC-MS Methode;
Aufarbeitung, Derivatisierung und Analyse der Proben mittels GC-MS; statistische Auswertung und graphische Darstellung der gesamtem Daten; Erstellung und Revision des Manuskripts
Publikation Nr. 2
Bollenbach A, Hanff E, Tsikas D, Utility of homoarginine in the GC-MS quantification of asymmetric dimethylarginine (ADMA) in human serum proteins. Analytical biochemistry, 2018;563:67-70.
Beitrag des Autors: Eigenständige Entwicklung und Validierung der GC-MS Methode;
Aufarbeitung, Derivatisierung und Analyse der Proben mittels GC-MS; statistische Auswertung und graphische Darstellung der gesamten Daten; Erstellung und Revision des Manuskripts
23 Publikation Nr. 3
Bollenbach A, Huneau J F, Mariotti F, Tsikas D, Asymmetric and Symmetric Protein Arginine Dimethylation: Concept and Postprandial Effects of High-Fat Protein Meals in Healthy Overweight Men. Nutrients, 2019;11(7):1463.
Beitrag des Autors: Statistische Auswertung sowie tabellarische und graphische Darstellung der gesamten Daten; Erstellung und Revision des Manuskripts
Publikation Nr. 4
Bollenbach A, Hanff E, Brunner G, Tsikas D, Asymmetric dimethylation and citrullination of proteinic arginine and homoarginine synthesis in human Helicobacter pylori infection. Amino acids, 2019;51(6):961-971.
Beitrag des Autors: Aufarbeitung, Derivatisierung und Analyse der Proben mittels GC-MS;
statistische Auswertung sowie tabellarische und graphische Darstellung der gesamten Daten; Erstellung und Revision des Manuskripts
Manuskript Nr. 5
Bollenbach A, Jörns A, Lenzen S, Tsikas D, Tissue amino acid profiling in the LEW.1AR1- iddm rat, an animal model of human T1DM: Effects of diabetes and anti-diabetic therapy on asymmetric dimethylation and citrullination of L-arginine in tissue proteins. Amino acids, 2019;submitted:AMAC-D-19-00180R1.
Beitrag des Autors: Aufarbeitung, Derivatisierung und Analyse der Proben mittels GC-MS;
statistische Auswertung sowie tabellarische und graphische Darstellung der gesamten Daten; Erstellung und Revision des Manuskripts
Veröffentlichungen 2
24 Publikation Nr. 6
Said MY*, Bollenbach A*, Minović, van Londen M, Frenay AR, et al., Plasma ADMA, urinary ADMA excretion, and late mortality in renal transplant recipients. Amino acids, 2018;51(6):913-927.
*Geteilte Erstautorenschaft
Beitrag des Autors: Aufarbeitung, Derivatisierung und Analyse des gesamten SDMA Datensatzes mittels GC-MS; statistische Auswertung und tabellarische Darstellung des SDMA Datensatzes; Revision des Manuskripts
Manuskript Nr. 7
Bollenbach A, Schutte A E, Kruger R, Tsikas D, Whole-body asymmetric and symmetric dimethylation of L-arginine residues in proteins in healthy black and white boys and young men form South Africa: Results of the bi-ethnic ASOS and African-PREDICT studies.
Beitrag des Autors: Aufarbeitung, Derivatisierung und Analyse der Proben mittels GC-MS;
statistische Auswertung und tabellarische Darstellung der gesamten Daten; Erstellung des Manuskripts
Manuskript Nr. 8
Bollenbach A, Gambaryan S, Mindukshev I, Gravemann U, Pich A, Tsikas D, GC-MS and LC-MS/MS studies on the dimethylation of guanidine (NG) groups of L-arginine in peptides and proteins: Identification of NG-dimethylated proteins in human red blood cells and effects of asymmetrically and symmetrically NG-dimethylated vasopressin on platelet function Beitrag des Autors: Aufarbeitung, Derivatisierung und Analyse der Proben mittels GC-MS;
Durchführung und Auswertung der ex vivo Experimente, statistische Auswertung sowie tabellarische und graphische Darstellung der gesamten Daten; Erstellung des Manuskripts
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2.1 Publikation Nr. 1
Veröffentlichungen 2
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