Zielsetzung - Massenspektrometrie-basierte in vitro und in vivo Studien zu posttranslationalen

Proteine, die posttranslational von den verschiedenen PRMT-Isoformen an der Guanidino-Gruppe (N^G) von Arginin-Resten methyliert werden, setzen durch reguläre Proteolyse die nicht-proteinogenen Aminosäuren MMA, ADMA und SDMA frei. Diese methylierten Arginin-Derivate sind Inhibitoren aller bekannten NOS-Isoformen. Basierend auf dieser Eigenschaft wird generell angenommen, dass erhöhte Konzentrationen der freien Säuren im humanen Blut mit einer Inhibition der NO-Produktion in bestimmten Zellen assoziiert und folglich die Ursache diverser Erkrankungen insbesondere im kardiovaskulären System sind.

Die Identität, das Ausmaß und die biologische Bedeutung von N^G-methylierten Proteinen sind dagegen wenig untersucht und unzureichend verstanden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, dazu einen Beitrag zu leisten.

Für die Realisierung der Ziele der vorliegenden Arbeit war es notwendig, zuverlässige GC-MS-Methoden zur Quantifizierung von SDMA und ADMA in biologischen Proben (Plasma, Serum, Urin, Gewebe) zu entwickeln und zu validieren. Aufgrund der aus analytischer Sicht sehr problematischen GC-MS-Messung von SDMA wurde eine neuartige Derivatisierung erstmalig entwickelt und erfolgreich eingesetzt. Für die GC-MS-Messung von ADMA, DMA und Aminosäuren wurden vorhandene Methoden adaptiert. Neu-entwickelte und adaptierte Methoden für freie Aminosäuren und für Aminosäuren in HCl-Proteolysaten wurden in vitro, in tierexperimentellen und in klinischen sowie klinisch-pharmakologischen Studien eingesetzt. Ziele dieser Studien war es, Effekte von Nahrung (fettreiche Proteine), Alter (Kinder, Erwachsene), Ethnie (Schwarz und Weiß) und Krankheit (chronische Nierenerkrankung, Nierentransplantation, Diabetes mellitus, Helicobacter pylori) auf die Arginin-Dimethylierung zu untersuchen. Dafür sollte ein neuartiges Konzept zur Ganzkörper-Arginin-Dimethylierung entwickelt werden.

Frühere Untersuchungen wiesen auf das Vorhandensein von Arginin-dimethylierten Proteinen in humanen Erythrozyten hin. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Identität dieser Proteine mittels Massenspektrometrie-basierter proteomischer Methoden nachzuweisen.

Endogene Proteine und Peptide wie das Arginin-Vasopressin (antidiuretisches Hormon) und Angiotensin-I/II haben vielfältige physiologische Funktionen. Arginin-Vasopressin, mit einer einzigen Arginin-Gruppe, bietet sich als Modell-Peptid zur Untersuchung möglicher Effekte der Arginin-Dimethylierung auf physiologische Funktionen an. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten synthetische am Arginin-Rest asymmetrisch und symmetrisch dimethylierte Vasopressine auf die Plättchenaggregation ex vivo untersucht werden. Solche gut charakterisierten Modell-Peptide sind auch dafür geeignet, die GC-MS-Methoden zur Messung von ADMA und SDMA in Peptiden und Proteinen zu überprüfen.

Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, die prinzipielle Methylierung von nativem Arginin-Vasopressin und weiterer Peptide mittels kommerziell erhältlicher humaner rekombinanter PRMT-1 zu untersuchen.

Veröffentlichungen 2

2 Veröffentlichungen

Publikation Nr. 1

Bollenbach A, Hanff E, Beckmann B, Kruger R, Tsikas D, GC-MS quantification of urinary symmetric dimethylarginine (SDMA), a whole-body symmetric L-arginine methylation index. Analytical biochemistry, 2018;556:40-44.

Beitrag des Autors: Eigenständige Entwicklung und Validierung der GC-MS Methode;

Aufarbeitung, Derivatisierung und Analyse der Proben mittels GC-MS; statistische Auswertung und graphische Darstellung der gesamtem Daten; Erstellung und Revision des Manuskripts

Publikation Nr. 2

Bollenbach A, Hanff E, Tsikas D, Utility of homoarginine in the GC-MS quantification of asymmetric dimethylarginine (ADMA) in human serum proteins. Analytical biochemistry, 2018;563:67-70.

Beitrag des Autors: Eigenständige Entwicklung und Validierung der GC-MS Methode;

Aufarbeitung, Derivatisierung und Analyse der Proben mittels GC-MS; statistische Auswertung und graphische Darstellung der gesamten Daten; Erstellung und Revision des Manuskripts

23 Publikation Nr. 3

Bollenbach A, Huneau J F, Mariotti F, Tsikas D, Asymmetric and Symmetric Protein Arginine Dimethylation: Concept and Postprandial Effects of High-Fat Protein Meals in Healthy Overweight Men. Nutrients, 2019;11(7):1463.

Beitrag des Autors: Statistische Auswertung sowie tabellarische und graphische Darstellung der gesamten Daten; Erstellung und Revision des Manuskripts

Publikation Nr. 4

Bollenbach A, Hanff E, Brunner G, Tsikas D, Asymmetric dimethylation and citrullination of proteinic arginine and homoarginine synthesis in human Helicobacter pylori infection. Amino acids, 2019;51(6):961-971.

Beitrag des Autors: Aufarbeitung, Derivatisierung und Analyse der Proben mittels GC-MS;

statistische Auswertung sowie tabellarische und graphische Darstellung der gesamten Daten; Erstellung und Revision des Manuskripts

Manuskript Nr. 5

Bollenbach A, Jörns A, Lenzen S, Tsikas D, Tissue amino acid profiling in the LEW.1AR1-iddm rat, an animal model of human T1DM: Effects of diabetes and anti-diabetic therapy on asymmetric dimethylation and citrullination of L-arginine in tissue proteins. Amino acids, 2019;submitted:AMAC-D-19-00180R1.

Beitrag des Autors: Aufarbeitung, Derivatisierung und Analyse der Proben mittels GC-MS;

statistische Auswertung sowie tabellarische und graphische Darstellung der gesamten Daten; Erstellung und Revision des Manuskripts

Veröffentlichungen 2

24 Publikation Nr. 6

Said MY*, Bollenbach A*, Minović, van Londen M, Frenay AR, et al., Plasma ADMA, urinary ADMA excretion, and late mortality in renal transplant recipients. Amino acids, 2018;51(6):913-927.

*Geteilte Erstautorenschaft

Beitrag des Autors: Aufarbeitung, Derivatisierung und Analyse des gesamten SDMA Datensatzes mittels GC-MS; statistische Auswertung und tabellarische Darstellung des SDMA Datensatzes; Revision des Manuskripts

Manuskript Nr. 7

Bollenbach A, Schutte A E, Kruger R, Tsikas D, Whole-body asymmetric and symmetric dimethylation of L-arginine residues in proteins in healthy black and white boys and young men form South Africa: Results of the bi-ethnic ASOS and African-PREDICT studies.

Beitrag des Autors: Aufarbeitung, Derivatisierung und Analyse der Proben mittels GC-MS;

statistische Auswertung und tabellarische Darstellung der gesamten Daten; Erstellung des Manuskripts

Manuskript Nr. 8

Bollenbach A, Gambaryan S, Mindukshev I, Gravemann U, Pich A, Tsikas D, GC-MS and LC-MS/MS studies on the dimethylation of guanidine (N^G) groups of L-arginine in peptides and proteins: Identification of N^G-dimethylated proteins in human red blood cells and effects of asymmetrically and symmetrically N^G-dimethylated vasopressin on platelet function Beitrag des Autors: Aufarbeitung, Derivatisierung und Analyse der Proben mittels GC-MS;

Durchführung und Auswertung der ex vivo Experimente, statistische Auswertung sowie tabellarische und graphische Darstellung der gesamten Daten; Erstellung des Manuskripts

Im Dokument Massenspektrometrie-basierte in vitro und in vivo Studien zu posttranslationalen Modifikationen von Arginin und Bestimmung der Ganzkörper-Arginin-Dimethylierung am Menschen (Seite 32-37)