Medizinische Hochschule Hannover
Aus der Kinderklinik der Medizinischen Hochschule Hannover in Kooperation mit dem
Institut für Klinische Pharmakologie
Prof. Dr. med. Thomas Lücke
Der L-Arginin/Stickstoffmonoxid-Stoffwechselweg bei Frühgeborenen
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin an der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Anna Buck
geboren in Tscheljabinsk (Russland) Hannover 2012
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 29.01.2013.
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident/Präsidentin: Prof. Dr. med. Dieter Bitter-Suermann Betreuer der Arbeit: Prof. Dr. med. Thomas Lücke
Referent/Referentin: Prof. Dr. med. Dorothee Viemann Korreferent: Prof. Dr. med. Jan Kielstein
Tag der mündlichen Prüfung: 29.01.2013 Prüfungsausschussmitglieder:
Prof. Dr. med. Constantin von Kaisenberg PD Dr. Vivien Schacht-Stahlbock
PD Dr. Hossein Tezval
Abkürzungsverzeichnis
A. Arteria
ADMA Asymmetrisches Dimethylarginin
ANS Atemnotsyndrom
bds. beidseits
BE base excess
BGA Blutgasanalyse
BH4 Tetrahydrobiopterin
CAD collision activated dissociation
CAT cationic amino acid transporter
CD3OD deuteriertes Methanol
CF6 Coupling factor 6
cGMP cyclisches Guanosinmonophosphat
CH3OH Methanol
CPAP Continuous Positive Air Pressure
DDAH Dimethylarginin-Dimethylaminohydrolase
DLB Druckluftbrille
DMA Dimethylamin
EDTA Ethylendiamintetraacetat
ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
eNOS endothelial konstitutive NO-Synthetase
eutr. eutrophes
FAD Flavin-Adenosin-Dinukleotid
FG Frühgeborene
FMN Flavin-Mononukleotid
FN Frühchennahrung
FSGS Fokal segmentale Glomerulosklerose
GC-MS Gaschromatographie-Massenspektrometrie
GC-MS/MS Gaschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie
GOP Glutamat-Oxalacetat-Transaminase
GPT Glutamat-Pyruvat-Transaminase
Hb Hämoglobin
Hk Hämatokrit
HPLC High Performance Liquid Chromatography
hypotr. hypotrophes
iNOS induzierbare NO-Synthetase
IVH intraventrikuläre Hämorrhagie
KG Körpergröße
KH Kohlenhydrate
KHK Koronare Herzerkrankung
LDL Low Density Lipoprotein
LPS Lipopolysaccharide
M. Morbus
macNOS in Makrophagen exprimierte NO-Synthetase
MAD mittlerer arterieller Druck
MCH mean corpuscular haemoglobin
MCHC mean corpuscular haemoglobin concentration
MCV mean cell volume
MM Muttermilch
NADPH Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat
n.b. nicht bestimmt
NEC nekrotisierende Enterokolitis
NICI negative-ion chemical ionisation
NMMA N-Monomethyl-L-Arginin
NO Stickstoffmonoxid
NO2 Nitrit
NO3 Nitrat
NOS NO- Synthetase
nNOS neuronal konstitutive NO-Synthetase
pAVK periphere arterielle Verschlusskrankheit
pCO2 Partialdruck von Kohlenstoffdioxid
PDA persistierender Ductus arteriosus
PEEP positiver endexpiratorischer Druck
PFAA Pentafluoropropionsäureanhydrid
PFO persistierendes Foramen ovale
pO2 Partialdruck von Sauerstoff
PPHN persistierende pulmonale Hypertonie
PRMT Protein-Arginin-Methyltransferasen
RAAS Renin-Angiotensin-Aldosteron-System
RDW red cell distribution width
resp. respiratorisch
RSD Relative Standard Deviation
SDMA symmetrisches Dimethylarginin
SIOD Schimke immunoossäre Dysplasie
SpO2 Sauerstoffsättigung
SSW Schwangerschaftswoche
TNF-! Tumornekrosefaktor-!
UPLC Ultra Performance Liquid Chromatography
VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
VSD Ventrikelseptumdefekt
i
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung……… 1
1.1 Bedeutung und Synthese von Stickstoffmonoxid………... 1
1.2 ADMA - ein endogener Inhibitor der NO-Synthese………….……….. 4
1.3 Synthese von ADMA………...…………... 8
1.4 Abbau von ADMA………...………... 9
1.5 Pathophysiologische Bedeutung der DDAH……….. 9
1.6 Der L-Arginin/NO-Stoffwechselweg im Kindesalter..………...……… 10
2. Patienten und Methodik………... 14
2.1 Studienkollektiv……….. 14
2.2 Ausschlusskriterien………. 15
2.3 Studienablauf………... 16
2.3.1 Aufklärung und gesetzliche Regelung……….. 16
2.3.2 Gewinnung der Proben und Erhebung der Patientendaten………... 16
2.4 Analytische Methoden……… 17
2.4.1 Messung von ADMA im Plasma und Urin..……… 18
2.4.2 Messung von L-Arginin im Plasma……….……… 19
2.4.3 Messung von Nitrat und Nitrit im Plasma….………….…………. 19
2.4.4 Messung von Nitrat und Nitrit im Urin.….…..……… 20
2.4.5 Messung von Dimethylamin im Urin…....……….. 20
2.4.6 Messung von Kreatinin im Urin……….. 21
2.5 Statistik………... 21
3. Ergebnisse……….. 23
3.1 Parameter bezogen auf das Gesamtkollektiv ...…. 24
3.1.1 ADMA im Plasma bei Frühgeborenen ……….…………. 24
3.1.2 ADMA im Urin bei Frühgeborenen……….……….. 25
3.1.3 L-Arginin im Plasma bei Frühgeborenen ………... 26
3.1.4 Nitrit im Plasma bei Frühgeborenen……….…...……….. 27
3.1.5 Nitrat im Plasma bei Frühgeborenen ……….……… 28
3.1.6 Nitrit im Urin bei Frühgeborenen ………..……… 29
3.1.7 Nitrat im Urin bei Frühgeborenen ………..………... 30
ii
3.1.8 DMA im Urin bei Frühgeborenen ……….………..……….. 31
3.1.9 DMA/ADMA-Ratio im Urin bei Frühgeborenen……….…… 32
3.1.10 L-Arginin/ADMA-Ratio im Plasma bei Frühgeborenen.…….…… 33
3.2 Parameter im Alter von 23.-29. SSW und 30.-36. SSW im Vergleich… 35 3.2.1 ADMA im Plasma bei Frühgeborenen………... 35
3.2.2 ADMA im Urin bei Frühgeborenen………... 36
3.2.3 L-Arginin im Plasma bei Frühgeborenen………... 37
3.2.4 Nitrit im Plasma bei Frühgeborenen………... 38
3.2.5 Nitrat im Plasma bei Frühgeborenen………...……... 39
3.2.6 Nitrit im Urin bei Frühgeborenen………... 40
3.2.7 Nitrat im Urin bei Frühgeborenen………...………... 41
3.2.8 DMA im Urin bei Frühgeborenen……….…………. 42
3.2.9 DMA/ADMA-Ratio bei Frühgeborenen………...…….…... 43
3.2.10 L-Arginin/ADMA-Ratio bei Frühgeborenen……….……... 44
3.3 Parameter bezogen auf das Geschlecht………... 45
3.3.1 ADMA im Plasma bei Frühgeborenen………... 45
3.3.2 ADMA im Urin bei Frühgeborenen………... 46
3.3.3 L-Arginin im Plasma bei Frühgeborenen……….. 47
3.3.4 Nitrit im Plasma bei Frühgeborenen………...…... 48
3.3.5 Nitrat im Plasma bei Frühgeborenen………..…... 49
3.3.6 Nitrit im Urin bei Frühgeborenen………...……... 50
3.3.7 Nitrat im Urin bei Frühgeborenen………..……... 51
3.3.8 DMA im Urin bei Frühgeborenen………..……... 52
3.3.9 DMA/ADMA-Ratio im Urin bei Frühgeborenen...……...………... 53
3.3.10 L-Arginin/ADMA-Ratio bei Frühgeborenen………....…... 54
3.4 Sonstige Korrelationen……….………...….. 55
3.4.1 Korrelation zwischen L-Arginin und ADMA im Plasma (Gesamtkollektiv)……….………. 55
3.4.2 Korrelation zwischen ADMA im Plasma bzw. Urin sowie Nitrit und Nitrat im Plasma bzw. Urin………...…………. 56
4. Diskussion………. 57
4.1 Studienkollektiv und Abnahmezeitpunkt der Proben………. 59 4.2 L-Arginin/NO-Stoffwechselweg: Bestimmung der Normwerte
iii
für Frühgeborene………..……… 61
4.3 Indirekte DDAH-Aktivität bei Frühgeborenen………. 67
5. Zusammenfassung………. 69
6. Literatur…………..……… 71
7. Anhang……… 81
7.1 Patienteninformation……… 81
7.2 Einwilligungserklärung……… 83
7.3 Patientendokumentation……….. 85
7.4 Messwerte……… 87
7.4.1 Übersicht der gemessenen Werte des L-Arginin/NO-Stoffwechsel- weges bei Frühgeborenen.………..…………... 87
7.4.2 Statistische Übersicht der gemessenen Parameter des L-Arginin/NO-Stoffwechselweges bei Frühgeborenen..……… 92
7.5 Sonstige Patientendaten……… 93
7.5.1 Medikation zum Abnahmezeitpunkt………...…………... 93
7.5.2 Ernährung der Frühgeborenen zum Abnahmezeitpunkt……….…… 95
7.5.3 Postnatale Adaptationsstörungen/Erkrankungen der Frühgeborenen zum Abnahmezeitpunkt………..………… 99
8. Erklärung………..……… 103
9. Danksagung………...…… 104
10. Curriculum vitae………...… 105
Einleitung
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1
1. Einleitung
Asymmetrisches Dimethylarginin (ADMA) ist ein endogener Inhibitor der Stickstoffmonoxid-(NO)-Synthetase und ein etablierter kardiovaskulärer Risikofaktor bei Erwachsenen [Achan et al. 2003; Kielstein et al. 2004; Valkonen et al. 2003]. In Studien wurde gezeigt, dass die Plasmakonzentrationen von ADMA bei Säuglingen deutlich höher sind (708 + 162 nM) als bei Erwachsenen, und dass sie mit steigendem Alter bis zum 20. Lebensjahr zum Erwachsenenniveau sinken (380 + 130 nM) [Lücke et al. 2007]. Das Enzym Dimethylarginin-Dimethylaminohydrolase (DDAH) metabolisiert ADMA zu Dimethylamin (DMA) sowie L-Citrullin und ermöglicht seine renale Ausscheidung [Jacobi et al. 2005; Teerlink 2005]. Das Ziel unserer aktuellen Studie war es, den L-Arginin/NO-Stoffwechselweg im Frühgeborenenalter mit steigendem Gestationsalter zu beschreiben sowie Normwerte zu erstellen.
1.1 Bedeutung und Synthese von Stickstoffmonoxid
NO ist ein wichtiger intra- und interzellulärer Botenstoff mit hoher Reaktivität und Radikaleigenschaften [Heslop et al. 1976; Moncada et al. 1989; Vosper 1975].
Als endogenes Signalmolekül übt NO einen Einfluss auf die Blutdruckregulation aus.
Durch die NO-Freisetzung in der Gefäßwand werden der Tonus der glatten Gefäßmuskulatur sowie die Angiogenese beeinflusst [Moncada et al. 1988; Nakaki et al.
1990]. Zusätzlich hemmt NO die Adhäsion von Thrombozyten und Monozyten an die Gefäßwand [Cooke et al. 1997; Cooke 2005; Böger et al. 1996; Böger et al. 1997;
Moncada et al. 1991; Radomski et al. 1993; Schrör 1991; Schrör 1995]. NO ist zusätzlich enzymatisch an der oxidativen Modifikation der Lipoproteine beteiligt [Böger et al. 2000a; Hogg et al. 1993; Tsimikas et al. 2011].
Ferner wird auch die Signalübertragung nicht-adrenerger und nicht-cholinerger Nerven des peripheren Nervensystems durch NO moduliert [Moncada et al. 1991]. Im zentralen Nervensystem stellt NO einen wichtigen Neurotransmitter dar [Ignarro 1990; Moncada et al. 1995; Palmer 1993; Snyder et al. 1992]. Ebenso reguliert NO Funktionen des spezifischen und unspezifischen Immunsystems (Abb. 1) [Nussler et al. 1993].
Einleitung
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2 Abb. 1: Wirkungen von Stickstoffmonoxid (NO)
Die Biosynthese von NO erfolgt unter Beteiligung der NO-Synthetase (NOS) aus der Aminosäure L-Arginin [Marletta 1993]. Diese wird sowohl mit der Nahrung aufgenommen, als auch von dem Körper selbst durch den Harnstoffzyklus aus L- Citrullin gebildet (Abb. 4) [Gardner et al. 1998].
Beim Menschen werden je nach Zelltyp und Wirkung drei verschiedene NOS unterschieden: die induzierbare (iNOS bzw. Typ II), die neuronal konstitutive (nNOS bzw. Typ I) und die endothelial konstitutive (eNOS bzw. Typ III) Form. Die Aktivitäten der nNOS und eNOS werden ausschließlich über Calcium/Calmodulin (Calcium gebunden an Calmodulin) gesteuert. Im Gegensatz dazu ist die iNOS-Aktivität Calcium-unabhängig und wird durch Cytokine wie Interferone und Interleukine sowie Endotoxine wie Lipopolysaccharide (LPS) stimuliert [Busse et al. 1996].
Initial wurden die Isoenzyme nach ihren ursprünglichen Gewebearten benannt. Später konnte man diese jedoch auch in anderen Zellgruppierungen nachweisen. So kommt die nNOS sowohl im Skelettmuskel als auch in pulmonalen Epithelzellen vor [Nakane et al.
1993]. Die eNOS wurde außer im Endothel zusätzlich auch in Thrombozyten, Kardiomyozyten, renalen und pulmonalen Epithelzellen sowie in Nervenzellen nachgewiesen [Shaul et al. 1994; Stamler et al. 1992]. Die iNOS (Typ II), die im Rahmen immunologischer und inflammatorischer Prozesse akut exprimiert wird, ist überwiegend in Makrophagen zu finden und wird somit auch als macNOS bezeichnet
Einleitung
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3
[Irmanishi et al. 2004]. Überdies ist die iNOS aber auch in Epithelzellen, glatten Muskelzellen, Kardiomyozyten, Hepatozyten, mikrovaskulären Endothelzellen und mesangialen Zellen gefunden worden [Meyer et al. 1999; Darra et al. 2010].
Trotz unterschiedlicher Herkunft ist allen Isoformen gemeinsam, dass sie in einer zweistufigen Oxidationsreaktion die Aminosäure L-Arginin zu L-Citrullin und NO umsetzen. Die NO-Biosynthese wird durch den endogenen NOS-Inhibitor asymmetrisches Dimethylarginin (ADMA) gehemmt [Ignarro 1990; Moncada et al.
1991; Vallance et al. 1992].
Einleitung
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1.2 ADMA - ein endogener Inhibitor der NO-Synthese
ADMA ist ein im menschlichen Blut und Urin nachweisbarer, endogener Hemmstoff der Synthese von NO. ADMA und symmetrisches Dimethylarginin (SDMA) sowie N- Monomethyl-L-Arginin (NMMA) (Abb. 2) entstehen bei posttranslationeller Modifikation Arginin-haltiger Proteine [Rawal et al. 1995]. Im Gegensatz zu ADMA und NMMA bewirkt das Isomer SDMA keine Hemmung der NO-Synthese [Vallance et al. 1992; Böger et al. 2000b].
Abb. 2: Strukturformeln von L-Arginin, L-NMMA, ADMA und SDMA
Die pathophysiologische Bedeutung von ADMA resultiert aus der endogenen Inhibition der NO-Bildung. Erhöhte ADMA-Plasmakonzentrationen spielen im Erwachsenenalter eine wichtige Rolle bei der Entstehung und dem Fortschreiten von Gefäßerkrankungen - insbesondere der Arteriosklerose (Abb. 3) und stellen einen Marker für das kardiovaskuläre Risiko dar [Abbasi et al. 2001; Al Banchaabouchi et al. 2000; Altinova et al. 2007; Böger et al. 1997; Böger et al. 2000; Carlström et al. 2008; Eid et al. 2003;
Goonasekera et al. 1997; Kielstein et al. 2004; Lin et al. 2002; Sydow et al. 2003;
Tarnow et al. 2004; Vallance et al. 1992; Zoccali et al. 2001; Zoccali C. 2007]. Die Schlüsselrolle von ADMA in Bezug auf die Entstehung kardiovaskulärer Ereignisse wurde in einer finnischen Studie untersucht: dabei zeigten klinisch gesunde Männer mit höheren ADMA-Konzentrationen (>0,62 µM/L) ein deutlich erhöhtes Risiko gegenüber Männern mit niedrigem ADMA, schwerwiegende kardiovaskuläre Ereignisse- insbesondere koronarer Herzkrankheit (KHK) zu erleiden [Valkonen et al. 2001]. In einer weiteren Studie (CARDIAC) erwiesen sich ADMA- Plasmakonzentrationen-
Einleitung
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5
unter Berücksichtigung aller anderen Risikofaktoren- oberhalb von 1,7 !M/l als ein Risikomarker für die Entstehung einer KHK [Böger et al. 2003].
Zusätzlich wurde ADMA bei Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz detektiert:
dabei korrelierte der Schweregrad endothelialer Dysfunktion bei herzinsuffizienten Patienten mit erhöhten ADMA-Konzentrationen [Hornig et al. 1998]. In einer weiteren Studie wurde ein signifikanter Zusammenhang zwischen dem Anstieg der ADMA- Konzentration und der links-ventrikulären Muskelmasse sowie eine inverse Korrelation in Bezug auf ADMA und die Ejektionsfraktion des linken Ventrikels gefunden [Zoccali et al. 2002].
Experimentelle Untersuchungen bei Patienten mit essentieller Hypertonie zeigten doppelt so hohe ADMA-Werte im Vergleich zu Patienten mit normalem Blutdruck [Surdacki et al. 1999]. Außerdem führt eine lokale intraarterielle Injektion von ADMA zu einer deutlichen Vasokonstriktion des betreffenden Gefäßes [Calver et al. 1993].
Ferner erfolgt bei systemischer ADMA-Applikation über die Zunahme des Gefäßtonus ein signifikanter Anstieg des peripheren Gesamtwiderstandes [Achan et al. 2003].
ADMA spielt ebenfalls eine wichtige Rolle bei der Pathogenese der peripheren arteriellen Verschlusserkrankung (pAVK): so konnte gezeigt werden, dass bei Patienten mit pAVK ein vom Schweregrad der peripheren Durchblutungsstörung abhängiger Anstieg der ADMA-Plasmakonzentrationen vorliegt. Interessanterweise korrelierte die Höhe des NOS-Inhibitors mit dem jeweiligen Stadium der pAVK (Fontaine I-IV) [Böger et al. 1997].
Bei Patienten mit chronischer (dialysepflichtiger) Niereninsuffizienz wurden ebenfalls erhöhte ADMA-Spiegel gemessen. Dieser Anstieg entsteht unter anderem durch die unzureichende Eliminierung von ADMA während der Hämodialyse. Der ADMA- Anstieg führt bei diesen Patienten zu einer Zunahme der bereits vorliegenden endothelialen Dysfunktion und begünstigt somit die Entstehung kardiovaskulärer Begleiterkrankungen [Böger et al. 2003; Kielstein et al. 1999].
Zusätzlich scheint ADMA auch beim Diabetes mellitus Typ 2 eine pathophysiologische Bedeutung zu haben: so weisen Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 im Vergleich zu Patienten ohne Diabetes wesentlich höhere ADMA-Plasmakonzentrationen auf [Abbasi et al. 2001; Fard et al. 2000; Miyazaki et al. 1999; Stühlinger et al. 2002]. Als Ursache für die ADMA-Erhöhung wurden eine durch oxidativen Stress bedingte Dysregulation der Dimethylarginin-Dimethylaminohydrolase (DDAH) diskutiert [Ito et al. 2002].
Interessanterweise ist bereits eine gestörte Glukosetoleranz mit erhöhten ADMA-
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Werten assoziiert. Ferner führt eine medikamentöse Therapie mit Metformin und Rosiglitazin bei Typ 2-Diabetikern zu einer signifikanten Reduktion der ADMA- Plasmaspiegel [Asagami et al. 2002; Kelly et al. 2007].
Auch bei Patienten mit Hypercholesterinämie wurde eine signifikante ADMA- Erhöhung gegenüber Personen mit normaler LDL-Cholesterinkonzentration beobachtet [Böger et al. 1998]. Die Hypercholesterinämie wird von einer endothelialen Dysfunktion durch Inhibierung der NOS begleitet [Lundman et al. 2001].
Außerdem besteht ein deutlicher Zusammenhang zwischen erhöhten ADMA-Werten und der (Prä-) Eklampsie bei Schwangeren [Braekke et al. 2009; Speer et al. 2008]. So wurden erhöhte ADMA-Konzentrationen bei Patientinnen mit Präeklampsie nachgewiesen. Der Anstieg des NOS-inhibierenden Enzyms ADMA ist mit einer Störung der endothelialen Homöostase und somit einer mangelnden Plazentadurchblutung assoziiert. Diese trägt zur Entstehung der Symptome der Präeklampsie bei: Hypertonie, Ödembildung und Proteinurie. Im Gegensatz dazu weisen gesunde Schwangere keine Erhöhung der ADMA-Plasmakonzentrationen sowie eine normale Endothelfunktion auf [Fickling et al. 1993; Holden et al. 1998; Savvidou et al. 2003]. So stellt die Messung einer erhöhten ADMA-Konzentration bei Schwangeren möglicherweise einen diagnostischen Marker für das Risiko einer Präeklampsie dar [Ellis et al. 2001; Pettersson et al. 1998].
Eine Störung des NO/cGMP-Stoffwechselweges führt in vielen Fällen zu einer erektilen Dysfunktion. Meist wird diese durch das Vorliegen kardiovaskulärer Erkrankungen bzw. kardiovaskulärer Risikofaktoren verursacht [Aktoz et al. 2010; Maas et al. 2002;
Maas et al. 2005]. Es konnte durch mehrere Studien gezeigt werden, dass sich die erektile Dysfunktion durch die Verabreichung von L-Arginin bessert [Chen et al. 1999;
Zorgniotti et al. 1994]. Bei Patienten mit erektiler Dysfunktion, aufgrund von kardiovaskulären Ereignissen, wurden erhöhte ADMA-Konzentrationen gefunden.
Ferner lagen bei dieser Gruppe von Patienten ebenfalls erniedrigte L-Arginin-Spiegel vor [Elesber et al. 2006].
Die aufgeführten pathologischen Prozesse sind mit Veränderungen im L-Arginin/NO- Stoffwechsel assoziiert und werden durch einen Anstieg der ADMA-Werte begünstigt (Abb. 3). Prinzipiell können erhöhte ADMA-Plasmakonzentrationen (>380 + 130 nM) sowohl die Folge einer gesteigerten Neubildung als auch eines verzögerten enzymatischen Abbaus bzw. einer verminderten (renalen) Ausscheidung sein [Tsikas 2009; Vallance et al. 2004].
Einleitung
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Abb. 3: Erkrankungen, die mit erhöhten ADMA-Plasmakonzentrationen bei Erwachsenen assoziiert sind
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8 1.3 Synthese von ADMA
Bei der Dimethylargininsynthese werden eine oder mehrere Methylgruppen von dem Methylgruppen-Donator S-Adenosylmethionin, einem Homocystein- Stoffwechselprodukt, auf proteinständige L-Arginin-Reste übertragen [Garlick et al.
1976; Paik et al. 1968]. In dieser Reaktion sind Protein-Arginin-Methyltransferasen (PRMT) für die Methylierung der Aminosäure Arginin verantwortlich (Abb. 4).
Dementsprechend entstehen je nach der Anzahl der übertragenen Methylgruppen Monomethylarginin und ADMA umgesetzt durch die Protein-Methylase I, bzw.
Monomethylarginin und symmetrisches Dimethylarginin (SDMA) durch die Protein- Methylase II. Insgesamt erfolgen 90% der Methylierungsreaktion der Aminosäure L- Arginin über die PRMT I [Tang et al. 2000].
Abb. 4: Synthese, Wirkung, Metabolismus und Elimination von ADMA [modifiziert nach Kielstein et al. 2002]
Einleitung
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9 1.4 Abbau von ADMA
ADMA wird in allen Zellen des Organismus synthetisiert. Anschließend wird ADMA durch DDAH entweder intrazellulär zu L-Citrullin und DMA metabolisiert oder mittels kationischer Aminosäuretransporter, cationic amino acid transporter (CAT), aus den Zellen ins Plasma exportiert und renal eliminiert [Teerlink 2005]. Grundsätzlich wird ADMA zu 90% durch das Enzym DDAH zu L-Citrullin und Dimethylamin hydrolytisch gespalten [Ogawa et al. 1989; Mac Allister et al. 1996].
1.5 Pathophysiologische Bedeutung der DDAH
ADMA wird hauptsächlich in der Leber sowie den Nieren metabolisiert und intrazellulär durch DDAH zu L-Citrullin und DMA abgebaut [Teerlink 2005; Tran et al.
2003]. Im Tierexperiment konnte bislang eine DDAH-Aktivität in Niere, Pankreas, Leber, Gehirn und im Endothel der Ratte nachgewiesen werden [Wang et al. 2007].
Ebenfalls wurden beim Menschen hohe DDAH-Expression in der Aorta, den neutrophilen Granulozyten und in den Makrophagen gefunden [Leiper et al. 1999].
Bisher wurden zwei Isoformen der DDAH (DDAH 1 und DDAH 2) mit jeweils unterschiedlicher Gewebeverteilung im menschlichen Organismus beschrieben. Dabei wird die DDAH 1 überwiegend in der Leber und Niere sowie gemeinsam mit der nNOS im neuronalen Gewebe exprimiert, während die DDAH 2 in Co-Lokalisation mit der eNOS im Gefäßendothel gebildet wird [Leiper et al. 1999; Palm et al. 2007; Tran et al.
2000].
Die DDAH-Aktivität reguliert die Konzentration von ADMA im biologischen System.
Somit führt eine verringerte Aktivität bzw. DDAH-Expression zu erhöhten ADMA- Spiegel [Mac Allister et al. 1996; Tanaka et al. 2005].
Es konnte der positive Effekt der DDAH-Aktivität auf den NO-Stoffwechsel gezeigt werden. So führt eine Überexpression der humanen DDAH 1 in transgenen Mäusen zu erniedrigten ADMA-Plasmakonzentrationen und einer gesteigerten Angiogenese, die auf eine gesteigerte NO-Synthese zurückzuführen ist [Dayoub et al. 2003; Jacobi et al.
2005]. Smith et al. beschreiben bei einer gesteigerten DDAH-Expression eine deutlich gesenkte ADMA-Konzentration (186 ± 30 µM) und erhöhte VEGF mRNA-Level in
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modifizierten Endothelzellen, die mit einer erhöhten Ausbildung endothelialer Gefäße in vitro assoziiert sind. Im Gegensatz dazu hat die Hemmung der DDAH einen negativen Effekt auf die Angiogenese [Smith et al. 2003]. Zusätzlich führt eine in vitro pharmakologische Hemmung der DDAH in isolierten Arteriensegmenten zu einer Vasokonstriktion [Valkonen et al. 2003; Valkonen et al. 2005].
Die Aktivität der DDAH wird von diversen externen Faktoren beeinflusst: es konnte gezeigt werden, dass die DDAH 1-Proteinexpression durch IL-1" erhöht und durch das oxidierte LDL bzw. TNF-# erniedrig wird [Ueda et al. 2003]. Ferner scheint oxidativer Stress einen Einfluss sowohl auf die DDAH 2-Gen- als auch auf die DDAH-Protein- Expression zu haben [Tanaka et al. 2006]. Ein wichtiges Cytokin des ATP- Stoffwechsels, Coupling factor 6 (CF6) vermindert die DDAH-Aktivität und begünstigt durch seine chemischen Interaktionen die Vasokonstriktion. Im Gegensatz dazu begünstigt Vitamin A in den Endothelzellen die DDAH 2-Gen- bzw. Proteinexpression, reduziert somit die ADMA-Plasmakonzentration und fördert dadurch die NO- Produktion [Wang et al. 2009].
1.6 Der L-Arginin/NO-Stoffwechselweg im Kindesalter
Im Gegensatz zur Datenlage der Erwachsenen ist der NO-Metabolismus bei Kindern, und vor allem bei Frühgeborenen noch wenig untersucht.
In bisherigen Studien konnte gezeigt werden, dass die Plasmakonzentrationen für ADMA bei gesunden Kindern mit Werten bis zu 1000 nM/l im Vergleich zu den Erwachsenen deutlich höher liegen und sich mit steigendem Alter den Erwachsenennormwerten mit Konzentrationen von etwa 400 nM/l angleichen [Lücke et al. 2007].
Tatsächlich gibt es nur wenige Arbeiten, die sich auf die pathophysiologische Bedeutung von ADMA und dessen Auswirkungen auf den kindlichen NO-Stoffwechsel insbesondere bei pädiatrischen Erkrankungen konzentrieren. Bisher gibt es deutliche Zusammenhänge zwischen erhöhten ADMA-Plasmakonzentrationen und Endotheldysfunktionen im renalen System im Kindesalter. Pädiatrische Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz haben deutlich höhere ADMA-Plasmaspiegel als gesunde Kinder (1,10 + 0,35 !M/l vs. 0,78 + 0,16 !M/l) [Wang et al. 2007]. Ebenso beschrieben Lücke et al. erhöhte ADMA-Konzentrationen (851 nM/l vs. 684 nM/l,
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p = 0.008) bei Kindern mit einer sporadischen fokal segmentalen Glomerulosklerose (FSGS) im Vergleich zur gesunden Kontrollgruppe [Lücke et al. 2008]. Außerdem konnten bei nierentransplantierten Kindern ebenfalls erhöhte ADMA-Werte im Plasma und somit eine verstärkte Inhibierung der NO-Synthese beobachtet werden [Andrade et al. 2011]. Interessanterweise fanden sich bei der fortschreitenden Glomerulopathie der Schimke-immunoossären Dysplasie (SIOD), die auf eine frühe generalisierte Arteriosklerose zurück zu führen ist, keine erhöhten ADMA-Werte bzw.
Veränderungen im L-Arginin/NO-Metabolismus [Lücke et al. 2006].
Weiterhin wurde die Wirkung von ADMA auf das kardiovaskuläre System im Kindesalter untersucht. So wurden im Vergleich zu gesunden Kindern erhöhte ADMA- Plasmakonzentrationen bei Patienten mit angeborenen Herzfehlern und pulmonaler Hypertension gemessen [Arrigoni et al. 2003; Gorenflo et al. 2001]. Außerdem besteht ein Zusammenhang zwischen erhöhten ADMA-Konzentrationen und der arteriellen Hypertonie im Kindesalter. So wurden bei hypertensiven Kindern ADMA-Werte von 0,23 + 0,03 !M/l im Vergleich zu normotensiven gesunden Kindern mit Werten von 0,10 + 0,01 !M/l gefunden [Goonasekera 1997]. Zusätzlich zeigten Goonasekera et al.
einen möglichen Einfluss von ADMA auf die Atheromentstehung bei der Arteriosklerose in Kindern sowie jungen Erwachsenen mit arterieller Hypertonie [Goonasekera et al. 2000]. In weiteren Studien wurde die Intima-Media-(Wand-)Dicke der A. carotis bei Patienten mit arteriellem Hypertonus gemessen und ein möglicher pathologischer Zusammenhang zwischen gemessenen Lipoproteinwerten sowie ADMA und der Gefäßwanddicke untersucht. So bestand eine positive Korrelation (p = 0,001) zwischen gemessenen ADMA-Werten und dem Gefäßdurchmesser [Ayer et al. 2009].
Weiterhin wurden erhöhte ADMA-Werte bei Kindern mit familiärer Hypercholesterinämie detektiert [Engler et al. 2004; Jehlicka et al. 2009]. Bei Kindern mit Hypercholesterinämie Typ II kommt es im Vergleich zu gesunden Kindern zu keinem signifikanten ADMA-Konzentrationsanstieg. Interessanterweise ist aber eine gesteigerte Aktivität der indirekten Ganzkörper-DDAH-Aktivität (molare DMA/ADMA-Ratio im Urin) bei Kindern mit Hypercholesterinämie Typ II im Gegensatz zu den Kontrollpatienten beobachtet worden (9,2 {6,0-16,3} vs. 5,4 {3,8- 9,4},p = 0.0004) [Chobanyan-Jürgens et al. 2011]. Bei Kindern besteht ein Zusammenhang zwischen ADMA-Konzentrationen und Diabetes mellitus Typ 1. So wurden keine signifikanten Veränderungen der ADMA-Werte bei Patienten mit Diabetes mellitus Typ 1, die keine weiteren kardiovaskulären Störungen bzw.
Einleitung
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pathologische Veränderungen im Fettstoffwechsel aufweisen, im Vergleich zu gesunden Kindern beobachtet. Während Kinder mit Diabetes mellitus Typ 1 und zusätzlichen Erkrankungen wie vaskulären Veränderungen, Hypertonie oder Störungen im Fettstoffwechsel erhöhte ADMA-Konzentrationen im Vergleich zu gesunden Kindern hatten [Ayer et al. 2009; Jehlicka et al. 2009; Heilmann et al. 2009]. Zusätzlich hat man die ADMA-Konzentrationen in Zusammenhang zu dem Harnstoffzyklus untersucht.
Patienten mit einem Harnstoffzyklus-Enzymdefekt weisen trotz einer adäquaten Argininsubstitution eine verminderte NO-Synthese auf [Nagasaka et al. 2009]. Ferner fanden Lücke et al. erhöhte ADMA-Werte bei Kindern mit Citrullinämie, einer Störung des Harnstoffzyklus [Lücke et al. 2006]. Außerdem wurden bei Kindern mit Homocystinurie- einer seltenen angeborenen Störung des Aminosäurestoffwechsels- höhere ADMA-Plasmakonzentrationen im Vergleich zu Patienten mit Phenylketonurie gemessen (585 ± 125 vs. 512 ± 136 nM, p = 0.009) [Kanzelmeyer et al. 2011].
Im Vergleich zu dem NO-Metabolismus im Kindesalter gibt es tatsächlich nur wenige Untersuchungen die sich auf die postnatale Entwicklung von Frühgeborenen beziehen.
Bisher konnte gezeigt werden, dass die ADMA-Konzentrationen im umbilicalvenösen Plasma der Neugeborenen im Vergleich zu den ADMA-Werten der Mütter erhöht sind (1,02 + 0,18 nM/mL; p < 0,005). Außerdem wurde eine höhere ADMA-Konzentration im Plasma der Frühgeborenen im Verhältnis zu reif geborenen Säuglingen beobachtet [Maeda et al. 2003]. Interessanterweise wurde in der frühen postnatalen Phase der Neugeborenen ein Konzentrationsabfall von ADMA am zweiten Lebenstag in Bezug auf die umbilicalvenösen ADMA-Werte detektiert. Dies könnte auf eine mögliche lokale feedback-Regulation des kumulierten ADMAs aus der fetoplacentalen Regulation und eine reaktive gesteigerte NO-Produktion hindeuten [Vida et al. 2007].
Es gibt erste Hinweise, dass die initial gemessenen erhöhten ADMA-Plasmawerte im Zusammenhang zu der endothelialen Dysfunktionen und Inzidenz von chronischen Erkrankungen im Erwachsenenalter, die mit den Folgen der NO-Syntheseinhibition assoziiert sind, stehen [Luo et al. 2006, Vida et al. 2009]. Die Arbeitsgruppe von Bassareo et al. konnte zeigen, dass ehemals zu früh geborene Erwachsene höhere ADMA-Werte im Plasma aufweisen und ein erhöhtes Risiko für kardiovaskuläre Ereignisse im Vergleich zu der Kontrollgruppe aus reif geborenen Erwachsenen besitzen. So hatten die ehemals zu früh geborenen Erwachsenen ADMA-Plasmawerte von 0,606 + 0,095 µM/l im Vergleich zur gesunden Kontrollgruppe mit ADMA-Werten von 0,562 + 0,101 !M/l (p < 0,05) [Bassareo et al. 2011].
Einleitung
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Zusätzlich wurde eine positive Korrelation zwischen den Plasmakonzentrationen des NOS-Inhibitors ADMA und der Länge der mechanischen Beatmung bei Neugeborenen beobachtet [Richir et al. 2008]. Ferner fanden Kul et al. eine Erhöhung der ADMA- Konzentrationen bei Frühgeborenen mit einer perinatalen Hypoxie [Kul et al. 2009].
Die durch das ADMA gehemmte NO-Produktion scheint die Entstehung der Nekrotisierenden Enterocolitis (NEC) zu begünstigen [Richir et al. 2007].
Interessanterweise gibt es trotz der oben genannten Untersuchungen zum NO- Stoffwechsel bei Frühgeborenen bislang keine definierten Normwerte der L-Arginin/
NO-Metabolite.
Aus diesem Grund war das Hauptziel dieser Arbeit den L-Arginin/NO-Stoffwechselweg bei sog. „gesunden“ Frühgeborenen mit einem komplikationsarmen Verlauf zu einem definierten postnatalen Zeitpunkt zu untersuchen, um einheitliche Ausgangsnormwerte für die Parameter des L-Arginin/NO-Stoffwechselweges zu erstellen.
Patienten und Methodik
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15
Das Ziel der Patientenrekrutierung bestand darin, Frühgeborene mit einem komplikationslosen Verlauf zu erfassen. Es erfolgten weder Alters- noch Gewichtsbeschränkungen der Patienten. Es waren eine unterstützende Sauerstoffzufuhr über eine CPAP-Beatmung bzw. eine Druckluftbrille sowie die Verabreichung von notwendigen Medikamenten (Vigantolette, Ferrosanol, Coffein) erlaubt (im Anhang Tab.: 7.5.1).
Zu dem Probenentnahmezeitpunkt erfolgte bei den Patienten bereits der orale Nahrungsaufbau mit Muttermilch, ergänzt durch ein Nährstoffsupplement FM85 („Frühchennahrung“). 10 der 108 Frühgeborenen wurden zusätzlich noch parenteral ernährt. Der Kostaufbau nach der Geburt gestaltete sich bei allen 108 Patienten komplikationslos (im Anhang Tab.: 7.5.2).
Abgesehen von den unten aufgeführten Ausschlusskriterien wurden folgende mit der Frühgeburtlichkeit assoziierte postnatale Probleme der Kinder toleriert. Es waren (unvermeidbare) Adaptationsstörungen wie z.B. das Atemnotsyndrom (I°-III°), eine (phototherapiepflichtige) Hyperbilirubinämie, das Apnoe-Bradykardie-Syndrom sowie unkomplizierte kardiale Störungen wie z.B. offener Ductus arterious/Botalli, Ventrikelseptumdefekt oder offenes Foramen ovale, erlaubt (Tab. 7.5.3).
2.2 Ausschlusskriterien
Das Studienkollektiv sollte aus möglichst „gesunden“ Frühgeborenen bestehen. Somit wurden vor Beginn der Rekrutierung Ausschlusskriterien definiert.
Dazu gehörten zum Untersuchungszeitpunkt:
• Infektion/Sepsis
• Intraventrikuläre Hämorrhagie (IVH) > II°
• Kongenitale Fehlbildungen/chromosomale Aberrationen
• Maschinelle Beatmung
• Pulmonale Hypertension
• Atemnotsyndrom > III°
Patienten und Methodik
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16 2.3 Studienablauf
2.3.1 Aufklärung und gesetzliche Regelung
Vor Beginn dieser klinischen Studie ist das angefertigte Studienprotokoll von der Ethikkommission der Medizinischen Hochschule Hannover geprüft und bewilligt worden (Ergänzung zum Antrag Nr. 2720).
Die Aufklärung der Eltern über den Nutzen und die Durchführung der Studie erfolgte durch die behandelnden Stationsärzte. Dazu wurden den Eltern u.a. ein Patienteninformationsblatt (s. Anhang) ausgehändigt sowie für noch ausstehende Fragen ausreichend Zeit zur Verfügung gestellt. Ein Abbruch der Studie ohne Nennung von Gründen und ohne Nachteile für die weitere Behandlung war jeder Zeit möglich.
2.3.2 Gewinnung der Proben und Erhebung der Patientendaten
Nach der Unterzeichnung der Einwilligungserklärung (s. Anhang) erfolgte die Entnahme von zwei 0,5 ml EDTA-Röhrchen Blut sowie einigen Millilitern Urin. Die zeitnahe Anonymisierung und Erfassung der Patientendaten fand in Form eines zuvor erarbeiteten Erhebungsbogens (s. Anhang) statt. Dabei wurden die Namen der Kinder durch eine laufende Patientennummer und das Geburtsdatum (Pseudonymisierung) ersetzt.
Unmittelbar nach der Probenentnahme durch die Stationsärzte wurde das Blut und der Urin (auf Eis gelagert) von mir persönlich in das Stoffwechsellabor der Kinderklinik transportiert und nach Aufarbeitung (s. 2.4.1) bei – 80° C aserviert. Die Messung und Auswertung der Blut- und Urinproben erfolgte nach Abschluss der Rekrutierungsphase.
Aus vorangegangenen Studien war bekannt, dass die Stabilität der Patientenproben durch die Aufbewahrung bei -80° C für einige Monate gewährleistet war.
Aufgrund des wenigen Probenvolumens der Frühgeborenen, konnten nicht alle Messungen komplett durchgeführt werden, sodass die N-Zahl insbesondere der Urin- Parameter variiert.
Patienten und Methodik
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17 2.4 Analytische Methoden
Es wurden in den Proben der Frühgeborenen folgende biochemischen Parameter bestimmt und ausgewertet:
- ADMA im Plasma und Urin mittels GC-MS/MS [Tsikas et al. 2003; Tsikas et al.
2011b]
- L-Arginin im Plasma mittels GC-MS [Tsikas et al. 2009]
- Nitrit und Nitrat im Plasma und Urin mittels GC-MS [Tsikas et al. 1994; Tsikas et al. 2011a]
- Dimethylamin im Urin mittels GC-MS [Ripley et al. 1982; Tsikas et al. 2007]
- Kreatinin im Urin mittels GC-MS [Tsikas et al. 2010]
Die Konzentration aller im Urin gemessenen Parameter wurde durch die Kreatinin- Konzentration korrigiert und als !mol/mmol Kreatinin berichtet.
Zur Bestimmung der Parameter im Plasma wurde Ultrafiltrat hergestellt. Dazu wurde das exakte Volumen des Plasmas bestimmt, das Plasma in ein Eppendorfhüttchen überführt und anschließend mit dem gleichen Volumenanteil destillierten Wassers verdünnt. Zusätzlich wurde 1/10 des Plasmavolumens mit einem Gemisch aus
15NO2/15NO3-Standard aus 40 µM 15NO2 und 400 µM 15NO3 gespikt. Im Anschluss wurden die Proben bei 15000&g und 4° C für 30 Minuten zentrifugiert (Vivaspin2 Hydrosart Ultrafiltrationskartuschen, MWCO 10000).
Für alle gemessenen Parameter wurden auch Qualitätskontrollen parallel zu den Studienproben durchgeführt und Präzision und Richtigkeit der Messmethode bestimmt.
Für alle Parameter lagen Präzision (relative Standardabweichung, RSD, %) und Richtigkeit (Wiederfindung bzw. Bias) innerhalb allgemein akzeptierter Grenzen (RSD
< 10%, Bias < 20%).
Patienten und Methodik
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18 2.4.1 Messung von ADMA im Plasma und Urin
Die Bestimmung der Plasmakonzentration von ADMA im Plasma und Urin erfolgte mittels Gaschromatographie-Tandem Massenspektrometrie (GC-MS/MS) [Tsikas et al.
2003; Tsikas 2009]. Ein 10-µl Aliquot Ultrafiltrat bzw. Urin sowie ein 10-µl Aliquot einer 1 µM wässrigen ADMA-Lösung für Plasma bzw. 20 µM für Urin wurden unter Stickstoff zur Trockene eingeengt. Die Rückstände aus den Plasma- und Urin-Proben wurden anschließend mit 100-µl Aliquots einer 2 M HCl-Lösung in Methanol (CH3OH) aufgenommen. Die Rückstände der ADMA-Standardlösung wurden mit 100-µl Aliquots einer 2 M HCl-Lösung in deuteriertem Methanol (CD3OD) versetzt. Zur Methylierung der Aminosäuren wurden die Proben bei einer Temperatur von 80° C für 60 Minuten erhitzt. Nach dem Abkühlen der Proben auf Raumtemperatur wurden die methanolischen Plasma- und Urin-Proben mit den methanolischen ADMA- Standardlösungen vereint. Um den quantitativen Transfer zu sichern, wurde der Rückstand jeweils mit 100 µl CH3OH aufgenommen. Nach Einengung des Lösungsmittels und der Reagenzien der kombinierten Lösungen unter Stickstoff wurden den Rückständen 100-µl Aliquots einer Lösung von Pentafluoropropionsäureanhydrid (PFAA) in Ethylacetat (1:4, v/v) zugesetzt. Anschließend wurden die Proben für 30 Minuten bei 65° C erhitzt. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurden die Proben erneut unter Stickstoff getrocknet. Die Rückstände der Proben wurden in 200-µl Aliquots eines 0,4 M Boratpuffers, pH 8,5, aufgenommen und anschließend für 1 Minute mit 200-µl Aliquots Toluol für Plasma bzw. mit 1000-µl Aliquots für Urin gevortext. 100- bis 800-µl Aliquots der organischen Phase wurden in ein Bördelgläschen überführt. Daraus erfolgte die Injektion von 1-µl Aliquots und die Analyse mittels GC-MS/MS im NICI-Modus (negative-ion chemical ionisation).
Es wurde ein Finnigan MAT ThermoQuest TSQ 7000 triple-stage quadropole Massenspektrometer (San Jose, CA, USA), das mit einem Finnigan MAT Gaschromatographen Trace 2000 series (CE Instrument, Austin, Tx) gekoppelt war, verwendet. Es wurde eine Silica-Kapillarsäule Optima 17 (0,25 mm & 30 m; 0,25 µm Beschichtungsdicke) von Macherey-Nagel (Düren, Deutschland) verwendet. Als Trägergas diente Helium mit einer konstanten Flussrate von 1 ml/min. Die Kapillarsäule wurde nach folgendem Programm aufgeheizt: initial 2 Minuten bei 90° C, gefolgt von
Patienten und Methodik
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19
einer Rate von 20° C/min bis 340° C. Injektor, Interface und Ionenquelle wurden bei 280° C, 280° C und 180° C konstant gehalten. Die Elektronenenergie betrug 200 eV und der Emissionsstrom war 300 µA. Als Reaktandgas für die NICI wurde Methan (530 kPa) eingesetzt. Argon wurde mit einem Druck von 0,13 Pa zur CAD (collision activated dissociation) verwendet. Die Kollisionsenergie betrug 15 eV.
2.4.2 Messung von L-Arginin im Plasma
Die Bestimmung der Plasmakonzentration von L-Arginin im Plasma-Ultrafiltrat erfolgte mittels GC-MS. Ultrafiltrat-Proben wurden mit dem internen Standard L- [guanidino-15N2] Arginin-HCl versetzt. 10-µl Aliquots wurden anschließend unter Stickstoff eingeengt. Die Derivatisierung und die weitere Aufbereitung wurden analog der Bestimmung von ADMA durchgeführt.
2.4.3 Messung von Nitrit und Nitrat im Plasma
Nitrit und Nitrat im Plasma wurden simultan mittels GC-MS bestimmt. Dazu wurde jeweils ein Probenvolumen von 100 µl eingesetzt, welchem ein Gemisch aus 15NO2 und
15NO3 bereits vor der Ultrazentrifugation zugegeben war [Tsikas et al. 1994]. Die Endkonzentration der Standards in den Proben betrug 8 µM für Nitrit und 80 µM für Nitrat. Zu 100-µl Aliquots wurden 400 µl Aceton und 10 µl Pentafluorobenzyl-Bromid hinzugefügt. Danach wurden die einzelnen Proben für 5 Minuten (für Nitrit) bzw. für 60 Minuten (für Nitrat) bei 50° C inkubiert. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurde das Aceton unter Stickstoff abgedampft und die Proben wurden mit 1000 µl Toluol versetzt und für 1 Minute gevortext. Durch Zentrifugation (5 Minuten, 1500&g) wurden die Phasen getrennt und 750 µl der oberen Toluolphase wurden in ein sauberes Autosampler-Gefäß zur GC-MS-Messung überführt.
Es wurde ein ThermoFisher DSQ single-stage quadropole Massenspektrometer (San Jose, CA, USA), das mit einem ThermoFisher Gaschromotographen Focus gekoppelt war, verwendet. Die Temperatur der Optima-17 Silica-Kapillarsäule (0,25 mm &15 m, 0,25 µm Beschichtungsdicke) wurde für 1 Minute bei 70° C gehalten und dann mit einer
Patienten und Methodik
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20
Rate von 30° C/min auf die Endtemperatur von 280° C erhöht. Helium diente bei einem konstanten Druck von 40 kPa als Trägergas. Als Reaktandgas wurde Methan bei einem Druck von 200 kPa im NICI-Modus eingesetzt. Die Temperatur für Injektor, Interface, Quadrupol und Ionenquelle betrug 200° C, 260° C, 120° C und 180° C. Die Elektronenenergie betrug 230 eV und Elektronenstrom war 300 µA. Unter diesen Bedingungen betrugen die Retentionszeit der PFB-Derivate von Nitrit 2,9 Minuten und die von Nitrat 2,73 Minuten. Die quantitative Bestimmung erfolgte im SIM-Modus.
Dazu wurden die Ionen mit dem Masse-zu-Ladung-Verhältnis (m/z) von m/z 46 für
14NO2 (endogenes Nitrit), m/z 47 für 15NO2, m/z 62 für 14NO3 (endogenes Nitrat) und m/z 63 für 15NO3 registriert.
2.4.4 Messung von Nitrit und Nitrat im Urin
Bei der Derivatisierung von Nitrit und Nitrat im Urin (100 !l) wurde ein 10-µl Aliquot eines Gemisches von 15NO2/15NO3 als interne Standards bei einer Endkonzentration von 8 µM für 15NO2 und 800 µM für 15NO3 hinzu gegeben.
Die Inkubation erfolgte für 60 Minuten bei 50° C. Die weiteren Aufarbeitungsschritte sowie die GC-MS-Bedingungen entsprachen der Aufarbeitung der Plasmaproben.
2.4.5 Messung von Dimethylamin im Urin
Dimethylamin im Urin wurde mittels GC-MS im NICI-Modus analysiert. Urin-Proben wurden auf Eis aufgetaut und anschließend bei 4600&g für 5 Minuten zentrifugiert.
Danach wurden 120-µl Aliquots 1 M Kaliumphosphat-Puffer zu 120-µl Aliquots der Urin-Proben hinzu pipettiert. Anschließend wurden 6-µl Aliquots des internen Standards d6-Dimethylamin-hydrochlorid hinzu gegeben. Zwei 100-!l Aliquots der verdünnten Urinproben wurden mit 1 ml Toluol, 10 µl einer 20 mM Natriumcarbonatlösung und 10 µl Pentafluorbenzoylchlorid versetzt, gevortext und zentrifugiert (4° C, 5 Minuten, 4600&g). Abschließend wurden 750 µl der oberen Toluolphase in ein Bördelgläschen überführt und mittels GC-MS im SIM-Modus analysiert.
Patienten und Methodik
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21 2.4.6 Messung von Kreatinin im Urin
Das Kreatinin in den Urin-Proben wurde ebenfalls mittels GC-MS bestimmt [Tsikas et al. 2010].
Die zuvor bei 4600&g für 5 Minuten zentrifugierten Urinproben wurden im Verhältnis von 1:100 (v/v) mit Phosphat-Puffer verdünnt. Nach Zugabe von 10-µl Aliquots des internen Standards d3-Kreatinin zu 100-µl Aliquots der verdünnten Proben wurden 400 µl Aceton und 10 µl Pentafluorbenzyl-Bromid hinzugefügt. Danach wurden die Proben für 1 Stunde bei 50° C inkubiert. Aceton wurde unter Stickstoff abgedampft und anschließend wurden die Proben mit 1000 µl Toluol durch 1-minütiges Vortexen extrahiert. Nach Zentrifugation (5 Minuten, bei 4600&g) wurde die obere Toluolphase (750 µl) in ein sauberes Autosampler-Gefäß überführt. Abschließend erfolgte die GC- MS Analyse im NICI-Modus durch SIM.
2.5 Statistik
Die Datenauswertung wurde im Zentrum Biometrie der MHH mit der Statistiksoftware SPSS Version 18 durchgeführt. Die Normalitätsprüfung (Kolmogorov-Smirnov-Test) zeigte eine Normalverteilung der Werte.
Der Vergleich der Gestationsaltergruppen untereinander erfolgte mit Hilfe des Student- t-Test für heterogene Varianzen. Die Alterskorrelation der Frühgeborenen im Zusammenhang zu den gemessenen Metaboliten des L-Arginin/NO-Systems erfolgten mit Hilfe des Pearson-Korrelationstests (Pearson-Korrelationskoeffizient, r).
Im Folgenden werden die Minimum-, Maximum- und Mittelwerte sowie die Standardabweichung und die Konfidenzintervalle tabellarisch aufgeführt. Beim Student- t-Test wird ein p-Wert < 0,05 als statistisch signifikant und ein p-Wert < 0,01 als statistisch hoch signifikant berücksichtigt. Der Pearson-Korrelationkoeffizient kann Werte zwischen '1 und +1 annehmen. Zusätzlich entsprechen Werte > 0 einer positiven Korrelation und Werte < 0 einer negativen Korrelation. Im Text sind die Daten ebenso wie Mittelwert ± Standardabweichung präsentiert.
Patienten und Methodik
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22
Die graphische Darstellung der Ergebnisse bezogen auf die Unterteilung nach dem Gestationsalter erfolgte in Form von Boxplot-Diagrammen. Mit Hilfe des Boxplots lassen sich einzelne Werte genauer verdeutlichen und interpretieren (Abb. 6).
Abb. 6.: Graphische Darstellung eines Boxplot-Diagramms
Ergebnisse
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23
3. Ergebnisse
Im Folgenden werden die Ergebnisse der Messungen des L-Arginin/NO- Stoffwechselweges aufgeführt. Die Darstellung der statistischen Auswertung erfolgt in drei Abschnitten. Der erste Abschnitt analysiert die Messparameter für alle 108 Patienten (Gesamtkollektiv) bezogen auf das Gestationsalter. Wir bestimmten erstmals die Normwerte für ADMA im Plasma und Urin bei Frühgeborenen im Alter von 23. bis zur 36. SSW (3.1). Im zweiten Abschnitt beziehen sich die Ergebnisse auf die Unterteilung in zwei Gruppen (Frühgeborene im Alter von 23.-29. SSW und „reifere“
Frühgeborene der 30.-36. SSW). Die Unterteilung des Patientenkollektivs soll einen möglichen Zusammenhang zwischen ADMA und dem Gestationsalter und somit auch dem Reifungsgrad der Frühgeborenen verdeutlichen (3.2). Der dritte Abschnitt beinhaltet die Auswertung der gemessenen biochemischen Parameter in Bezug auf das Geschlecht der Kinder (3.3).
Ergebnisse
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33
3.1.10 L-Arginin/ADMA-Ratio im Plasma bei Frühgeborenen
Die NOS katalysiert die Bildung von NO aus der Aminosäure L-Arginin. Das Verhältnis von L-Arginin im Plasma zu ADMA im Plasma der Frühgeborenen stellt einen indirekten Bezug zur Ganzkörper-NOS-Aktivität dar. Da NO im menschlichen Organismus eine Halbwertszeit von < 0,1 Sekunden besitzt, lässt die Bestimmung der L-Arginin/ ADMA-Ratio Rückschlüsse auf die qualitative NO-Synthese bei Frühgeborenen zu. Ferner ist es möglich durch dieses Verhältnis wesentliche Veränderungen sowie Störungen im L-Arginin/NO-Stoffwechselweg aufgrund inadäquater NOS-Aktivität festzustellen.
Der Mittelwert der bestimmten L-Arginin/ADMA-Ratio war 0,051 (!mol/nmol) mit einer Standardabweichung 0,019. Es wurde eine deutliche negative Korrelation zwischen den gemessenen L-Arginin/ADMA-Ratio-Werten und dem Alter der Kinder in Schwangerschaftswochen (Abb. 3.1.10) beobachtet.
Anzahl Minimum (!mol/
nmol)
Maximum (!mol/
nmol)
Median (!mol/
nmol)
Mittelwert (!mol/
nmol)
Standard- abweichung (!mol/nmol)
95%
Konfidenz- intervall Untergrenze (!mol/nmol)
95%
Konfidenz- intervall Obergrenze (!mol/nmol)
106 0,01 0,10 0,050 0,051 0,019 0,048 0,055
Ergebnisse
______________________________________________________________________
56
3.4.2 Korrelation zwischen ADMA im Plasma bzw. Urin sowie Nitrit und Nitrat im Plasma bzw. Urin
Dargestellt sind Korrelation zwischen ADMA im Plasma und Urin sowie Nitrat bzw.
Nitrit im Plasma und Urin. Die fett markierten p-Werte sind signifikant.
ADMA Plasma [nM]
ADMA Urin [!mol/mmol Kreatinin]
NITRIT Plasma [!M]
NITRIT Urin [!mol/mmol Kreatinin]
NITRAT Plasma [!M]
NITRAT Urin [!mol/mmol Kreatinin]
SSW
ADMA Plasma [nM]
Korrelation nach Pearson Signifikanz (p-Wert)
1 0,444
0,0001
-0,003
0,976
-0,150
0,201
-0,020
0,841
0,078
0,509
0,298
0,002 ADMA Urin
[!mol/mmol Kreatinin]
Korrelation nach Pearson Signifikanz (p-Wert)
0,444
0,0001
1 0,002
0,988
0,036
0,763
-0,087
0,473
0,086
0,470
0,250
0,033 NITRIT
Plasma [!M]
Korrelation nach Pearson Signifikanz (p-Wert)
-0,003
0,976
0,002
0,988
1 -0,166
0,157
0,156
0,111
-0,002
0,986
0,097
0,324 NITRIT
Urin [!mol/mmol Kreatinin]
Korrelation nach Pearson Signifikanz (p-Wert)
-0,150
0,201
0,036
0,763
-0,166
0,157
1 0,006
0,960
-0,049
0,672
-0,15
0,198
NITRAT Plasma [!M]
Korrelation nach Pearson Signifikanz (p-Wert)
-0,020
0,841
-0,087
0,473
0,156
0,111
0,006
0,960
1 0,250
0,031
-0,11
0,262 NITRAT
Urin [!mol/mmol Kreatinin]
Korrelation nach Pearson Signifikanz (p-Wert)
0,078
0,509
0,086
0,470
-0,002
0,986
-0,049
0,672
0,250
0,031
1 0,066
0,573
SSW Korrelation
nach Pearson Signifikanz (p-Wert)
0,298
0,002
0,250
0,033
0,097
0,324
-0,150
0,198
-0,110
0,262
0,066
0,573 1
Tabelle 2: Korrelationen zwischen ADMA im Plasma/Urin sowie Nitrit und Nitrat im Plasma/Urin
Diskussion
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57
4. Diskussion
In der vorliegenden Studie an 108 „gesunden“ Frühgeborenen wurde durch die Bestimmung der L-Arginin/NO-Metabolite ADMA, L-Arginin, Nitrat, Nitrit und DMA im Plasma und Urin ein möglicher Zusammenhang zwischen der gemessenen Konzentration und dem Gestationsalter der Frühgeborenen untersucht.
Folgende vier Hauptergebnisse werden in der vorliegenden Arbeit vorgestellt:
1. Erstmalig wurden Normwerte für ADMA im Plasma und Urin bei gesunden Frühgeborenen bestimmt. Dabei bestand kein Unterschied zwischen weiblichen und männlichen Kindern.
2. Im Vergleich zu gesunden Kindern und Jugendlichen, die im Mittel (708 + 162 nM) [Lücke et al. 2007] im Vergleich zu Erwachsenen (380 + 130 nM) [Tsikas et al. 2003; Deneva-Koycheva et al. 2011] bereits höhere ADMA- Plasmakonzentrationen aufweisen, sind bei Frühgeborenen die ADMA-Werte im Plasma im Mittel noch höher (860 + 174 nM).
3. Das Gesamtkollektiv wurde in zwei Gruppen eingeteilt: In Frühgeborene mit einem Alter von 23.-29. SSW und 30.-36. SSW. Interessanterweise bestand ebenfalls ein Unterschied zwischen den ADMA-Plasmaspiegeln bei Frühgeborenen mit dem Gestationsalter von 23.-29. SSW (774 + 164 nM) und der Frühgeborenen im Alter von 30.-36. SSW (895 + 166 nM; p = 0,001). Die gemessene ADMA-Konzentration im Urin korrelierte positiv mit dem Gestationsalter (23.-36. SSW) der gesamten 108 Frühgeborenen (p = 0,033).
Aber es bestand kein signifikanter Unterschied in der ADMA-Konzentration im Urin zwischen den beiden Gruppen im Vergleich (12,8 + 3,6 !mol/mmol Kreatinin vs. 12,2 + 4,6 !mol/mmol Kreatinin; p = 0,61).
Es wurden erstmalig die DMA-Werte im Urin bei gesunden Frühgeborenen bestimmt sowie ein Zusammenhang der im Urin gemessenen DMA und DMA/ADMA-Ratio (und damit der Ganzkörper-DDAH-Aktivität) mit dem
Diskussion
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Gestationsalter festgestellt. So nahm sowohl die DMA-Konzentration (p = 0,005) als auch die molare DMA/ADMA-Ratio im Urin mit steigendem Gestationsalter ab. Nach der Aufteilung in die beiden Altersgruppen waren die DMA- Konzentration (282 + 44 !mol/mmol Kreatinin vs. 247 + 35 !mol/mmol Kreatinin, p = 0,004) und die DMA/ADMA-Ratio im Urin (27 + 13 !mol/mmol Kreatinin vs. 20 + 5 !mol/mmol Kreatinin; p = 0,065) bei Frühgeborenen der 23.-29. SSW tendenziell höher als bei den Frühgeborenen der 30.-36. SSW.
Somit weisen erhöhte DMA- und DMA/ADMA-Werte im Urin auf einen gesteigerten ADMA-Abbau, der durch das Enzym DDAH katalysiert wird, hin.
In diesem Zusammenhang besteht die Grundüberlegung, dass die niedrigeren ADMA-Werte bei unreifen Kindern auf einen erhöhten ADMA-Abbau durch das Enzym DDAH, und möglicherweise auf einen höheren Schutz der Endothelfunktion hinweisen könnten. Umgekehrt würde eine Störung des ADMA-Abbaus bzw. eine Steigerung der ADMA-Synthese mögliche pathologische Effekte, die mit der Frühgeburtlichkeit assoziiert sind, erklären.
4. Betrachtet man das Gesamtkollektiv der Frühgeborenen, so besteht kein Unterschied in den Nitrat- und Nitrit-Werten im Plasma und Urin. Die L- Arginin/ADMA-Ratio (indirekte NOS-Aktivität) scheint im Gesamtkollektiv der Frühgeborenen mit steigendem Gestationsalter jedoch abzunehmen (p < 0,01).
Dies könnte auf eine erhöhte NO-Synthese bei Frühgeborenen mit kleineren Gestationsalter hindeuten und bei diesen möglicherweise für die postnatale Adaptation bedeutend sein.
Diskussion
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4.1 Studienkollektiv und Abnahmezeitpunkt der Proben
Die Grundüberlegung dieser Arbeit bestand darin Normwerte bei Frühgeborenen für den NOS-Inhibitor ADMA im Plasma und Urin zu definieren. Dazu sollte ein Studienkollektiv aus möglichst „gesunden“ Frühgeborenen rekrutiert werden. Um das Kriterium des „gesunden“ Frühgeborenen erfüllen zu können, wurden folgende Ausschlusskriterien zum Zeitpunkt der Probenentnahme definiert:
- Infektion/Sepsis,
- Intraventrikuläre Hämorrhagie > II°,
- kongenitale Fehlbildungen/chromosomale Aberrationen - maschinelle Beatmung
- Pulmonale Hypertension - Atemnotsyndrom > III°.
Abgesehen von den bestimmten Ausschlusskriterien wurde bewusst auf eine zu enge Eingrenzung des Studienkollektivs verzichtet. Es wurden Frühgeborene mit unterschiedlich prognostizierten Outcome in die Studie eingeschlossen, sofern sie ein Gestationsalter < 37. SSW aufwiesen. Für die Definition eines „gesunden“
Frühgeborenen wurden nur das gesundheitliche Befinden des Patienten zum Proben- Abnahmezeitpunkt und nicht der stationäre Verlauf bzw. die Entlassungsdiagnosen gewertet. Somit wurden Patienten unterschiedlichen Gestationsalters und Gewichts rekrutiert. Die unvermeidlichen mit der Frühgeburtlichkeit assoziierten Störungen (Atemnotsyndrom, (phototherapiepflichtige) Hyperbilirubinämie, Apnoe-Bradykardie- Syndrom, offener Ductus arterious/Botalli, Ventrikelseptumdefekt oder offenes Foramen ovale) sollten in diesem Zusammenhang toleriert werden. Zu den Einschlusskriterien gehörten eine komplikationslose postpartale Adaptation ohne Anzeichen eines Infektes, die einen initialen Nahrungsaufbau und den Verzicht auf maschinelle Beatmung voraus setzte. Wobei die unterstützende Sauerstoffzufuhr über eine CPAP-Beatmung erlaubt war.
Die Geschlechtsverteilung der Patienten bestand aus 56 weiblichen und 52 männlichen Frühgeborenen. Mittermayer et al. postulieren eine geschlechtsspezifische Differenz in Bezug auf gemessene ADMA-Plasmakonzentrationen aus der Umbilicalvene der Kinder [Mittermayer et al. 2006]. Es wurden bei männlichen im Vergleich zu weiblichen Frühgeborenen wesentlich höhere ADMA-Plasmaspiegel detektiert (p < 0,005) und ein
