Aus dem Institut für Klinische Pharmakologie im Zentrum Pharmakologie und Toxikologie
der Medizinischen Hochschule Hannover Kommiss. Leiter: Prof. Dr. med. Dirk O. Stichtenoth
Die APAV-Pilotstudie:
„L-Arginin bei Patienten mit peripherer arterieller Verschlusskrankheit“
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Humanbiologie an der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Jessica Y. Lachmuth
aus Siegen
Hannover 2007
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am: 03.07.2008
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Prof. Dr. med. Dieter Bitter-Suermann Betreuer: Prof. Dr. med. Jürgen C. Frölich Referenten: Prof. Dr. med. Dirk Stichtenoth Koreferent: Prof. Dr. med. Klaus Resch Koreferent: Prof. Dr. med. Malte Kelm
Tag der mündlichen Prüfung: 03.07.2008
Abkürzungsverzeichnis
1 Einleitung………1
1.1 Die periphere arterielle Verschlusskrankheit……….1
1.1.1 Defininition und Klassifikation………1
1.1.2 Prävalenz und epidemiologische Bedeutung………..3
1.1.3 Kardiovaskuläres Risikopotenzial und Prognose………3
1.1.4 Pathophysiologische Grundlagen der pAVK………...4
1.1.5 Aktuelle Therapiemöglichkeiten der pAVK………..5
1.2 Pathogenese der Arteriosklerose………..…9
1.2.1 Allgemeine Grundlagen………...9
1.2.2 Physiologische Rolle von Stickstoffmonoxid (NO) im Gefäßsystem………….11
1.2.3 Rolle einer verminderten Bioverfügbarkeit von NO in der Pathogenese der Arteriosklerose………13
1.2.4 Oxidativer Stress und endotheliale Dysfunktion………...13
1.3 Der L-Arginin/Stickstoffmonoxid (NO)-Stoffwechselweg………..16
1.3.1 L-Arginin als Vorstufe für die endogene Stickstoffmonoxidsynthese………....16
1.3.2 Biochemische und physiologische Bedeutung von L-Arginin……….17
1.3.3 Synthese von Stickstoffmonoxid (NO)………18
1.3.4 Das „L-Arginin-Paradox“………...20
1.3.5 Bedeutung endogener Inhibitoren für die Regulation der NO-Synthese………..21
1.4 Therapieoptionen für L-Arginin bei Patienten mit pAVK………...24
1.5 Studienziel und Fragestellung………..26
2 Methoden………..29
2.1 Studiendesign………29
2.1.1 Ziel der Studie………29
2.1.2 Ethische Gesichtspunkte………..…29
2.1.3 Randomisierung……….……30
2.1.4 Zeitlicher Ablauf der Studie………..……30
2.1.5 Verblindung………..………..31
2.2 Studienmedikation………..….32
2.2.1 Beschreibung der Studienmedikation……….………32
2.2.2 Prüfung der Studienmedikation auf Gleichförmigkeit des Gehalts………...….34
2.3.1 Einschlusskriterien……….…37
2.3.2 Ausschlusskriterien………38
2.3.3 Begleiterkrankungen und –medikation……….……..39
2.4 Klinische Untersuchungen………..………..39
2.4.1 Bestimmung der Gehstrecke………..……….39
2.4.2 Knöchel-Arm-Index………...……….40
2.4.3 Blutdruckmessung……….40
2.4.4 Duplex-Sonographie……….……….41
2.5 Biochemische Analysen……….………41
2.5.1 Gewinnung und Aufbewahrung der Blut- und Urinproben………..41
2.5.2 Bestimmung der Routineparameter………42
2.5.3 Bestimmung der speziellen biochemischen Parameter……..………42
a) Bestimmung von L-Arginin und ADMA im Plasma/Urin……….……43
b) Bestimmung von Nitrit und Nitrat im Plasma/Urin………...……44
c) Bestimmung von Gesamt-Homocystein im Plasma………..…….45
d) Bestimmung von 8-iso-PGF2α im Plasma/Urin……….…………46
e) Bestimmung von Malondialdehyd und 4-Hydroxynonenal im Plasma…….48
f) Bestimmung von Dimethylamin im Urin………..………..49
g) Bestimmung von 2,3-dn-6-keto-PGF1α und 2,3-dn-TXB2 im Urin…………..50
h) Bestimmung von Kreatinin im Urin………...…….53
i) Bestimmung von cGMP im Urin………...……..54
2.6 Lebensqualität………...………55
2.7 Datenerfassung……….55
2.8 Statistische Auswertung………55
2.8.1 Verbundene Stichproben………..………56
2.8.2 Unverbundene Stichproben……….56
2.8.3 Vergleich von relativen Häufigkeiten……….……….57
2.8.4 Zusammenhänge zwischen Variablen………57
3 Ergebnisse………...…………58
3.1 Patientencharakteristika……….………58
3.2 Klinische Beobachtungen und Nebenwirkungen………..………..61
3.3 Patienten-Compliance………...………..63
3.4 Mittelwertvergleiche zwischen beiden Therapiegruppen………..64
a) Absolute und schmerzfreie Gehstrecke………..………..64
b) Knöchel-Arm-Index………..………68
c) Systolischer und diastolischer Blutdruck………..……68
d) Lebensqualität……….………..70
3.4.2 Biochemische Parameter……….………73
a) L-Arginin……….74
b) Asymmetrisches Dimethylarginin (ADMA)……….………..76
c) L-Arginin/ADMA-Ratio……….78
d) Nitrat und Nitrit………..………79
e) cGMP………..………85
f) Dimethylamin………..……..85
g) Gesamt-Homocystein………..87
h) 8-isoPGF2...89
i) Malondialdehyd………..………..90
j) 4-Hydroxy-2-nonenal………92
k) 2,3-dn-6-keto-PGF1α und 2,3-dn-TxB2………...……..….94
3.5 Analysen zum Zusammenhang zwischen absoluter Gehstrecke und verschiedenen unabhängigen Variablen……….………..96
3.5.1 Univariate Korrelationsanalysen………..………96
3.5.2 Varianzanalysen (ANOVA)……….………..97
4 Diskussion………99
4.1 Analyse des Patientenkollektivs der APAV-Pilotstudie……… …100
4.1.1 Randomisierung in Therapiegruppen……… 100
4.1.2 Vergleichbarkeit der Therapiegruppen bei Studienbeginn………. 100
4.2 Unterschiede in Plasma- und Urinkonzentrationen von Parametern des L- Arginin/NO-Stoffwechselwegs nach 3-monatiger Therapie und ihre Bedeutung für die Studie……….………101
4.2.1 Plasmaspiegel und Urinexkretionsraten von L-Arginin……….. 101
4.2.2 Die L-Arginin/ADMA-Ratio im Plasma………..…...…103
4.2.3 Beeinflussung der Plasma- und Urinkonzentration des kardiovaskulären Risikofaktors ADMA durch L-Arginin………....…103
4.2.4 Untersuchung von Regulatoren und Markern im Metabolismus von ADMA.107 4.2.5 Die DMA/ADMA-Ratio……….……...108
4.2.6 Nitrat, Nitrit und cGMP als Indexmetabolite einer gesteigerten NO-Synthese………....110
4.2.7 Weitere relevante biochemische Parameter……….…..…113
4.3.1 Plasmaspiegel und Urinexkretionsraten von 8-iso-PGF2α……….……...115
4.3.2 Plasmaspiegel von Malondialdehyd und 4-Hydroxynonenal……….…..116
4.4 Beeinflussung klinischer Parameter im Verlauf der Studie……….…….…….117
4.4.1 Veränderung der absoluten und schmerzfreien Gehstrecke……….…..117
4.4.2 Effekte des durchgeführten Gehtrainings auf die Gehstrecke der Patienten119 4.4.3 Beziehung zwischen der absoluten Gehstrecke und verschiedenen unabhängigen Variablen……….………..….120
4.4.4 Einfluss auf Knöchel-Arm-Index und Blutdruck……….……….122
4.4.5 Die Lebensqualität der Patienten………..…123
4.5 Bisheriger und zukünftiger therapeutischer Einsatz von oralem L-Arginin unter Berücksichtigung der Ergebnisse der APAV-Pilotstudie……….……...125
4.5.1 Übersicht bisher publizierter Untersuchungen zur Anwendung von oralem L- Arginin beim Menschen………...………..….125
4.5.2 Verträglichkeit von oral verabreichtem L-Arginin……….……..128
4.5.3 Die APAV-Pilotstudie – Erkenntnisse für die Planung und Durchführung zukünftiger Therapiestudien……….……….128
5 Zusammenfassung………..…130
6 Literaturverzeichnis……….………...133
7 Anhang………...152
7.1 Originaldaten………..………..…..152
7.2 Patienteninformation………....205
7.3 Patienteneinwilligungserklärung………..210
7.4 Auflistung aller Begleiterkrankungen der Patienten………...211
7.5 Auflistung aller Begleitmedikamente der Patienten………...….212
7.6 Liste der verwendeten Chemikalien………..…………..213
7.7 Liste der verwendeten Materialien………..……….…214
7.8 Liste der verwendeten Geräte……….……...216
7.9 Liste der hergestellten Lösungen………..………..….217
Lebenslauf
Erklärung nach § 2 Abs. 2 Nr. 7 und 8 PromO Danksagung
ABI Knöchel-Arm-Index (ankle-brachial index)
ACD Absolute Gehstrecke (absolute claudication distance) ACE Angiotensin Converting Enzym
ACVB Aortokoronarer-Venen-Bypass ADMA Asymmetrisches Dimethylarginin
ADP Adenosindiphosphat
ALAT Alanin-Aminotransferase
AMP Adenosinmonophosphat
ANOVA Varianzanalyse (Analysis of Variance) ASAT Aspartat-Aminotransferase
ASS Acetylsalicylsäure
ATP Adenosintriphosphat
AUC Fläche unter der Konzentrations-Zeit-Kurve (Area under the Curve) AV-Block Atrioventrikulärer Block
AVK Arterielle Verschlusskrankheit
BMI Body Mass Index
BSTFA N,O-bis(Trimethylsilyl)-trifluoroacetamid cAMP zyklisches Adenosinmonophosphat cGMP zyklisches Guanosinmonophosphat
CHOD Cholesterinoxidase
COPD Chronisch obstruktive Lungenerkrankung
CRF Patienten-Dokumentationsbogen (Case Report Form) CRP C-reaktives Protein
CSE Cholesterinsyntheseenzym (syn. für HMG-CoA-Reduktase) CTP Cytidintriphosphat
cUMP zyklisches Uridinmonophosphat
DDAH Dimethylarginin Dimethylaminohydrolase
DMA Dimethylamin
DNA Desoxyribonukleinsäure (Desoxyribonucleic Acid)
ED Einzeldosis
EDRF Endothelium-derived relaxing Factor EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EI Electron Impact
ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay eNOS endotheliale NO-Synthase
FAD Flavin-Adenin-Dinucleotid FMN Flavin-Mononucleotid
GC-MS gekoppelte Gaschromatographie/Massenspektrometrie
GC-MS/MS gekoppelte Gaschromatographie/Tandem-Massenspektrometrie
GMP Guanosinmonophosphat
GOT Glutamat-Oxalat-Transaminase (syn. für ASAT) GPO Glycerinphosphatoxidase
GPT Glutamat-Pyruvat-Transaminase (syn. für ALAT) GPX Glutathion-Peroxidase
GSH Glutathion
GTP Guanosintriphosphat
HDL High Density Lipoprotein
HMG-CoA 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Coenzym-A
HNE Hydroxynonenal
HPLC Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie
IAC Immuno Affinity Column
ICAM-1 Intercellular Adhesion Molecule 1
ICD Schmerzfreie Gehstrecke (initial claudication distance) IFCC International Federation of Clinical Chemistry
ISE Ionen-selektive Elektrode (ion-selective electrodes) KHK Koronare Herzkrankheit
LDL Low Density Lipoprotein L-NAME Nω-Nitro-L-Arginin-Methylester L-NMMA Nω-Monomethyl-L-Arginin L-NNA Nω-Nitro-L-Arginin
MCS Psychische Summenskala (Mental Score)
MCH Mittleres Korpuskuläres Hämoglobin (mean corpuscular hemoglobin) MCHC Mittlere Korpuskuläre Hämoglobinkonzentration (mean corpuscular
hemoglobin concentration)
MCV Mittleres Erythrozyteneinzelvolumen (mean corpuscular volume)
MDA Malondialdehyd
MS Massenspektroskopie
MS/MS Tandem-Massenspektroskopie
MW Mittelwert
m/z Masse/Ladungs-Verhältnis
NADH Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid
NADPH Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat
NANC-Transmission Nicht-adrenerge, nicht-cholinerge Neurotransmission NICI Negative Ion Chemical Ionisation
NOS NO-Synthase (Nitric Oxide Synthase)
n.s. nicht signifikant
NYHA New York Heart Association (Klassifikation der Herzerkrankungen)
OP Operation
OPA O-Phthaldialdehyd
oxLDL Oxidiertes LDL
PAP Peroxidase-Anti-Peroxidase (immunhistochemisches Verfahren) pAVK periphere Arterielle Verschlusskrankheit
PBS Phosphatpuffer (Phosphoric Buffered Solution) PCS Körperliche Summenskala (Physical Score) PFB Pentafluorobenzylbromid
PGE1 Prostaglandin E1 (Alprostadil)
PGF1α/2α Prostaglandin F1α/2α
PP Polypropylen
PRMT Protein-Arginin-N-Methyltransferase PTA Perkutane transluminale Angioplastie
PTCA Perkutane transluminale koronare Angioplastie Pyp Pyridoxalphosphataktivierung
ROS Reaktive Sauerstoffspezies (Reactive Oxygen Species) RR Blutdruck (gemessen nach Riva-Rocci)
SAE Schwerwiegendes unerwünschtes Ereignis (Serious Adverse Event) SAR Schwerwiegende Nebenwirkung (Serious Adverse Reaction)
SD Standardabweichung (Standard Deviation) SDMA Symmetrisches Dimethylarginin
SEM Standardfehler (Standard Error of the Mean) SF-12 Standardisierter Fragebogen SF-12®
SIM Selected-Ion Monitoring
SOD Superoxid-Dismutase
SPE Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction) SRM Selected-Reaction Monitoring
THB Tetrahydrobiopterin
TIA Transitorische ischämische Attacke t-PA Tissue Plasminogen Activator ULN Upper Limit of Normal
VCAM-1 Vascular Cell Adhesion Molecule 1
vs. versus
WHO World Health Organisation
1 Einleitung
1.1 Die periphere arterielle Verschlusskrankheit 1.1.1 Definition und Klassifikation
Bei arteriellen Verschlusskrankheiten (AVK) handelt es sich um Erkrankungen, welche durch verengende (stenosierende) und verschließende (okkludierende) Veränderungen an Arterien verursacht werden und zu Durchblutungsstörungen mit Ischämie in versorgungsabhängigen Geweben oder Organen führen. Man unterscheidet je nach Ursache zwischen akuten Arterienverschlüssen und chronischen Verschlusskrankheiten, welche zu 95 % arteriosklerotisch bedingt sind. Weitere Ursachen können entzündliche Gefäßveränderungen (z.B. Thrombangiitis obliterans) und andere Angiitiden (v.a. Kollagenosen) sein.
Die periphere arterielle Verschlusskrankheit (pAVK) ist definiert als Stenose oder Verschluss arterieller Gefäße distal des Aortenbogens mit Ausnahme der Koronararterien. In ca. 90 % sind Arterien der unteren Extremitäten betroffen. Symptomatische arteriosklerotische Durchblutungsstörungen der Arme oder Hände sind seltener (Tabelle 1.1) [Arzneimittelkommission der deutschen Ärzteschaft 2004].
Tabelle 1.1: Häufigkeit der arteriellen Verschlusslokalisation an oberer und unterer Extremität [Arzneimittelkommission der deutschen Ärzteschaft 2004]
Obere Extremität 10 %
Untere Extremität 90 %
Beckentyp Aorta abdominalis, A. iliaca communis, A. iliaca externa und
A. iliaca interna 35 %
Oberschenkeltyp A. femoralis, A. poplitea 50 %
Peripherer Typ A. tibialis anterior und A. tibialis posterior, A. fibularis, Fuß-
und Digitalarterien 15 %
Die klinische Manifestation reicht von asymptomatischen arteriosklerotischen Veränderungen der Blutgefäße und belastungsabhängigen Einschränkungen der Gehstrecke bis zu ischämischen Ruheschmerzen und Nekrosen [Diehm et al. 2004a]. Man unterscheidet zwischen asymptomatischem Stadium, Stadium mit funktioneller, belastungsabhängiger Einschränkung (Claudicatio intermittens) und dem Stadium kritischer Extremitätenischämie.
Die Einteilung der Schweregrade erfolgt entweder nach der Rutherford Klassifikation oder mittels der Stadieneinteilung nach Fontaine. In Europa wird hauptsächlich die Stadieneinteilung nach Fontaine verwendet (Tabelle 1.2) [Hirsch et al. 2006, Dormandy &
Rutherford 2000].
Tabelle 1.2: Stadieneinteilung nach Fontaine
Stadium I Beschwerdefreiheit bei Nachweis von arteriellen Stenosen / Verschlüssen
Stadium II Belastungsabhängige Schmerzen (Claudicatio intermittens) Stadium IIa: Schmerzfreie Gehstrecke > 200 m
Stadium IIb: Schmerzfreie Gehstrecke ≤ 200 m
Stadium III Ruheschmerzen
Stadium IV Trophische Störungen (Nekrosen, Ulzerationen, Gangrän)
Die Diagnose einer peripheren Durchblutungsstörung kann durch Bestimmung des Knöchel- Arm-Index (vgl. Abschnitt 2.4.2) schnell und sicher gestellt werden. Als Grenzwert für das Vorhandensein einer peripheren arteriellen Verschlusskrankheit gilt ein Ruhewert von ≤ 0,9 (Tabelle 1.3) [Norgren et al. 2007, Hiatt 2001].
Der Knöchel-Arm-Index (ABI, Ankle-Brachial Index) ist neben seiner Funktion zur Diagnosestellung der pAVK ein wichtiger unabhängiger Faktor, um das Risiko der Patienten zu prognostizieren [Hirsch et al. 2006]. Patienten mit niedrigem Knöchel-Arm-Index haben ein wesentlich erhöhtes Risiko für schwere vaskuläre Ereignisse oder Tod. Verglichen mit einem ABI von ≥ 1,1 steigt die Mortalität linear mit weiter abnehmendem Index: Die Odds- Ratio liegt für einen ABI von 0,7-0,89 bei 1,7 und für einen ABI von < 0,5 bereits bei 3,6.
Auch Patienten mit einem ABI zwischen 1,1 und 0,9 können nach neuesten Ergebnissen bereits als grenzwertig gefährdet angesehen werden [Diehm et al. 2006].
Tabelle 1.3: Interpretation des Knöchel-Arm-Index (ABI) [Hiatt 2001]
Knöchel-Arm-Index Interpretation
> 0,9 Normalbereich
0,41 – 0,90 gut bis moderat kompensierte pAVK
0,00 – 0,40 schwere pAVK mit kritisch verschlechterter Durchblutung
1.1.2 Prävalenz und epidemiologische Bedeutung
Die periphere arterielle Verschlusskrankheit gewinnt aufgrund demographischer Trends und steigender Anzahl von Patienten mit arteriosklerotischen Gefäßerkrankungen zunehmend an Bedeutung.
Die Prävalenz der pAVK, welche symptomatische und asymptomatische Formen umfasst (ABI ≤ 0,9), liegt in Deutschland für Männer bei 19,8 % und für Frauen bei 16,8 %. Eine Claudicatio intermittens als häufigste symptomatische Form weisen ca. 3 % aller Patienten über 65 Jahren auf. Die erst kürzlich abgeschlossene getABI-Studie (Deutsche epidemiologische Studie zum Knöchel-Arm-Index bei älteren Patienten in hausärztlicher Betreuung) mit 6880 eingeschlossenen Patienten beiderlei Geschlechts im Alter von > 65 Jahren zeigt, dass die Prävalenz der pAVK mit höherem Alter stetig zunimmt. Mit steigender Lebenserwartung der Bevölkerung wird auch die Prävalenz der pAVK in Zukunft ansteigen.
Aus den Ergebnissen der getABI-Studie kann weiterhin abgeleitet werden, dass die überwiegende Mehrheit der Patienten asymptomatisch ist und die Patienten mit intermittierender Claudicatio nur die „Spitze des Eisbergs“ darstellen [Diehm et al. 2004a/b, The getABI Study Group 2002].
1.1.3 Kardiovaskuläres Risikopotenzial und Prognose
Die pAVK gilt als Markerkrankheit für Arteriosklerose. Die Prognose und Lebenserwartung der Patienten mit chronischer pAVK wird nicht so sehr durch den lokalen arteriosklerotischen Prozess in den Extremitätengefäßen bestimmt, sondern vielmehr durch das erhöhte kardiovaskuläre Risiko infolge einer generalisierten systemischen Arteriosklerose.
Etwa 30 % der Patienten mit Claudicatio intermittens sterben innerhalb von fünf Jahren nach Diagnosestellung, die Überlebensrate nach 10 Jahren beträgt 50 % [Diehm et al. 2004a]. Die koronare Herzkrankheit stellt die Haupttodesursache (40-60 %) bei diesen Patienten dar [Dormandy & Rutherford 2000, National Cholesterol Education Program 2001, Criqui et al.
1992]. 40 % der Patienten haben zusätzlich eine symptomatische koronare Herzkrankheit (KHK), 25 % hatten bereits einen Herzinfarkt. Auch von den restlichen Patienten haben viele eine asymptomatische KHK und circa 12 % der Patienten haben Carotisstenosen. Zwischen 10 und 20 % der Patienten sterben an zerebrovaskulären und etwa 10 % an anderen vaskulären Ereignissen [Dormandy & Rutherford 2000].
1.1.4 Pathophysiologische Grundlagen der pAVK
Als Hauptursache für die Manifestation arterieller Durchblutungsstörungen gilt die Arteriosklerose [Ludwig 2003]. Die im folgenden beschriebenen pathophysiologischen Zusammenhänge stellen die Grundlage der therapeutischen Konzepte dar. Chronische Arterienverschlüsse und die daraus folgenden arteriellen Durchblutungsstörungen entstehen aus langsam wachsenden stenosierenden Arterienwandveränderungen (Arteriosklerose). Mit der Zunahme des Stenosegrades der extremitätenversorgenden Arterien kommt es zur Ausbildung eines Kollateralkreislaufs. Dieser kann einerseits aus präformierten Arterien entstehen, andererseits ist die Neubildung von Gefäßen durch Angiogenese möglich, welche durch arterielle Strömungsbeschleunigungen mit Zunahme endothelialer Scherkräfte angeregt wird.
Unter Ruhebedingungen erfolgt der poststenotische Blutfluss im Gewebe über eine reaktive Dilatation der Arteriolen, wodurch es zu einem Blutdruckabfall in den Arterien des minderversorgten Gebietes kommt. Die Senkung des poststenotischen Druckes ist umso größer, je stärker das Strömungshindernis den Blutfluss in der Peripherie beeinträchtigt.
Unter Belastung ist die reaktive Mehrversorgung des peripheren Gewebes über einen Anstieg des Herzzeitvolumens nur begrenzt möglich, so dass hieraus ein verlängerter und verstärkter Abfall des postokklusiven Drucks resultiert. Mit Unterschreiten eines postokklusiven Verschlussdrucks von ca. 60 mm Hg ist die Belastungstoleranz des Patienten in aller Regel klinisch erkennbar verringert.
Das langsame Wachstum chronisch arterieller Gefäßstenosen mit der Bildung von Kollateralen kann dazu führen, dass die kritische Abnahme der Durchblutung im betroffenen Organ lange kompensiert wird und klinische Beschwerdefreiheit besteht (Stadium I nach Fontaine).
Ist die Balance zwischen peripherem Sauerstoffangebot und Laktatabtransport gestört, so treten zunächst belastungsabhängige Muskelschmerzen in der minderversorgten Extremitätenregion auf (Stadium II a/b nach Fontaine). Die weitere Zunahme der Durchblutungsinsuffizienz hat die Ausbildung von Ruheschmerzen zur Folge (Stadium III nach Fontaine). Das Auftreten von Gewebedefekten (Stadium IV nach Fontaine) ist das Resultat der progredienten Durchblutungsinsuffizienz [Ludwig 2003].
1.1.5 Aktuelle Therapiemöglichkeiten der pAVK
Bei der Therapie der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit unterscheidet man zwischen einer Basaltherapie, welche die Progression der Arteriosklerose und die kardiovaskulären Risikofaktoren minimieren und somit die kardiovaskuläre Mortalität absenken soll sowie einer dem Krankheitsstadium entsprechenden symptomatischen Medikation, welche die periphere Durchblutung fördern und somit zu einer Verbesserung der Beschwerden und zu einer erhöhten Lebensqualität der Patienten führen soll. Im folgenden sind die aktuellen Therapiemöglichkeiten bei Patienten mit Claudicatio intermittens dargestellt. Das Stadium II nach Fontaine ist für unsere Studie von besonderem Interesse, weil bei diesen Patienten am ehesten noch mit einer positiven Beeinflussung durch therapeutische Interventionen zu rechnen ist.
Basaltherapie bei Patienten mit Claudicatio intermittens
Die Basaltherapie (Sekundärprävention) im Stadium II umfasst nicht-pharmakologische und pharmakologische Möglichkeiten zur Modifikation der kardiovaskulären Risikofaktoren.
Rauchen ist der bedeutendste etiologische Risikofaktor für die Entstehung und Progression der pAVK. Ein sofortiger und absoluter Rauchverzicht ist somit die wichtigste klinische und kosteneffektivste Maßnahme bei Patienten mit pAVK [Hobbs & Bradbury 2003]. Die nicht- pharmakologischen Möglichkeiten beinhalten auch eine Stabilisierung oder Reduktion des Körpergewichts durch Einhaltung eines gesunden Lebensstils [Must et al. 1999] und die ausführliche Information der Patienten über Etiologie und Prognose ihrer Erkrankung [McDermott et al. 2002 & 2003a].
Aufgrund der hohen kardialen Komorbidität wird die pAVK im US National Cholesterol Education Program (NCEP) als KHK-Äquivalent zu den Indikationen gezählt, bei welchen eine drastische Lipidsenkung notwendig ist [National Cholesterol Education Program 2001].
Die wichtigste pharmakologische Maßnahme um die erwünschte LDL-Konzentration von weniger als 100 mg/dl zu erreichen, ist der Einsatz von HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren (Statinen). Neben der gut belegten Reduktion kardiovaskulärer Ereignisse [Heart Protection Study Collaborative Group 2002, LaRosa et al. 1999] ist ein Zusammenhang zwischen der Einnahme von Statinen und der Progression einer pAVK noch nicht klar belegt.
Untersuchungen zum Effekt lipidsenkender Therapien auf die Intima-Media-Dicke an Carotiden und Femoralarterien lieferten widersprüchliche Ergebnisse [Youssef et al. 2002, Salonen et al. 1995]. In zwei Studien an Patienten mit pAVK konnte jedoch eine verminderte Progression peripherer Gefäßveränderungen beobachtet werden [Buchwald et al. 1996, Pedersen et al. 1998].
Auch die optimale Therapie der weiteren kardiovaskulären Risikofaktoren Hypertonie und Diabetes mellitus sind in der Praxis etabliert, obwohl in großen Studien Endpunke bezüglich peripherer Durchblutungsstörungen nicht untersucht wurden [Stratton et al. 2000, Chiasson et al. 2002]. Der Einsatz eines β-Rezeptorenblockers gilt als lohnend im Bezug auf das kardiovaskuläre Risiko, zumal eine Verschlechterung der Claudicatio unter Therapie mit β- Rezeptorenblockern nicht zu erwarten ist [Radack & Deck 1991]. Einen günstigen Effekt bei Patienten mit pAVK zeigte die Gabe von Angiotensin-Converting-Enzyme(ACE)-Inhibitoren in der HOPE-Studie [The heart outcomes prevention evaluation study investigators 2000].
Der ACE-Hemmer Ramipril konnte das Risiko der primären Endpunkte Tod durch ein kardiovaskuläres Ereignis, Myokardinfarkt und Schlaganfall von 17,7 % in der Placebo- Gruppe auf 14,1 % in der Verum-Gruppe senken. Effekte von Ramipril auf die Progression der pAVK oder die Amputationsraten wurden in der Studie leider nicht untersucht.
Eine weitere essentielle Komponente in der Sekundärprävention bei Patienten mit symptomatischer pAVK ist die Einnahme von Thrombozytenaggregationshemmern [Robless et al. 2001, Matsagas et al. 2002]. Der Einsatz von Acetylsalicylsäure (ASS; Dosis 75 – 325 mg/d) führt zu einer deutlichen Absenkung des kardiovaskulären Risikos [Antiplatelet Trialists´ Collaboration 1994]. In mehreren Meta-Analysen klinischer Studien konnte eine Reduktion der kardiovaskulären und der Gesamtmortalität belegt werden [Hennekens et al.
1997, Antiplatelet Trialists´ Collaboration 1994]. Bei nahezu gleicher Wirksamkeit von ASS und Clopidogrel [CAPRIE Steering Commitee 1996] ist die kostengünstigere Alternative ASS zu bevorzugen. Eine Therapie mit Clopidogrel ist nur gerechtfertigt für Patienten, bei denen eine ASS-Intoleranz oder eine Kontraindikation für ASS vorliegt [Arzneimittelkommission der deutschen Ärzteschaft 2004].
Obwohl die Sekundärprophylaxe von elementarer Bedeutung für Patienten mit pAVK ist, werden nicht alle Patienten in hausärztlicher Betreuung adäquat therapiert. Verglichen mit KHK-Patienten erhalten pAVK-Patienten signifikant weniger Thrombozytenaggregations- hemmer und Statine [Diehm et al. 2006, Hirsch et al. 2001].
Symptomatische Therapie der Claudicatio intermittens
Die Entscheidung zwischen einer konventionellen und einer interventionellen Therapie im Stadium der Claudicatio hängt von der Morphologie des betroffenen Blutgefäßes, vom Ausmaß der Einschränkung der Gehleistung und vom Therapiewunsch des Patienten ab. Im Fall von kurzen isolierten Stenosen (3-5 cm), welche mit einem geringen Risiko interventionell behandelt werden können, ist die Angioplastie bei Patienten mit einer erheblich verkürzten Gehstrecke das Mittel der Wahl. Bei Patienten mit infrainguinalen Stenosen, bei denen eine Angioplastie nicht möglich oder angemessen ist, wird hingegen die konservative Therapie vorgezogen. Operative Maßnahmen werden im Stadium II eher zurückhaltend ergriffen, was dadurch begründet ist, dass in diesem Stadium keine Amputationsgefahr droht, die Funktionstüchtigkeit (Offenheitsraten) rekonstruierter Gefäßsegmente oder angelegter Überbrückungen (Bypass) zeitlich begrenzt ist und ein prinzipielles Mortalitätsrisiko besteht [Arzneimittelkommission der deutschen Ärzteschaft 2004].
Die wichtigste nicht-medikamentöse Maßnahme in der symptomatischen Therapie für Patienten im Stadium II ohne einschränkende Begleiterkrankungen (kardiorespiratorische Insuffizienz, orthopädische oder gravierende neurologische Krankheitsbilder) ist das Gehtraining [Stewart et al. 2002]. Nach Meta-Analysen konnte nach 3 – 12 Monaten Training eine durchschnittliche Zunahme der schmerzfreien Gehstrecke gegenüber Kontrollgruppen um 66 – 78 % erreicht werden [Stewart et al. 2002, Brandsma et al. 1998, Gardner &
Poehlmann 1995].
Als Mittel der Wahl zur Pharmakotherapie bei Claudicatio intermittens in den USA gilt Cilostazol, ein Phosphodiesterase-III-Hemmer mit vasodilatierenden und thrombozyten- funktionshemmenden Eigenschaften. Mehrere Studien haben gezeigt, dass Cilostazol (Dosierung: 2 x 50 mg bzw. 2 x 100 mg) die schmerzfreie und maximale Gehstrecke von Claudicatio-Patienten signifikant erweitern konnte. Auch die Lebensqualität der behandelten Patienten verbesserte sich [Norgren et al. 2007, Hirsch et al. 2006]. Bislang stand Cilostazol in Deutschland für die Therapie nicht zur Verfügung, seit Anfang des Jahres 2007 ist der Arzneistoff unter dem Handelsnamen Pletal® nun aber auf dem europäischen Markt eingeführt.
In Deutschland stehen als weitere medikamentöse Therapie mit Buflomedil, Pentoxifyllin und Naftidrofuryl sogenannte vasoaktive Substanzen für die orale Gabe zur Verfügung, wobei der Nachweis einer klinisch relevanten Wirksamkeit nach evidenz-basierten Kriterien zumeist nicht hinreichend geführt ist [Moher et al. 2000, De Backer et al. 2000].
Für alle drei Arzneistoffe konnten zwar auf der Ebene der Mikrozirkulation positive Effekte gezeigt werden [Hiatt 2001, Girolami et al. 1999], jedoch liegen nur zu Naftidrofuryl klinische Studien jüngeren Datums vor, die den methodischen Anforderungen moderner Prüfrichtlinien weitgehend gerecht werden [Committee for Proprietary Medicinal Products (CPMP) 1990 &
2002] und deren Daten somit für eine evidenz-basierte Therapieempfehlung ausreichen. In der APIEC-Studie konnten Gamand und Mitarbeiter eine Steigerung der schmerzfreien und absoluten Gehstrecke von 92 bzw. 83 % nach 12-monatiger Therapie mit Naftidrofuryl (600 mg/d) beobachten [Kieffer et al. 2001]. In der NCIS-Studie wurde nach 6-monatiger Therapie ebenfalls eine signifikante Zunahme sowohl der schmerzfreien als auch der absoluten Gehstrecke gezeigt [Boccalon et al. 2001].
Die vorhandenen Daten zum Nutzen von Pentoxifyllin sind widersprüchlich. Während frühere Studien bezüglich einer Steigerung der Gehstrecken positiv ausfielen, zeigten spätere Untersuchungen im Vergleich zu Placebo keinen Effekt von Pentoxifyllin auf Gehstrecken und Lebensqualität (Norgren et al. 2007).
Zu Buflomedil existieren zwei kleinere Studien mit marginal positiven Effekten auf die Gehstrecke, welche den klinischen Nutzen ebenfalls unzureichend belegen (Norgren et al.
2007). Aufgrund von Berichten über Fälle schwerer neurologischer und kardiovaskulärer unerwünschter Arzneimittelwirkungen infolge der Einnahme von Buflomedil, welche in erster Linie nach Überdosierung oder Missbrauch dieses durch geringe therapeutische Breite charakterisierten Medikamentes beobachtet wurden, werden sämtliche Chargen verschiedener Hersteller derzeit präventiv aus dem Handel zurückgerufen.
Auch für weitere Arzneimittel wie Nikotinsäurederivate, Ginkgo biloba, Vitamin E, Omega-3- Fettsäuren und Knoblauch-Präparate finden sich keine hinreichenden Daten, die eine präventive oder therapeutische Gabe bei pAVK rechtfertigen würden [Norgren et al. 2007, Arzneimittelkommission der deutschen Ärzteschaft 2004].
Der Einsatz von Prostanoiden ist eine weitere therapeutische Möglichkeit. PGE1 (Alprostadil) beeinflusst hämodynamische, rheologische, hämostatische und metabolische Parameter.
Die zugrunde liegenden Wirkmechanismen sind jedoch noch nicht vollständig aufgeklärt [Weiss T et al. 1998 & 2002, Weiss C et al. 2000].
PGE1 und das Prostazyklinanalogon Iloprost werden intravenös verabreicht. Eine Infusionstherapie wird meist über einen Zeitraum von 2 - 4 Wochen durchgeführt. Für beide Substanzen existieren mehrere Studien zur Behandlung von Patienten mit kritischer Extremitätenischämie [Dormandy & Rutherford 2000]. Zur Therapie der intermittierenden Claudicatio mit PGE1 wurden ebenfalls Studien durchgeführt [Reiter et al. 2002, Diehm et al.
1997]. In der größten Studie an 208 Patienten konnte nach 4-wöchiger intravenöser Infusion von PGE1, gefolgt von einer 4-wöchigen Intervalltherapie mit zwei Infusionen pro Woche, eine Steigerung der absoluten Gehstrecke um 101 % im Vergleich zum Basalwert erreicht werden [Diehm et al. 1997]. In einer Meta-Analyse konnte mit PGE1 eine Zunahme der schmerzfreien Gehstrecke um 28 % und eine 30 %ige Steigerung der absoluten Gehstrecke verglichen mit Placebo festgestellt werden [Reiter et al. 2002]. PGE1 ist jedoch nicht zur Behandlung der pAVK im Stadium II zugelassen und die Zulassung von Iloprost ist in Deutschland auf die Indikation Thrombangitis obliterans im fortgeschrittenen Stadium beschränkt [Fachinformation prostavasin® 10/2004, Fachinformation Ilomedin® 07/2004].
Einen neuen Ansatz verfolgen erste Studien, in denen durch eine gesteigerte Zufuhr der Aminosäure L-Arginin ein positiver Effekt auf die bei arteriosklerotisch veränderten Gefäßen gestörte Endothelfunktion und die Bioverfügbarkeit von Stickstoffmonoxid (NO) gezeigt werden konnte. Die zugrunde liegenden molekularen Zusammenhänge sowie die Ergebnisse bisheriger Studien zum therapeutischen Einsatz von L-Arginin bei Patienten mit peripherer arterieller Verschlusskrankheit werden im Folgenden dargestellt.
1.2 Pathogenese der Arteriosklerose 1.2.1 Allgemeine Grundlagen
Nach der WHO-Definition ist die Arteriosklerose eine variable Kombination von Veränderungen der Intima arterieller Blutgefäße, bestehend aus herdförmigen Ansammlungen von Lipiden, komplexen Kohlenhydraten, Blut und Blutbestandteilen, Bindegewebe sowie Ablagerungen von Calciumsalzen, die mit Veränderungen der Arterienmedia verbunden sind. Streng genommen ist die Arteriosklerose eine von verschiedenen Prozessen bestimmte Verhärtung der Gefäßwand, die auf einer vermehrten Einlagerung von Kollagenfasern und Proteoglykanen beruht. Besonders die Intima der Aorta und der großen Körperschlagadern ist betroffen. Der Begriff Atherosklerose hingegen beschreibt eine progressive pathologische Lipideinlagerung in die Arterienwand (Abbildung 1.1). Die Ursache ist in einem gestörten Lipoproteinstoffwechsel zu suchen und teilt sich in verschiedene Stadien ein [Riede & Schaefer 1999].
Endogene und exogene Faktoren, welche statistisch mit der Arteriosklerose korrelieren werden als Risikofaktoren bezeichnet. Eine Reihe von Risikofaktoren begünstigen kausalpathologisch die Entwicklung einer Arteriosklerose, wobei das Zusammentreffen mehrerer Faktoren die Erkrankungswahrscheinlichkeit erhöht. Zu den bekannten Risikofaktoren zählen Rauchen, Lipidstoffwechselstörungen, Hypertonie, Diabetes mellitus, metabolisches Syndrom (Stammfettsucht, Insulinresistenz und Hyperinsulinämie mit assoziierten Erkrankungen), erhöhte Werte von Lipoprotein(a), Hyperfibrinogenämie (> 300 mg/dl), Hyperhomocysteinämie (> 12 mg/dl), Antiphospholipid-Antikörper, genetisch bedingte t-PA-Defekte, Bewegungsmangel, Adipositas und psychosozialer Streß. Zu den unbeeinflußbaren Risikofaktoren gehören eine positive Familienanamnese, erhöhtes Lebensalter sowie männliches Geschlecht [Thews/Mutschler/Vaupel 1999].
Allerdings können diese bislang am besten untersuchten Risikofaktoren nicht bei allen Patienten das Auftreten schwerwiegender ischämischer Ereignisse ausreichend erklären.
Abbildung 1.1: Formale Pathogenese der Atherosklerose [aus: Riede & Schaefer 1999]
1.2.2 Physiologische Rolle von Stickstoffmonoxid (NO) im Gefäßsystem
Stickstoffmonoxid (NO) ist der potenteste endogene Vasodilatator im Gefäßsystem [Vallance et al. 1989]. Im Gefäßsystem besitzt NO jedoch neben seiner vasodilatierenden Eigenschaft auch modulierende Eigenschaften auf weitere in die Pathogenese der Arteriosklerose involvierte Faktoren (Abbildung 1.2). NO wirkt als Thrombozytenaggregationshemmer [Radomski et al. 1990] und inhibiert die Adhäsion mononukleärer Leukozyten an das Endothel [Kubes et al. 1991, Böger et al. 1998c]. Stickstoffmonoxid hemmt konzentrationsabhängig die Proliferation kultivierter glatter Gefäßmuskelzellen [Garg &
Hassid 1988c, Böger et al. 1998c] und reduziert die Bildung freier Sauerstoffradikale in der hypercholesterinämischen Gefäßwand sowie in isolierten Leukozyten [Böger et al. 1995a, Candipan et al. 1996, Böger et al 1997b]. Diese Wirkung beruht zum Teil auf einer direkten inhibitorischen Wirkung von NO auf Radikal-bildende Enzyme wie NADPH-Oxidasen [Clancy et al. 1992]. Auch eine hemmende Wirkung von NO auf die Oxidation von LDL Lipoproteinen wurde nachgewiesen [Hogg et al. 1993], wobei allerdings bislang unklar geblieben ist, ob dieser Effekt durch weitere Mechanismen als die Hemmung oxidativer Enzyme bedingt ist.
Dieses breite Spektrum der physiologischen Effekte von NO auf das gesamte kardiovaskuläre System führte zu der Bezeichnung „endogenes anti-arteriosklerotisches Molekül“ [Tsao & Cooke 1994].
Abbildung 1.2: Effekte von Stickstoffmonoxid (NO) in der Gefäßwand [modifiziert nach Bode-Böger et al. 1997]
Durch die kontinuierliche basale Freisetzung von NO aus Endothelzellen wird ein vasodilatierender Gefäßtonus aufrecht erhalten, welcher im gesunden Gefäßsystem eine Reihe endothelialer vasokonstriktorischer Einflüsse (z.B. Endothelin-1, Angiotensin II, Adrenalin und vasokonstriktorische Prostaglandine) antagonisiert [Rees et al. 1989]. Neben der kontinuierlichen basalen NO-Aktivität, kann die Bildung von NO in Endothelzellen durch
NO-Sythase L-Arginin
LDL-Oxidation
Superoxidradikalproduktion Proliferation glatter Gefäßmuskelzellen Monozytenadhäsion Thrombozytenaggregation Vasodilatation
ADMA
NO
verschiedene physikalische und chemische Stimuli gesteigert werden und in der Folge eine weitere endothelabhängige Vasodilatation bewirken. Zu den chemischen Mediatoren gehören Acetylcholin, Bradykinin, Adenosindiphosphat (ADP), Serotonin und Substanz P, welche ihre Wirkung durch Rezeptoren vermitteln (Abbildung 1.3) [Rees et al. 1989]. Die Freisetzung von vasokonstriktorischen Substanzen, wie Serotonin, ADP sowie plättchenaktivierendem Faktor aus aktivierten Blutplättchen führt bei intaktem Endothel zur Bildung von NO in den Endothelzellen und infolgedessen zu einer Gefäßerweiterung [Furchgott 1984, Moncada & Higgs 1993].
Bei geschädigtem Endothel (z.B. durch arteriosklerotische Plaques) fehlt die vasodilatierende Wirkung von NO. Die Plättchenfaktoren üben ihre Wirkung direkt auf die Muskelzellen der Gefäßwand aus, was zu einer Vasokonstriktion führt [Förstermann et al.
1988a & 1988b]. Ein wichtiger physikalischer Stimulus der endothelialen NO-Synthese ist der Blutfluss-induzierte „shear stress“. Durch die auf die Endotheloberfläche ausgeübte Scherkraft des vorbeiströmenden Blutes werden Kalium-Kanäle an der luminalen Zellmembran der Endothelzellen aktiviert, welche die NO-Synthese steigern [Pohl et al.
1986, Cooke et al. 1991]. Dieses Phänomen ist in der klinischen Praxis als poststenotische Vasodilatation [Bollinger 1982] bekannt, bei der eine Lumenverengung arterieller Gefäße zur lokalen Steigerung der Strömungsgeschwindigkeit des Blutes führt und infolgedessen eine verstärkte NO-Freisetzung bewirkt. Blutfluss-induzierte Vasodilatation tritt auch während physischer Belastung auf [Gilligan et al. 1994].
Es konnte nachgewiesen werden, dass diese Vasodilatation durch NO vermittelt wird [Wang et al. 1993]. Die Beobachtung, dass beim Menschen nach 30-minütiger submaximaler körperlicher Belastung die Exkretionsraten von NO3- und cGMP im Urin auf das Doppelte des Ausgangswertes anstiegen [Bode-Böger et al. 1994b], zeigte, dass eine gesteigerte periphere Durchblutung hervorgerufen durch die körperliche Ausdauerleistung ebenfalls ein potenter physiologischer Stimulus der systemischen NO-Produktion ist. Nach chronischem Belastungstraining konnte bei Hunden eine gesteigerte Expression der endothelialen NOS (NOS III) beobachtet werden [Sessa et al. 1994]. Bei Patienten mit koronarer Herzkrankheit konnte nach 4-wöchigem körperlichen Ausdauertraining ebenfalls eine signifikante Zunahme NOS III-Genexpression und -Enzymaktivität gezeigt werden [Hambrecht et al. 2003]. Es ist somit plausibel, dass eine gesteigerte NOS-Aktivität für die günstigen Effekte körperlichen Ausdauertrainings auf das kardiovaskuläre System mitverantwortlich ist.
1.2.3 Rolle einer verminderten Bioverfügbarkeit von NO in der Pathogenese der Arteriosklerose
Es gibt viele wissenschaftliche Hinweise für die zentrale Rolle einer verminderten Bioverfügbarkeit von endothelial gebildetem NO in der Entstehung und Progression der Arteriosklerose und ihrer klinischen Folgen [Yang & Ming 2006]. Bei Patienten mit nachgewiesener Arteriosklerose findet man eine Abschwächung der endothelabhängigen, NO-vermittelten Relaxation [Böger et al. 1996b, Busse & Fleming 1996]. Eine endotheliale Dysfunktion ist jedoch häufig bereits bei asymtomatischen Patienten mit verschiedenen kardiovaskulären Risikofaktoren wie Hypercholesterinämie [Creager et al. 1990], Rauchen [Zeiher et al. 1995], Hyperhomocysteinämie [Celermajer et al. 1993, Tawakol et al. 1997] und Hypertonie [Panza et al. 1990] sowie bei Patienten mit Diabetes mellitus [Pieper & Gross 1991] vorhanden. Die endotheliale Dysfunktion entsteht nicht nur in den großkalibrigen Arterien mit arteriosklerotischen Plaques [Cooke et al. 1991]. Sowohl in isolierten menschlichen Koronarien [Förstermann et al. 1988a] als auch in der koronaren Mikrozirkulation bei Patienten mit Hypercholesterinämie [Drexler et al. 1991] konnte eine Abschwächung endothelabhängier Relaxation beobachtet werden. Im Zusammenhang mit dem Schweregrad der Erkrankung konnte auch bei Patienten mit pAVK eine reduzierte NO- Produktion gezeigt werden [Böger et al. 1997a].
Die wesentlichen zugrunde liegenden Mechanismen der endothelialen Dysfunktion bei Arteriosklerose werden noch immer intensiv untersucht. Verschiedene Mechanismen werden diskutiert, jedoch lassen sich weder Störungen innerhalb der komplexen Zusammenhänge der Arteriosklerose noch innerhalb der verschiedenen Regulationsmechanismen der NO- Synthese allein durch eine einzelne Ursache vollständig erklären. Die bisherigen Forschungsergebnisse deuten darauf hin, dass die endotheliale Dysfunktion im wesentlichen durch eine reduzierte NO-Synthase-Aktivität (z.B. Hemmung der NOS durch endogene Inhibitoren, vgl. Abschnitt 1.3.5) oder einen gesteigerten Abbau (z.B. oxidative Inaktivierung durch reaktive Sauerstoffspezies, vgl. Abschnitt 1.2.4) verursacht wird [Bode-Böger 2006, Yang & Ming 2006, Förstermann 2006].
1.2.4 Oxidativer Stress und endotheliale Dysfunktion
Freie Radikale sind aufgrund ihrer chemischen Struktur, die ein ungepaartes Elektron aufweist, sehr reaktiv. Man geht davon aus, dass freie Radikale die Struktur und Funktion von Biomolekülen (Proteine, Zucker und Fettsäuren) intakter Zellen schädigen können [Awad et al. 1996].
In einem gesunden Organismus existieren Schutzmechanismen, die einer unkontrollierten Oxidation von Biomolekülen, dem sogenannten oxidativen Stress, entgegenwirken. Hierzu gehören vor allem Glutathion (GSH), die antioxidativ wirkenden Vitamine A, C und E sowie die Enzyme Superoxid-Dismutase (SOD) und Glutathion-Peroxidase (GPX) [Frei 1994, Di Mascio et al. 1991, Halliwell & Gutteridge 1990]. Doch diese Schutzmechanismen haben nur ein begrenztes Potential und sind nicht in der Lage, die durch erhöhten oxidativen Stress verursachten Defekte gänzlich zu verhindern [Halliwell & Cross 1994, Halliwell 1996].
Erhöhter oxidativer Stress durch sogenannte reaktive Sauerstoffverbindungen (reactive oxygen species, ROS) konnte bei verschiedenen kardiovaskulären Erkrankungen nachgewiesen werden und steht im Zusammenhang mit der endothelialen Dysfunktion [Förstermann 2006]. Bei Patienten mit fortgeschrittener Arteriosklerose ist zudem die Aktivität der extrazellulären Superoxid-Dismutase signifikant reduziert, was eine weitere Verschlimmerung der endothelialen Dysfunktion zur Folge hat [Landmesser et al. 2006].
Als einer der Hauptfaktoren im entzündungsähnlichen Prozess der Arteriosklerose gelten die Granulozyten [Tsao et al. 1994]. Neutrophile Granulozyten wandern chemotaktisch angelockt in die Intima der Gefäße ein [Katsuda et al. 1993] und setzen dort mit Hilfe ihres NADPH- Oxidase-Systems toxische Sauerstoffverbindungen (H2O2, O2-) frei. Neben den neutrophilen Granulozyten wandern auch Makrophagen in die geschädigte Intima ein. Sie bilden wie die Granulozyten toxische Sauerstoffverbindungen und Arachidonatabkömmlinge. Die Freisetzung von Superoxid-(O2-)Radikalen ist somit in der arteriosklerotischen Gefäßwand massiv gesteigert [Mügge et al. 1994, Ohara et al. 1993]. Superoxide entstehen ebenso in Endothel- und Gefäßzellen durch eine membrangebundene NADH/NADPH-Oxidase [Garg &
Hassid 1989]. Eine weitere Quelle von Superoxidradikalen ist die Xanthinoxidase, die im Purinstoffwechsel Hypoxanthin zu Xanthin oxidiert. Verschiedene Studien konnten eine deutlich gesteigerte NADPH-Oxidase-Aktivität in der Gefäßwand bei kardiovaskulären Erkrankungen nachweisen. Die Bedeutung der Xanthinoxidasen in der endothelialen Dysfunktion ist noch relativ unklar [Förstermann 2006]. Beide Oxidasen können direkt durch NO gehemmt werden, jedoch ist die biologische Aktivität von NO bei Arteriosklerose stark vermindert (vgl. Abschnitt 1.2.3) [De Keulenaer et al. 1998, Clancy et al. 1992].
Bei einer verminderten Bioverfügbarkeit von NO scheint die Bildung freier Radikale pathologisch erhöht zu sein. Niu und Mitarbeiter beschrieben erstmals, dass es durch eine Hemmung der NO-Synthase mit L-NAME zu einer erhöhten O2--Freisetzung kommt [Niu et al. 1994]. Ähnliche Ergebnisse brachten Experimente mit kultivierten Endothelzellen, in denen sich bei Anwesenheit von nativem LDL die Konzentration der Superoxidradikale erhöhte [Pritchard et al. 1995]. Auch oxLDL trägt zur weiteren Verminderung der NO-
Syntheserate sowie zur oxidativen Inaktivierung von NO bei [Simon et al. 1990, Liao et al.
1995, Plane et al. 1992].
Neuere Untersuchungen entdeckten die endotheliale NO-Synthase (NOS III) selbst als bedeutende Quelle dieser gesteigerten Superoxid-Produktion bei Arteriosklerose, welche über einen „eNOS-Entkopplungs“-Mechanismus verläuft. Der physiologisch ablaufende Elektronenfluss einer intakten NOS III benötigt die Dimerisation des Enzyms (vgl. Abschnitt 1.3.3). Bei vielen kardiovaskulären Erkrankungen ist nicht nur die NADPH-Oxidase-Aktivität in der Gefäßwand erhöht, sondern auch die Aktiviät der NOS III. Die jeweiligen Produkte beider Enzyme reagieren miteinander zu Peroxynitrit (ONOO-) [Laursen et al. 2001, White et al. 1994]. Diese Inaktivierung senkt die biologische Verfügbarkeit von NO und gleichzeitig oxidiert Peroxynitrit den essentiellen Co-Faktor der NOS III (6R)-5,6,7,8-tetrahydro-L- biopterin (BH4) [Laursen et al. 2001, Milstien & Katusic 1999] und/oder schädigt oxidativ den Zinkthiolat-Komplex der NOS III [Zou et al. 2002]. Dadurch wird die O2-Reduktion der NOS III von der NO-Bildung abgekoppelt und aus der funktionellen endothelialen NO-Synthase wird ein zum vaskulären oxidativen Stress beitragendes Superoxid-bildendes Enzym [Stuehr et al. 2001]. Auch die Anwesenheit größerer Mengen des endogenen Inhibitors ADMA kann neben der direkten Hemmung der NOS (vgl. Abschnitt 1.3.5) zur einer „eNOS-Entkopplung“
und damit zu erhöhtem oxidativen Stress beitragen. Erhöhter oxidativer Stress kann wiederum zu einer erhöhten ADMA-Produktion und/oder einem verminderten ADMA- Metabolismus führen, da die Aktivitäten beider in den ADMA-Stoffwechsel involvierten Enzyme Redox-empfindlich sind [Förstermann 2006].
Eine gestörte Endothelfunktion kann somit gleichzeitig als Ursache und Folge arteriosklerotischer Gefäßveränderungen angesehen werden. Bei Patienten mit Gefäßkrankheiten ist der Abbau von Stickstoffmonoxid durch Reaktion von NO und Superoxid zu Peroxynitrit mit hoher Wahrscheinlichkeit gesteigert. Die daraus resultierende verminderte Bioverfügbarkeit von NO führt zu einer „eNOS-Entkopplung“ und Veränderungen in der Aktivität der NOS III. Dadurch kommt es zu einer weiter reduzierten NO- und einer gesteigerten Superoxid-Produktion [Bode-Böger 2006, Yang & Ming 2006, Förstermann 2006].
1.3 Der L-Arginin/Stickstoffmonoxid (NO)-Stoffwechselweg
1.3.1 L-Arginin als Vorstufe für die endogene Stickstoffmonoxidsynthese
Das Endothel spielt eine entscheidende Rolle in der Vasodilatation von Blutgefäßen als Antwort auf eine Reihe von Arzneistoffen. In 1980 entdeckten Furchgott und Mitarbeiter, dass die Fähigkeit von Acetylcholin, isolierte Blutgefäße zu erweitern, zwingend von einer intakten Funktion der innersten Zellauskleidung der Blutgefäße, dem Gefäßendothel, abhängt [Furchgott et al. 1980]. Die Endothelzellen produzieren nach Stimulation mit Acetylcholin und anderen Substanzen (Abbildung 1.3) einen zunächst nicht identifizierten, extrem kurzlebigen Faktor, der nach seiner Wirkung „endothelium-derived relaxing factor“
(EDRF) benannt wurde [Furchgott 1984]. Die Gruppe um Salvador Moncada identifizierte 1987 Stickstoffmonoxid (NO) als Wirkprinzip des relaxierenden endothelialen Faktors (EDRF) [Palmer et al. 1987]. Später wurde die Aminosäure L-Arginin als biologische Vorstufe von endothelial-gebildetem NO entdeckt [Schmidt et al. 1988, Palmer et al. 1988].
Abbildung 1.3: Schema des L-Arginin-Stickstoffmonoxid-Stoffwechselwegs in der Gefäßwand [aus: Böger et al. 1996b/c]. ADP, Adenosin-diphosphat; A 23187, Calcium- Ionophor A 23187; L-NAME, Nω-Nitro-L-Arginin-Methylester; L-NMMA, Nω-Monomethyl-L- Arginin; cGMP, zyklisches 3´,5´-Guanosinmonophosphat
1.3.2 Biochemische und physiologische Bedeutung von L-Arginin
L-Arginin ist ein basische, semi-essentielle Aminosäure [Rose et al. 1948]. Bei Zugrundelegung einer ausgewogenen mitteleuropäischen Diät wird L-Arginin in einer Menge von ca. 5 – 6 g/Tag mit der Nahrung aufgenommen. Diese Menge entspricht 1 – 2 % der gesamten Nahrungsaufnahme und 5 – 6 % der gesamten Proteinzufuhr beim Menschen [Visek 1986]. Neben der Zufuhr mit der Nahrung ist die Neusynthese von L-Arginin eine wichtige Quelle für diese Aminosäure, die Hauptsyntheseorgane sind Leber und Niere.
Während in der Leber synthetisiertes L-Arginin praktisch vollständig im lebereigenen Stoffwechsel metabolisiert wird [White & Christensen 1983], ist die Niere das Hauptorgan der L-Arginin-Neusynthese zur Aufrechterhaltung des physiologischen Plasmaspiegels [Borsook
& Dubnoff 1941]. Somit wird die Homöostase des Plasma-L-Arginin-Spiegels durch ein Gleichgewicht zwischen diätetischer L-Arginin-Zufuhr und metabolischem Abbau reguliert. Ist der Metabolismus von L-Arginin z.B. durch Wundheilung, Sepsis oder Körperwachstum gesteigert, kann L-Arginin zur essentiellen Aminosäure werden [Castillo et al. 1993b].
Abbildung 1.4: Stoffwechselwege, an denen L-Arginin beteiligt ist [aus: Bode-Böger 1999]: 1. Biosynthese von NO aus L-Arginin durch die NO-Synthasen; 2. Synthese von L- Citrullin aus L-Arginin unter Abspaltung eines Moleküls Ammoniak durch das Enzym Arginindeaminase; 3. Abspaltung von Harnstoff aus L-Arginin unter Bildung von Ornithin im Harnstoffzyklus durch das Enzym Arginase; 4. Decarboxylierung von L-Arginin zu Agmatin durch die Arginindecarboxylase; 5. Methylierung von L-Arginin durch Methyltransferasen (nur für Argininseitengruppen innerhalb von Proteinen); 6. Metabolisierung von Methylargininen zu Citrullin durch das Enzym Dimethylarginin-Dimethylaminohydrolase (DDAH)
L-Arginin ist im Intermediärstoffwechsel für eine Vielzahl von Stoffwechselwegen von Bedeutung (Abbildung 1.4). Für die vorliegende Arbeit ist jedoch in erster Linie die Rolle von L-Arginin als Substrat der NO-Synthase, sowie die sich daraus ergebenden pharmakologischen Wirkungen, von Interesse.
1.3.3 Synthese von Stickstoffmonoxid
Das an der Synthese von Stickstoffmonoxid (NO) aus L-Arginin beteiligte Enzym, die NO- Synthase (NOS), wurde 1991 isoliert und kloniert [Bredt et al. 1991, Pollock et al. 1991]. Die NOS oxidiert L-Arginin in einer zweistufigen Reaktion an der terminalen Guanidino- Stickstoffgruppe. Über das Zwischenprodukt Nω-OH-L-Arginin entstehen das gasförmige NO und L-Citrullin als Nebenprodukt. NADPH liefert zwei Elektronen für den initialen Oxidationsschritt und ein weiteres Elektron für die abschließende Oxidation, gleichzeitig wird ein Molekül Sauerstoff verbraucht (Abbildung 1.5) [Stuehr et al. 2001]. Für diese Reaktion muss ein Homodimer gebildet werden [Förstermann 2006].
Abbildung 1.5: Schema der Bildung von NO aus der Vorstufe L-Arginin durch das stereospezifische Enzym NO-Synthase. NADPH, Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid- Phosphat, reduzierte Form; THB, 6(R)-5,6,7,8-Tetrahydrobiopterin; FAD, Flavin-Adenin- Dinucleotid; FMN, Flavin-Mononucleotid; Ca2+, Calcium; CaM, Calmodulin; L-NMMA, Nω- Monomethyl-L-Arginin; L-NNA, Nω-Nitro-L-Arginin; L-NAME, Nω-Nitro-L-Arginin-Methylester
Bislang sind drei Isoformen des Enzyms NO-Synthase bekannt (Tabelle 1.4). Die NO- Synthase I (NOS I) wird konstitutiv in neuronalen und epithelialen Zellen exprimiert. Ihre Funktionen liegen damit zum einen im zentralen Nervensystem, wo NO an der langfristigen Modulation synaptischer Plastizität beteiligt ist. Zum anderen spielt NO eine wichtige Rolle als atypischer Neurotransmitter im peripheren Nervensystem (NANC-Transmission: nicht- adrenerge, nicht-cholinerge Neurotransmission) [Sheng et al. 1993]. Eine weitere Isoform ist die induzierbare NO-Synthase (NOS II), welche in verschiedenen Cytokin-induzierbaren Zelltypen (z.B. aktivierten Makrophagen) isoliert werden konnte [Stuehr 1991]. Von diesen Abwehrzellen können bei Bedarf große Mengen an NO produziert werden. Aufgrund der hohen Affinität von NO zu Protein-gebundenem Eisen werden dadurch essentielle eisenhaltige Enzyme in den Zielzellen blockiert [Nathan & Hibbs 1991]. Weitere zellschädigende Mechanismen von Stickstoffmonoxid sind die direkte Desaminierung von DNA und die oxidative Schädigung durch Peroxynitrit [Wink et al. 1991, Fehsel et al. 1993].
Eine Kombination dieser Effekte könnte den Mechanismus der zytostatischen und zytotoxischen Effekte auf Mikroorganismen und Tumorzellen darstellen [Förstermann et al.
1994]. Die Isoform NOS III wird wie die NOS I konstitutiv exprimiert und kommt hauptsächlich in Endothelzellen vor. Durch bestimmte Mechanismen (z.B. shear stress) kann die basale Expression der endothelialen NO-Synthase zusätzlich gesteigert werden [Nishida et al. 1992]. Die insgesamt als „antiarteriosklerotisch“ bezeichneten Effekte von endothelial- gebildetem NO wurden im Abschnitt 1.2.2 bereits beschrieben.
L-Arginin und molekularer Sauerstoff sind Substrate aller drei Isoformen der NOS.
Entscheidend für ihre Aktivität sind außerdem die zur Reaktion benötigten Co-Faktoren Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat (NADPH), Flavin-Adenin-Dinucleotid (FAD), Flavin-Mononucleotid (FMN) und 6(R)-5,6,7,8-Tetrahydrobiopterin [Förstermann et al. 1994].
Die Enzymaktivität der Isoformen I und III wird durch eine rezeptorvermittelte (z.B.
Acetylcholin) oder rezeptorunabhängige (z.B. Calcium Ionophor A23187) Erhöhung der zytoplasmatischen Ca2+-Konzentration und Calmodulin gesteuert [Förstermann et al. 1990, Förstermann et al. 1991]. Die Aktivität der Isoform II wird dagegen auf der Ebene der Transkription reguliert und ist trotz einer vorhandenen Bindungsstelle für Calmodulin Ca2+- unabhängig [Lyons et al. 1992].
Tabelle 1.4: Biochemische und physiologische Charakteristika der drei NO-Synthase- Isoenzyme [aus: Böger et al. 1996c]
NOS I NOS II NOS III
Zelltypen Neurone und Epithelzellen verschiedene Cytokin-
induzierbare Zelltypen Endothelzellen
Molekulargewicht 150 kDA 130 kDA 135 kDA
Lokalisation löslich, zytoplasmatisch löslich, zytoplasmatisch partikulär
Expression konstitutiv induzierbar konstitutiv
Aktivität niedrig/kurzdauernd hoch/langanhaltend niedrig/kurzdauernd
Co-Faktoren NADPH, 6(R)-5,6,7,8-Tetrahydrobiopterin, FAD, FMN (für alle drei Isoenzyme) Regulation Ca2+, Calmodulin auf Ebene der Transkription Ca2+, Calmodulin Funktion
physiologisch
pathophysiologisch
ZNS:
synaptische Plastizität;
periphere Nerven:
NANC-Transmission („nitrinerge Nerven“)
NMDA-Rezeptor-vermittelter neuronaler Zelltod
(zerebrale Ischämie)
Zytotoxizität;
Hemmung eisenhaltiger Enzyme
septischer Schock Autoimmunerkrankungen
Vasodilatation, Hemmung der Thrombozytenaggregation, Leukozytenadhäsion und Pro- liferation glatter Gefäßmuskel- zellen
Arteriosklerose, Hypertonie, Diabetes mellitus
Daten aus: Förstermann et al. 1994, Stuehr et al. 1991, Mayer et al. 1991, Pollock et al. 1991.
Abkürzungen: NADPH: Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat, reduzierte Form; FAD: Flavin-Adenin-Dinucleotid; FMN:
Flavin-Mononucleotid; ZNS: zentrales Nervensystem; NANC-Transmission: nicht-adrenerge, nicht-cholinerge Neurotransmission; NMDA: N-Methyl-D-Aspartat.
1.3.4 Das „L-Arginin-Paradox“
Nachdem L-Arginin als Substrat der NO-Synthase charakterisiert worden war, richtete sich das Interesse auf die mögliche Rolle von L-Arginin für die Regulation der NO-Synthase- Aktivität. Die Michaelis-Menten-Konstanten (Km) der NO-Synthasen für L-Arginin werden mit 1,4-2,2 µM für NOS I, 2,8-32,3 µM für NOS II und 2,9 µM für NOS III angegeben [Förstermann et al. 1994]. In frisch isolierten Endothelzellen konnten intrazelluläre L-Arginin- Konzentrationen von bis zu 2 mM gefunden werden [Hecker et al. 1990]. Betrachtet man diesen Wert und die für isolierte, aufgereinigte NO-Synthase aus Rinderaortenendothelzellen angegebene Km = 2,9 µM für L-Arginin, so ist die NO-Synthase zwar von L-Arginin als Substrat abhängig, bei physiologischen L-Arginin-Konzentrationen wäre das Enzym in Endothelzellen allerdings als gesättigt zu betrachten [Tsikas et al. 2000a].
Überraschenderweise konnten jedoch verschiedene Studien nach intravenöser oder oraler Supplementation von L-Arginin einen positiven Effekt auf die endotheliale NO-Produktion zeigen [Drexler et al. 1991, Cooke et al. 1991, Bode-Böger et al. 1998]. Dieses Phänomen wird auch als „L-Arginin-Paradox“ bezeichnet [Förstermann et al. 1994]. Eine mögliche Erklärung hierfür ist die Hemmung der NO-Synthase durch endogene guanidino-substituierte L-Arginin-Analoga [Tsikas et al. 2000a].
1.3.5 Bedeutung endogener Inhibitoren für die Regulation der NO-Synthese
Bislang sind drei endogen vorkommende guanidino-substituierte L-Arginin-Analoga bekannt (Abbildung 1.6). Die asymmetrisch substituierten Methylarginine ADMA (asymmetrisches Dimethylarginin) und L-NMMA (N-Monomethyl-L-Arginin) sind potente kompetitive Inhibitoren der NO-Synthase. Der IC50 für L-NMMA auf alle drei Isoformen der NOS liegt bei 2 – 5 µM, die inhibitorische Wirkung von ADMA ist nahezu gleichwertig. Da die Plasmakonzentration von ADMA beim Menschen 10-fach höher ist als natürlich vorkommende L-NMMA Konzentrationen, wird ADMA als der wichtigste endogene Inhibitor der NOS angesehen [Leiper & Vallance 1999]. SDMA (symmetrisches Dimethylarginin) hat keinen Effekt auf die NO-Synthase [Vallance et al. 1992].
N
H2 O
N H
NH N H2
OH
N
H2 O
N H
N N H
OH CH3 CH3
O N H
N N H
OH CH3 CH3
N H2 N
H2 O
N H
N N H2
OH CH3
L-Arginine NMMA SDMA ADMA
Abbildung 1.6: Struktur von L-Arginin und endogenen Methylargininen [aus: Leiper &
Vallance 2006]. L-NMMA, Nω-Monomethyl-L-Arginin; ADMA, NωNω-Dimethylarginin; SDMA, NωN´ω-Dimethylarginin
Alle drei freien Methylarginine konkurrieren untereinander und mit L-Arginin nicht nur um die Bindungsstelle der NO-Synthase, sondern auch um den Transport über das induzierbare y+- Transportsystem hCAT-2B [Closs et al. 1997]. Mögliche funktionelle Effekte dieser Tatsache auf die NO-Synthese sind jedoch bisher nicht genau bekannt [Leiper & Vallance 1999]. Die Hemmung des hCAT-2B-abhängigen L-Arginin-Transports durch SDMA kann durch einen Überschuss von L-Arginin rückgängig gemacht werden. Der inhibitorische Effekt der Methylarginine auf die NOS-Isoenzyme könnte folglich von der extrazellulären Konzentration an ADMA, SDMA, L-NMMA und L-Arginin abhängen. Die in vivo gesteigerte NO-Produktion nach Gabe hoher Dosen L-Arginin kann dann möglicherweise als Ergebnis eines Austauschs intrazellulärer Inhibitoren gegen zirkulierendes L-Arginin angesehen werden [Tsikas et al.
2000a].
Terminale Guanidino-Gruppen der in Proteinen eingebauten Aminosäure L-Arginin werden von einer Familie so genannter PRMT(Protein-Arginin-N-Methyltransferase)-Enzyme methyliert [Clarke 1993]. Die Proteolyse dieser Methylarginin-enthaltenden Proteine führt zu einer Freisetzung der Methylarginine ins Zytoplasma [Kakimoto et al. 1970]. Synthese und Abbau von methylierten Proteinen sind eng an Proteinsynthese und -abbau gebunden [Miyake & Kakimoto 1976]. So könnten freie Methylarginine in Geweben mit hohem Protein- Turnover in einer für die Hemmung der NOS ausreichenden Menge vorkommen [Tran et al.
2003]. Unter bestimmten Bedingungen ist auch in Geweben mit normalerweise niedriger Zellteilungsrate ein erhöhter Turnover festzustellen. So findet man beispielsweise in Endothelzellen an Stellen mit hohen Turbolenzen (Arterienabzweigungen) proportional viele proliferierende Zellen [Alberts et al. 1994]. Erkrankungen und Zustände, welche mit erhöhtem Proteinabbau einhergehen (z.B. Diabetes mellitus) [Dice & Walker 1979], könnten ebenso zu erhöhten Spiegeln an freien Methylargininen führen [Tran et al. 2003].
Ogawaga und Mitarbeiter identifizierten 1989 das Enzym DDAH (Dimethylarginin Dimethylaminohydrolase), welches spezifisch die asymmetrischen Methylarginine ADMA und L-NMMA, aber nicht SDMA, zu Citrullin und Mono- oder Dimethylamin hydrolysiert [Ogawaga et al. 1989]. Eine zweite Isoform der DDAH wurde 1999 von Leiper und Mitarbeitern identifiziert. DDAH I und II sind funktionell identisch, sie unterscheiden sich jedoch in ihrer Gewebelokalisation (Tabelle 1.5), was auf eine Isoform-spezifische Regulation der NOS via Modulation der Methylarginin-Konzentration hinweist. So findet man die DDAH I in Geweben, in denen hauptsächlich NOS I exprimiert wird (Gehirn, Niere). Die Isoform DDAH II wird in Herz, Plazenta und Niere stark exprimiert, wo verstärkt NOS III zu finden ist [Leiper et al.
1999].
Tabelle 1.5: Quantifizierung der DDAH-Isoform-Expression in menschlichem Gewebe mittels Northern-Blot [Leiper et al. 1999]
Gehalt an Isoform (% des Maximums)
Gewebe DDAH I DDAH II
Herz 15 100
Gehirn 56 19
Placenta 12 56
Lunge 16 36
Leber 42 26
Skelettmuskel 27 25
Niere 100 70
Pankreas 47 34
Die Vermutung, dass DDAH die Akkumulation von intrazellulärem ADMA verhindert und somit einen wichtigen Regulator der NOS-Aktivität darstellt, konnte durch eine pharmakologische Studie mit dem DDAH-Inhibitor S-2-Amino-4(3- Methylguanidino)Buttersäure (4124W) bestätigt werden [MacAllister et al. 1996]. Die vaskulären Effekte von 4124W lassen sich am besten als eine indirekte Hemmung der NOS infolge einer Akkumulation von ADMA durch Hemmung des Enzyms DDAH erklären.
Sowohl Bildung als auch Metabolismus der endogenen Inhibitoren der Stickstoffmonoxidsynthese stellen aktiv gesteuerte Prozesse dar (Abbildung 1.6).
Intrazelluläre- und Plasmakonzentration der Methylarginine werden durch diese beiden Stoffwechselvorgänge limitiert, eine Fehlregulation kann zu erhöhten Konzentrationen freier Methylarginine und damit zu einer Hemmung der NO-Syntase führen [Tran et al. 2003].
