Analytische Methoden

2.3.1 Bestimmung von 3-Nitrotyrosin als freie Aminosäure [90]

Zur GC-tandem MS-Analyse vom freien 3-Nitrotyrosin (NTfrei) wurde aus 1 ml Plasma ein Ultrafiltrat gewonnen (s. Abb. 5). Dazu wurden Centrisart-I-Ultrafiltrations-kartuschen verwendet (20 kD cut-off, 4 [m Porengröße, 2,5 ml, Sartorius, Göttingen).

Die Proben wurden bei 20 °C zunächst für 5 min mit 2800 U/min und dann für 1 h mit 4000 U/min zentrifugiert (RC5C, Sorvall^® Instruments, Du Pont, Newtown, Conneticut). Hierbei konnte etwa 700 [l Ultrafiltrat gewonnen werden. Vor der Ultrafiltration wurden einer Menge von 1 ml Plasma 6 pmol synthetisiertes 3-Nitro-L-[²H3]tyrosin [90] als interner Standard zugegeben.

Um das 3-Nitrotyrosin vor der Derivatisierung von Nitrit, Nitrat und Tyrosin zu trennen, wurde die Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC, high-pressure liquid chromatography) verwendet. Das HPLC-System setzte sich wie folgt zusammen: Pumpe (HPLC Pump 2248, Pharmacia, Schweden), UV-vis-Detektor (Spectroflow 783, Kratos Analytical, Ramsey, NJ) und Integrator (C-R6A Chromatopac, Shimadzu, Japan). Als stationäre Phase diente eine EC 125/3 Trennsäule der Dimension 150 x 3 mm ID gefüllt mit Nucleosil 120/3 C18 (Octadecylsilica, 3 [m Korngröße, Macherey-Nagel, Düren). Die mobile Phase bestand aus 70 mM Kaliumphospat-Puffer/Methanol, 92/8 (v/v), pH 2,5. Die Flussrate betrug 0,5 ml/min und die Detektion von 3-Nitrotyrosin erfolgte bei 276 nm. Vor jeder Serie von Analysen wurde die Retentionszeit von 3-Nitrotyrosin bestimmt. Um eine Kontamination der Proben durch exogenes 3-Nitrotyrosin zu vermeiden, wurde p-Nitrophenylalanin (Sigma, Deisenhofen, Deutschland) injiziert, dessen Retentions-zeit unter den gewählten Bedingungen mit der von 3-Nitrotyrosin nahezu identisch war und ebenso bei 276 nm detektiert werden kann. Die ermittelte Retentionszeit betrug 7,6 ± 0,2 min (Mittelwert ± STABW, n = 8). Für die Trennung mittels HPLC wurde ein 200 [l-Aliquot des Ultrafiltrats injiziert und ein Eluat von ca. 1 ml um die Retentionszeit von p-Nitrophenylalanin gesammelt.

Im Anschluss an die HPLC erfolgte eine Festphasenextraktion vom 3-Nitrotyrosin aus dem Eluat (SPE, solid-phase extraction). Dafür wurden Chromabond HR-P SPE-Kartuschen (100 mg, 1 ml, Macherey-Nagel, Düren) verwendet. Diese wurden vor

dem Auftragen der HPLC-Fraktion wie folgt konditioniert: 5 ml Methanol, 5 ml Methanol/ 0,5 %-ige wässrige Ammoniak-Lösung, 90/10 (v/v), und 5 ml Wasser (Ampuwa ®, Fresenius, Bad Homburg). Anschließend wurden die HPLC-Fraktionen aufgegeben, mit 5 ml 0,3 mM Salzsäure gewaschen und kurz mit Luft getrocknet. Zur Elution wurden 2 ml Methanol/0,5 %-ige wässrige Ammoniaklösung, 90/10 (v/v) verwendet. Die Eluate wurden unmittelbar darauf durch Eindampfen mit Stickstoff getrocknet und der Rückstand schließlich für die massenspektrometrische Analyse derivatisiert.

Zuerst wurden die zur Trockene eingeengten Proben in 100 [l einer 3 M HCl-Lösung in Propanol aufgenommen, in ein silanisiertes Gefäß überführt und für 1 Stunde bei 65 °C erhitzt (Veresterung mit propanolischer HCl). Nach Eindampfen mit Stickstoff wurden die Proben mit 100 [l Pentafluoropropionsäureanhydrid (PFPA) (Pierce, Rockford, IL, USA) in Ethylacetat (1:4, v/v) versetzt und für 30 Minuten bei 65 °C erhitzt (Amidierung mit PFPA). Nach erneutem Abdampfen mit Stickstoff wurde der Rückstand der Proben mit 200 [l H2O und 500 [l Ethylacetat versetzt. Die Proben wurden 1 Minute geschüttelt, und nach Zentrifugation die Ethylacetatphase in ein weiteres silanisiertes Gefäß überführt und mit Stickstoff eingedampft (Extraktion mit Ethylacetat). Als letzter Derivatisierungsschritt folgte die Veretherung mit 50 [l N,O-bis(Trimethylsilyl)trifluoroacetamid (BSTFA, Pierce, IL, USA) für 60 Minuten bei 60 °C.

Die GC-tandem MS-Analyse erfolgte mit dem Triple stage Quadrupole Massen-spektrometer TSQ 7000 (Finnigan MAT, ThermoQuest, Austin, Texas, USA), das direkt mit dem Gaschromatographen Trace 2000 (ThermoQuest) gekoppelt ist. Die Probenaufgabe (1 [l) erfolgte im splitless-Modus mittels Autosampler (AS 2000, ThermoQuest). Zur gaschromatographischen Trennung wurde eine Optima-17 Kapillarsäule (30 m x 0,25 mm ID; 0,25 [m Filmdicke) von Macherey-Nagel (Düren, Deutschland) eingesetzt. Als Trägergas wurde Helium bei einem konstanten Fluss von 1,5 ml/min verwendet. Das folgende Ofen-Temperaturprogramm wurde verwendet: Temperierung für 2 min bei 90 °C, gefolgt von einer Steigerung der Temperatur in Stufen von 25 °C/min bis auf einen Wert von 340 °C, diese Temperatur wurde für eine Minute gehalten. Die Temperaturen von Interface und Injektor betrugen je 280 °C und die der Ionenquelle 180 °C. Für die quantitative massen-spektrometrische Bestimmung von 3-Nitrotyrosin wurde der MS/MS-Modus

unter NICI-Bedingungen (Messung negativer Ionen bei chemischer Ionisation) gewählt. Als Reaktandgas diente Methan bei einem Druck von 533 Pa. Argon wurde als Kollisionsgas im zweiten Quadrupol bei einem Druck von 0,27 Pa eingesetzt. Die Kollisionsenergie betrug 6 eV, die Elektronenenergie 200 eV und der Elektronen-strom 400 [A. Zur Detektion der Ionen wurde jeweils eine Spannung von 2000 3000 V am Sekundär-Elektronen-Multiplier angelegt. Die quantitative Bestimmung erfolgte durch „selected-reaction monitoring“ (SRM) des Massenübergangs von m/z 396 nach m/z 379 für das n-Propyl/PFP/TMS-Derivat des endogenen 3-Nitrotyrosin bzw. des Massenübergangs von m/z 399 nach m/z 382 für das Derivat von 3-Nitro-L-[²H3]tyrosin (interner Standard).

Abb. 5: Schematisches Diagramm der analytischen Methode zur Bestimmung von freiem 3-Nitrotyrosin (NTfrei, links) und 3-Nitrotyrosin-Resten in Plasmaproteinen (NTProt, rechts) in menschlichem Plasma mittels GC-tandem MS.

[SPE, solid-phase extraction; HPLC, high-pressure liquid chromatography]

HPLC

GC-tandem MS SPE

PLASMA

Ultrafiltration

Ultrafiltration Proteinverdau

HPLC

GC-tandem MS SPE Ultrafiltrat

Proteinkonzentrat

Hydrolysat

Derivatisierung

+ Interner Standard

+ Pronase

2.3.2 Bestimmung von 3-Nitrotyrosin als Aminosäure in Proteinen [91]

Die analytische Methode zur quantitativen Bestimmung von proteinassoziiertem 3-Nitrotyrosin (NTProt) entspricht grundsätzlich der in Kapitel 2.3.1 beschriebenen Methode für das freie 3-Nitrotyrosin (s. Abb. 5). Im Gegensatz zu dieser Methode wurde hier jedoch das aus Plasma durch Ultrafiltration gewonnene Proteinkonzentrat verwendet.

Das Proteinkonzentrat wurde mit Puffer B (50 mM Kaliumdihydrogenphosphat, 1,5 M Kaliumchlorid, pH 7,0) aus praktischen Gründen auf ein Volumen von 2,5 ml aufgefüllt (die Markierung auf den Ultrafiltrationskartuschen für das maximale Füll-volumen entspricht 2,5 ml). Dabei wurde zuerst auf jede Probe 6 mg Pronase E (Roche GmbH, Mannheim) gegeben. Diese war jeweils frisch in Puffer B in einer Konzentration von 6 mg/ml angesetzt worden. Im Anschluss wurde das Protein-konzentrat mit pronasefreiem Puffer B auf ein Volumen von 2,5 ml aufgefüllt. Von den 2,5 ml wurde jeweils 1 ml für 20 Stunden bei einer Reaktionstemperatur von 37 °C inkubiert. Nach Beendigung der enzymatischen Hydrolyse wurden die Proben mit 10 pmol 3-Nitro-L-[²H3]tyrosin als internen Standard versetzt und erneut unter gleichen Bedingungen wie für das freie 3-Nitrotyrosin ultrafiltriert. Alle nun anschließenden Schritte (HPLC, SPE, Derivatisierung und GC-tandem MS-Analyse) entsprechen dem Verfahren für das freie 3-Nitrotyrosin (s. Kapitel 2.3.1).

Abb. 6 (s. S. 24) zeigt das GC-tandem MS Massenspektrum des n-Propyl/PFP/TMS-Derivates von endogenem proteinassoziierten 3-Nitrotyrosin [91].

Das proteinassoziierte 3-Nitrotyrosin wird auf das im Ultrafiltrat bestimmte Tyrosin bezogen, die Einheit wird folglich in nmol/mmol Tyrosin angegeben (s. Kapitel 2.3.4).

Das gewonnene Ultrafiltrat wurde neben der Bestimmung von proteinassoziiertem 3-Nitrotyrosin auch zur Bestimmung von Tyrosin, Phenylalanin und des Tyrosin/Phenylalanin-Verhältnisses verwendet (s. Kapitel 2.3.4).

2.3.3 Messung von proteinassoziiertem 3-NT im Plasma einer gesunden Vergleichsgruppe

Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde das Plasma von je 7 gesunden Männern und Frauen (Alter ± STABW, 36,3 ± 12,4 Jahre) entsprechend der Beschreibung in Kapitel 2.3.1 bzw. 2.3.2 auf das proteinassoziierte 3-NT untersucht (s. Tabelle 3).

Mittelwert (MW) und Standardfehler (SE) betragen 13,1 ± 1,78 nmol/mmol Tyrosin.

Diese Werte wurden für spätere Vergleiche mit gemessenen Werten der Transplantierten herangezogen.

Tabelle 3: Messung von proteinassoziiertem 3-NT im Plasma einer Vergleichsgruppe aus gesunden Probanden

NTProt Tyrosin NTProt

[nmol] [mmol] [nmol/mmol Tyrosin]

D. S. m 39 83,6 7,6 11,0

D. T. m 44 31,9 7,5 4,3

J. H. w 25 125,5 7,6 16,5

I. S. w 30 135,8 7,2 18,9

A. M. w 32 76,2 7,2 10,6

F. G. m 41 65,6 7 9,4

J. F. m 63 87,8 7,3 12,0

J. S. m 33 80,7 7,9 10,2

V. P. w 26 132,4 7,2 18,4

M. R. w 32 213,1 7,1 30,0

B. B. m 27 77,7 7,4 10,5

S. S. w 31 74,3 7,1 10,5

I. R. w 24 29,4 7,6 3,9

P. R. m 61 122,5 7,3 16,8

Alter Geschlecht

Probanden

Abb. 6: GC-tandem MS Massenspektrum (obere Abbildung) des n-Propyl/PFP/TMS-Derivates von endogenem proteinassoziiertem 3-Nitrotyrosin (untere Abbildung, Peak bei 10,02 min), welches durch Kollisions-induzierte Dissoziation des Vorläuferions mit m/z 396 ([P]_, [M-TMSOH]_) mit Argon als Kollisionsgas (2 mTorr) bei einer Kollisionsenergie von 6 eV gewonnen wurde. PFP, Pentafluoropropionyl; TMS, Trimethylsilyl, TMSOH, Trimethylsilanol.