Der Bereich, in denen die Konzentrationen von ADMA und SDMA im Blut (Plasma, Serum) als physiologisch angesehen werden, ist relativ schmal. Folglich ist die Verwendung von analytischen Methoden mit einer sehr hohen analytischen Sensitivität und Präzision für die verlässliche Bestimmung von relativ kleinen Veränderungen in den ADMA- und SDMA-Konzentrationen unabdingbar [108].
Gegenwärtig werden für die Quantifizierung von ADMA und SDMA die high-performance liquid chromatography (HPLC) [109], die liquid chromatography (LC) in Kopplung mit einem Massenspektrometer (MS) (LC-MS und LC-MS/MS) [110, 111], die ultrahigh-performance liquid chromatography (UPLC)-MS/MS [112], der enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA) [113]
und die gas chromatography (GC) in Kopplung mit MS (GC-MS und GC-MS/MS) verwendet [114]. Die HPLC-basierten Methoden sind sehr zeitintensiv und erfordern die chromatographische Trennung der beiden Konstitutionsisomere ADMA und SDMA, damit diese mittels Ultraviolett (UV)- oder Fluoreszenz-Detektor detektiert werden können. ELISA-Methoden dagegen neigen häufig dazu, die Konzentrationen von ADMA und SDMA zu überschätzen und zeigen nur eine moderate Korrelation mit den mit Hilfe der UPLC-MS/MS ermittelten ADMA- und SDMA-Konzentrationen [112, 115]. Im Vergleich dazu, erweist sich die GC-MS als eine vielseitige und zuverlässige Technik [116-119]. Hinsichtlich der chromatographischen Auftrennung ist die GC der LC bei weitem überlegen [120]. Ein der GC-MS innewohnender Nachteil ist jedoch, dass nur volatile Verbindungen analysiert werden können. Für die Analyse von thermolabilen, polaren und nicht-volatilen Substanzen wie z.B. der Aminosäuren, müssen diese vor der Analyse zunächst chemisch derivatisiert werden. Die Derivatisierung mit geeigneten Reagenzien verleiht ihnen Volatilität und Thermostabilität und bei geeigneter Wahl des Derivatisierungsmittels auch höhere analytische Sensitivität [121]. Für die Ionisation von Analyten werden bei der GC-MS hauptsächlich die klassische Elektronen-Ionisation (EI) und die neuere chemische Ionisation (CI) verwendet. Bei der EI-Methode werden die sich in der Gasphase der Ionenquelle befindenden Analytmoleküle direkt mit Elektronen, die standardmäßig eine kinetische Energie von 70 eV aufweisen, beschossen und in Kationen umgewandelt. Die Ionisation
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mittels EI ist eine „harte“ Ionisations-Methode und führt in der Regel zur Bildung zahlreicher Massenfragmente [122]. Die Summe der dabei entstehenden Fragmente ergibt ein Massenspektrum, welches wie ein individueller Fingerabdruck für jeden Analyten fungiert.
Der EI gegenüber steht die CI als „weiche“ Ionisations-Methode, bei der sehr wenige Massenfragmente entstehen. Bei der CI erfolgt die Ionisation des Analyten indirekt, indem die energetischen Elektronen in einem ersten Schritt ein Reaktandgas (auch Puffergas genannt) ionisieren. Meistens werden Methan und andere Alkane als Reaktandgase verwendet, bei weitem seltener Ammoniak und Wasser. Ionisiertes Reaktandgas bzw.
Sekundär-Elektronen ionisieren die gasförmigen elektrisch ungeladenen Analytmoleküle.
Dabei können positiv (positive CI, PCI) oder negativ (negative CI, NCI) geladene Analyt-Ionen entstehen. Sowohl bei der EI als auch bei der CI entstehen einfach geladene Ionen [123, 124].
Mit Hilfe eines Massenanalysators werden die ionisierten Analyten anhand ihres Masse-Ladungs-Verhältnisses (mass-to-charge ratio, m/z) aufgetrennt und zum Detektor hin durchgelassen. In der GC-MS werden hauptsächlich mit Quadrupolen (Q) oder in einem Flugrohr (time-of-flight, TOF) erzeugte elektrische Felder als Massenanalysatoren verwendet.
Die Quantifizierung erfolgt meist im selected-ion-monitoring (SIM)-Modus. Dabei werden meist zwei elektrische Felder alternierend erzeugt, so dass ausgesuchte Ionen des Analyten und des internen Standards (meist der Analyt selbst, markiert mit stabilen Isotopen) sich mit ihren spezifischen m/z-Verhältnissen auf stabilen Bahnen in Richtung Detektor bewegen [125].
Der Detektor ist in der Regel ein Elektronen- oder Photonen-Vervielfacher. Dazu werden die Ionen an der Konversionsdynode in Elektronen bzw. Photonen umgewandelt. Abhängig vom Gerätetyp kann ein Ion um einen Faktor von etwa einer Million „vervielfacht“ werden [125]. Durch das Hintereinanderschalten von meist zwei Massenanalysatoren und einer dazwischen liegenden Kollisionskammer (Tandem-Massenspektrometrie) kann die Spezifität enorm gesteigert werden [126]. In der Kollisionskammer (z.B. Q2) werden die am ersten Massenanalysator (z.B. Q1) selektierten Ionen (precursors) mit einem Kollisionsgas (meist Argon) zu den Produkt-Ionen fragmentiert (product ions). Mit dem zweiten Massenanalysator (z.B. Q3) werden bestimmte Produkt-Ionen selektiert und zum Detektor hin beschleunigt.
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Mittels computergestützter Fouriertransformation kann abschließend über das elektrische Signal auf das m/z-Verhältnis der Analyt-Ionen zurückgeschlossen werden [125].
In der vorliegenden Arbeit werden freies ADMA, freie Aminosäuren sowie aus Proteinen durch HCl-katalysierte freigesetzte Aminosäuren – letztere werden hier als proteinische Aminosäuren bezeichnet – in einem ersten Schritt mit Hilfe von methanolischer Salzsäure an der Carboxylgruppe zu ihren Methylestern (Me) verestert. In einem zweiten Schritt werden die Aminogruppen der Aminosäure-Methylester mit Hilfe von Pentafluoropropionsäure-anhydrid (PFPA) zu ihren Pentafluoropropionyl (PFP)-Derivaten amidiert (N-acyliert). Die verschiedenen Me-PFP-Derivate der Aminosäuren werden anschließend mit entsprechenden in situ generierten deuterierten Me-Analoga der Derivate als interner Standard versetzt und dann mittels NCI am GC-MS quantifiziert [127]. Aufgrund der Besonderheit von SDMA wurde dafür eine neue Methode entwickelt. Für die Quantifizierung von SDMA wird dieses mit einem käuflich erworbenen NG,N´G-di-[2H3]Methyl-L-Arginin (d6-SDMA) als interner Standard versetzt und mit PFPA derivatisiert. Dabei wird die Carboxylgruppe zu einem gemischten Anhydrid umgesetzt, während gleichzeitig die Aminogruppen amidiert werden.
Anschließend erfolgt die Quantifizierung von SDMA mittels GC-MS im NCI-Modus [128].
Das Dimethylamin (DMA) ist eine starke Base und bei Raumtemperatur (RT) ein Gas (Kochpunkt, 7 bis 9 °C). An sich ist DMA einer direkten GC-Analyse zugänglich. Für die quantitative Bestimmung von DMA im Urin wurde eine bestehende GC-MS-Methode adaptiert [140]. Urinproben werden mit einem kommerziell erhältlichem d6-DMA als interner Standard versetzt und endogenes DMA (d0-DMA) sowie d6-DMA werden mit Pentafluorobenzoylchlorid (PFBCl) zum Pentafluorobenzamid derivatisiert und gleichzeitig mit Toluol extrahiert (extraktive Amidierung). Die Quantifizierung von DMA aus Urinproben erfolgt mittels GC-MS nach PCI im SIM-Modus [129].
Die Kopplung der Flüssigchromatographie mit der Massenspektrometrie wurde wesentlich später als die Kopplung der Gaschromatographie mit der Massenspektrometrie entwickelt.
Naturgemäß ist die LC-MS-basierte Methodologie für die Analyse von theoretisch aller Klassen von nieder- und hochmolekularen Molekülen meist ohne besondere Probenvorbereitung sehr gut geeignet. LC-MS-basierte Methodologien sind heute unabdingbar in der Entschlüsselung des Proteoms und werden weiter unten etwas
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ausführlicher beschrieben. Die Bestimmung des humanen Proteoms kann mit verschiedenen biochemischen Methoden erfolgen. Neben auf Antikörpern basierenden Assays wie dem ELISA oder dem pull-down-Assay, bieten sich auch gelelektrophoretische Trennverfahren wie die SDS-PAGE gekoppelt mit einem Western Blot oder die zweidimensionale Differenz-Gelelektrophorese (two-dimensional difference gel electrophoresis, 2D-DIGE) an. Bei diesen genannten Methoden können jedoch nur jeweils einzelne Proteine oder nur ein kleiner Teil des Proteoms qualitativ und quantitativ bestimmt werden [130].
LC-MS-basierte Techniken zur Bestimmung des Proteoms, generell Proteomics genannt, sind state of the art [131]. Sie haben einen sehr hohen Durchsatz und erlauben schnelle, sensitive und umfangreiche Analysen des Proteoms. Die Massenspektrometrie im Bereich der Proteomics lässt sich ebenfalls wie bei der GC-MS grob in folgende Komponenten einteilen:
Chromatographie, Ionisierung, Separation am Massenanalysator, Detektion und Datenverarbeitung. Im Bereich der Proteomics finden die matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) und die electrospray ionization (ESI) aufgrund ihrer schonenden Art der Ionisierung von Peptiden und Proteinen Anwendung [132, 133]. Als Massenanalysatoren kommen bei den Proteomics neben dem TOF oder Q-Ionenfallen auch Orbitrap-Analysatoren zum Einsatz. Analog der GC-MS kann auch bei der LC-MS durch das Hintereinanderschalten von mehreren Massenanalysatoren und in der Regel dazwischen liegender Kollisionskammer die Spezifität erheblich gesteigert werden. Als Detektoren eignen sich ebenfalls Elektronen- oder Photonen-Vervielfacher, mit deren Hilfe letztlich das m/z-Verhältnis der jeweiligen Peptide gewonnen werden kann. Die anschließende Identifikation und relative Quantifizierung der Proteine erfolgt mittels eines Datenbank-abhängigen Algorithmus und spezieller Software wie z.B. MaxQuant [134]. Hinsichtlich MS-basierter Proteomics und Besonderheiten auf diesem Gebiet wird auf Übersichtsartikel verwiesen [135-139].
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