In diesem Abschnitt der Arbeit werden die Publikationen Nr. 1, Nr. 2 und Nr. 3 ausführlich zusammengefasst und diskutiert. Diese Publikationen beschreiben die Entwicklung, die Validierung und die Applikation von analytischen Methoden zur Quantifizierung von peptidischem, proteinischem, und niedermolekularem SDMA und ADMA in biologischen Proben. SDMA und ADMA werden aus ihren Peptiden und Proteinen mittels klassischer HCl-Hydrolyse (20 h, 110 °C) freigesetzt.
Für die Quantifizierung von SDMA, ADMA und anderen Aminosäuren mittels GC-MS, müssen diese zunächst derivatisiert werden. Hauptziel der Derivatisierung ist die Herstellung von Derivaten, deren chemischen Eigenschaften es überhaupt möglich machen, dass sie in die Gasphase gebracht werden können. Das heißt, die Derivate müssen elektrisch neutral, volatil (flüchtig) und thermisch stabil sein. Durch geeignete Wahl der Derivatisierungsmittel kann auch die Sensitivität der Methode stark erhöht werden.
Letzteres ist besonders wichtig bei endogenen Substanzen, die in sehr niedrigen Konzentrationen (pM/nM-Bereich) vorkommen. Im Falle der GC-Analysen von Aminosäuren werden Carboxyl-, Amin- und Thiol-Gruppen derivatisiert. Die Anzahl der Derivatisierungs-Reaktionen hängt an erster Stelle von den Eigenschaften (Selektivität, Spezifität) der Derivatisierungs-Reagenzien und der Stabilität der Derivate ab [127].
Carboxyl-Gruppen von Aminosäuren werden spezifisch durch die Verwendung von 2 M HCl in Methanol (1 h, 80 °C) in ihre Methylester derivatisiert. Diese sind elektrisch neutral und wesentlich volatiler und thermisch stabiler als die entsprechenden Carbonsäuren.
Aminosäuren mit Säure-labilen funktionellen Gruppen wie Asparagin, Glutamin und Citrullin werden bei dieser Derivatisierungsreaktion in die Methylester von Aspartat, Glutamat bzw. Ornithin umgewandelt. Bei der GC-MS-Analyse dieser Aminosäuren wird die Summe aus Asparagin+Asparaginsäure, Glutamin+Glutaminsäure bzw. Citrullin+
Ornithin (Cit+Orn) bestimmt [127].
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Für die GC-Analyse von Aminosäuren werden ihre Aminogruppen generell mit aktivierten Carbonsäuren acyliert. Dazu zählen Säurechloride und Säureanhydride. Für die sensitive GC-MS-Analyse von Aminosäuren werden Reagenzien wie Pentafluoropropionsäure-anhydrid (PFPA) oder HeptafluorobuttersäurePentafluoropropionsäure-anhydrid verwendet. Zuvor generierte Methylester von Aminosäuren werden mit einer Lösung von PFPA in Ethylacetat (1:4, v/v) für 30 min bei 65 °C inkubiert. Dabei entstehen N-pentafluoropropionyl (PFP) Derivate der Methylester (Abbildung 6). Dadurch werden 5 Fluor-Atome pro Aminogruppe in die Struktur des Analyten eingeführt. Fluor (F) besitzt mit einer Elektronegativität von 4.0 auf der Pauling-Skala gegenüber allen anderen chemischen Elementen das größte Potential Elektronen an sich zu ziehen. Im Falle der Verwendung der negativen chemischen Ionisierung (NCI) in der GC-MS ist die Ionisierbarkeit von F-haltigen Analyten sehr leicht und die Ionisationsausbeute sehr hoch. Daraus resultiert eine sehr hohe analytische Sensitivität und sehr niedrige meist im attomol-Bereich liegende instrumentelle Detektionsgrenzen (LOD) [127, 140].
Durch die Verwendung von tetra-deuteriertem Methanol (CD3OD) kann bei der Veresterung der Carboxylgruppe der Aminosäuren eine „schwere“ Methylgruppe in die Aminosäurestruktur eingeführt werden. Dadurch werden „schwerere“ Analoga von Aminosäuren mit einem Massenunterschied von 3 Da pro Methylgruppe hergestellt.
Trideutero-Methylester und Methylester von Aminosäuren unterscheiden sich in ihrem Molekulargewicht jedoch kaum in anderen physikochemischen Eigenschaften. Trideutero-Methylester sind daher für die Quantifizierung von endogenen Aminosäuren mittels GC-MS als interne Standards besonders gut geeignet [140].
Da PFPA nicht spezifisch für Aminogruppen ist, sondern auch mit sauren OH-Gruppen zu gemischten und sehr Hydrolyse-empfindlichen Anhydriden reagiert, muss bei der GC-MS-Analyse von Aminosäuren erst die Veresterung der Carboxylgruppe(n) und dann die N-Acylierung erfolgen. Die meisten Aminosäuren wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit als Methylester-PFP-Derivate mittels GC-MS analysiert.
Die Eigenschaft von PFPA, mit allen funktionellen Gruppen von Aminosäuren zu reagieren, wurde in der vorliegenden Arbeit ausgenutzt, um SDMA unter Verwendung von
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kommerziell erhältlichem NG,N´G-di-[2H3]Methyl-L-Arginin (d6-SDMA) als internen Standard mittels GC-MS zu quantifizieren [128]. Diese Methode wird weiter unten diskutiert.
NH
Abbildung 6: Chemische Derivatisierungsreaktionen für die GC-MS-Analyse von ADMA, SDMA und DMA. 1) ADMA wird im ersten Schritt mit Hilfe von Methanol (CH3OH) in 2 M HCl für 1 h bei 80 °C an der Carboxylgruppe verestert. In einem zweiten Schritt werden sämtliche Aminogruppen mit Hilfe von Pentafluoropropionsäureanhydrid (PFPA) für 30 min bei 65 °C N-acyliert. Die blaue-markierte Methylgruppe kann unter Verwendung von tetra-deuteriertem Methanol (CD3OD) für die in situ Herstellung des internen Standards d3-ADMA zur Quantifizierung von ADMA verwendet werden.
2) SDMA wird mit PFPA für 30 min bei 65 °C derivatisiert. Die Aminogruppen werden N-acyliert und die Carboxylgruppe wird zu einem gemischten Anhydrid mit PFPA umgesetzt. d6-SDMA dient als interner Standard. 3) DMA wird mit Pentafluorobenzoylchlorid (PFBCl) für 1 min bei Raumtemperatur (RT) extraktiv amidiert. d6-DMA wird als interner Standard verwendet.
Das NCI-Massenspektrum vom nicht markierten Methylester-PFP-Derivat von ADMA (d0Me-ADMA-PFP) (Abbildung 6, Reaktion 1)) enthält ein intensives Fragment-Ion mit dem m/z von 634. Das NCI-Massenspektrum vom Deuterium-markierten Methylester-PFP-Derivat von ADMA (d3Me-ADMA-PFP) enthält das entsprechende intensive Fragment-Ion bei m/z 637. Über das Verhältnis der Intensitäten der im SIM-Modus erhaltenen Peaks von d0Me-ADMA-PFP und d3Me-ADMA-PFP bei m/z 634 bzw. m/z 637 und der bekannten Konzentration des internen Standards d3Me-ADMA-PFP und unter Berücksichtigung von
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etwaigen Verdünnungsfaktoren, kann die ADMA-Konzentration in der biologischen Probe berechnet werden.
Diese GC-MS-Methode eignet sich für die zuverlässige Quantifizierung von freiem ADMA im humanen Plasma, Serum, Sputum, Urin sowie auch in Gewebehomogenaten humanen oder tierischen Ursprungs nach Entfernung der Proteine durch Ultrafiltration oder Fällung mit organischen Lösungsmitteln wie Methanol [141, 142]. ADMA kommt jedoch nicht nur als freie Säure vor, sondern ist auch aufgrund der durch die PRMT des Typs I katalysierten PTM von Arginin-Resten in Proteinen ein Bestandteil von diversen intakten Proteinen. Die oben erwähnte GC-MS-Methode kann auch für ADMA eingesetzt werden, das durch chemische Proteolyse (6 M HCl, 20 h, 110 °C) erhalten wird.
Die durchschnittliche Konzentration von proteinischem ADMA wurde mittels GC-MS/MS zu 107 nM im Plasma von 10 gesunden Personen bestimmt [143]. In Plasma-Proben von 134 gesunden Kaukasiern wurde mittels Kapillarelektrophorese und einer Dioden-Array-Detektion eine durchschnittliche proteinische ADMA-Konzentration von 4.11 nmol/mg Protein und eine durchschnittliche proteinische SDMA-Konzentration von 1.66 nmol/mg Protein bestimmt [144]. Wesentlich höhere proteinische ADMA-Konzentrationen in der Größenordnung von 15 µM wurden in humanen Erythrozyten mittels GC-MS/MS nach salzsaurer Hydrolyse gefolgt von einer Ultrafiltration (cut-off Wert 50 kDa) ermittelt. Sowohl humanes Serumalbumin als auch erythrozytäres humanes Hämoglobin enthalten praktisch kein ADMA in ihren Molekülen [145-147]. Welche erythrozytären Proteine ADMA als Reste tragen, ist bislang nicht gesichert bekannt. Es gibt Hinweise darauf, dass Katalase eines dieser Proteine sein könnte [148, 149].
Die HCl-katalysierte Hydrolyse von Proteinen setzt proteinogene Aminosäuren in großen Mengen frei. In Proteolysaten erreichen viele Aminosäuren wie z.B. Arginin Konzentrationen von einigen mM [150]. Solche hohen Aminosäure-Konzentrationen können analytische Schwierigkeiten für die Messung von PTM-Aminosäuren bereiten, die in weit kleineren Konzentrationen in Proteolysaten vorkommen. Große Konzentrationsunterschiede zwischen modifizierten und unmodifizierten Aminosäuren können die akkurate Quantifizierung von Aminosäuren wie ADMA erschweren und unter Verwendung der LC-MS/MS zu fehlerhaften Ergebnissen führen [151]. Die Verdünnung der Proben ist
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insbesondere in der LC-MS/MS keine sinnvolle Option. Proteine können vor der Proteolyse von biologischen Proben mittels Ultrafiltration oder Proteinfällung getrennt werden. Auch solche Prozeduren sind nicht besonders hilfreich. Sie sind darüber hinaus zeit- und kostenintensiv. Insbesondere bei umfangreichen Probensätzen können Störfaktoren sich nachteilig addieren und auswirken [152].
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde für die Bestimmung von asymmetrisch dimethylierten und citrullinierten Arginin-Molekülen proteinischen Ursprungs eine alternative GC-MS-Methode entwickelt. Sie beruht auf der Verwendung von Homoarginin (hArg). hArg ist eine nicht-proteinogene Aminosäure und kommt in relativ kleinen und konstanten Konzentrationen in biologischen Proben vor. Wir haben gezeigt, dass die hArg-Konzentration in HCl-Proteolysaten in der Tat sehr konstant ist und sich nicht von der Konzentration des freien hArg unterscheidet [153]. Da hArg mittels GC-MS sehr sensitiv und akkurat gemessen werden kann, eignet sich hArg besonders gut als ein externer Standard.
hArg steigert die Spezifität der GC-MS-Methode zur Bestimmung von PTM von Arginin in Proteinen. Es ist erwähnenswert, dass hArg ein gut etablierter Parameter für die Bestimmung von aktiven Lysin-Resten in Proteinen und somit des Proteinverdaus ist [154].
Die Konzentration von proteinischen ADMA wird durch Differenz-Bildung ermittelt. Dafür wird die ADMA-Konzentration parallel in zwei Ansätzen bestimmt, in hydrolysierten (6 M HCl, 20 h, 110 °C; Gesamt-Konzentration) und in nicht-hydrolysierten (6 M HCl, 20 h, 20 °C; Konzentration des freien ADMA) Proben.
In der vorliegenden Arbeit wurde im Serum von 27 gesunden Männern und Frauen im Alter zwischen 31 und 105 Jahren die mittlere Konzentration des proteinischen ADMA zu etwa 89 nM bestimmt. Das mittlere molare Verhältnis von freiem ADMA zu proteinischem ADMA wurde zu annähernd 6:1 bestimmt. Zwischen den ermittelten Konzentrationen für freies- und totales-hArg wurde kein signifikanter Unterschied festgestellt. Dies ist im Einklang mit der in der Literatur beschriebenen Abwesenheit von hArg in Proteinen [155]
und bestätigt die Eignung von hArg als externe Kontrolle. Die mittlere Konzentration von 89 nM für das proteinische ADMA im humanen Serum unterscheidet sich nur um 18 nM von der mittleren Konzentration von 107 nM für das proteinische ADMA im Plasma von anderen Personen [143]. Unterschiede in den untersuchten Populationen und Unterschiede in der
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Zusammensetzung von Plasma und Serum (Abwesenheit von mit der Koagulation im Zusammenhang stehenden Proteinen) könnten zu diesen eher sehr kleinen Differenzen beigetragen haben [156].
In unserer Studie wurde keine Korrelation zwischen der Konzentration des proteinischen ADMA und dem Alter der Probanden festgestellt (r = 0.282, P = 0.155, n = 27) [153]. In einer anderen Studie wurde eine schwächere jedoch statistisch signifikante positive Korrelation (r = 0.194, P = 0.025, n =134) für die Altersabhängigkeit der proteinischen ADMA-Konzentration gefunden [144]. In unserer Studie wurde die in der Literatur beschriebene positive Korrelation des fortschreitenden Alters mit der freien ADMA-Konzentration im Blut mit einem mittleren Anstieg von etwa 3 nM ADMA pro Jahr im Serum unserer Kohorte festgelegt [83]. Die fehlende statistische Signifikanz der Korrelation zwischen proteinischer ADMA-Konzentration und dem Lebensalter in unserer Studie könnte ein Hinweis darauf sein, dass die biologische Varianz der Konzentration von proteinischem ADMA größer als die von freiem ADMA sein könnte. Die in der vorliegenden Arbeit entwickelte Methode zur Bestimmung der proteinischen ADMA-Konzentration im humanen Serum erlaubt die Bestimmung der hArg- und ADMA-Konzentration mit einer vergleichbaren Präzision (RSD) von unter 10 %. Diese Methode ist geeignet für die akkurate und präzise quantitative Bestimmung von proteinischem ADMA in einem Hochdurchsatz-Modus und ist somit dafür geeignet, die Bedeutung der PTM-Dimethylierung von Arginin-Resten in großen Kohorten von gesunden und erkrankten Personen zu untersuchen [153].
Die in der Abbildung 6 unter 1) beschriebene Derivatisierung für ADMA lässt sich nur mit großen Einschränkungen auf die Quantifizierung von SDMA mittels GC-MS anwenden.
Grund hierfür ist die schwache Intensität von ~5 % des spezifischen Fragment-Ions mit einem m/z von 634 des mit Methanol und PFPA derivatisierten SDMA im NCI-Modus. Diese geringe Intensität erlaubt keine verlässliche Detektion von SDMA mittels GC-MS in pathophysiologisch relevanten Konzentrationsbereichen (oberer nM- bis unterster µM-Bereich in Plasma und Serum) [105]. Die Verwendung des deutlich intensiveren Fragment-Ions mit einem m/z von 233 bietet keine Alternative für die Quantifizierung von SDMA mittels GC-MS, da das m/z von 233 nicht spezifisch ist, sondern von vielen Aminosäuren-Derivaten gebildet wird. Daher ist die Quantifizierung von SDMA als
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Methylester-PFP-Derivat mittels GC-MS weder in Plasma oder Serum noch in humanem Urin möglich, obwohl im letzteren SDMA in wesentlich höheren Konzentrationen vorkommt (ca. 20 bis 120 µM). Lediglich mit Hilfe eines GC-MS/MS lässt sich das Sensitivitäts-Problem befriedigend lösen [114]. Ein GC-MS/MS-Gerät stand im Rahmen dieser Arbeit nicht routinemäßig zur Verfügung.
Das stark unterschiedliche Derivatisierungs- und Ionisierungsverhalten der beiden Konstitutionsisomere ADMA und SDMA ist vermutlich auf die Position der zweiten Methylgruppe innerhalb der Guanidino-Gruppe zurückzuführen. Entgegen der weitläufigen Annahme, dass die beiden Stickstoff-Atome der Guanidino-Gruppe planar und symmetrisch mit einem Winkel von 120° angeordnet sind, konnte kürzlich durch den Vergleich von 211 kristallographischen Proteinstrukturen gezeigt werden, dass die Guanidino-Gruppe aplanar angeordnet ist und sich zwischen den beiden endständigen Stickstoff-Atomen ein Winkel von ~119,4° und zwischen den endständigen Stickstoff-Atomen und dem δ-Stickstoff-Atom jeweils ein Winkel von ~121,5° und ~119,2° einstellt [157]. Folglich sind die beiden äußeren Stickstoff-Atome der Guanidino-Gruppe nicht äquivalent, und dies könnte auch bei den beiden Guanidin-Methylgruppen von ADMA und SDMA der Fall sein. Dafür sprechen theoretische Berechnungen zur Energiedifferenz der Biosynthese von ADMA und SDMA von 3.2 kcal/mol (ΔΔG‡ = 3.2 kcal/mol) [158]. Dieser energetische Mehraufwand für die Biosynthese von SDMA im Vergleich zu ADMA könnte auch ein Erklärungsansatz dafür sein, dass die humane PRMT5 (Typ II) für ihre enzymatische Aktivität die Komplexbildung mit dem methylosome protein 50 (MEP50/WD repeat domain 77, WDR77) erfordert [159-161].
Das MEP50 könnte als biologischer Katalysator für die Herabsetzung der Aktivierungs-energie für die symmetrische Dimethylierung von Arginin-Resten in Proteinen und Peptiden durch PRMT5 wirken. Ob die Unterschiede zwischen SDMA und ADMA Parallelen zu den unterschiedlichen NCI-Eigenschaften der Methylester-PFP-Derivate haben, ist zurzeit unbekannt.
Um die quantitative Bestimmung von SDMA in biologischen Proben akkurat und präzise mittels GC-MS durchzuführen zu können, musste eine neue Methode entwickelt werden.
Eine Alternative bestand darin, auf die HCl-katalysierte Veresterung von SDMA in Methanol zu verzichten und SDMA lediglich mit PFPA zu derivatisieren, unter den gleichen
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Reaktionsbedingungen wie bei dem Methylester von SDMA (30 min, 65 °C) (Abbildung 6, Reaktion 2)). Diese Alternative konnte getestet werden, da NG,N´G-di-[2H3]Methyl-L-Arginin (d6-SDMA) kommerziell erhältlich ist und als interner Standard verwendet werden konnte.
Die GC-MS-Analyse von lediglich mit PFPA derivatisierten d0-SDMA und d6-SDMA ergab NCI-Massenspektren, die zwei korrespondierende intensive Fragmente-Ionen mit m/z von 456 für d0-SDMA und m/z von 462 für d6-SDMA enthielten. Die Massenspektren sprechen für die Bildung von SDMA-Derivaten mit 4 PFP-Resten, d.h. für die N-Pentafluoro-propionylierung der primären und der sekundären Aminogruppen von SDMA und für die O-Pentafluoropropionylierung der Carboxylgruppe von SDMA. Letzteres spricht für die Bildung eines gemischten Anhydrids zwischen SDMA und PFPA. Die charakteristischen Ionen mit m/z 456 für d0-SDMA und m/z 462 für d6-SDMA wurden im SIM-Modus für die quantitative Analyse von SDMA in biologischen Proben verwendet [128].
Aufgrund der inhärenten chemischen Eigenschaften von Anhydriden war mit einer starken Hydrolyse des SDMA-PFP-Anhydrids zu rechnen. Untersuchungen zur Lagerstabilität von mit PFPA derivatisiertem d0-SDMA und d6-SDMA und im Extraktionsmittel Toluol befindlichen Derivaten ergaben eine Abnahme der Peakintensitäten von m/z 456 für d0-SDMA und m/z 462 für d6-SDMA um einen Faktor von etwa 5 nach einer Lagerung der Toluol-Proben für 8 Tage bei Raumtemperatur. Diese verhältnismäßig starke Intensitätsabnahme wurde nicht bei Methylester-PFP-Derivaten von Aminosäuren beobachtet und spricht für eine starke hygroskopische Eigenschaft des SDMA-PFP-Derivates. Um Sensitivitätsverluste durch Lagerung der derivatisierten Proben in Toluolextrakten zu minimieren, wurden die Proben unmittelbar nach ihrer Derivatisierung und Extraktion mittels GC-MS analysiert [128].
Die GC-MS-Methode für SDMA sollte hauptsächlich für die Analyse von Urin-Proben eingesetzt werden und wurde für diese Matrix einhergehend validiert. Die Präzision der Methode lag bei etwa 2,3 %, ihre Akkuratheit bei etwa 101 %. Sie ist somit für die verlässliche Quantifizierung von SDMA im Urin sehr gut geeignet. Da SDMA kaum metabolisiert und zu fast 100 % über die Niere in den Urin in unveränderter Form ausgeschieden wird, ist die neu entwickelte GC-MS-Methode für die Bestimmung der symmetrischen Ganzkörper-Methylierung von Arginin-Resten in Proteinen sehr gut geeignet
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[91]. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde diese Methode in mehreren Studien eingesetzt [128, 162-164].
ADMA wird etwa zu 80-85 % durch die DDAH katalysierte hydrolytische Spaltung zu DMA und L-Citrullin metabolisiert [93]. Die quantitative Bestimmung von ADMA und DMA im Urin erlaubt somit die asymmetrische Ganzkörper-Dimethylierung von Arginin-Resten in Proteinen zu ermitteln. Für die Quantifizierung von DMA in Urinproben aus verschiedenen Studien wurde eine bereits bestehende GC-MS-Methode adaptiert [129, 165]. In dieser Methode wird DMA mit Pentafluorobenzoylchlorid (PFBCl) für 1 min bei RT amidiert und das Pentafluorobenzamid-Derivat in Toluol extrahiert (Abbildung 6, Reaktion 3)). Als interner Standard dient (CD3)2NH (d6-DMA). Die quantitative Bestimmung erfolgt nach PCI durch SIM von m/z 240 für d0-DMA und m/z 246 für d6-DMA. Die quantitative Bestimmung von ADMA erfolgt nach NCI durch SIM von m/z 634 für d0-ADMA und m/z 637 für den internen Standard d3-ADMA.
Die GC-MS-Methoden für die Analyse von ADMA, SDMA und DMA im Urin dienten als Grundlage für die Entwicklung eines Konzeptes zur Quantifizierung der Ganzkörper-Dimethylierung von Arginin-Resten in Proteinen in vivo im Menschen und zur Bestimmung des relativen Beitrags der asymmetrischen und symmetrischen Dimethylierung. Dafür wurden folgende Begriffe eingeführt (Abbildung 7) [166]. aPADiMeX, asymmetric Protein Arginine DiMethylation indeX, beschreibt die gesamte asymmetrische Dimethylierung und wird aus der Summe der Konzentrationen von ADMA und DMA im Urin berechnet.
sPADiMeX, symmetric Protein Arginine DiMethylation indeX, beschreibt die symmetrische Dimethylierung und wird aus der Konzentration von SDMA im Urin berechnet.
toPADiMeX, total Protein Arginine DiMethylation indeX, beschreibt die gesamt Dimethylierung und wird aus der Konzentration von ADMA, DMA und SDMA im Urin berechnet. a/sPADiMeX, asymmetric/symmetric Protein Arginine DiMethylation indeX, beschreibt das Verhältnis von asymmetrischer-zu-symmetrischer Dimethylierung und wird aus dem Molarverhältnis der Summe der Konzentrationen von ADMA+DMA zur Konzentration von SDMA im Urin berechnet [166]. Im Falle von Messungen in Spontan-Urinproben werden die Konzentrationen durch die Konzentrationen von Kreatinin in den Urinproben korrigiert (dividiert). Im Falle von Messungen von in einem bestimmten
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Zeitintervall gesammelten Urinproben mit bekannten Volumen werden die ausgeschiedenen Stoffmengen von ADMA, DMA und SDMA verwendet.
Auf der Basis von in einer Studie am Menschen erzielten Ergebnissen wurde errechnet, dass ein gesunder Mensch täglich etwa 300 µmol ADMA produziert, von denen bis zu 250 µmol in DMA umgewandelt und über die Niere in den Urin ausgeschieden werden [89]. Darüber hinaus ist bekannt, dass MMA, SDMA, ADMA und insbesondere DMA Bestandteile der täglichen Nahrung sind. MMA, SDMA und ADMA wurden in Gemüse und Früchten im untersten µmol pro kg Feuchtgewicht Bereich gemessen [167]. Der Verzehr von Cholin und Lecithin war mit einem signifikanten Anstieg an DMA in Urin von Probanden verbunden [168]. Besonders stark kann sich der Verzehr von Fisch und Meeresfrüchten auf die DMA-Ausscheidung auswirken. Im Vergleich zu einer Kontrolle und in Abhängigkeit von der Art des konsumierten Fisches bzw. Meeresfrucht wurde bis zu 7 Mal mehr DMA in den Urin (BMI > 25 kg/m2) Männern, die eine fettreiche Mahlzeit (93 g Fett (70 % Energie), 45 g Zucker (15 % Energie) und 45 g Proteine (15 % Energie) zu sich genommen hatten, wurde ein akuter Anstieg der ADMA-Konzentration im Plasma innerhalb der ersten Stunde nach Einnahme der Mahlzeit gemessen [171]. Die oben genannten Beispiele zeigen auf, dass die Ernährung Einfluss auf die Konzentrationen von SDMA, ADMA und dessen Abbauprodukt DMA im Plasma und Urin des Menschen haben kann. Dadurch kann es zu falschen Ergebnissen und Fehlinterpretationen kommen.
Das Konzept der von uns eingeführten Ganzkörper-Dimethylierung von proteinischem Arginin und der mögliche Einfluss der Ernährung wurden in einer kontrollierten Ernährungsstudie untersucht. Zehn übergewichtige gesunde Männer (BMI > 25 kg/m2) erhielten drei verschiedene fettreiche Protein-Mahlzeiten [172]. Im Rahmen der vorliegenden Studie wurde untersucht, ob diese Mahlzeiten Auswirkungen auf die Ganzkörper-Arg-Dimethylierung haben [166]. Dazu wurden von jedem Probanden vor und zu verschiedenen