Erfassung des oxidativen Stresses und des L-Arginin/NO-Metabolismusweges bei Reperfusion unter Lebertransplantation am Menschen

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Direktor: Prof. Dr. med. Jürgen C. Frölich

Erfassung des oxidativen Stresses und des L-Arginin/ NO-Metabolismusweges bei Reperfusion

unter Lebertransplantation am Menschen

Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin an der Medizinischen Hochschule Hannover

Vorgelegt von Iris Mevius geb. Rode aus Löningen

Hannover 2003

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Präsident: Prof. Dr. Dieter Bitter-Suermann Betreuer: Priv.-Doz. Dr. Dimitrios Tsikas

Referent: Prof. Dr. Gorig Brunner Korreferent: Prof. Dr. Axel Haverich

Tag der mündlichen Prüfung: 11.01.2005

Promotionsausschussmitglieder:

Prof. Dr. Hans Bigalke

Priv.-Doz. Dr. Gerhard Schumann Prof. Dr. Michael Gebel

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Abkürzungsverzeichnis

1 Einleitung 1

1.1 Der L-Arginin/ Stickstoffmonoxid (NO)-Stoffwechselweg 1 1.1.1 L-Arginin als Vorstufe für die endogene NO-Synthese 1 1.1.2 Asymmetrisches Dimethylarginin (ADMA) als Inhibitor der NO-Synthase 3

1.2 Oxidativer Stress 4

1.2.1 ROS und RNS 4

1.2.2 Antioxidantien 5

1.2.3 Biomarker des oxidativen Stresses 6

1.3 Die orthotope Lebertransplantation (oLTX) 8

1.3.1 Allgemeines 8

1.3.2 Primäre Dysfunktion (PDF), Ischämie-/ Reperfusionsschaden (IRI) und

Oxidativer Stress 9

1.4 Studienziel und Zielparameter 13

2 Material und Methoden 15

2.1 Patienten 15

2.2 Studienablauf 16

2.2.1 Aufklärung und gesetzliche Regelung 16

2.2.2 Probengewinnung und -aufbewahrung 16

2.2.3 Abnahmezeitpunkte und Abnahmestellen der Blut- und Urinproben 16

2.3 Analytische Methoden 19

2.3.1 Bestimmung von 3-Nitrotyrosin als freie Aminosäure 19 2.3.2 Bestimmung von 3-Nitrotyrosin als Aminosäure in Proteinen 22 2.3.3 Messung von proteinassoziiertem 3-NT im Plasma einer gesunden

Vergleichsgruppe 23

2.3.4 Bestimmung der Tyrosin- und Phenylalanin-Konzentration und des

Tyrosin/ Phenylalanin-Verhältnisses in der Plasmaprotein-Fraktion 25

2.3.5 Bestimmung von Nitrit und Nitrat im Plasma 25

2.3.6 Bestimmung von L-Arginin und ADMA im Plasma 27

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2.3.9 Bestimmung von Kreatinin im Urin 29

2.4 Statistische Analyse 30

3 Ergebnisse 31

3.1 Statistische Auswertung 31

3.1.1 Freies und proteinassoziiertes 3-Nitrotyrosin im Plasma 31

3.1.2 Nitrit und Nitrat im Plasma 33

3.1.3 L-Arginin und ADMA im Plasma 34

3.1.3.1 L-Arginin und ADMA im Transplantatausstrom 37

3.1.4 8-iso-Prostaglandin F2Cim Urin 39

3.1.5 Nitrit und Nitrat im Urin 40

4 Diskussion 42

4.1 Biomarker des oxidativen Stresses 43

4.2 L-Arginin/ NO-Stoffwechselweg 45

4.3 Ausblick 53

5 Zusammenfassung 54

6 Literaturverzeichnis 56

7 Anhang 65

7.1 Patienteninformation 65

7.2 Einwilligungserklärung 66

7.3 Qualitätskontrollen für Nitrit und Nitrat im Urin und im 68

7.4 Patient Nr. 1 69

7.4.1 Plasma-Parameter für Patient Nr. 1 69

7.4.1.1 Freies und proteinassoziiertes 3-Nitrotyrosin im Plasma 70

7.4.1.2 Nitrit und Nitrat im Plasma 71

7.4.1.3 L-Arginin und ADMA im Plasma 72

7.4.2 Urin-Parameter für Patient Nr. 1 73

(5)

7.5 Patient Nr. 2 75

7.5.2.1 8-iso-Prostaglandin F2Cim Urin 79

7.5.2.2 Nitrit und Nitrat im Urin 80

7.6 Patient Nr. 3 81

7.7 Patient Nr. 4 87

7.8 Patient Nr. 5 93

(6)

7.9 Patient Nr. 6 99

7.10 Patient Nr. 7 105

7.11 Patient Nr. 8 111

7.12 Patient Nr. 9 117

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Abb. ...Abbildung

ADMA...asymmetrisches Dimethylarginin

BSTFA...N,O-bis(Trimethylsilyl)trifluoroacetamid DDAH...Dimethylarginin-Dimethylaminohydrolase eNOS... endotheliale NO-Synthase

eV...Elektronenvolt

FAD...Flavin-Adenin-Dinucleotid FMN... Flavin-Mononucleotid GSH... Glutathion, reduziertes

GC-tandem MS... Gaschromatographie-tandem Massenspektrometrie HCC... Hepatocelluläres Carcinom

HCl... Salzsäure

HPLC...high-pressure liquid chromatography ICAM-1... intercellular-adhesion-molecule-1 IHVC... infrahepatische Vena cava inferior iNOS... induzierbare NO-Synthase

IRI...ischemia reperfusion injury (Ischämie-Reperfusionsschaden) 8-iso-PGF2C... 8-iso-Prostaglandin F2C

MDA... Malondialdehyd min... Minuten

MW...Mittelwert

m/z... Masse-zu-Ladung n... Anzahl der Patienten

NADPH ... Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat NICI...negative-ion chemical ionisation

eNOS... endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase nNOS... neuronale Stickstoffmonoxid-Synthase NO...Stickstoffmonoxid

NOS... Stickstoffmonoxid-Synthase n.R. ... nach Reperfusion

n.s. ... nicht signifikant 3-NT... 3-Nitrotyrosin

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oLTX... orthotope Lebertransplantation PBC...primär biliäre Zirrhose

PDF...primary dysfunction

PFB-Bromid... Pentafluorobenzyl-Bromid

PFPA...Pentafluoropropionsäureanhydrid PNF...primary non-function

PRMT...Proteinmethylase I

PSC...Primär sklerosierende Cholangitis QK...Qualitätskontrolle

Ref. -wert... Referenzwert

RNS... Reaktive Stickstoffspezies ROS... Reaktive Sauerstoffspezies SE... Standardfehler

SHVC... suprahepatische Vena cava inferior SIM...selected-ion monitoring

SOD... Superoxid-Dismutase SPE...solid-phase extraction

SRM...selected-reaction monitoring STABW... Standardabweichung

TBARS... Thiobarbitursäure reaktive Substanzen TNF-C...Tumor Nekrose Faktor-C

V. cava inf. ... Vena cava inferior (untere Hohlvene) v.N. ...vor Narkose

v.H. ...vor Hautschnitt v.K. ...vor Klemmung v.R. ...vor Reperfusion v/v... Volumenanteile

ZVK...Zentralvenöser Katheter

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1 Einleitung

1.1 Der L-Arginin/ Stickstoffmonoxid (NO

)-Stoffwechselweg

1.1.1 L-Arginin als Vorstufe für die endogene NO-Synthese

L-Arginin ist eine basische, semi-essentielle Aminosäure, die im menschlichen Organismus für zahlreiche Stoffwechselfunktionen von Bedeutung ist. Eine wichtige Rolle nimmt L-Arginin im Harnstoffzyklus ein, wo es in der letzten Zyklusreaktion durch das zytosolische Enzym Arginase unter Bildung von Harnstoff und Ornithin gespalten wird (s. Abb. 1) und somit der Elimination nicht-essentieller, stickstoff- haltiger Verbindungen aus dem Organismus dient [1].

L-Arginin wird zum einen mit der Nahrung aufgenommen und zum anderen de novo im menschlichen Organismus gebildet. Der Hauptort der Neusynthese ist neben der Leber und in geringerem Ausmaß den Makrophagen und Endothelzellen die Niere.

Dies erklärt die Tatsache, dass die Plasmakonzentration von L-Arginin bei Patienten mit Nierenversagen erniedrigt ist [2].

Der L-Arginin-Gehalt in der Leber ist sehr gering und entspricht etwa 5 - 10 % der Blutkonzentration [3]. Dies läßt sich dadurch erklären, dass die Leber als Ort der Harnstoffsynthese das Organ mit der höchsten Arginaseaktivität ist. Die Niere hingegen mit einem 5- bis 10-fach höheren L-Arginin-Gehalt hat eine Arginase- Aktivität, die etwa 1 % der Leber entpricht [4].

Ein großer Teil des L-Arginins wird für die Synthese von Peptiden und Proteinen verwendet (z. B. Kreatin aus Arginin und Glycin) [5]. Das in der Leber gebildete L-Arginin dient fast ausschließlich dem eigenen Stoffwechsel, d.h. in erster Linie der Harnstoffsynthese.

Ende der 80er Jahre konnte gezeigt werden, dass Endothelzellen NO aus L-Arginin synthetisieren [6]. Das Enzym, welches L-Arginin zu NO umwandelt, wurde 1991 aus Makrophagen und Endothelzellen isoliert und kloniert [7, 8]. Es handelt sich dabei um die NO-Synthase (NOS), welche NO durch Oxidation einer Aminogruppe der terminalen Guanidino-Gruppe aus L-Arginin bildet. Hierbei entsteht als Nebenprodukt L-Citrullin (s. Abb. 1).

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Abb. 1: Vereinfachte schematische Darstellung des L-Arginin/ NO-Stoffwechselweges.

L-Arginin stellt das Substrat für die NO-Synthese dar, welche durch das Enzym NO-Synthase (NOS) katalysiert wird. Stabile Endprodukte der NO-Synthese sind Nitrit und Nitrat. Das Asymmetrische Dimethylarginin (ADMA) ist ein potenter NOS-Inhibitor und wird durch die Dimethylarginin-Dimethylaminohydrolase (DDAH) abgebaut. L-Arginin wird durch die Arginase zu Harnstoff und Ornithin metabolisiert.

Die NOS läßt sich in drei Isoformen unterteilen [9], zwei konstitutive – die neuronale (nNOS oder NOS I) und die endotheliale (eNOS oder NOS III) – und eine induzierbare (iNOS oder NOS II). Die konstitutiven Formen werden kontinuierlich exprimiert, sind Ca²⁺-abhängig und kommen überwiegend im Nervensystem bzw. im Endothelium vor. Im Nervensystem wirkt NO als Neurotransmitter. In der Zirkulation hingegen bewirkt es eine Gefäßdilatation [10], hemmt die Thrombozytenaggregation [11], die Gefäßwandadhäsion und Migration der Leukozyten [12] sowie die Proliferation glatter Muskelzellen [13]. Ausserdem bietet NO den Zellen Schutz vor Angriffe durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) [14]. Aufgrund dieser Eigenschaften wird NO auch als anti-arteriosklerotisches Molekül bezeichnet [15].

Die gefäßerweiternde Eigenschaft von NO findet im klinischen Alltag in vielen Bereichen therapeutische Anwendung. So wird NO zur Behandlung der Angina pectoris und der idiopatischen Hypertonie in Form der organischen Nitrate sowie zur Behandlung des akuten Lungenversagens in Form des Gases eingesetzt.

Die induzierbare NO-Synthase kommt vorrangig in Makrophagen vor, ist Ca²⁺-unabhängig und wird auf der Ebene der Transkription reguliert. Eine Induktion des Enzyms erfolgt durch proinflammatorische Zytokine und Endotoxine. Dies führt

L-Arginin

ADMA DDAH

Citrullin

Dimethylamin

NOS

NO

NO₂

NO₃

Citrullin Ornithin

Harnstoff

Arginase

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zu einer hohen und langanhaltenden Aktivität [16], die auf intrazelluläre Bakterien und Viren, aber auch auf bestimmte Tumorzellen zytotoxisch wirkt (indirekte Makrophagen-induzierte Zytotoxizität) [9, 17]. NO wirkt jedoch auch direkt zytotoxisch, indem es mit mitochondrialen Hämproteinen reagiert und so die Atmungs- kette hemmt [17]. Ein weiterer zytotoxischer Effekt von NO geht auf die Reaktion mit Superoxid (O2-

) zu Peroxynitrit (ONOO^-) zurück, welches eine sehr instabile und reaktionsfreudige Substanz darstellt [18].

Entscheidend für die Aktivität der drei Isoformen ist das Vorliegen von Nicotinamid- Adenin-Dinucleotid-Phosphat (NADPH), Flavin-Adenin-Dinucleotid (FAD), Flavin- Mononucleotid (FMN) und Tetrahydrobiopterin (H4B) als Co-Faktoren sowie molekularer Sauerstoff (O2) als Cosubstrat.

NO ist mit einer Halbwertszeit von nur wenigen Sekunden in vitro ein sehr kurzlebiges Radikal [19]. Es wird schnell durch Oxidation inaktiviert, wobei im Verlauf die stabilen Metabolite Nitrit und Nitrat entstehen, die über die Nieren eliminiert werden [20] (s. Abb. 1). Die im Urin bestimmten Nitrit- und Nitrat-Spiegel gelten daher als nicht-invasive Marker der endogenen NO-Synthese.

1.1.2 Asymmetrisches Dimethylarginin (ADMA) als Inhibitor der NO-Synthase Die Methylierung der N-Atome der Guanidino-Gruppe von L-Arginin in Proteinen durch die Proteinmethylase I (PRMT) und die anschließende Hydrolyse führt zu mono- und dimethylierten L-Arginin-Analoga, wie N^G-Monomethyl-L-Arginin (L-NMMA) und N^G,N^G-Dimethyl-L-Arginin (asymmetrisches Dimethylarginin, ADMA).

Beide Verbindungen sind potente kompetitive Inhibitoren der NO-Synthase [21], die für das L-Arginin-Paradoxon verantwortlich gemacht werden [22]. Dabei handelt es sich um die Beobachtung, dass eine Erhöhung des L-Arginin-Spiegels im Plasma (z. B. durch i.v. - Gabe von L-Arginin) trotz Substratsättigung zu einer verstärkten NO-Bildung führen kann.

Die ADMA-Konzentration im Plasma wird im wesentlichen durch drei Mechanismen reguliert:

1. ADMA wird über die Nieren ausgeschieden und ist daher bei eingeschränkter ADMA-Clearance, wie sie beim Nierenversagen auftritt, erhöht [23, 24].

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2. ADMA wird über das Enzym Dimethylarginin-Dimethyl-aminohydrolase (DDAH) zu Dimethylamin und Citrullin abgebaut [25, 26] (s. Abb. 1).

3. Die ADMA-Konzentration steigt infolge einer vermehrten Expression der Protein- methylase I an. (Dies wurde bei erhöhten LDL-Cholesterin-Spiegeln in menschlichen Endothelzellen gezeigt [27] ).

Durch die Funktion von ADMA als NO-Synthase-Inhibitor kommt es bei Konzentrationszunahme im Plasma zu einer Abnahme der NO-Generierung und damit zu einer Störung der NO-vermittelten endothelialen Vasodilatation [28].

Interessant ist in diesem Zusammenhang die Beobachtung von Vallance et al. und Kielstein et al., dass die beim Nierenversagen auftretende endotheliale Dysfunktion durch L-Arginin-Gabe [24] bzw. durch Dialyse [29] normalisiert werden kann.

Erhöhte ADMA-Spiegel im Plasma finden sich bei Hypercholesterinämie, Hypertonie, Hyperglykämie, Nikotinabusus [30] sowie Hyperhomocysteinämie [31]. Ito et al.

nennen die gestörte DDAH-Aktivität bei Hypercholesterinämie [32], Stühlinger et al.

bei Hyperhomocysteinämie als Grund für die erhöhten ADMA-Spiegel im Plasma.

Erst kürzlich wurde gezeigt, dass schon leicht erhöhte ADMA-Konzentrationen im Plasma mit einem erhöhten Risiko für akute koronare Ereignisse assoziiert sind [33].

ADMA stellt somit eine Substanz mit proatherogenen Eigenschaften dar, dessen Plasmaspiegel Auskunft über das kardiovaskuläre Risiko geben kann.

1.2 Oxidativer Stress

1.2.1 ROS und RNS

Als „Oxidativen Stress“ bezeichnet man ein Ungleichgewicht zwischen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und elementaren, antioxidativen Verteidigungsmecha- nismen (s. Abb. 2). Dieses Ungleichgewicht tritt auf, wenn die Bildung der ROS stark erhöht und/ oder die antioxidative Verteidigung herabgesetzt ist. Oxidativer Stress führt zum Zelltod und folglich zu Gewebeschäden. Zu den reaktiven Sauerstoff- spezies zählen u. a. das Superoxidradikal (O2-

), das Wasserstoffperoxid (H2O2) und das Hydroxylradikal (OH), wobei letzeres das reaktivste Radikal darstellt.

Neben den ROS rechnet man auch die reaktiven Stickstoffspezies (RNS) zu den Verursachern des oxidativen Stresses [34]. Vertreter sind das Stickstoffmonoxid

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(NO) und das Stickstoffdioxid (NO2). Eine Besonderheit stellt das Peroxynitrit (ONOO^-) dar, das aus der Reaktion von Superoxid-Anion und Stickstoffmonoxid hervorgeht [35]. Peroxynitrit ist ein stärkeres Oxidans als Superoxid, es nitriert Proteine, oxidiert und nitriert Aminosäuren, DNA und Lipide. Aufgrund seiner Reaktionsfreudigkeit wird es für zahlreiche pathologische Veränderungen verantwortlich gemacht.

Abb. 2: Gleichgewicht zwischen oxidativem Stress und antioxidativer Verteidigung. Durch erhöhte ROS-Bildung bzw. ungenügender antioxidativer Verteidigung kommt es zum Ungleichgewicht und in diesem Fall zum oxidativem Stress, der die Zellen schädigt.

1.2.2 Antioxidantien

Der Zelle als „Angriffsort” des oxidativen Stresses stehen zahlreiche Abwehrmechanismen zur Verfügung (s. Abb. 2) [34, 35]. Insbesondere das Glutathion (GSH) verleiht der Zelle ein hohes reduktives Potential. Durch Oxidation zum Disulfid (GSSG) über die GSH-Peroxidase reduziert es Wasserstoffperoxid zu Wasser. Der größte Teil des oxidierten Glutathions wird sofort wieder durch die GSH- Reduktase unter Verbrauch von NADPH zu Glutathion reduziert. Ein weiteres

Oxidativer Stress Antioxidative Verteidigung

Zelltod Überleben

Superoxid-Dismutase Katalase GSH-Peroxidase GSSG-Reduktase -Tocopherol Ascorbinsäure

GSH O2

.-

H2O2

OH^. RO^. ONOO^-

NO^. NO2 .

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wichtiges Enzym gegen den oxidativen Stress ist die Superoxid-Dismutase (SOD).

Dieses Enzym katalysiert die Oxidation eines Superoxid-Anions zu molekularem Sauerstoff und die Reduktion eines zweiten Superoxid-Anions zu Wasserstoffperoxid, das entweder durch die GSH-Peroxidase oder durch die in den Peroxisomen befindliche Katalase abgebaut wird. SOD verhindert so die Bildung des hochtoxischen Hydroxylradikals, das aus Superoxid-Anionen durch Oxidation von Fe²⁺ gebildet werden kann (Haber-Weiss-Reaktion). Hydoxylradikale entstehen zudem aus der Reaktion von H2O2 mit Fe²⁺ (Fenton-Reaktion). Eisenchelatoren wie Desferoxamin und Transferrin zählen in diesem Sinne auch zu den Antioxidantien, da sie die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies verhindern.

Neben den genannten Enzymen und den Eisenchelatoren zählen auch bestimmte Vitamine wie das -Tocopherol (Vitamin E) und die Ascorbinsäure (Vitamin C) zu den Antioxidantien. -Tocopherol ist sehr lipophil und kommt verstärkt in den Zellmembranen vor. Hier fängt es Peroxy-Radikalintermediate ab und unterbricht so die Kettenreaktion der Lipidperoxidation. Aufgrund dieser Eigenschaft wird das -Tocopherol auch als kettenbrechendes Antioxidans bezeichnet [36]. Das bei dieser Reaktion entstehende Tocopherol-Radikal ist sehr reaktionsträge und wird durch die Ascorbinsäure aufgefangen.

1.2.3 Biomarker des oxidativen Stresses

Da es sich beim oxidativen Stress im wesentlichen um freie Radikale handelt, ist eine direkte Messung sehr schwierig. Daher bedient man sich der indirekten Messung, bei der stabile Endprodukte als sogenannte Biomarker des oxidativen Stresses bestimmt werden.

Stabile Endprodukte sind durch oxidativen Stress veränderte Biomoleküle wie Fette, Proteine, aber auch Nukleinsäuren. Die entsprechenden Mechanismen sind Lipid- peroxidation, Oxidation von Proteinen und DNA-Oxidation.

Ein Marker für das Ausmaß oxidativer DNA-Schädigung ist das 8-Hydroxy-2‘- Desoxyguanosin, das im Urin bestimmt werden kann und als ein Faktor der Karzinogenese diskutiert wird.

Für die Lipidperoxidation gibt es zahlreiche Marker des oxidativen Stresses. So werden konjugierte Diene bei einer Absorbtion von 235 nm gemessen [37] und

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kurzkettige Alkane in der ausgeatmeten Luft detektiert [38]. Malondialdehyd (MDA) und andere mit der Thiobarbitursäure reaktive Substanzen (TBARS) werden mit dem sogenannten TBA-Test gemessen.

Als weitere Marker der Lipidperoxidation können die Isoprostane herangezogen werden [39]. Isoprostane sind stabile Isomere der Prostaglandine, die nicht- enzymatisch durch freie Radikale aus der in der Zellmembran verankerten Arachidonsäure gebildet werden. Durch die Phospholipase A2erfolgt die Abspaltung der Isoprostane von den Membranlipiden und die Freisetzung in den Blutkreislauf [40]. Insbesondere das 8-iso-Prostaglandin F2C (8-iso-PGF2C) ist ein sehr spezifischer und stabiler Parameter des oxidativen Stresses [41], der sich im Urin gut bestimmen läßt. Die Referenzmethode stellt die Gaschromatographie-Tandem-Massen- spektrometrie (GC-MS/MS) dar, welche eine sehr zuverlässige und präzise Messung ermöglicht [42].

Erhöhte 8-iso-PGF2C-Konzentrationen im Urin finden sich bei Erkrankungen wie Diabetes mellitus (Typ 1 und Typ 2) [43] sowie diabetische Ketoazidose [44], chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD) [45] und Cystische Fibrose [46], Hypercholesterinämie [47, 48], instabile Angina [49] und koronare Ischämie- Reperfusionssyndrome [50]. Erhöhte Spiegel finden sich ausserdem bei Rauchern [51] und bei Leberzirrhotikern [52], insbesondere wenn die Zirrhose ethyltoxischer Genese ist [53].

In zahlreichen Studien konnte gezeigt werden, dass sich diese erhöhten 8-iso-PGF2C- Spiegel durch Gabe von Antioxidantien wie C-Tocopherol, Ascorbinsäure oder S-Carotin senken lassen [54]. Diese Wirkung der Antioxidantien spricht für den oxidativen Stress als Komponente in der Entstehung und Entwicklung zahlreicher Erkrankungen.

Neben den Fetten werden auch Proteine bzw. Aminosäuren durch den oxidativen Stress verändert. Reaktive Stickstoffspezies, insbesondere Peroxynitrit, sind in der Lage, Phenolringe und Tyrosinreste von Proteinen zu nitrieren. Aus der Reaktion von Peroxynitrit mit Tyrosinresten entsteht das 3-Nitrotyrosin [55], das sowohl gebunden an Proteine als auch als freie Aminosäure in biologischen Flüssigkeiten vorkommt.

3-Nitrotyrosin-Reste finden sich vermehrt in Proteinen im Zusammenhang mit unterschiedlichen Erkrankungen [56, 57] Insbesondere bei neurodegenerativen Erkrankungen ist die Nitrierung von Tyrosinresten in Proteinen ein pathologisch

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relevanter Vorgang wie z.B. bei der Amyotrophen Lateralsklerose (ALS), einer degenerativen, die Motoneurone betreffenden Rückenmarkserkrankung, bei der sich erhöhte 3-Nitrotyrosin-Spiegel im Liquor finden [58]. Weitere neurodegenerative Erkrankungen, die vermehrt 3-Nitrotyrosin-Reste in Proteinen aufweisen, sind das Parkinson-Syndrom [59], das Alzheimer-Syndrom [60] und die Multiple Sklerose [61].

Ferner finden sich erhöhte Werte bei Arteriosklerose [62] und Diabetes mellitus [57].

Auch nach Transplantationen [63], bei entzündlichen Prozessen [64] und besonders bei Hepatitis [65] wird über die Nitrierung von Tyrosin-Resten berichtet.

Auch das 3-Nitrotyrosin als freie Aminosäure zeigt erhöhte Spiegel unter pathologischen Veränderungen. So werden z. B. im Plasma und in der Synovialflüssigkeit von Patienten mit rheumatoider Arthritis erhöhte Werte gemessen [66]. Auch bei Zöliakie wird über hohe Plasmakonzentrationen von freiem 3-Nitrotyrosin berichtet [67]. Die bislang höchsten Werte traten im Plasma von Patienten mit septischem Schock oder akutem Nierenversagen auf [68].

1.3 Die orthotope Lebertransplantation (oLTX)

1.3.1 Allgemeines

Die orthotope Lebertransplantation stellt zur Zeit für viele Lebererkrankungen im Endstadium die Therapie der Wahl mit sehr guten Erfolgsaussichten dar. Zum jetzigen Zeitpunkt werden Einjahresüberlebensraten von 80 % erreicht [69,70].

In Deutschland standen im Jahr 2001 800 Patienten auf der Warteliste für ein Spenderorgan. Es wurden jedoch lediglich 660 Lebertransplantationen durchgeführt, das sind 15 % weniger als im Jahr davor¹. Diese Diskrepanz zwischen der Zahl geeigneter Spenderorgane und dem steigenden Transplantatbedarf besteht weltweit.

Zahlreiche Entwicklungen der letzten Jahre versuchen das Problem der Organ- knappheit und das Überleben der auf ein geeignetes Spenderorgan Wartenden zu verbessern. Neue chirurgische Strategien und Techniken wie die Leberlebendspende und das sogenannte Splitleber-Verfahren wurden entwickelt und haben sich im Klinikalltag etabliert. Die Leberlebenspende, die vorrangig in der Pädiatrie

1http://www.eurotransplant.nl

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Verwendung findet, und im wesentlichen durch einen Elternteil geleistet wird, zeigt Einjahresüberlebensraten von 94 % [71]. Beim Splitleber-Verfahren, das erstmals 1988 von R. Pichlmayr beschrieben wurde [72], wird eine Kadaverleber so geteilt, dass zwei Transplantate entstehen: ein kleineres Transplantat (i. a. Segment II und III) für einen kindlichen und ein größeres für einen erwachsenen Empfänger (rechter Leberlappen oder Segment IV bis VIII). Die Überlebensraten bei Splitlebertrans- plantation sind ähnlich wie bei der orthotopen Lebertransplantation einer ungeteilten Leber [73].

Ein weiterer Fortschritt in der Transplantationschirurgie ist die Entwicklung von sogenannten Leberunterstützungssystemen. Im sogenannten Leberdialyseverfahren (MARS^®-Verfahren) wird dabei der Körper von Giftstoffen wie Bilirubin, Gallensäuren und Ammoniak befreit. Anwendung findet dieses Verfahren beim akuten und chronischen Leberversagen, das häufig zum Koma, Nierenversagen und letzlich zum Tod durch Multiorganversagen führt. Das Leberdialyseverfahren verbessert die Organfunktion und kann bei Patienten mit schwerer Leberinsuffizienz die Zeit bis zur Transplantation eines geeigneten Organs überbrücken.

Häufige Indikationen für eine Transplantation sind die chronisch aktiven Hepatitiden mit Zirrhosebildung (Hepatitis B- oder C-Infektion, Autoimmunhepatitis, Medika- mente), die primär biliäre Zirrhose (PBC), die primär sklerosierende Cholangitis (PSC), die ethyltoxische Leberzirrhose, das Budd-Chiari-Syndrom, das akute Leberversagen und die bösartigen, primären Lebertumoren. Bei Kindern häufig gestellte Indikationen sind Gallengangsatresien und angeborene Stoffwechsel- störungen wie der Morbus Wilson und die Hämochromatose [74].

1.3.2 Primäre Dysfunktion (PDF), Ischämie-/ Reperfusionsschaden (IRI) und Oxidativer Stress

Die Lebertransplantation führt nach wie vor regelmäßig zu verschiedenen Komplikationen. Neben langfristigen Problemen wie ein Rezidiv der Grund- erkrankung (Tumor, Hepatitis) und Nebenwirkungen der Immunsuppression, kann es auch zu schweren Komplikationen im frühen postoperativem Verlauf kommen. Dazu gehören u.a. die Transplantatabstoßung und das primäre Leberversagen (PNF, primary non-function).

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Die primäre Dysfunktion ist eine gefürchtete Frühkomplikation der Lebertransplan- tation, in deren Verlauf es zum Leberausfall mit seinen bekannten Komplikationen wie Kreislaufinsuffizienz, hepatorenalem Syndrom und Koma kommen kann. Die PDF umfasst in der Fachliteratur das primäre Leberversagen (PNF, primary non- funtion) und die initial schwache Leberfunktion (IPF, initial poor function). Von einer IPF spricht man, wenn innerhalb der ersten drei postoperativen Tage ein hoher Leberenzymanstieg (GOT > 2500 U/l) vorliegt, die Galleproduktion weniger als 20 ml/Tag beträgt und eine Gerinnungsfaktorgabe über mehr als zwei Tage notwendig ist. Eine PNF liegt vor, wenn innerhalb der ersten sieben postoperativen Tage eine Retransplantation erforderlich wird [75]. Die Häufigkeit der PDF wird in der Literatur unterschiedlich angegeben. Sie liegt durchschnittlich zwischen 15 und 21 %, wobei die PNF bei 6 - 8 % der Transplantierten auftrittt [76, 77].

Die genauen Ursachen der primären Dysfunktion sind unbekannt. Es werden jedoch verschiedene Risikofaktoren mit ihrer Entstehung in Verbindung gebracht. Vom Spender gehen Risikofaktoren aus wie eine lange Hospitalisierungszeit (ab dem vierten Tag), ein hohes Alter (über dem 49. Lebensjahr), eine fettige Veränderung der Leber (Steatose) sowie eine reduzierte Lebergröße. Risikofaktoren des Empfängers hingegen sind ein junges Transplantationsalter, eine Retransplantation sowie eine Niereninsuffizienz und ein hoher Medikamentenstatus (insbesondere Katecholamine) vor oLTX [78]. Auch die Dauer der kalten Ischämiezeit (CIT, cold ischemia time) spielt eine wesentliche Rolle in der Entstehung der PDF. So zeigten Adam et al., dass Patienten, denen ein Transplantat mit einer CIT unter 12 h eingepflanzt worden war, ein signifikant längeres Langzeitüberleben und eine niedrigere Retransplantationsrate als Patienten mit einer CIT über 12 h hatten [79].

Daneben scheint auch der Verfettungsgrad der Leber das Auftreten der PDF in besonderem Maße zu beeinflussen. Dies ist von großer Bedeutung, da gerade in den westlichen Ländern die Steatose als ein allgemein übliches Krankheitsbild bei jeder vierten Spenderleber diagnostiziert wird. Es konnte gezeigt werden, dass eine Verfettung der Leber mit einem Anteil von über 60 % ein sehr hohes Risiko beinhaltet, eine PNF zu entwickeln. Das Risiko bei einer Verfettung der Leber unter 30 % (milde Steatose) ist hingegen gleichzusetzen mit dem Risiko bei Trans- plantation einer gesunden Leber. Der Verlauf bei moderater Steatose (30 - 60 %) variiert und ist abhängig von zusätzlichen Risikofaktoren [80]. Die Entscheidung für ein solches grenzwertiges Transplantat sollte deshalb nur unter Ausschluss weiterer

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Risikofaktoren erfolgen. Zudem sollte die kalte Ischämiezeit als einzige kontrollierbare Variable so kurz wie möglich gehalten werden.

Als eine mögliche Ursache für die Entwicklung einer PDF wird der durch die Ischämie und insbesondere durch die Wiederdurchblutung (Reperfusion) des Transplantats auftretende Gewebeschaden, der sogenannte Ischämie-/ Reperfu- sionsschaden (IRI, ischemia/reperfusion injury), diskutiert (s. Abb. 3).

Der Ischämie-/ Reperfusionsschaden der Leber stellt ein komplexes Netzwerk aus hepatischen und extrahepatischen Mechanismen dar, in dessen Zentrum der oxidative Stress steht. Granger et al. konnten 1981 erstmals indirekt den durch freie Radikale vermittelten Reperfusionsschaden im Katzenmodell nachweisen. Durch Gabe von Superoxid-Dismutase (SOD) konnte die nach Reperfusion des Dünndarms auftretende erhöhte Kapillardurchlässigkeit als Zeichen der Gewebsschädigung fast vollständig verhindert werden. Die Arbeitsgruppe um Granger sieht die Konvertierung von Xanthindehydrogenase zu Xanthin-Oxidase während der kalten Ischämiezeit und das Wiedereintreten von Sauerstoff mit der Reperfusion als einen Patho- mechanismus an, bei dem Radikale gebildet werden. Die Xanthin-Oxidase der Endothelzellen und Hepatozyten katalysiert dabei die Bildung von Superoxidanionen aus Sauerstoff, in deren Verlauf zudem die hochtoxischen Hydroxylradikale entstehen, die mitunter für den Gewebeschaden verantwortlich gemacht werden [81].

Der IRI ist weiterhin durch eine Akkumulation und Endothelzelladhäsion von neutrophilen Granulozyten (Leukozyten) insbesondere in den Sinusoiden gekenn- zeichnet [82]. Diese werden durch die vermehrt gebildeten Radikale sowie durch Komplementfaktoren angelockt und bilden ihrerseits durch das Enzym NADPH- Oxidase Superoxidanionen, die den Reperfusionsschaden weiter verstärken [83].

Eine besondere Rolle nehmen die Kupfferzellen als ortsständige Makrophagen ein, die ebenfalls über die NADPH-Oxidase zur Radikalbildung beitragen und als Hauptbildungsort für die ROS gelten [84, 85]. Die aktivierten Leukozyten und Kupfferzellen verfügen zudem über eine Reihe von Proteasen wie der neutrophilen Elastase, die bei Freisetzung die subendotheliale Matrix (Elastin, Fibronektin) der Endothelzellen zerstört und diese so aus ihrem Zellverband herauslöst [86,87].

Neben den Proteasen werden zahlreiche Mediatorsubstanzen wie Interleukin 1, Tumor Nekrose Faktor-C(TNF-C) und der Plättchen-aktivierende Faktor (PAF) freige- setzt. Die Zytokine bewirken eine vermehrte Expression von ICAM (intercellular-

(20)

adhesion-molecule)-1-Rezeptoren auf den Endothelzellen und verstärken über Interaktion mit den L-Selectin-Rezeptoren der Leukozyten sowohl deren Endothel -zelladhäsion („rolling phenomenon“) als auch die Migration in den Hepatozyten- verbund. Diese Wechselwirkung der Leukozyten mit den Endothelzellen wird auch für die Störung der hepatischen Mikrozirkulation als Bestandteil des Reperfusions- schadens verantwortlich gemacht [88].

Abb. 3: Pathogenese des Ischämie-/Reperfusionsschadens (IRI) der Leber. Im Zentrum des Geschehens stehen die reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), deren Rolle bei der Enstehung der primären Dysfunktion (PDF) diskutiert wird.

Als eine weitere Ursache für den Reperfusionsschaden wird ein Ungleichgewicht zwischen Vasokonstriktoren (Endothelin) und Vasodilatatoren (NO) gesehen. Die mit der Reperfusion zahlreich gebildeten ROS begünstigen dabei die Freisetzung von Vasokonstriktoren wie dem Endothelin und tragen so zur Störung der hepatischen Mikrozirkulation bei [89].

Ischämie + Reperfusion

Neutrophilenakkumulation/-adhäsion Kupfferzellaktivierung

sinusoidaler Endothelzellschaden + gestörte hepatische Mikrozirkulation

PDF

ROS

(in Endothelzellen/Hepatozyten) Xanthin-Dehydrogenase Xanthin-Oxidase

Leberzellschaden (IRI)

NADPH-Oxidase NADPH-Oxidase

Proteasen +Zytokine

(21)

1.4 Studienziel und Zielparameter

Die weltweite Diskrepanz zwischen Bedarf und Anzahl von Spenderorganen stellt ein wesentliches Problem der Transplantationschirurgie dar. Viele Transplantations- zentren fordern daher, die Zulassungskriterien für ein Spenderorgan auf sogenannte Marginalorgane (wie Lebern mit moderater Steatose) auszuweiten. Eine Lockerung der Zulassungskriterien beinhaltet jedoch auch Risiken, die das Organ- und Spender- leben negativ beeinflussen. Auf die Lebertransplantation bezogen würde dies u.a. mit einem zunehmenden Risiko, eine primäre Dysfunktion (PDF) zu entwickeln, verbunden sein. Auch der nach der Konservierung auftretende Reperfusionsschaden (IRI) würde dadurch verschlimmert werden. Das vorrangige Ziel sollte daher in erster Linie eine Reduktion der Risikofaktoren sein, die zur PDF bzw. zum IRI führen, sowie die Aufdeckung der Mechanismen, die den Leberschaden bei Transplantation bewirken. Nur dann kann in entscheidendem Maße durch therapeutische Intervention vorgebeugt werden und nur dann ist eine Erwägung von Marginalorganen in Betracht zu ziehen.

Die Ziele der vorliegenden Studie waren es, zum einen, den endogenen L-Arginin/

NO-Stoffwechselweg bei Lebertransplantation am Menschen unmittelbar nach Reperfusion (Zeitraum bis vier Stunden nach Organreperfusion) zu untersuchen, und zum anderen, das Ausmaß des auftretenden oxidativen Stresses anhand geeigneter Parameter quantitativ zu bestimmen (s. nächste Seite).

Für die Untersuchung des L-Arginin/ NO-Stoffwechselweges wurde die L-Arginin- und ADMA-Konzentration im Plasma sowie die Nitrit- und Nitrat-Konzentration im Urin und im Plasma bestimmt.

Als Indexparameter für den oxidativen Stress wurde die (freie und proteinassoziierte) 3-Nitrotyrosin-Konzentration im Plasma sowie die 8-iso-PGF2C-Ausscheidung im Urin bestimmt.

Daneben wurde Blut untersucht, das direkt aus der reperfundierten Leber kam.

Dieses sogenannte geflushte Blut wurde aus den entsprechenden Lebergefäßen entnommen und ermöglicht eine Untersuchung des Spenderrorgans vor Eintreten in den Blutkreislauf des Empfängers (s. Kapitel 2.2.3).

(22)

OH O

H O H

COOH

COOH NH₂ NH

N H

N CH₃ C H₃

COOH NH₂ NH

N H

N H₂

O H

O₂N

CH₂ C H NH₂

COOR

N O

O

N O

O O

15( S )-8-iso-PGF

₂

ADMA

L-Arginin

3-Nitro-L-tyrosin

_

Nitrit

Nitrat

_

Schema: Struktur und Namen der untersuchten Biomarker des oxidativen Stresses und der NO-Synthese

Als Biomarker des oxidativen Stresses wurden die 3-Nitrotyrosin-Konzentration im Plasma und die 8-iso-PGF2C-Konzentration im Urin bestimmt. Der Status des L-Arginin/NO-Stoffwechselweges wurde durch die Bestimmung der Nitrit- und Nitrat- Konzentration in Plasma und Urin sowie des L-Arginin- und ADMA-Plasmaspiegels erfaßt.

(23)

2 Material und Methoden

2.1 Patienten

An der Studie nahmen 9 Patienten im Alter von 32 bis 69 Jahren teil, denen im Zeitraum von März bis August 2002 im Rahmen einer orthotopen Leber- transplantation (oLTX) in der Medizinischen Hochschule Hannover (MHH) ein geeignetes Spenderorgan verpflanzt wurde. Das Kollektiv bestand aus 2 Frauen und 7 Männern. Der Altersdurchschnitt ± Standardabweichung betrug 45,7 ± 14,7 Jahre.

Von allen Patienten, bis auf Patient Nr. 9, wurden Plasma- und Urinproben entnommen. Von Patient Nr. 9 lagen lediglich Urinproben vor. Tabelle 1 soll eine Übersicht über das untersuchte Patientenkollektiv geben. Detailierte Angaben über die Krankheitsgeschichte jedes einzelnen Patienten finden sich im Anhang (s. Kapitel 7.4 - 7.12).

Tabelle 1: Charakterisierung der im Rahmen dieser Arbeit untersuchten und transplantierten Patienten

Pat.-Nr. Sex Alter Operationsindikation

1 w 42 partielles Budd-Chiari-Syndrom mit Pfortaderthrombose 2 m 60 Retransplantation wegen Tumorrezidivs

3 m 69 Hepatocelluläres Carcinom (HCC) bei nutritiv-tox. Leberzirrhose (Child A) 4 m 42 sekundär sklerosierende eitrige Cholangitis

5 m 64 ethyltoxische Leberzirrhose (Child B) 6 m 32 primär sklerosierende Cholangitis (PSC) 7 m 33 Leberzirrhose (Child B) bei Autoimmunhepatitis

8 w 32 HCC bei Leberzirrhose infolge chron. Budd-Chiari-Syndroms 9 m 37 Leberzirrhose (Child B) bei Autoimmunhepatitis

(24)

2.2 Studienablauf

2.2.1 Aufklärung und gesetzliche Regelung

Vor Operationsbeginn wurden die Patienten über die Art und Durchführung der Studie aufgeklärt (u. a. durch ein Patienteninformationsblatt, s. Anhang). Vor der Unterzeichnung der Einwilligungserklärung (s. Anhang) wurde jedem Patienten ausreichend Zeit zur Verfügung gestellt, um noch offenstehende Fragen zu stellen.

Das entsprechende Studienprotokoll ist von der Ethikkommission der Medizinischen Hochschule Hannover geprüft und bewilligt worden (Nr. 2800, „Oxidativer Stress bei Reperfusion unter Lebertransplantation“, 17.10.2001).

2.2.2 Probengewinnung und -aufbewahrung

Die Blutentnahmen erfolgten in EDTA-Monovetten (Fa. Sarstedt, Hannover). Das Blut wurde unmittelbar nach Entnahme für 5 Minuten bei 2 °C und 800 g zentrifugiert und bis zum Operationsende auf Eis gelegt. Später wurde das Plasma abgenommen und bis zur weiteren Analyse bei - 80 °C tiefgefroren. Die Urine wurden als Spontan- und Katheterurine (vor bzw. während der Operation) gewonnen und ebenfalls vor dem Tieffrieren auf Eis gelagert. Die Aliquotierung der Proben erfolgte in beiden Fällen mit dem ersten Auftauen. 1 ml Plasma wurden für die Bestimmung von 3-Nitrotyrosin, 1 ml Plasma für die Bestimmung von L-Arginin und ADMA und jeweils 100 [l Plasma für die Bestimmung von Nitrit und Nitrat verwendet. Für die Bestimmung von 8-iso-PGF2C im Urin wurden 4 ml, für die Nitrit- und Nitrat- bestimmung im Urin 100 [l aliquotiert.

2.2.3 Abnahmezeitpunkte und Abnahmestellen der Blut- und Urinproben Nach Unterzeichnen der Einwilligungserklärung gaben die Patienten einen Spontan- urin ab und es wurde eine venöse Blutprobe aus einer peripher liegenden Vene entnommen. Die nächsten Urine wurden nach Reperfusion (n. R.) entnommen, jeweils ein Aliquot von ca. 40 ml aus einer Frühphasensammlung (40 - 60 min n. R.) und aus einer Spätphasensammlung (60 - 240 min n. R.).

Weiterhin wurden Blutentnahmen aus dem Zentralvenösen Katheter (ZVK) durch- geführt (s. Tabelle 2). Hierfür ergeben sich die Zeitpunkte „vor Hautschnitt“ (v. H.),

(25)

„vor Klemmung“ der Lebergefäße des Empfängers (v. K., vor Beginn der anhepatischen Phase) und „vor Reperfusion“ des eingepflanzten Spenderorgans (v. R., am Ende der anhepatischen Phase) sowie die Entnahmezeitpunkte 5, 10, 20, 40, 60, 120 und 240 min nach Reperfusion (n. R.).

Neben den Blutentnahmen aus dem Zentralvenösen Katheter (ZVK) wurde zusätzlich Blut unmittelbar vor Reperfusion aus der geklemmten Pfortader entnommen sowie sogenanntes „geflushtes“ Blut aus der infrahepatischen Vena cava inferior (IHVC) (s. Abb. 4). Als geflushtes Blut wird das Blut bezeichnet, welches unmittelbar nach Öffnen der geklemmten Pfortader die eingepflanzte Leber durchspült. Dieses Blut gelangt nicht ins Blutkreislaufsystem des Empfängers, sondern wird über die geöffnete IHVC unter Klemmung der suprahepatischen Vena cava inferior (SHVC) ausgespült (engl. flushen). Der Grund für dieses Vorgehen ist die Vermeidung einer Elektrolytverschiebung des Patienten durch die in der Spenderleber enthaltene Konservierungslösung.

Tabelle 2: Darstellung der zeitlichen Blutentnahmen aus definierten Entnahmestellen (Blutentnahme-Protokoll).

In den weißen Feldern wurde während der Transplantation bei erfolgreich durchgeführter Blutentnahme der vorgesehene Entnahmezeitpunkt als auch Entnahmeort bestätigt. Die dunkelgrau markierten Felder stellen den Zeitpunkt der Reperfusion dar.

1. vor Narkose 2. vor Hautschnitt 3. 1 Min. vor Klemmung 4. vor Pfortaderanastomose 5. 1 Min. vor Reperfusion

Reperfusion 6. 1 Min. nach Rep.

7. 5 Min. nach Rep.

8. 10 Min. nach Rep.

Nr. Zeitpunkt peripherer

Zugang

Zentraler Venenkatheter

geklemmte Pfortader

untere Cava- anastomose Blutentnahmen

(26)

Abb. 4: Blutentnahme aus der infrahepatischen V. cava inf. (IHVC). Nach Öffnen der Pfortader durchfließt das Empfängerblut die Spenderleber und strömt über die Lebervenen in die geklemmte suprahepatische V. cava inf. (SHVC). Der so umgeleitete Blutstrom ermöglicht die Blutentnahme aus der IHVC.

Lebervene Lebervene

Lebera rterie Pfortader

S H V C

I H V C

(27)

2.3 Analytische Methoden

2.3.1 Bestimmung von 3-Nitrotyrosin als freie Aminosäure [90]

Zur GC-tandem MS-Analyse vom freien 3-Nitrotyrosin (NTfrei) wurde aus 1 ml Plasma ein Ultrafiltrat gewonnen (s. Abb. 5). Dazu wurden Centrisart-I-Ultrafiltrations- kartuschen verwendet (20 kD cut-off, 4 [m Porengröße, 2,5 ml, Sartorius, Göttingen).

Die Proben wurden bei 20 °C zunächst für 5 min mit 2800 U/min und dann für 1 h mit 4000 U/min zentrifugiert (RC5C, Sorvall^® Instruments, Du Pont, Newtown, Conneticut). Hierbei konnte etwa 700 [l Ultrafiltrat gewonnen werden. Vor der Ultrafiltration wurden einer Menge von 1 ml Plasma 6 pmol synthetisiertes 3-Nitro- L-[²H3]tyrosin [90] als interner Standard zugegeben.

Um das 3-Nitrotyrosin vor der Derivatisierung von Nitrit, Nitrat und Tyrosin zu trennen, wurde die Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC, high- pressure liquid chromatography) verwendet. Das HPLC-System setzte sich wie folgt zusammen: Pumpe (HPLC Pump 2248, Pharmacia, Schweden), UV-vis-Detektor (Spectroflow 783, Kratos Analytical, Ramsey, NJ) und Integrator (C-R6A Chromatopac, Shimadzu, Japan). Als stationäre Phase diente eine EC 125/3 Trennsäule der Dimension 150 x 3 mm ID gefüllt mit Nucleosil 120/3 C18 (Octadecylsilica, 3 [m Korngröße, Macherey-Nagel, Düren). Die mobile Phase bestand aus 70 mM Kaliumphospat-Puffer/Methanol, 92/8 (v/v), pH 2,5. Die Flussrate betrug 0,5 ml/min und die Detektion von 3-Nitrotyrosin erfolgte bei 276 nm. Vor jeder Serie von Analysen wurde die Retentionszeit von 3-Nitrotyrosin bestimmt. Um eine Kontamination der Proben durch exogenes 3-Nitrotyrosin zu vermeiden, wurde p-Nitrophenylalanin (Sigma, Deisenhofen, Deutschland) injiziert, dessen Retentions- zeit unter den gewählten Bedingungen mit der von 3-Nitrotyrosin nahezu identisch war und ebenso bei 276 nm detektiert werden kann. Die ermittelte Retentionszeit betrug 7,6 ± 0,2 min (Mittelwert ± STABW, n = 8). Für die Trennung mittels HPLC wurde ein 200 [l-Aliquot des Ultrafiltrats injiziert und ein Eluat von ca. 1 ml um die Retentionszeit von p-Nitrophenylalanin gesammelt.

Im Anschluss an die HPLC erfolgte eine Festphasenextraktion vom 3-Nitrotyrosin aus dem Eluat (SPE, solid-phase extraction). Dafür wurden Chromabond HR-P SPE- Kartuschen (100 mg, 1 ml, Macherey-Nagel, Düren) verwendet. Diese wurden vor

(28)

dem Auftragen der HPLC-Fraktion wie folgt konditioniert: 5 ml Methanol, 5 ml Methanol/ 0,5 %-ige wässrige Ammoniak-Lösung, 90/10 (v/v), und 5 ml Wasser (Ampuwa ®, Fresenius, Bad Homburg). Anschließend wurden die HPLC-Fraktionen aufgegeben, mit 5 ml 0,3 mM Salzsäure gewaschen und kurz mit Luft getrocknet. Zur Elution wurden 2 ml Methanol/0,5 %-ige wässrige Ammoniaklösung, 90/10 (v/v) verwendet. Die Eluate wurden unmittelbar darauf durch Eindampfen mit Stickstoff getrocknet und der Rückstand schließlich für die massenspektrometrische Analyse derivatisiert.

Zuerst wurden die zur Trockene eingeengten Proben in 100 [l einer 3 M HCl-Lösung in Propanol aufgenommen, in ein silanisiertes Gefäß überführt und für 1 Stunde bei 65 °C erhitzt (Veresterung mit propanolischer HCl). Nach Eindampfen mit Stickstoff wurden die Proben mit 100 [l Pentafluoropropionsäureanhydrid (PFPA) (Pierce, Rockford, IL, USA) in Ethylacetat (1:4, v/v) versetzt und für 30 Minuten bei 65 °C erhitzt (Amidierung mit PFPA). Nach erneutem Abdampfen mit Stickstoff wurde der Rückstand der Proben mit 200 [l H2O und 500 [l Ethylacetat versetzt. Die Proben wurden 1 Minute geschüttelt, und nach Zentrifugation die Ethylacetatphase in ein weiteres silanisiertes Gefäß überführt und mit Stickstoff eingedampft (Extraktion mit Ethylacetat). Als letzter Derivatisierungsschritt folgte die Veretherung mit 50 [l N,O-bis(Trimethylsilyl)trifluoroacetamid (BSTFA, Pierce, IL, USA) für 60 Minuten bei 60 °C.

Die GC-tandem MS-Analyse erfolgte mit dem Triple stage Quadrupole Massen- spektrometer TSQ 7000 (Finnigan MAT, ThermoQuest, Austin, Texas, USA), das direkt mit dem Gaschromatographen Trace 2000 (ThermoQuest) gekoppelt ist. Die Probenaufgabe (1 [l) erfolgte im splitless-Modus mittels Autosampler (AS 2000, ThermoQuest). Zur gaschromatographischen Trennung wurde eine Optima-17 Kapillarsäule (30 m x 0,25 mm ID; 0,25 [m Filmdicke) von Macherey-Nagel (Düren, Deutschland) eingesetzt. Als Trägergas wurde Helium bei einem konstanten Fluss von 1,5 ml/min verwendet. Das folgende Ofen-Temperaturprogramm wurde verwendet: Temperierung für 2 min bei 90 °C, gefolgt von einer Steigerung der Temperatur in Stufen von 25 °C/min bis auf einen Wert von 340 °C, diese Temperatur wurde für eine Minute gehalten. Die Temperaturen von Interface und Injektor betrugen je 280 °C und die der Ionenquelle 180 °C. Für die quantitative massen-spektrometrische Bestimmung von 3-Nitrotyrosin wurde der MS/MS-Modus

(29)

unter NICI-Bedingungen (Messung negativer Ionen bei chemischer Ionisation) gewählt. Als Reaktandgas diente Methan bei einem Druck von 533 Pa. Argon wurde als Kollisionsgas im zweiten Quadrupol bei einem Druck von 0,27 Pa eingesetzt. Die Kollisionsenergie betrug 6 eV, die Elektronenenergie 200 eV und der Elektronen- strom 400 [A. Zur Detektion der Ionen wurde jeweils eine Spannung von 2000 - 3000 V am Sekundär-Elektronen-Multiplier angelegt. Die quantitative Bestimmung erfolgte durch „selected-reaction monitoring“ (SRM) des Massenübergangs von m/z 396 nach m/z 379 für das n-Propyl/PFP/TMS-Derivat des endogenen 3-Nitrotyrosin bzw. des Massenübergangs von m/z 399 nach m/z 382 für das Derivat von 3-Nitro- L-[²H3]tyrosin (interner Standard).

Abb. 5: Schematisches Diagramm der analytischen Methode zur Bestimmung von freiem 3-Nitrotyrosin (NTfrei, links) und 3-Nitrotyrosin-Resten in Plasmaproteinen (NTProt, rechts) in menschlichem Plasma mittels GC-tandem MS.

[SPE, solid-phase extraction; HPLC, high-pressure liquid chromatography]

HPLC

GC-tandem MS SPE

PLASMA

Ultrafiltration

Ultrafiltration Proteinverdau

HPLC

GC-tandem MS SPE Ultrafiltrat

Proteinkonzentrat

Hydrolysat

Derivatisierung

+ Interner Standard

+ Pronase

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2.3.2 Bestimmung von 3-Nitrotyrosin als Aminosäure in Proteinen [91]

Die analytische Methode zur quantitativen Bestimmung von proteinassoziiertem 3-Nitrotyrosin (NTProt) entspricht grundsätzlich der in Kapitel 2.3.1 beschriebenen Methode für das freie 3-Nitrotyrosin (s. Abb. 5). Im Gegensatz zu dieser Methode wurde hier jedoch das aus Plasma durch Ultrafiltration gewonnene Proteinkonzentrat verwendet.

Das Proteinkonzentrat wurde mit Puffer B (50 mM Kaliumdihydrogenphosphat, 1,5 M Kaliumchlorid, pH 7,0) aus praktischen Gründen auf ein Volumen von 2,5 ml aufgefüllt (die Markierung auf den Ultrafiltrationskartuschen für das maximale Füll- volumen entspricht 2,5 ml). Dabei wurde zuerst auf jede Probe 6 mg Pronase E (Roche GmbH, Mannheim) gegeben. Diese war jeweils frisch in Puffer B in einer Konzentration von 6 mg/ml angesetzt worden. Im Anschluss wurde das Protein- konzentrat mit pronasefreiem Puffer B auf ein Volumen von 2,5 ml aufgefüllt. Von den 2,5 ml wurde jeweils 1 ml für 20 Stunden bei einer Reaktionstemperatur von 37 °C inkubiert. Nach Beendigung der enzymatischen Hydrolyse wurden die Proben mit 10 pmol 3-Nitro-L-[²H3]tyrosin als internen Standard versetzt und erneut unter gleichen Bedingungen wie für das freie 3-Nitrotyrosin ultrafiltriert. Alle nun anschließenden Schritte (HPLC, SPE, Derivatisierung und GC-tandem MS-Analyse) entsprechen dem Verfahren für das freie 3-Nitrotyrosin (s. Kapitel 2.3.1).

Abb. 6 (s. S. 24) zeigt das GC-tandem MS Massenspektrum des n-Propyl/PFP/TMS- Derivates von endogenem proteinassoziierten 3-Nitrotyrosin [91].

Das proteinassoziierte 3-Nitrotyrosin wird auf das im Ultrafiltrat bestimmte Tyrosin bezogen, die Einheit wird folglich in nmol/mmol Tyrosin angegeben (s. Kapitel 2.3.4).

Das gewonnene Ultrafiltrat wurde neben der Bestimmung von proteinassoziiertem 3-Nitrotyrosin auch zur Bestimmung von Tyrosin, Phenylalanin und des Tyrosin/Phenylalanin-Verhältnisses verwendet (s. Kapitel 2.3.4).

(31)

2.3.3 Messung von proteinassoziiertem 3-NT im Plasma einer gesunden Vergleichsgruppe

Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde das Plasma von je 7 gesunden Männern und Frauen (Alter ± STABW, 36,3 ± 12,4 Jahre) entsprechend der Beschreibung in Kapitel 2.3.1 bzw. 2.3.2 auf das proteinassoziierte 3-NT untersucht (s. Tabelle 3).

Mittelwert (MW) und Standardfehler (SE) betragen 13,1 ± 1,78 nmol/mmol Tyrosin.

Diese Werte wurden für spätere Vergleiche mit gemessenen Werten der Transplantierten herangezogen.

Tabelle 3: Messung von proteinassoziiertem 3-NT im Plasma einer Vergleichsgruppe aus gesunden Probanden

NTProt Tyrosin NTProt

[nmol] [mmol] [nmol/mmol Tyrosin]

D. S. m 39 83,6 7,6 11,0

D. T. m 44 31,9 7,5 4,3

J. H. w 25 125,5 7,6 16,5

I. S. w 30 135,8 7,2 18,9

A. M. w 32 76,2 7,2 10,6

F. G. m 41 65,6 7 9,4

J. F. m 63 87,8 7,3 12,0

J. S. m 33 80,7 7,9 10,2

V. P. w 26 132,4 7,2 18,4

M. R. w 32 213,1 7,1 30,0

B. B. m 27 77,7 7,4 10,5

S. S. w 31 74,3 7,1 10,5

I. R. w 24 29,4 7,6 3,9

P. R. m 61 122,5 7,3 16,8

Alter Geschlecht

Probanden

(32)

Abb. 6: GC-tandem MS Massenspektrum (obere Abbildung) des n-Propyl/PFP/TMS- Derivates von endogenem proteinassoziiertem 3-Nitrotyrosin (untere Abbildung, Peak bei 10,02 min), welches durch Kollisions-induzierte Dissoziation des Vorläuferions mit m/z 396 ([P]_, [M-TMSOH]_) mit Argon als Kollisionsgas (2 mTorr) bei einer Kollisionsenergie von 6 eV gewonnen wurde. PFP, Pentafluoropropionyl; TMS, Trimethylsilyl, TMSOH, Trimethylsilanol.

50 100 150 200 250 300 350 400

m/z 0

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

RelativeAbundance(%)

379

396 261

7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0

Zeit (min) 0

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

RelativeAbundance(%)

RT: 10.02

endogenes NO

₂

Tyr

[P–OH]^-

[n-propyl-CO₂-CH=N-PFP]^-

[P]^-

(33)

2.3.4 Bestimmung der Tyrosin- und Phenylalanin-Konzentration und des Tyrosin/ Phenylalanin-Verhältnisses in der Plasmaprotein-Fraktion Die Bestimmung des Tyrosingehaltes in den Ultrafiltraten der Proteinfraktion erfolgte mittels der Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS). Zunächst wurde ein 10 [l Aliquot des Ultrafiltrats mit 990 [l einer 20 [M d4-L-Tyrosin-Lösung (Sigma Aldrich, Steinheim) verdünnt, so dass die Menge des internen Standards in etwa 20 nmol betrug. 100 [l davon wurden mit 400 [l Aceton und 10 [l Pentafluorobenzyl- Bromid (PFB-Bromid, Sigma Aldrich, Steinheim) versetzt und für eine Stunde bei 60 °C inkubiert (Alkylierung mit PFB-Bromid). Nach der Reaktion wurde das Aceton unter Stickstoff abgeblasen und die Probe nach Zugabe von 1 ml Toluol für 1 Minute gevortext. Im Anschluss erfolgte eine Zentrifugation der Proben für 5 Minuten bei 4000 U/min (1500 g). Die Toluolphase wurde in ein Autosampler-Gefäß überführt und mit 50 [lN,O-bis(Trimethylsilyl)trifluoroacetamid (BSTFA, Pierce, USA) versetzt.

Nach der Veretherung mit BSTFA bei Raumtemperatur folgte die GC-MS-Analyse.

Diese wurde mittels eines Massenspektrometers MS 5989A (Hewlett Packard) gekoppelt mit einem Gaschromatographen 5890 II GC und einem Autosampler Modell 7673 (Hewlett-Packard, Waldbronn, Deutschland) durchgeführt. Die gaschromatographische Auftrennung erfolgte mittels einer Silica-Kapillarsäule (Optima 17, 15m x 0,25 mm I.D., 0,25 [m Filmdicke, Macherey-Nagel, Düren). Dazu wurden Aliquots von 0,5 [l der abgenommenen Toluolphase injiziert. Das folgende Ofen-Temperaturprogramm wurde gewählt: Temperierung für die Dauer von 1 min bei 90 °C, gefolgt von einer Steigerung der Temperatur in Stufen von 20 °C/min bis auf einen Wert von 300 °C und einer weiteren Steigerung von 5 °C/min auf 340 °C.

Als Trägergas wurde Helium bei einem Druck von 40 kPa verwendet. Als Reaktandgas für NICI (negative-ion chemical ionisation) diente Methan bei einem Druck von 200 Pa. Die Elektronenenergie betrug 200 eV und der Emissionsstrom 400 [A. Es wurden konstante Temperaturen von 180 °C, 260 °C, 120 °C und 200 °C für Ionenquelle, Interface, Quadrupol bzw. Injector eingestellt. Im SIM-Modus (selected- ion monitoring) erfolgte die Quantifizierung des endogenen Tyrosins bei m/z 432, des internen Standards (d4-L-Tyrosin) bei m/z 436 und die des Phenylalanins bei m/z 344. Das Tyrosin/Phenylalanin-Verhältnis für Plasmaproteine wurde durch Division der gemessenen Konzentrationen berechnet und diente als Kontrollgröße einer optimalen enzymatischen Verdauung der Plasmaproteine (Der Quotient liegt ungefähr bei 0,6; Albumin als Hauptprotein im Plasma vorausgesetzt).

(34)

2.3.5 Bestimmung von Nitrit und Nitrat im Plasma [92]

Zur Bestimmung von Nitrit und Nitrat im Plasma wurde jeweils ein Probenvolumen von 100 [l eingesetzt, welchem [¹⁵N]Nitrit bzw. [¹⁵N]Nitrat als interner Standard zugegeben wurde. Die Konzentration des internen Standards in den Proben betrug 8 [M für Nitrit bzw. 80 [M für Nitrat. Auf 100 [l Probenvolumen wurde 400 [l Aceton und 10 [l PFB-Bromid gegeben. Zur Bildung der Nitrat- und Nitrit-PFB-Derivate wurden die Proben 1 Stunde bzw. 5 Minuten bei 50 °C inkubiert. Nach der Reaktion wurde das Aceton unter Stickstoff abgedampft. Die Proben wurden dann mit 1000 [l Toluol versetzt und für eine Minute gevortext. Zur Phasenbildung folgte eine Zentrifugation für 5 Minuten bei 4000 U/min (1500 g). Die obere Toluolphase wurde in ein sauberes Autosampler-Gefäß überführt und zur GC-MS-Messung bereitgestellt.

Für die GC-MS-Analyse fand das gleiche GC-MS-System wie zur Tyrosin- bestimmung Verwendung (s. Kapitel 2.3.4). Variiert wurde hierbei das Ofen- Temperaturprogramm, das sowohl für die Nitrat- als auch für die Nitrit-Proben verwendet wurde. Die Optima-17 Kapillarsäule wurde 1 Minute bei 70 °C gehalten und die Temperatur dann mit einer Rate von 30 °C/min auf eine Endtemperatur von 280 °C erhöht. Helium diente bei einem konstanten Druck von 40 kPa als Trägergas.

Als Reaktandgas wurde Methan bei einem Druck von 200 Pa in der NICI eingesetzt.

Die Temperaturen für Injektor, Interface, Quadrupol und Ionenquelle betrugen 200 °C, 260 °C, 120 °C, bzw. 180 °C. Es wurde eine Elektronenenergie von 230 eV bei einem Elektronenstrom von 300 [A gewählt. Unter diesen GC-Bedingungen stellte sich eine Retentionszeit der PFB-Derivate des endogenen Nitrates und des dazugehörigen ¹⁵N-Standards von 2,73 min ein. Die Retentionszeit der PFB-Derivate des endogenen Nitrits und des ¹⁵N-Nitrits lag bei 2,9 min. Die quantitativen Bestimmungen erfolgten im SIM-Modus. Dazu wurden die Ionen m/z 62 für das endogene Nitrat und m/z 63 für das ¹⁵N-Nitrat gemessen. Die Nitritbestimmung erfolgte durch Messung der Ionen m/z 46 für das endogene Nitrit und m/z 47 für

15N-Nitrit.

Zu jeder Bestimmung von Patientenproben wurden Qualitätskontrollen angefertigt, die eine hohe Reproduzierbarkeit (Präzision) und Richtigkeit (Accuracy) der Messmethode belegen (s. Anhang, Kapitel 7.3).

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2.3.6 Bestimmung von L-Arginin und ADMA im Plasma [93]

Die Bestimmung der Plasmakonzentration von L-Arginin und asymmetrischem Dimethylarginin (ADMA) erfolgte mittels HPLC und einer Vorsäulen-Derivatisierung mit o-Phthaldialdehyd (OPA, Sigma, München).

Zuerst wurden 500 [l Plasma mit 50 [l einer 0,1 mM Homoarginin-Lösung versetzt, mit 500 [l Ampuwa-Wasser verdünnt und zentrifugiert. Neben den Plasmaproben wurde ein Standardgemisch mitgeführt, das neben 10 [M Homoarginin 25 [M L-Arginin und 1 [M ADMA enthielt. Vor der HPLC-Analyse wurden die Proben und der Standard auf CBA-Festphasen-Extraktions-Säulen (Varian Bond Elut CBA, 500 mg, 3 ml, USA) aufgereinigt. Nach dem Konditionieren der Säulen mit je 3 ml Methanol (Mallinckrodt-Baker, Griesheim) und 3 ml Ampuwa wurde ein Proben- bzw.

Standardvolumen von 1000 [l aufgetragen, die Säulen getrocknet, zweimal mit je 3 ml Ampuwa gewaschen und erneut getrocknet. Schließlich wurde jede Probe mit 1000 [l 1 M Ameisensäure (Merck, Darmstadt) eluiert, zentrifugiert und über Nacht (12 Stunden) bei 4 °C in der Speedvac (Savant SC 100, USA) zur Trockene eingeengt. Die Trockenrückstände wurden mit je 120 [l Ampuwa aufgenommen, zentrifugiert und in HPLC-Fläschen überführt.

Die HPLC-Analyse baute sich durch folgende Systemkomponenten auf:

Gradientenpumpe (Gynkotek M 480), automatischer Injektor (Gynkotek Injection Automat 160), Fluoreszenz-detektor (Gynkotek RF 1002) und Autosampler (Gynkotek GINA). Die Integration und Auswertung der injizierten Proben erfolgte computergestützt durch eine Software der Firma Gynkotek (Gynkosoft). Als stationäre Phase diente eine ET-Trennsäule (250 x 4 mm I.D.) gefüllt mit Nucleosil 100-7 C6H5 (7 [m Korngröße, Macherey-Nagel, Düren). Die mobile Phase bestand aus 0,96 %-iger Zitronensäure (Merck, Darmstadt)/ Methanol, 67/33 (v/v), pH 6,8.

Vor und nach jeder Messreihe wurde die Säule mit einer 90 %-igen Methanol-Lösung gewaschen. Die Flussrate beider Eluenten betrug 1 ml/min. Von den 120 [l Proben- und Standardvolumen wurden vor der automatischen Injektion 20 [l mit 100 [l OPA- Reagenz (5,4 mg/ml o-Phthaldialdehyd in 0,4 M Boratpuffer (Merck), pH 8,5/

Methanol, v/v, 90/10, 100 [l 2-Mercaptoethanol (Aldrich, Steinheim)) für 20 s derivatisiert. Das Injektionsvolumen betrug 5 [l und der Fluoreszenzdetektor wurde auf _ex= 342 nm und _em= 453 nm eingestellt.

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2.3.7 Bestimmung von 8-iso-Prostaglandin F2Gim Urin [94]

Bevor das 8-iso-Prostaglandin F2C (8-iso-PGF2C) mittels GC-tandem MS analysiert werden konnte, war zunächst eine Aufarbeitung der Urine mit sogenannten Immunoaffinitätssäulen (IAC) erforderlich. Hierbei fanden 4 ml 8-isoprostane IAC- Säulen der Firma Cayman (Ann Arbor, Michigan, USA) Verwendung, durch die das 8-iso-PGF2C immunologisch selektiv gebunden und so aus dem Urin isoliert werden konnte. Auf die Säulen wurde eine Urinmenge von 5 ml gegeben, der zuvor als interner Standard [3,3’,4,4’-²H4]-8-iso-Prostaglandin F2C (d4-8-iso-PGF2C) (Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA) mit einer Endkonzentration von 1 ng/ml zugefügt worden war. Nachdem der Urin durchgelaufen war, wurde die Säule mit 2 ml 0,1 M Phosphatlösung (13,3 g/l K2HPO4, 3,22 g/l KH2PO4, 29,2 g/l NaCl) und mit 2 ml Ampuwa gewaschen. Im Anschluss wurden mit 2 ml Ethanol/Wasser (v/v, 95/5) das 8-iso-PGF2C und der interne Standard von den Säulen eluiert und das Eluat bis zur Trockene unter Stickstoff eingeengt. Der Rückstand wurde mit 10 [l Methanol, 100 [l Acetonitril, 10 [l N-Ethyldiisopropylamin (Sigma, Deutschand) und 10 [l PFB-Bromid (33 %-ig in Acetonitril) aufgenommen und für eine Stunde bei 30 °C inkubiert. Nach erneuter Trocknung der Proben unter Stickstoff erfolgte eine letzte Derivatisierung mit 50 [l BSTFA für 1 Stunde bei 60 °C.

Es folgte die GC-tandem MS-Analyse. Gaschromatograph, Massenspektrometer und Autosampler sowie Kapillarsäule waren dieselben wie zur Bestimmung für das 3-Nitrotyrosin (s. Kapitel 2.3.1). Als Trägergas wurde ebenso Helium jedoch mit einem konstanten Fluss von 1 ml/min eingesetzt. Das Ofen-Temperaturprogramm gestaltete sich wie folgt: Temperierung bei 80 °C für 2,5 min, danach Erhöhung der Temperatur um 8° C/min auf 320 °C mit anschließendem Halten dieser Temperatur für 4 min. Unter diesen Bedingungen betrug die Retentionszeit 28,23 min für das 8-iso-PGF2C und 28,16 min für das d4-8-iso-PGF2C. Die quantitativen massen- spektrometrischen Bestimmungen wurden ebenfalls im SRM-Modus unter NICI- Bedingungen durchgeführt. Methan fand als Reaktandgas bei einem Druck von 533 Pa und Argon als Kollisionsgas im zweiten Quadrupol mit einem Druck von 0,27 Pa Verwendung. Die Kollisionsenergie betrug 25 eV, die Elektronenenergie 200 eV und der Elektronenstrom 400 [A. Die quantitatve Bestimmung erfolgte im SRM-Modus. Hierbei wurden die Produktionen von m/z 299 für das endogene 8-iso-PGF2C und von m/z 303 für das d4-8-iso-PGF2C gemessen, die aus den