Bedeutung des LPA1-Rezeptors für die pulmonale Alveolarisation in der Maus

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Medizinischen Hochschule Hannover

Bedeutung des LPA

1

-Rezeptors für die pulmonale Alveolarisation in der Maus

Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der

Medizinischen Hochschule Hannover

vorgelegt von

Stefanie Matthieu aus Halle/Westf.

Hannover 2019

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am: 06.12.2019

Gedruckt mit der Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover

Präsident: Prof. Dr. med. Michael P. Manns Betreuer/in der Arbeit: Prof. Dr. med. Lars Knudsen

1. Referent/in: Prof. Dr. med. vet. Kirsten Haastert-Talini 2. Referent/in: PD Dr. med. Thomas Fühner

Tag der mündlichen Prüfung: 06.12.2019 Prüfungsausschuss:

Vorsitz: Prof. Dr. rer. nat. Peter Claus

1. Prüfer/in: Prof. Dr. rer. nat. Herbert Hildebrandt 2. Prüfer/in: Prof. Dr. med. Danny Jonigk

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Abbildungsverzeichnis...4

Tabellenverzeichnis...5

Abkürzungsverzeichnis...6

1. Einleitung...10

1.1. Anatomie der Lunge des Menschen...10

1.2. Histologischer Aufbau des Respirationstraktes...11

1.3. Lungenentwicklung...12

1.3.1. Entwicklung der Mäuselunge...12

1.3.2. Vergleich zwischen Mäuse- und Menschenlunge...13

1.3.3. Bildung und Wachstum der Alveolen...16

1.4. Thesen über die Alveolarisation ...18

1.5. Lungenentwicklung und proﬁbrotisches Remodeling:   Bedeutung von TGF-ß, Smad3 und LPA1 in der Mäuselunge....20

1.5.1. TGF-ß und Smad3...22

1.5.2. LPA und seine Rezeptoren...24

1.6. Rolle von LPA und S1P unter Betonung von LPA ...25

1.7. LPA und Lungenﬁbrose (Mausmodell)...29

1.8. Rolle der peripheren Myoﬁbroblasten in der Alveologenese unter Berücksichtigung der Rolle von LPA1...34

1.9. Hypothesen...35

2. Literaturübersicht - Stereologie...36

2.1. Allgemeines...36

2.2. Richtigkeit und Präzision...36

2.3. Sampling (SURS)...37

2.4. Design-basierte Stereologie mit geometrischen Parametern und Referenzvolumen...38

3. Material und Methoden...42

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3.1. Tiere...42

3.2. Gewinnung des Lungenorgans...43

3.3. Bestimmung des Referenzvolumens...44

3.4. Histologische Aufarbeitung...45

3.4.1. Agar-Einbettung und Probengewinnung...45

3.4.2. Färbung des Lungengewebes...47

3.4.2.1. Orceinfärbung...47

3.4.2.2. Toluidinblaufärbung...48

3.5. Lichtmikroskopische Analyse...48

3.6. Design-basierte Stereologie...48

3.7. Statistische Bewertung...53

4. Ergebnisse...54

4.1. Qualitative lichtmikroskopische und  elektronenmikroskopische Befunde...54

4.2. Quantitative Ergebnisse: Graphische Darstellung der stereologisch erhobenen Daten...56

4.2.1. WT versus LPA1-KO : Stereologische Parameter ...57

4.2.1.1. Stereologische Daten im Alter von 3 Wochen ...57

4.2.1.2. Stereologische Daten im Alter von 12 Wochen...60

4.2.1.3. Stereologische Daten im Alter von 24 Wochen...63

4.2.2. Altersabhängige Veränderungen in WT und LPA1-KO ...66

4.2.3. Korrelationsanalysen ...70

4.2.3.1. Alveolenzahl versus Oberﬂäche des Alveolarepithels...70

4.2.3.2. Alveolenzahl versus Volumen der Septen...71

5. Diskussion...72

5.1. Interpretation der Ergebnisse...74

5.1.1.TGF-ß, Smad3 und Alveolarisation...78

5.2. Alveolenbildung...82

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5.2.1. Späte Phase der Alveolarisation...83

5.2.2. Periphere Myoﬁbroblasten in Zusammenhang mit LPA1 unter dem Aspekt der Alveolarisation ...87

5.3. Rolle der LPA-LPA1-Signalkaskade in der Lunge unter physiologischen und pathologischen Bedingungen...89

5.4. Ausblick...91

6. Zusammenfassung...93

Literaturverzeichnis...97

Curriculum vitae ...120

Erklärung nach § 2 Abs. 2 Nr. 6 und 7 PromO...122

Danksagung...123

Abstract...124

Anmerkung...125

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Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Repräsentative lichtmikroskopische Befunde in WT und LPA1-KO Mäusen unterschiedlichen Alters. Aus M.Funke et al.

Wochen alten WT (A) und LPA1-KO (B) Mäusen. Aus M.

Absolutes Lungenvolumen; B: Absolutes Volumen der azinären Lufträume pro Lunge; C: Absolutes Volumen der interalveolären Septen pro Lunge; D: Gesamtoberﬂäche des Alveolarepithels pro Lunge; E: Arithmetische mittlere Dicke der interalveolären Septen; F: Gesamtzahl der Alveolen pro Lunge; G: Volumen-gewichtetes mittleres Volumen der Alveolen...59 Abbildung 4: Stereologische Daten im Alter von 12 Wochen. A:

Absolutes Lungenvolumen; B: Absolutes Volumen der azinären Lufträume pro Lunge; C: Absolutes Volumen der interalveolären Septen pro Lunge; D: Gesamtoberﬂäche des Alveolarepithels pro Lunge; E: Arithmetische mittlere Dicke der interalveolären Septen; F: Gesamtzahl der Alveolen pro Lunge; G: Volumen-gewichtetes mittleres Volumen der Alveolen...62 Abbildung 5: Stereologische Daten im Alter von 24 Wochen. A:

Absolutes Lungenvolumen; B: Absolutes Volumen der azinären Lufträume pro Lunge; C: Absolutes Volumen der interalveolären Septen pro Lunge; D: Gesamtoberﬂäche des Alveolarepithels pro Lunge; E: Arithmetische mittlere Dicke der interalveolären Septen; F: Gesamtzahl der Alveolen pro Lunge; G: Volumen-gewichtetes mittleres Volumen der Alveolen...65

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Tabellenverzeichnis

Abbildung 6: Altersabhängige Entwicklung der stereologischen Parameter. Mittelwert und Standardabweichungen werden dargestellt. A: Absolutes Lungenvolumen; B: Absolutes Volumen der azinären Lufträume pro Lunge; C: Absolutes Volumen der interalveolären Septen pro Lunge; D:

Gesamtoberﬂäche des Alveolarepithels pro Lunge; E:

Arithmetische mittlere Dicke der interalveolären Septen; F:

Gesamtzahl der Alveolen pro Lunge; G: Volumen-gewichtetes mittleres Volumen der Alveolen. #: p < 0.05...69 Abbildung 7: Korrelation zwischen der Alveolenzahl pro Lunge

(N(alv,lung)) und der Alveolaroberﬂäche (S(alvepi,lung)). WT:

p < 0.001; LPA1-KO: p < 0.001...70 Abbildung 8: Korrelation zwischen der Alveolenzahl pro Lunge

(N(alv,lung)) und dem Gesamtvolumen an interalveolären Septen (V(sep,lung)). WT: p < 0.001; LPA1-KO: p < 0.001....71

Tabelle 1: Anzahl der eingeschlossenen Tiere im Bezug auf Genotyp und Alter 43 Tabelle 2: Zählverfahren ...52

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Abkürzungsverzeichnis

a Fläche

Akt AKR mouse thymoma Proteinkinase B

Alpha-SMA Alpha-smooth muscle actin

ARDS acute respiratory distress syndrome

ATP Adenosintriphosphat

ATX Autotaxin

B Brücken

bzw. beziehungsweise

°C Grad Celsius

cAMP cyclisches Adenosinmonophosphat

cm Zentimeter

COPD chronisch obstruktive Lungenerkrankung

C57BL/6J der am häuﬁgsten verwendete Inzuchtstamm und der erste, dessen Genom sequenziert wurde

3D dreidimensional

1D eindimensional

ERK Extracellular-signal-regulated Kinase et al. et alii = und andere

Fas-Ligand Typ-II-Transmembranprotein, das zu der Tumor- Nekrose-Faktor-Familie gehört

Fas-Rezeptor Transmembranprotein Typ-I, ein TNF-Rezeptor, spielt bei der Zellapoptose eine Rolle

G-Protein GTP-Protein

GTP Guanosintriphosphat

h Disectorhöhe

HCL Salzsäure

HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure H2O chemische Summenformel des Wassermoleküls

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I(alvepi) Zahl der Schnittpunkte der Testlinien mit dem Alveolarepithel

Ii Abstand von einer Alveolarwand zur anderen IPF idiopathic pulmonary ﬁbrosis = idiopathische

Lungenﬁbrose

kg Kilogramm

KG Körpergewicht

KO Knockout

LPA Lysophosphatidic Acid

LT Länge einer Testlinie

M Molar

Mg Milligramm

MHH Medizinische Hochschule Hannover

mm Millimeter

µm Mikrometer

MMP Matrixmetalloprotease

mRNA messenger RNA (ribonucleic acid)

MRT Magnetresonanztomographie

n Anzahl der „Counting Frames“

NA Absolutzahl des zweidimensionalen Proﬁls der Flächeneinheit

NaHCO3 Natriumhydrogencarbonat

N(alv,lung) Alveolenzahl, Gesamtzahl der Alveolen pro Lunge NHBE Normal Human Bronchial Epithelial Cells

N0 Nulldimensional

NV wahre Zahl des dreidimensionalen Objektes per Volumenunit des Gewebes

Nv(alv,lung) Dichte der Alveolen pro Einheit Referenzvolumen

OH- Hydroxy(l)gruppe

PDGF Plateled Derived Growth Factor

PGE2 Prostaglandin E2

PL(par) Zahl der Testlinien, die auf das Parenchym projiziert wurden

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P(lung) Zählpunkte im Lungengewebe

P(par) Zahl der Punkte, die auf dem Lungenparenchym zu liegen kommen

PSI point-sampled intercepts, Punkte PSMFBs periphere septale Myoﬁbroblasten

p-Wert Signiﬁkanzwert

P2Y5-Rrezeptor G-Protein gekoppelter Rezeptor, der durch LPA aktiviert wird

Rac Ras-related C3 botulinum toxin substrate Ras Receptor activated substrate

Rho Ras homolog gene family

RNA Ribonukleinsäure

R3/1 a new rat type I-like alveolar epithelial cell line S(alvepi,lung) Gesamtoberﬂäche des Alveolarepithels pro Lunge

S1P sphingosine 1-phosphate

SMAD Gruppe von Rezeptorsubstanzen, die

Transkriptionsprozesse im Zellkern steuern; Name leitet sich von den sie kodierenden Genen ab

(Drosophilagen Mad = Mother against decapentaplegic und Gen in C. elegans Sma = Small body size)

sog. sogenannt(e/er/es)

s.u. siehe unten

SURS systemic uniform random sampling = systematische einheitliche randomisierte Probenauswahl

Sv(alvepi,par) Oberﬂächendichte des Alveolarepithels innerhalb des Parenchyms

TGF Transforming Growth Factor

t(sep) arithmetische mittlere Dicke der interalveolären Septen t-Test Hypothesentest mit t-verteilter Testprüfgröße

V absolutes Volumen einer Struktur

V(air,par) Absolutes Volumen der azinären Lufträume pro Lunge V(lung) absolutes Lungenvolumen

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V(par,lung) Absolutwert des gemessenen Lungenparenchyms in der Lunge

V(sep,lung) Absolutes Volumen des interalveolären Septen pro Lunge

Vv Volumenanteil/Volumenfraktion einer Struktur Vv(air,par) Volumenanteil der azinären Lufträume am

Lungenparenchym

Ṽv(alv) Volumen-gewichtetes mittleres Volumen der Alveolen Vv(par,lung) Volumenanteil des Lungenparenchyms an der Lunge Vv(sep,lung) Volumenanteil von Gewebssepten am Lungengewebe

Wks weeks = Wochen

Wnt/ß-Catenin-Pfad reguliert Pluripotenz von Stammzellen und Zellentwicklung

WT Wildtyp

z.B. zum Beispiel

2D zweidimensional 

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1. Einleitung

1.1. Anatomie der Lunge des Menschen

In der Lunge ﬁndet der Gasaustausch statt. Durch die Aufnahme von Sauerstoff und die Elimination von Kohlendioxid liefert sie Grundsubstrate für die Gewinnung von Adenosintriphosphat (ATP) in der Atmungskette.

Sauerstoffarmes Blut kommt aus der Peripherie des Körpers und wird über das rechte Herz in den Lungenkreislauf (kleiner Kreislauf) ausgeworfen, wo es mit Sauerstoff angereichert wird. Das sauerstoffreiche Blut wird dann über das linke Herz wieder in den großen Kreislauf eingespeist.

Das Lungenorgan wird in eine rechte Lunge mit drei Hauptlappen und eine linke Lunge mit zwei Hauptlappen unterteilt. Diese sind durch die beiden Hauptbronchien und die sich anschließende Trachea miteinander verbunden.

Die Pleura, welche aus einem viszeralen, dem Lungengewebe aufliegenden Blatt und einem parietalen, die Innenseite des Thorax auskleidenden Blatt besteht, umgibt die Lunge. Zwischen den zwei Pleurablättern befindet sich ein Flüssigkeitsfilm, welcher ein Aufeinandergleiten der Pleurablätter während der Atmung erlaubt und die Lunge durch Adhärenzkräfte an die Wand der Thoraxhöhle koppelt. Der Unterdruck im Pleuraspalt spannt die Lunge in der Pleurahöhle auf.

Im Allgemeinen unterscheidet man in der Lunge Abschnitte, die der Luftleitung dienen, und solche, die für den Gasaustausch verantwortlich sind. Zu den luftleitenden Atemwegen gehören die oberen Luftwege mit Rachen, Kehlkopf, Trachea und Bronchien. Orte für den Gasaustausch bilden die sich anschließenden distalen Lufträume, bestehend aus den Azini. Aus dem alveolären Luftraum diffundiert der eingeatmete Sauerstoff in das Blut des in den interalveolären Septen lokalisierten kapillären Netzwerkes. Gleichzeitig wird Kohlendioxid aus dem Blut in den alveolären Luftraum abgegeben, um abgeatmet zu werden. Durch den Wandaufbau der Alveole (Lungenbläschen) wird eine Barriere geschaffen, die das Gefäßsystem der Lunge von den

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luftgefüllten Räumen trennt. Diese Barriere wird als Blut-Luft-Schranke bezeichnet. Die Sauerstoffaufnahmekapazität der Lunge wird durch die Größe der Oberﬂäche und die Dicke der Blut-Luft-Schranke limitiert. Der in der Lunge aufgenommene Sauerstoff wird den Körperzellen zur Verfügung gestellt. In den Mitochondrien der Zelle entsteht durch den Ablauf der sogenannten Atmungskette ATP, das der Energiegewinnung der Zellen dient (Kirsch et al., 2011).

1.2. Histologischer Aufbau des Respirationstraktes

Der Bronchialbaum, der mit der Trachea beginnt, zweigt sich bis zu den Alveolen immer weiter auf. Es wird von dichotomer Zweiteilung der Luftwege mit stetig kleiner werdendem Durchmesser gesprochen. Im Durchschnitt endet der Luftweg einer menschlichen Lunge nach 23 Generationen in einem Sacculus. Zunächst ist die Hauptfunktion der Transport der Luft mittels Konvektion, dann folgt ein respiratorischer Abschnitt, der am Gasaustausch durch Diffusion teilnimmt. Wanddicke und knorpelige Anteile nehmen von proximal nach distal ab, wohingegen der Anteil an glatter Muskulatur zunimmt.

Die funktionelle Einheit der Lunge bildet der Azinus (Weibel et al., 2007). Dazu gehören alle Lufträume, die vom terminalen Bronchiolus abhängig sind. Dieser besteht aus den Bronchioli respiratorii, den Ductus alveolares sowie tausenden Alveolen. Die Luftwege sind hier durch ein starkes Fasernetz, vor allem aus elastischen Fasern bestehend, unterstützt. Ein axiales Netzwerk beginnt in der Wand der Bronchien und Bronchiolen, nimmt einen zirkulären Verlauf um die Eingänge der Alveolen und ist über septale Faserzüge mit dem submesothelialen Bindegewebe der Pleura ﬁxiert. Die Lungenbläschen (Alveolen) sind durch bindegewebige Septen voneinander getrennt und ordnen sich wabenartig um den Ductus alveolaris. Ein dichtmaschiges Kapillarnetz umgibt sie, bedeckt werden sie vom Alveolarepithel, bestehend aus Pneumozyten. Die Pneumozyten Typ 1 überziehen Kapillaren und bilden über 90% der alveolären Auskleidung. Die Pneumozyten Typ 2 dienen der Regeneration des Alveolarepithels und bilden Surfactant. Letzteres reduziert die Oberﬂächenspannung vor allem end-exspiratorisch und hat sowohl anti- ödematöse als auch immunologische Funktionen (Kirsch et al., 2011).

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1.3. Lungenentwicklung

1.3.1. Entwicklung der Mäuselunge

D i e L u n g e n e n t w i c k l u n g w i r d z u s a m m e n f a s s e n d i n z a h l r e i c h e n Übersichtsarbeiten (Burri et al., 1990; Burri et al., 2006) sowie Buchkapiteln (Fishman’s Pulmonary Diseases and Disorders, 4. Auﬂage, Band 1, Kapitel 4 und 5, 2008; im Literaturverzeichnis unter Schittny et Burri, 2008) beschrieben.

Im folgenden werden die Prinzipien der Lungenentwicklung aus morphologischer Sicht zusammengefasst. Die Lungenanlage geht aus dem Endoderm (epitheliale Anteile) und der Splanchnopleura (viszerales Mesoderm) hervor, aus denen sich die Gefäßnetze der Lungen, die Binde- und Stützgewebe, die glatte Muskulatur sowie die Pleura entwickeln. Durch Teilung der endodermalen Knospe entstehen zwei Lungenknospen, aus denen sich im Laufe der Entwicklung die rechte und linke Lunge, also der luftleitende Bronchialbaum sowie das dem Gasaustausch unmittelbar dienende Lungenparenchym, differenzieren. Wachstumsfaktoren hemmen oder fördern eine Vielzahl von Interaktionen zwischen Epithel und Mesenchym für die weitere Differenzierung und Aufzweigung des Bronchialbaumes. Die Gefäße des Lungenkreislaufes gehen aus dem 6. Aortenbogen hervor. Anteile des vegetativen Nervensystems wandern sekundär in die Lungenanlagen ein. Die fetale Lungenentwicklung wird in drei Phasen beschrieben. In der pseudoglandulären Phase schreitet die Aufzweigung des Bronchialbaums, insbesondere der luftleitenden Abschnitte, weiter voran, und es werden erste undifferenzierte säulenförmig angeordnete und das Lumen auskleidende epitheliale Zellen sichtbar. Während der kanalikulären Phase werden erste Abschnitte der luftleitenden azinären Lufträume gebildet, in denen später der Gasaustausch stattﬁnden wird. Durch Differenzierung des Epithels und das vermehrte Einsprossen der Kapillaren wird die Blut-Luft-Schranke gebildet.

Einige Epithelzellen werden der Form nach eher kubisch, weisen eine apikobasale Differenzierung mit apikalen Microvilli auf und werden zu Pneumozyten Typ 2, die schließlich Surfactant synthetisieren und freisetzen.

Andere Epithelzellen ﬂachen ab und bedecken als Pneumozyten Typ 1 einen Großteil der Oberﬂäche. Die sakkuläre Phase dauert bis zum Zeitpunkt der

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Geburt an. Es werden durch weitere Aufzweigungen im distalen Bereich die Alveolarsäcke (primitive Alveolen) gebildet. Diese primitiven Alveolen werden durch primäre Septen voneinander getrennt. Die Phase der deﬁnitiven Alveolenbildung geht über den Zeitpunkt der Geburt hinaus und erreicht den Höhepunkt erst postnatal. Aus dem bereits bestehenden Primärseptum werden durch Einlagerung von elastischen Fasern und Einsprießen von Myoﬁbroblasten sowie Kapillaren neue Geweberinge abgehoben, welche sich verdicken, in die primitiven Lufträume hineinragen und diese somit in kleinere Einheiten, die Alveolen, unterteilen. Auf diese Weise entsteht das sogenannte Sekundärseptum. Sowohl im Primär- als auch im Sekundärseptum ist ein doppeltes Kapillarbett vorhanden. Daher wird auch vom primitiven oder unreifen Septum gesprochen. In der Maus oder Ratte wird ab dem 14.

postpartalen Tag das doppelte Kapillarbett auf ein einfaches reduziert (Burri et al., 1990).

1.3.2. Vergleich zwischen Mäuse- und Menschenlunge

Die menschliche Lunge besteht bei der Geburt aus schätzungsweise 50 - 100 Millionen Alveoli (Dunnill, 1962; Thurlbeck, 1982; Moore et al., 2013). Die postnatale Lungenentwicklung setzt sich aus einem alveolären Stadium, einem Stadium der mikrovaskulären Reifung sowie höchstwahrscheinlich einem Stadium der späten Alveolarisation („late alveolarization“) zusammen (Narayanan et al., 2012; Schittny et al., 2008). Das Alveolenstadium ist bei Menschen- und Nagetierlungen wie Ratten und Mäusen ähnlich. Die Basis des Septums der unreifen Alveolen bilden ein doppeltes Kapillarbett und eine zentrale Bindegewebsschicht. Interalveoläre Septen entstehen durch Aussprossen einer der beiden kapillären Schichten. In beiden Spezies ﬁndet diese Alveolarisation rasch und im großen Umfang statt, so dass sie auch als

„bulk alveolarization“ bezeichnet wird (Zeltner et al., 1987). Während und nach der Alveolarisation entsteht im Rahmen des Reifungsprozesses aus dem doppelten Kapillarbett ein einschichtiges. Dies passiert in der Phase der mikrovaskulären Reifung. Danach tritt die Lunge in eine Wachstumsphase ein, während der das kapilläre Wachstum durch Einstülpung für den Gasaustausch eine wichtige Rolle spielt. Es scheint sich somit sowohl in Nagetier- als auch

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Menschenlungen das Stadium einer späten Alveolarisation abzuzeichnen (Burri, 2006).

In der Ratte sprechen Tschanz und Mitarbeiter von einer 2. „bulk alveolarisation“, welche mindestens bis zum 50. postnatalen Tag anhält und somit ohne Vorhandensein eines doppelten Kapillarnetzes fortschreitet (Tschanz et al., 2014).

Auch beim Menschen gibt es mittlerweile eine gute Evidenz, dass die Alveolenzahl bis ins junge Erwachsenenalter ansteigt und somit nicht mit Abschluss der Reifung des Kapilarbettes im Alter von ca. 2-3 Jahren stoppt (Narayanan et al., 2012).

Die embryonale Phase der Lungenentwicklung beginnt mit einer ventralen Ausstülpung des Vorderdarms, welche dann eine rechte sowie linke Lungenknospe hervorbringt. Ausgehend von den Lungenknospen beginnt ein kontinuierlicher Prozess von Verästelung und Wachstum in das umgebende Parenchym. In der embryonalen Phase, die vom 26. bis 49. Tag nach der Befruchtung beim Menschen und vom 9,5. bis 12. Tag nach der Befruchtung bei der Maus andauert, startet also die Organentstehung mit Bildung der Hauptluftwege. Ein epithelialer tubulärer Ast penetriert das umgebende Mesenchym, ein lockeres dreidimensionales kapilläres Netzwerk ist im Mesenchym lokalisiert (Schittny et Burri, 2008).

Die fetale Phase unterteilt sich in ein pseudoglanduläres, kanalikuläres und sakkuläres Stadium. Im pseudoglandulären Stadium formt sich der Bronchialbaum aus und große Anteile des zukünftigen respiratorischen Parenchyms sowie der Azinus entstehen. Beim Menschen ﬁndet diese Phase am 35. bis 119. Tag nach der Befruchtung, bei der Maus am 12. bis 16,5. Tag nach der Befruchtung statt. Im kanalikulären Stadium (Mensch: 112.-182. Tag nach Befruchtung; Maus: 16,5.-17,5. Tag nach Befruchtung) werden die luftführenden Atemwege fertiggestellt, es kommt zur epithelialen Differenzierung, zur ersten Blut-Luft-Schranke sowie zum Beginn der Surfactantproduktion. Im Rahmen des sakkulären Stadiums kommt es zur

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Exp a n si o n d e r d i sta l e n L u fträ u me d u rch Ab tre n n u n g e n . D i e ser Entwicklungsabschnitt liegt beim Menschen zwischen dem 168. bis 266. Tag nach Befruchtung, bei der Maus zwischen dem 17,5. Tag nach Befruchtung und dem 4. postnatalen Tag vor (Schittny et Burri, 2008).

Die postnatale Phase unterteilt sich in ein alveoläres Stadium, in ein Stadium der mikrovaskulären Reifung und in eines des normalen Lungenwachstums (Schittny et Burri, 2008). Das alveoläre Stadium beginnt beim Menschen am 252. Tag nach Befruchtung und dauert 1 bis 2 Jahre nach Geburt an. Hier liegt eine Alveolarisation durch Formation des Sekundärseptums vor: Das Primärseptum beinhaltet ein doppeltes Kapillarbett. Vorstufen von Muskelzellen, elastische Fasern sowie Kollagenfasern sammeln sich im unreifen Septum an Lokalisationen, wo ein neues, sogenanntes Sekundärseptum entsteht. Eine Schicht des Kapillarbettes klappt sich auf, das so entstandene Sekundärseptum unterteilt die bestehenden Lufträume und lässt so neue Alveolen entstehen. Auch das Sekundärseptum enthält ein doppelschichtiges Kapillarbett. Während der Alveolarisation liegt also ein dickes unreifes Septum mit einem doppelten Kapillarbett vor, welches ein Sekundärseptum formen kann. Die Maus beﬁndet sich vom 4. bis 14.

postnatalen Tag in diesem Stadium. Im Stadium der mikrovaskulären Reifung formen sich das interalveoläre Septum und das Kapillarbett um und bauen sich aus. Die Septumreifung funktioniert dabei wie folgt: Die doppelte Kapillarschicht im Septum ist durch eine bindegewebige Schicht getrennt. Während der Reifung verdichtet sich das Bindegewebe und dünnt aus, so dass das doppelte Kapillarbett miteinander verschmilzt. Nun existiert nur noch ein einschichtiges Kapillarbett. Der Mensch beﬁndet sich vom 0. bis 3. Lebensjahr im Stadium der mikrovaskulären Reifung, die Maus vom 14. bis 21. postnatalen Tag. Es existiert eine große Überlappung zwischen dem Stadium der Alveolarisation und der mikrovaskulären Reifung. Am Ende des Stadiums der mikrovaskulären Reifung existiert noch immer in bis zu 20% der Septa ein doppeltes Kapillarbett.

Nun schließt sich die Phase des normalen Lungenwachstums an, beim Menschen vom 2. Lebensjahr bis zum jungen Erwachsenenalter sowie bei der Maus von der 4. Woche nach Geburt bis zum Erwachsenenalter. Die Lungenoberﬂäche, die Anzahl der Segmente sowie das bestehende kapilläre

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Netzwerk wachsen dann durch Insertion des transluminalen Gewebes, welches im vorbestehenden Lumen eine säulenartige Form annimmt. Bezeichnet wird dieser Vorgang als intussuszeptives mikrovaskuläres Wachstum (Caduff et al., 1986; Djonov et al., 2000). Es wird vermutet, dass sich eine Form der späten Alveolarisation anschließt (siehe 1.3.3). Dabei werden zwei mögliche Mechanismen dieser sogenannten „late alveolarization“ gefordert, zum einen die Formung aus einem unreifen Septum mit doppelter Kapillarschicht in Erwachsenenlungen, zum anderen ein bisher undeﬁnierter Mechanismus im reifen Septum, bei dem sich aus einer einschichtigen Kapillarschicht mittels Ausstülpung eine neue Alveole formt (Schittny et al., 2008).

1.3.3. Bildung und Wachstum der Alveolen

Die menschliche Lunge beinhaltet bei der Geburt nur einen Anteil der Alveolenzahl des Erwachsenen. Außerdem beﬁndet sich das kapilläre Netzwerk in einem unreifen Stadium. Rattenlungen sind bei Geburt etwas unreifer als die Menschenlunge, beschreiten aber postnatal die gleichen Entwicklungsschritte und sind somit - wie auch die Mäuselungen - zugänglich für strukturelle und quantitative Untersuchungen (Burri et al., 1974; Kauffman et al., 1974; Burri, 1974).

Die Luftwege der Menschenlunge bei Geburt bestehen meistens aus dem sogenannten sakkulären Typ, was bedeutet, dass die Wände der distalen Lufträume noch relativ dick sind und eine Bindegewebsschicht zwischen einem doppelten Kapillarbett enthalten. Das adulte interalveoläre Septum hingegen besteht aus einem einfachen Kapillarbett (Zeltner et al., 1987).

Das doppelte Kapillarbett bildet die Voraussetzung für die Alveolarisation. Die menschliche Lunge besitzt zum Zeitpunkt der Geburt zwischen 0 und 100 Millionen Alveolen (Emery at al., 1960; Dunnill, 1962; Langston et al., 1984).

Da die ausgereifte Lunge durchschnittlich 480 Millionen Alveolen beherbergt (Ochs et al., 2004), scheint die Alveolarisation eindeutig ein postnatales Ereignis zu sein. Die Untersuchung der Rattenlunge gibt Aufschluss darüber,

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wie Alveolen gebildet werden. Die Alveolenentwicklung in der Rattenlunge ﬁndet innerhalb von 10 Tagen zwischen dem 4. und 13. postnatalen Tag statt.

Das Septum der Neugeborenenlunge ist hier charakterisiert durch eine zentrale Bindegewebsschicht, die jeweils von einer Kapillarschicht umgeben ist. An Tag 7 weist die septale Wand Einkerbungen auf, kleine Ecken ragen in die Lufträume hinein. Diese Ausstülpungen gehen vom sogenannten Primärseptum aus, werden als Sekundärseptum deﬁniert und bilden die Kontur der späteren Alveolen. Auch das Sekundärseptum weist ein doppelschichtiges Kapillarbett auf. Elastische Fasern sind typischerweise in den Spitzen der Aussackungen lokalisiert (Dubreuil et al., 1936).

Die massive und plötzliche Erscheinung von Alveolen wird auch als „bulk alveolarization“ bezeichnet. In der menschlichen Lunge spielt sich ähnliches bis zum 6. Lebensmonat ab. Diese Phase der Alveolarisation dauert 2 Wochen bei den Ratten und 12 bis 24 Monate bei den Menschen (Zeltner et al., 1987;

Thurlbeck, 1982).

Danach scheint sich noch eine weitere Phase der Alveolarisation anzuschließen. Das Stadium der späten Alveolarisation wird dabei kontrovers diskutiert. Da sowohl das Primär- als auch das Sekundärseptum ein doppeltes Kapillarbett aufweisen, bei der Erwachsenenlunge hingegen nur noch ein einschichtiges anzutreffen ist, muss sich an das Stadium der Alveolarisation eine Phase der mikrovaskulären Reifung anschließen. Dabei deuten Untersuchungen der Rattenlunge an, dass die Annäherung der zwei Kapillarschichten durch Reduktion des eingeschlossenen Interstitiums eingeleitet wird. In der 3. Woche nach Geburt nimmt das interstitielle Gewebe um 27% ab, wohingegen das Lungenvolumen um 25% ansteigt. So nähern sich die beiden Kapillarschichten einander an, verschmelzen im Verlauf miteinander und bilden ein Lumen aus. Dieses multifokale Ereignis spielt sich in einer kurzen Zeitperiode ab. Der Prozess der septalen Ausdünnung führt außerdem zur Bildung transseptaler epithelio-epithelialer Zellkontakte und Entstehung der Kohn-Poren, also feinsten Poren in den Alveolarsepten, die benachbarte Alveolen miteinander verbinden (Weiss et al., 1996). Letztere zeigen die mikrovaskuläre Reifung an. Am Ende der 3. Woche postnatal liegt bei den

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Ratten ein reifes interalveoläres Septum vor. Bei der Menschenlunge beginnt die mikrovaskuläre Reifung im Alter von einem Jahr und dauert bis zum 2. bis 3. Lebensjahr an. Über das Stadium der späten Alveolarisation existieren noch nicht genügend Daten. Anfänglich wurde vermutet, dass die Alveolenzahl bis zum 20. Lebensjahr ansteigt (Emery et al., 1960; Emery et al., 1966), sukzessive wurde diese Altersangabe auf 8 bis 11 Lebensjahre gesenkt (Zeltner et al., 1987; Davies et al., 1970), zuletzt sogar auf 2 Jahre (Langston et al., 1984). Bei Ratten existiert eine gute Evidenz, dass sich zusätzliche Alveolen nach der frühen Phasen der „bulk alveolarization“ ausbilden (Randell et al., 1989; Blanco, 1992; Blanco, 1995). Dieses steht der Theorie von Heiss (1923) gegenüber, dass die peripheren Luftwege ausgebildet werden mittels einer zentripetalen Abtrennung der Lufträume, beginnend in der Peripherie. Ob ein derartiger Prozess in der Menschenlunge während der Kindheit stattﬁndet, bleibt offen. Das Lungenwachstum in den ersten 18 Monaten zeigt eine zunehmend belüftete Lunge, da das Parenchym langsamer als das Lungenvolumen zunimmt. Ab dem 2. Lebensjahr bis zum jungen Erwachsenenalter hin wachsen Lungenkompartimente proportional zum Lungenvolumen und linear zum Körpergewicht (Burri, 2006).

Basierend auf innovativen Magnetresonanztomographie (MRT)-Methoden konnten gute Hinweise erbracht werden, dass die Phase der Alveolarisation beim Erwachsenen bis zum Alter von 21 Jahren anhält und somit länger als bisher gedacht vonstatten geht (Narayanan et al., 2012).

1.4. Thesen über die Alveolarisation

Das postnatale Wachstum der Mäuselunge wird kontrovers diskutiert. Koelliker (1881) und Short (1950) sehen die Entwicklung der Lungenstruktur mit der Geburt als abgeschlossen an. Nach der Geburt komme es nur noch zum Wachstum durch Größenausdehnung. Weibel (1967) und Burri (1974) zeigen allerdings bei Ratten, dass Neugeborene keine richtigen Alveolen besitzen, sondern dass der Gasaustausch über sogenannte „primary saccules“

stattﬁndet, die größer als Alveolen sind und deren primäres Septum ein doppeltes Kapillarbett aufweist. Im Rahmen der postnatalen Entwicklung

(21)

würden diese in Alveolen umgewandelt, deren sekundäres Septum aus Alveolarepithelzellen Typ I, Interstitium und Kapillaren bestehe. Im Rahmen elektronenmikroskopischer Untersuchungen unterschiedlich alter Mäuselungen von Amy et al. (1977) konnte aufgezeigt werden, dass auch bei Mäuselungen bei der Geburt richtige Alveolen fehlen und dass der Gasaustausch wie bei den Ratten über größere „primary saccules“ stattﬁndet. Diese besäßen ein Kapillarsystem mit doppelter Schicht. Alveolarepithelzellen Typ I würden dabei mittels einer interstitiellen Schicht von Alveolarepithelzellen Typ II getrennt. In den ersten drei postnatalen Tagen würden sich die „primary saccules“

vergrößern und weitere dünne Ausstülpungen ausprägen, so dass eine weitere Unterteilung stattfände. Die Spitzen dieser Aussackungen würden sich ab dem 4. postnatalen Tag verlängern und bestünden vor allem aus Kollagen- und elastischen Fasern. Somit könne ab dem 4. Tag die Entstehung von Alveolen durch die enorme Unterteilung der „primary saccules“ notiert werden, wobei dieser Prozess ca. vom 4. bis 14. postnatalen Tag andauere. Kohn-Poren würden ab dem 14. postnatalen Tag zunehmen. Ab dem 22. Tag sei lediglich noch ein einschichtiges Kapillarbett sichtbar, welches das deutlich dünnere Septum der reifen Lunge anzeige. Nun sei die Erscheinung einer Erwachsenenlunge erreicht. Während der ersten sechs postnatalen Tage steige das Lungengewicht deutlich an, was die zelluläre Proliferation in den Wänden der „primary saccules“ anzeige (Amy et al., 1977).

Initial wurde geglaubt, dass die Alveolarisation an das Vorliegen einer doppelten Kapillarschicht im Septum gebunden ist. Das hätte zur Konsequenz, d a s s n a c h d e r m i k r o v a s k u l ä r e n R e i f u n g d i e Ve r g r ö ß e r u n g d e r Gasaustauschﬂäche allein durch Lungenwachstum erreicht würde. Es wird aber gefordert, dass die Zahl der Alveolen, auch nachdem das Lungenparenchym gereift ist, weiter ansteigt. Hierfür spricht ebenfalls, dass sich Alveolen zum Beispiel nach einer Pneu- oder Lobektomie weiter ausbilden (Hsia et al., 1994).

Die Frage, ob und wie sich Alveolen in der Erwachsenenlunge ausprägen, hat eine hohe klinische Relevanz. Erkrankungen, die zu einem Verlust von Lungenparenchym führen, weisen eine Reduktion der Diffusionskapazität und den Verlust von Alveolarsepten auf. Dieses ist die entscheidende Pathogenese

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des Lungenemphysems (Nagai et al., 1989 und 1991). In einer Studie von Schittny et al. (2008) bzw. Tschanz et al. (2014) wurde aufgezeigt, dass die Alveolarisation in Ratten auch nach abgeschlossener mikrovaskulärer Reifung fortschreitet. Es konnte hier eine Zunahme des Alveolarseptums zwischen dem 6. und 36. Tag beobachtet werden. In der ersten Phase der Alveolarisation, die vom 4. bis 21. postnatalen Tag deﬁniert wird, hebe sich ein neues Septum aus dem unreifen Septum mit doppelter Kapillarschicht ab. In der zweiten Phase nach dem 21. postnatalen Tag werde neues Septum aus einem reifen Septum mit einschichtigem Kapillarbett gebildet. Es komme punktuell zu einer Ausstülpung der Kapillarschicht, diese stelle sich innerhalb des neugebildeten Septums wieder doppelschichtig durch Angiogenese an dessen Basis dar.

Diese doppelte Kapillarschicht werde durch weiche Muskelzellen, elastische Fasern und Kollagenfibrillen abgetrennt. Die Alveolaroberfläche und die kapilläre Oberfläche nehme bei Ratten zwischen dem 21. und 60. postnatalen Tag zu. Weil der Durchmesser der Kapillaren konstant bleibe, scheint diese Zunahme durch eine stetige Angiogenese verursacht zu sein.

1.5. Lungenentwicklung und proﬁbrotisches Remodeling:  

Bedeutung von TGF-ß, Smad3 und LPA

1

in der Mäuselunge

Die Lunge als Organ mit großer Oberfläche und Gasaustauschfunktion ist ständig schädigenden physikalischen, chemischen und biologischen Noxen ausgesetzt. Bei Lungenverletzungen gehen epitheliale Zellen zugrunde und die Barrierefunktion bricht somit auf. Als Reparaturmechanismus zum Erhalt der Lungenfunktion wandern im Optimalfall Vorläuferzellen in den Defekt ein, proliferieren und differenzieren sich, um die verletzte Oberfläche zu r e e p i t h e l i a l i s i e r e n . E i n e L u n g e n fi b r o s e k a n n a l s a b n o r m a l e r Regenerationsprozess gesehen werden, bei dem es nicht mehr möglich ist, die normale Lungenstruktur wiederherzustellen (Fehrenbach, 2001). Studien über die Lungenentwicklung sowie Reparaturmechanismen und Fibroseentwicklung in der Lunge legen zum jetzigen Zeitpunkt dar, dass viele Faktoren, die für die normale Lungenentwicklung eine Rolle spielen, auch eine Schlüsselfunktion bei der Entstehung der Lungenfibrose einnehmen (Geiser, 2003). Ein bedeutsames

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Beispiel hierfür ist der Transforming Growth Factor (TGF)-ß-Signalweg. Ein normaler TGF-ß-Spiegel ist für viele Aspekte in der normalen Lungenentwicklung ebenso wie für die pulmonale Immunfunktion wichtig (Warburton et al., 2013). Der Wachstumsfaktor TGF-ß bindet an seinen Rezeptor auf der Zelloberﬂäche und aktiviert auf diese Weise eine nachgeschaltete Gruppe von intrazellulären Proteinen, sogenannte Smad- Proteine (siehe auch Abkürzungsverzeichnis), welche sich in den Nucleolus verlagern und hier die vorgegebene Genexpression aktivieren (Shi et al., 2003).

Der TGF-ß-Signalweg ist für die Entwicklung des embryonalen Lungenmesenchyms sowie das postnatale Wachstum des Lungenepithels verantwortlich. Aus einer Überaktivierung von TGF-ß resultiert allerdings eine Fibroseentwicklung (Shi et al., 2009). Nach einem Gewebeschaden wandern alpha-smooth muscle actin (α-SMA)-positive Myoﬁbroblasten in den Defekt ein, um den mechanischen Stress zu entlasten, was aber wiederum zu einer beeinträchtigten Organstruktur und -funktion führt. Eben diese Myoﬁbroblastengeneration scheint unter anderem vor allem durch aktiviertes TGF-ß begünstigt zu sein. Bei der reifen Lunge ist das pathologische Kennzeichen für eine Überexpression von TGF-ß somit eine schwere progressive Fibrose. In der unreifen Lunge kommt es hingegen zu einer schweren Hypoplasie, die im klinischen Bild der bronchopulmonalen Dysplasie bei menschlichen Frühgeborenen resultiert. Ebenso führt ein Smad-Defekt zu einer defekten Elastinstruktur und gestörten Lungenalveolarisation in der Knockout (KO)-Maus (Shi et al., 2009).

Also scheinen TGF-ß und Smad-3 Faktoren zu sein, die sich Schlüsselrollen sowohl im Rahmen der Lungenentwicklung als auch in der pulmonalen Fibroseentstehung teilen. Hier können in der Zukunft Ansätze für medikamentöse Strategien gefunden werden. Ob Lysophosphatidic Acid (LPA)1

in diesem Zusammenhang ebenso eine wichtige Rolle spielt, gilt es im Rahmen dieser Dissertation zu klären.

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1.5.1. TGF-ß und Smad3

In einer Studie von Chen et al. (2005) wurde eine abnormale Lungenalveolarisation durch eine Smad3-Deﬁzienz beschrieben, welche die Erscheinungsform eines zentrilobulären Emphysems aufweist. Der TGF-ß- Signalweg spielt eine entscheidende regulatorische Rolle während der Lungenentwicklung und -umgestaltung. Smad3 ist ein wichtiger nachgeschalteter intrazellulärer Signalgeber in der TGF-ß-Kaskade von Zellmembran zu Nukleus. In Smad3-KO-Mäusen wird eine retardierte Lungenalveolarisation von Tag 7 bis Tag 28 postnatal beobachtet mit anschließender Ausbildung eines zentrilobulären Emphysems ab Tag 28.

Außerdem ist die periphere Lungenzellproliferation reduziert im Vergleich zu Wildtyp (WT)-Mäusen zwischen dem 7. und 28. postnatalen Tag. Weitere Veränderungen ab dem 28. postnatalen Tag bestehen bei den Smad3-KO- Mäusen in einer reduzierten Expression auf mRNA-Level von Tropoelastin, einem Grundbaustein der elastischen Fasern. Hinzu kommt eine erhöhte Expression und Aktivität von Matrixmetalloprotease (MMP)-9 sowohl im Lungengewebe als auch in der bronchoalveolären Lavageﬂüssigkeit. MMP-9 ist ein Enzym, welches die Spaltung von Peptidbindungen in Proteinen z.B. in der extrazellulären Matrix katalysiert. Smad3 scheint somit nicht nur positive regulatorische Auswirkungen auf die neonatale Lungenalveolarisation zu haben, sondern auch eine schützende Funktion gegenüber dem Auftreten eines zentrilobulären Emphysems im späteren Leben.

TGF-ß gehört zur Familie der Wachstumsfaktoren, die Zellproliferation, Differenzierung, Apoptose, Migration und Synthese von extrazellulären Matrixproteinen regulieren (Sporn et al., 1991). Extrazelluläres TGF-ß bindet an seinen verwandten Rezeptorkomplex an der Zelloberﬂäche. Die so aktivierte Rezeptorkinase phosphoryliert Smad2- und Smad3-Proteine, die vom Rezeptor dissoziieren und mit dem Komediator Smad4 in den Nucleus translozieren, um dort die Expression unterschiedlicher TGF-ß-Zielgene zu induzieren oder zu unterdrücken (Attisano et al., 2000; Massague, 1998; Shi et al., 2003). Darüber hinaus scheint es auch noch Smad-unabhängige Signalwege von der Zellmembran zum Nucleus zu geben (Derynck et al., 2003). Das Abschalten

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der Smad3-Funktion scheint eine Bleomycin-induzierte Lungenﬁbrose in Mäusen abzuschwächen und die Wundheilung zu beschleunigen (Ashcroft et al., 1999; Zhao et al., 2002). Die TGF-ß-Signalkaskade spielt eine wichtige Rolle in der Regulierung der fetalen Lungenmorphogenese, im postnatalen Lungenwachstum, in Lungenreparatur und -umgestaltung. Eine Stimulation führt zur Entstehung einer bronchopulmonalen Dysplasie und Lungenﬁbrose (Gauldie et al., 2003; Zhao et al., 2002), eine Verminderung verursacht eine reduzierte Lungenalveolarisation mit anschließendem Emphysem (Morris et al., 2003; Neptune et al., 2003; Sterner-Kock et al., 2002).

In der Studie von Chen et al. (2005) wurde die postnatale Alveolarisation und das Lungenwachstum zwischen Smad3-KO- und WT-Mäusen verglichen. Der Verlust der Smad3-Funktion scheint eine reduzierte pulmonale Zellproliferation mit einer retardierten Alveologenese in der neonatalen Mäuselunge zu verursachen, gefolgt von einem zentrilobulären Emphysem, welches auch im Erwachsenenalter weiter fortschreitet. In der Smad3-KO-Maus sei beginnend am 7. postnatalen Tag die pulmonale Alveologenese retardiert, gekennzeichnet durch eine Erweiterung der peripheren Lufträume. Des Weiteren sei eine reduzierte Zellproliferation ab dem 7. postnatalen Tag im peripheren Lungenparenchym zu verzeichnen. Es käme aber keine vermehrte Apoptose im Vergleich zu WT-Mäusen zur Darstellung. Am 28. postnatalen Tag läge das Bild eines typischen zentrilobulären Emphysems mit Erweiterung peripherer Lufträume distal des terminalen Bronchiolus vor. Die Größe der Alveolen sei im Vergleich zu WT-Mäusen um 58% angestiegen. Dieser Phänotyp persistiere und verschlechtere sich sogar noch zur typischen Emphysemlunge in den KO- Mäusen im Alter von 4 Wochen. Am 28. postnatalen Tag falle außerdem eine reduzierte Expression von Tropoelastin bis ins Erwachsenenalter auf, diese sei aber noch nicht in der frühen postnatalen Phase zwischen Tag 1 und 7 zu verzeichnen. Die Smad3-KO-Maus besäße zwar weniger elastische Fasern, aber diese hätten dennoch eine normale Struktur in der histologischen Färbung. Dies lässt Chen et al. zu folgenden Schlussfolgerungen kommen: Ein Verlust der Smad3-Genexpression behindere in der Mäuselunge die frühe Phase der Alveolarisation durch reduzierte Zellproliferation in der Lungenperipherie. Am Ende der Alveolarisation komme es zu einer

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progressiven zentrilobulären Emphysemstruktur der Lunge, die mit einer erhöhten MMP-9-Expression und -Aktivität einhergehe ebenso wie mit einer verminderten Tropoelastinexpression. Somit vereine die Smad3-KO-Maus eine gestörte Alveolarisation mit einem destruktiven Prozess, welcher im weiteren Verlauf zu einem Lungenemphysem führe. Darüber hinaus sei die TGF-ß- Smad3-Signalkaskade wichtig für ein postnatales Lungenwachstum und die pulmonale Reifung.

1.5.2. LPA und seine Rezeptoren

LPA entsteht vor allem extrazellulär mittels eines Plasmaenzyms Autotaxin ( AT X ) , w e l c h e s m i t H i l f e s e i n e r Ly s o p h o s p h o l i p a s e D - A k t i v it ä t Lysophospholipide in LPA umwandelt (Okudaira et al., 2010). LPA ist ein Phospholipid aus einer Phosphatkette, Glycerol und Fettsäure (Tokumara, 1995; Moolenaar, 1999; Tigyi et al., 2003). LPA vermittelt Zellproliferation und - migration, Neuritenretraktion, Plättchenaggregation, Kontraktion der glatten Muskulatur, Formation von Stressfasern sowie die Sekretion von Zytokinen und Chemokinen (van Meeteren et al., 2007). Sie verhindert Apoptose in Fibroblasten und kommt reichlich im Serum vor. LPA spielt darüber hinaus eine Rolle bei der Hirnentwicklung (Contos et al., 2000), neuropathischen Schmerzen (Inoue et al., 2004), Embryoimplantation (Ye at al., 2005), Haarwachstum (Pasternack et al., 2008; Shimomura et al., 2008) und Blutgefäßbildung (Tanaka et al., 2006; van Meeteren et al., 2006). LPA übt seine Wirkung über G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (LPA1-5) aus, die speziﬁsch für LPA sind (Aoki et al., 2008). Der LPA1-Rezeptor ist strukturell ä h n l i c h d e n s p h i n g o s i n e 1 - p h o s p h a t e ( S 1 P ) - R e z e p t o r e n u n d Kannabinoidrezeptoren. Seine in vivo Funktion besteht in Gehirnentwicklung, n e u r o p a t h i s c h e m S c h m e r z , L u n g e n - u n d N i e r e n ﬁ b r o s e s o w i e Krebsmetastasierung (Contos et al., 2000; Inoue et al., 2004; Tager et al., 2008;

Pradere et al., 2007; Liu et al., 2009). LPA1 ist häuﬁg mit Gi-Protein gekoppelt, was zu einer Erhöhung von cyclisches Adenosinmonophosphat (cAMP) und zur Aktivierung von Ras, Rac, ERK und Akt (siehe Abkürzungsverzeichnis) führt.

cAMP ist ein second messenger der zellulären Signaltransduktion und führt zur Aktivierung von Proteinkinasen, welche die Aktivität von Enzymen oder

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Transkriptionsfaktoren regulieren (Hecht et al., 1996; An et al., 1998; Contos et al., 2002). Ein weiterer Kopplungsmechanismus an G12/13 aktiviert kleine GTPasen wie Rho (siehe Abkürzungsverzeichnis), welche eine Umordnung im Zytoskelett und Zellmigration bewirken (Contos et al., 2002). Die Aktivierung des LPA-Rezeptors ist abhängig von der Fettsäureart (Yoshida et al., 2003;

Hayashi et al., 2001; Tokumara et al., 1994; Jalink et al., 1995). LPA1 wird stark exprimiert im Nervensystem (Hecht et al., 1996). LPA1-KO-Mäuse weisen unter anderem Abnormalitäten in der Hirnentwicklung auf (Contos et al., 2000), es wurde zum Beispiel eine erniedrigte Anzahl neuronaler Zellen detektiert (Inoue et al., 2004). LPA1 ist außerdem verantwortlich für eine LPA-induzierte Zellmigration unterschiedlicher Zelltypen inklusive Krebszellen (Hama et al., 2004). Der Rezeptor spielt eine entscheidende Rolle bei pulmonaler und renaler Fibrose, zumal es die Migration und Invasion von Fibroblasten und Myoﬁbroblasten fördert und auf der anderen Seite im Bleomycin-Modell die Apoptose von alveolären Epithelzellen fördert, diejenigen von Fibroblasten jedoch hemmt (Tager et al., 2008; Pradere et al., 2007). LPA kommt im Serum, in Follikelﬂüssigkeit (Tokumara et al., 1999), in Speichel (Sugiura et al., 2002) und in Sperma (Hama et al., 2002) vor. Auch einige Zellarten wie Ovarialkrebszellen oder Blutplättchen können LPA freisetzen (Mauco et al., 1978; Gerrard et al., 1989; Eichholtz et al., 1993).

1.6. Rolle von LPA und S1P unter Betonung von LPA

Dysregulierte Wundheilung ist charakterisiert durch eine pathologische Akkumulation von Fibroblasten und Myofibroblasten sowie der extrazellulären Matrix, die sie synthetisieren. Eine solch gestörte Wundheilung ist bei der idiopathischen Lungenfibrose und in der fibroproliferativen Phase des „acute respiratory distress syndrome“ (ARDS) zu beobachten. Gerade bei der idiopathischen Lungenfibrose (IPF) führt das Ersetzen des normalen Lungenparenchyms durch Bindegewebe im Endstadium zur Organdysfunktion und schließlich zum Tod. Nach Beginn der Lungenfibrose ist der Fibrosierungsprozess nur schwer zu unterbrechen, so dass eine zielgerichtete Therapie diesbezüglich anzustreben ist (Barry et al., 2012).

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Nach einem Trauma kommt es zu diversen biologischen Vorgängen:

• epithelialer Zelltod/Apoptose (Ley et al., 2010)- erhöhte Gefäßpermeabilität (Selman et al., 2006)

• Zelleinwanderung durch Entzündung (Gharaee-Kermani et al., 2009)

• extravaskuläre Koagulation (Antoniou et al., 2007)

• Aktivierung von TGF-ß und anderen proﬁbrotischen Mediatoren (Coward et al., 2010)

• Fibroblastenaktivierung und -proliferation (Coward et al., 2010; Selman et al., 2001)

• Persistenz der Fibroblasten und ihre Umwandlung zu Myoﬁbroblasten (Selman et al., 2001)

• Kollagensynthese und Synthese anderer extrazellulärer Matrixproteine (Selman et al., 2006; Gharaee-Kermani et al., 2009; Antoniou et al., 2007;

Coward et al., 2010).

LPA und S1P sind bioaktive Lysophospholipide, die über spezifische G-Protein- gekoppelte Rezeptoren ihre Signalkaskade vermitteln. Unterschieden werden LPA1-5 und S1P1-5 (Chun et al., 2010). Beide Rezeptorgruppen vermitteln viele zelluläre Basisfunktionen, eingeschlossen Zellwanderung, Zellüberleben, - kontraktion, -proliferation, Genexpression und Zell-Zell-Interaktionen (Ishii et al., 2004; Rivera et al., 2008). Besonders nach Trauma der Lunge durch zum Beispiel inhalierte Partikel, virale Infektionen oder Aspiration von Magensäure s c h e i n e n L PA u n d S 1 P E p i t h e l z e l l - u n d F i b r o b l a s t e n a p o p t o s e , Fibroblastenmigration und Myofibroblastendifferenzierung, Gefäßpermeabilität und den TGF-ß-Signalweg zu beeinflussen (Ye et al., 2002; Sakai et al., 1998;

Xu et al., 2009; Choi et al., 2010; Garcia et al., 2001; Goparaju et al., 2005;

Keller et al., 2007; Hagen et al., 2009). Somit kann ein therapeutischer

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Ansatzpunkt bei ﬁbrosierenden Erkrankungen die Signalkaskade von LPA und S1P sein.

LPA ist ein Phospholipid, bestehend aus Fettsäuren, Glycerin und Phosphat sowie einer Hydroxyl (OH)-Gruppe. Unterschiedliche Spezies von LPA differieren nur durch ihre unterschiedlichen Fettsäuren.

LPA unterstützt die Wundheilung in unterschiedlichen Geweben wie Haut, Gastrointestinaltrakt und Cornea (Mazereeuw-Hautier et al., 2005; Liliom et al., 1998; Demoyer et al., 2000; Balazs et al., 2001; Xu et al., 2007; Sturm et al., 1999). Sie wird produziert von zellmembranständigen Phospholipiden oder von Blutplättchen sowie von Phospholipiden des Surfactant (Aoki et al., 2004).

Bislang sind fünf LPA-Rezeptoren (LPA1-5) beschrieben, ein weniger afﬁner Rezeptor zu LPA - bekannt als P2Y5 - wird eventuell als LPA6 in die Familie der LPA-Rezeptoren aufgenommen (Chun et al., 2010). Die Rezeptoren sind G- Protein gekoppelt, das heißt, dass sie Signale über GTP-bindende Proteine in der Zellmembran in das Zellinnere weiterleiten.

LPA induziert über den LPA1-Rezeptor eine Lungenfibrose in Mäusen nach Bleomycininstillation: Der LPA-Spiegel ist im bronchoalveolären Lavagesekret erhöht und LPA1-KO-Mäuse sind nach Bleomycin-Gabe von der Lungenfibrose kaum betroffen (Tager et al., 2008). Die Behandlung mit einem spezifischen LPA1-Rezeptor-Antagonisten bewahrt Mäuse vor einer Bleomycin-induzierten Lungenfibrose (Swaney et al., 2010). Studien über Patienten mit IPF implizieren ebenfalls eine Relevanz des LPA-LPA1-Signalweges für die Entwicklung der Lungenfibrose beim Menschen. In der bronchoalveolären Lavage dieser Patienten können erhöhte LPA-Spiegel sowie hohe LPA1-Expressionen in den Fibroblasten nachgewiesen werden (Tager et al., 2008). Diese Daten legen nahe, dass LPA über LPA1 bei Patienten mit idiopathischer Lungenfibrose zur Akkumulation von Fibroblasten führt. Auch wird hier eine erhöhte Anzahl apoptotischer Zellen sowohl im Alveolar- als auch im Bronchialepithel beobachtet (Kuwano et al., 1996; Plataki et al., 2005). Ebenso bei Mäusen resultiert die Epithelzellapoptose in einer Lungenfibrose (Hagimoto et al., 1997;

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Matute-Bello et al., 2007; Lee et al., 2004; Sisson et al., 2010). Diese Zellapoptose ist auch im Bleomycin-Modell der Maus sichtbar, in dem intratracheal injiziertes Bleomycin zu einer raschen Apoptose in Alveolar- und Bronchialepithelzellen führt (Matute-Bello et al., 2007; Lee et al., 2004; Sisson et al., 2010). Bei LPA1-KO-Mäusen ist dieser Zelltod im Vergleich zum WT in deutlich reduzierter Form zu beobachten, was vermuten lässt, dass die LPA- LPA1-Kaskade nach Trauma zum Zelltod im Lungengewebe führt (Funke et al., 2012). Bei weiteren in vitro-Studien scheint der LPA-LPA1-Signalweg den programmierten Zelltod durch Herauslösen von adhärenten Zellen aus ihrem Verband zu induzieren (Frisch et al., 1994).

Bei Patienten mit Lungenﬁbrose wird eine erhöhte Gefäßpermeabilität beobachtet, was eine schlechte Prognose voraussagt (Mogulkoc et al., 2001;

McKeown et al., 2009). Traumatisierung von Gewebe kann direkt Blutgefäße verletzen, aber es werden auch bioaktive Faktoren freigesetzt, die die Gefäßpermeabilität erhöhen (Dvorak, 1986). Einer dieser Mediatoren in der Lunge ist LPA. Die interzellulären endothelialen Junktionen werden durch Lücken aufgebrochen, welche durch LPA mittels Aktivierung von Aktinfilamenten in den Zellen entstehen (Dudek et al., 2001; van Nieuw Amerongen et al., 2000). LPA1-KO-Mäuse hingegen weisen eine niedrigere Gefäßpermeabilität auf, so dass vermutet wird, dass der LPA-LPA1-Signalweg auch durch Gefäßpermeabilitätssteigerung zur Lungenfibrose führt. Des Weiteren wird indirekt durch Störung der Endothelbarriere die Koagulationskaskade intraalveolär aktiviert und auf diesem Weg sekundär die Lungenfibroseentwicklung unterstützt. In LPA1-KO-Mäusen liegt beispielsweise eine erniedrigte intraalveoläre Koagulation im Bleomycin-Maus-Modell vor (Tager et al. 2008).

Nach einer Lungenverletzung wandern Fibroblasten in ﬁbrinreiche Exsudate, welche sich in den Luftwegen entwickeln (Kuhn et al., 1989). Die Stärke dieser Fibroblastenmigration korreliert mit der Schwere der idiopathischen Lungenﬁbrose (Behr et al., 1993). LPA induziert potent die Migration und Invasion verschiedener Zelltypen, eingeschlossen Fibroblasten (Sakai et al., 1998). Im Bleomycin-Maus-Modell ist der LPA1-Spiegel in Proben einer

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bronchoalveolären Lavage erhöht und LPA1 wird vermehrt exprimiert in Lungenﬁbroblasten. Im Vergleich zu LPA1-KO-Mäusen ist die Chemotaxis zu 50% gesteigert (Tager et al., 2008). Damit scheint der LPA-LPA1-Signalweg auch verantwortlich für die Fibroblastenaktivierung zu sein. In LPA1-KO-Mäusen ﬁndet als Bestätigung dieser Hypothese eine verringerte Akkumulation von Fibroblasten in der Lunge statt.

Der LPA-LPA1-Signalweg verursacht weiterhin eine Fibroblastenresistenz gegenüber Apoptose. Lungenﬁbroblasten, die von Patienten mit IPF isoliert werden, zeigen diese vermehrte Resistenz (Chang et al., 2010). LPA verhindert Apoptose in verschiedenen Fibroblastenzellreihen (Fang et al., 2000). Dabei beruft sich das sogenannte „Apoptose-Paradoxon“ bei IPF auf eine gesteigerte Epithelzellapoptose gepaart mit Fibroblastenreistenz gegenüber dem Zelltod (Thannickal et al., 2006).

LPA scheint außerdem über den LPA2-Rezeptor TGF-ß zu aktivieren, ein proﬁbrotisches Zytokin, welches bei Überexpression in der Maus ebenfalls zu einer Lungenﬁbrose führt (Giri et al., 1993; Li et al., 2010).

1.7. LPA und Lungenﬁbrose (Mausmodell)

Bei der idiopathischen Lungenﬁbrose kommt es als Reaktion auf den Lungenschaden zu einer gesteigerten epithelialen Zellapoptose, deren molekularer Ablauf bislang noch nicht vollständig verstanden ist. In einer Studie von Funke et al. (2012) wurde festgestellt, dass LPA über den LPA1-Rezeptor eine epitheliale Zellapoptose nach Injektion von Bleomycin in die Mäuselunge veranlasst. Die Anzahl der apoptotischen Zellen im Alveolar- und Bronchialepithel sei am 3. Tag nach Bleomycin-Instillation im Vergleich zu Wildtypmäusen in LPA1-KO-Mäusen deutlich reduziert. Dies treffe ebenso für die Caspase-3-Aktivität zu. Auch Tager et al. (2008), wiesen in einer Studie n a c h , d a s s d i e A b w e s e n h e i t v o n L PA1 z u e i n e r r e d u z i e r t e n Fibroblastenchemotaxis und reduzierten vaskulären Schäden führt, wohingegen das Leukozyten-Rekruitment in der ersten Woche nach Verletzung anhält.

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Wiederholte Lungenverletzungen und abnormale Wundheilung tragen zur Pathogenese der idiopathischen Lungenﬁbrose bei. Gewebsverletzungen induzieren eine Reihe von Prozessen in der Wundheilung. Ziel ist eine Wiederherstellung des normalen Gewebes mit seiner Funktion. Es wird vermutet, dass eine gestörte Wundheilung in der Pathogenese der IPF eine Rolle spielt (Selman et al., 2001).

Fibrotische Lungenerkrankungen weisen eine hohe Mortalität auf und sind refraktär gegenüber aktuellen pharmakologischen Therapien. Daher ist eine genaue Identiﬁkation der Pathogenese der Erkrankung wichtig, um neue therapeutische Ansatzpunkte für diese ﬁnden zu können.

Bei der IPF wandern Fibroblasten in das ﬁbrinreiche Exsudat ein, welches sich nach einem Lungenschaden in den Lufträumen bildet (Kuhn et al., 1989). Diese chemotaktische Fibroblastenaktivität korreliert mit der Schwere der Erkrankung (Behr et al., 1993). Das heißt, chemotaktische Mediatoren, die die Fibroblastenaktivität beeinﬂussen, werden in den Lufträumen generiert - insbesondere bei Patienten mit IPF. Das Ausmaß ihrer Aktivität korreliert invers zur totalen Lungenkapazität und zur Vitalkapazität der betroffenen Patienten.

LPA, welches über einen spezifischen G-Protein-gekoppelten Rezeptor wirkt, n ä m l i c h L PA1, i s t d a b e i e i n v o r h e r r s c h e n d e r M e d i a t o r f ü r d i e Fibroblastenmigration (Tager et al., 2008; Ahluwalia et al., 2016). LPA vermittelt Signalkaskaden über spezifische G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, mindestens fünf, von denen LPA1-5 gut definiert sind (Choi et al., 2010). Bei f e h l e n d e r L PA1- E x p r e s s i o n k o m m t e s i n d e r M ä u s e l u n g e t r o t z Bleomycininstillation zu keiner Akkumulation von Fibroblasten.

LPA1-KO-Mäuse sind vor Fibrose und Mortalität signiﬁkant geschützt bei Bleomycin-induzierter Lungenﬁbrose (Tager et al., 2008). Intratracheale Bleomycininjektion beim WT führt zum raschen Zelltod von Bronchial- und Alveolarepithelzellen, nach einer frühen Phase schließt sich in der 2. Woche nach Injektion eine weitere Apoptosephase an (Hagimoto et al., 1997).

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Eine erhöhte Gefäßpermeabilität ist ein weiteres Kennzeichen bei Gewebsverletzungen (Martin, 1997). Gewebstraumata können eine direkte Gefäßschädigung auslösen, aber auch bioaktive Mediatoren können indirekt zu einer gesteigerten Gefäßpermeabilität führen. Diese Gefäßpermeabilität ist vor allem erhöht in der frühen Reparaturphase nach Gewebsverletzung (Dvorak, 1986). LPA wirkt über den LPA1-Rezeptor der endothelialen Zellen und führt so zu gesteigerter Gefäßpermeabilität (Tager et al., 2008). Sekundär wird über die gesteigerte Gefäßpermeabilität erneut zur Fibroseentwicklung beigetragen.

Durch persistierende vaskuläre Leckage kommt es zur extravaskulären Koagulation, die ebenfalls zur Fibroseentwicklung beisteuern kann (Idell, 2003;

C h a m b e r s e t a l . , 2 0 0 2 ) . E i n i g e P r o t e a s e n d e r e x t r i n s i s c h e n Koagulationskaskade wie Thrombin vermitteln über Protease-aktivierte Rezeptoren und die daraus folgende Induktion von Mediatoren wie Platelet Derived Growth Factor (PDGF) (Chambers et al., 2002) eine Fibrinproduktion.

Auch vaskuläre Defekte sind in LPA1-KO-Mäusen deutlich abgeschwächt. Um die Relevanz für die IPF beim Menschen aufzuzeigen, sind im Gegensatz dazu die LPA-Spiegel im bronchoalveolären Sekret von Patienten mit IPF erhöht, zusätzlich wird LPA1 von Fibroblasten vermehrt exprimiert (Tager et al., 2008).

Plättchenaktivierung und Hydrolyse der Surfactantphospholipide in den Luftwegen können ebenfalls zu erhöhten LPA-Spiegeln führen (Honda et al., 1988). Die LPA-Aktivität ist außerdem reguliert durch die Proteinbindungen, die die Bindung an den Rezeptor steigern (Albumin) oder erniedrigen (Plasmagelsolin) können (Goetzl et al., 2000).

Patienten mit IPF weisen eine gesteigerte Zellapoptose von Alveolar- und Bronchialepithelzellen auf (Kuwano et al., 1996; Plataki et al., 2005).

Es wurden in Zellkulturen die Auswirkungen von LPA auf normale Bronchialepithelzellen (NHBE) und auf R3/1-Rattenalveolarepithelzellen untersucht. Hier wurde festgestellt, dass der programmierte Zelltod über die Lösung von Zellen aus ihrer Verankerung induziert wird (Frisch et al., 1994).

Fokale Adhäsion wird durch LPA bei NHBE-Zellen verhindert, ein ähnlicher Effekt ist auch bei den R3/1-Zellen zu sehen (Gilmore et al., 2009; Cheng et al.,

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2004). Es kommt folglich zur Förderung der Zellapoptose durch Inhibierung fokaler Zelladhäsion und Aktinﬁlamentbewegung und -formation.

Neben LPA induziert auch TGF-ß, ein Signalmolekül, welches eine wichtige Rolle in der Differenzierung von Zellen und Geweben spielt, Apoptose in Lungenepithelzellen (Rahimi et al., 2007; Hagimoto et al., 2002; Solovyan et al., 2006) und induziert Apoptoseresistenz in Lungenﬁbroblasten (Zhang et al., 1999; Horowitz et al., 2007).

Induktion des Zelltods von Lungenepithelzellen in Mäusen durch Freisetzung von anti-Fas-Antikörpern (siehe Abkürzungsverzeichnis) (Hagimoto et al., 1997;

Matute-Bello et al., 2007) oder durch Überexpression von TGF-ß (Lee et al., 2004) führt zur Entwicklung von Lungenﬁbrose, wie es gewöhnlich die gezielte Schädigung von Alveolarepithelzellen hervorruft (Sisson et al., 2010).

P r o s t a g l a n d i n E 2 ( P G E 2 ) , e i n P r o s t a g l a n d i n , w e l c h e s i n Entzündungsgeschehen involviert ist, hat eine entgegengesetzte Wirkung zu LPA und TGF-ß, es schützt Alveolarepithelzellen Typ II vor Apoptose (Maher et al., 2010). Die IPF ist assoziiert mit einer Erhöhung von LPA und TGF-ß sowie einer Erniedrigung von PGE2. Hier könnte ein weiterer therapeutischer Ansatzpunkt bei idiopathischer Lungenﬁbose liegen, zum Beispiel durch Antagonisierung des LPA1-Rezeptors.

In der Studie von Funke et al. (2012) wurde die Frage untersucht, ob LPA zu einem gesteigerten epithelialen Zelltod führt. Hierbei wurden Lungen von WT- Tieren und LPA1-KO-Mäusen nach intratrachealer Bleomycininjektion miteinander verglichen. Die frühe Apoptosephase stellte sich dabei bei den LPA1-KO-Tieren deutlich abgeschwächt dar und lässt vermuten, dass LPA über LPA1 in vivo einen epithelialen Zelltod veranlasst. Fibroblasten und M y o ﬁ b r o b l a s t e n s c h e i n e n z u d e m e x t r e m r e s i s t e n t g e g e n ü b e r Apoptoseinduktion bei IPF zu sein (Chang et al., 2010).

Die Mechanismen, die zu einer Bleomycin-induzierten Lungenﬁbrose führen, scheinen somit zum einen die epitheliale Zellapoptose und zum anderen die

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gleichermaßen bestehende Fibroblastenresistenz gegenüber Apoptose in der Lunge - vermittelt über die LPA-LPA1-Signalkaskade - zu sein. So kommt es zur paradoxen Apoptose-Abnormität bei idiopathischer Lungenﬁbrose (Thannickal et al., 2006). In der LPA1-KO-Maus ist die frühe Phase der Alveolar- und Bronchialepithelapoptose abgeschwächt. Somit ist zu vermuten, dass LPA über LPA1 eine Apoptose im Lungenepithel nach Trauma verursacht. Beim WT können erhöhte LPA-Konzentrationen drei Tage nach Bleomycininjektion in der bronchoalveolären Flüssigkeit nachgewiesen werden.

Die Studie von Tager et al. (2008) zeigte auf, dass LPA durch Fibroblastenrekruitment und vaskulärer Leckage zur Entwicklung einer Lungenﬁbrose nach Trauma beiträgt.

Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass LPA nach Injektion von Bleomycin einen wichtigen Mediator für ein profibrotisches Milieu darstellt. Sie veranlasst Fibroblastenrekruitment und Gefäßundichtigkeit im Mausmodell. Des Weiteren vermittelt sie eine Induktion von Fibroblasteneinwanderung bei Patienten mit IPF und ist ein wichtiger Regulator beim Überleben oder bei Apoptose verschiedener Zelltypen. Über den LPA1-Rezeptor vermittelt LPA die Apoptose von menschlichen Bronchialepithelzellen. Außerdem wird der programmierte Zelltod durch Lösung von adhärenten Zellen aus ihrer Verankerung veranlasst und die Resistenz der Lungenfibroblasten gegenüber Apoptose gefördert. Somit reguliert möglicherweise dieser Signalweg die Entwicklung einer pulmonalen Fibrose nach Lungenverletzung. Die IPF ist gekennzeichnet durch einen gesteigerten epithelialen Zelltod, kombiniert mit einer gesteigerten Resistenz der Fibroblasten gegenüber Apoptose. Bei Patienten mit IPF ist darüber hinaus LPA in der bronchoalveolären Lavage erhöht und eine LPA₁-Inhibition reduziert die Fibroblastenaktivität. Der LPA- LPA1-Signalweg ist möglicherweise die molekulare Ursache für die genannten Mechanismen, denn es wird epithelialer Zelltod über LPA begünstigt, aber Fibroblasten zeigen sich gegenüber dieser Apoptose resistent, was möglicherweise für die Lungenfibrose nach pulmonaler Verletzung verantwortlich ist. Dieser Signalweg mag somit als therapeutischer Ansatz- oder Zielpunkt bei fibrosierenden Lungenerkrankungen wie IPF dienen. Ein

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therapeutisches Target wäre dabei der LPA1-Rezeptor. Prinzipiell wird aktuell diskutiert, dass Programme, welche in der Lungenentwicklung von Bedeutung sind, im Rahmen der Entwicklung der Lungenﬁbrose aktiviert werden (Selman et al., 2008). Ein prominentes Beispiel ist der Wnt/ß-Catenin (siehe Abkürzungsverzeichnis)- aber auch der bereits diskutierte TGF-ß/Smad-3-Pfad.

Inwieweit dieses auch für LPA-LPA1 zutrifft, ist aktuell unklar.

1.8. Rolle der peripheren Myoﬁbroblasten in der

Alveologenese unter Berücksichtigung der Rolle von LPA

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Bei Nagetieren kann bei der Lungenentwicklung zwischen einer frühen sowie einer späten Phase der Alveolarisation differenziert werden (Burri, 2006). In der frühen Phase wird ein primäres Alveolarseptum in zentralen Regionen der Lunge gebildet. Dieses ist durch ein doppeltes Kapillarbett charakterisiert, welches im Verlauf - bei Ratten 3 Wochen nach der Geburt - zu einem einschichtigen reift (Burry, 2006; Amy et al., 1977). Im Gegensatz hierzu wird ein primäres Alveolarseptum in den subpleuralen Lungenregionen während der späten Phase der Alveolarisation ohne das Vorhandensein einer initial doppelten Kapillarschicht ausgebildet (Mund et al., 2008). Die Septierung der Alveolen in der späten Phase der Alveolarisation, die bislang nicht gut untersucht ist, wird angetrieben durch α-SMA, welches von Fibroblasten exprimiert wird. Diese proliferieren, wandern ins periphere Lungengewebe ein, sezernieren extrazelluläre Matrixproteine (Schittny, 2008) und treten vorübergehend während der Lungenentwicklung im Alveolarseptum auf. Sie werden als periphere septale Myoﬁbroblasten (PSMFBs) bezeichnet (Yamada et al., 2005). Beeinträchtigungen ihrer Proliferation, Migration oder Produktion der Komponenten der extrazellulären Matrix sieht man auch in gestörter Alveolarisation, die neonatale chronische Lungenerkrankungen oder bronchopulmonale Dysplasien charakterisiert (Kim et al., 2006; Hilgendorff et al., 2014). Die Lungenentwicklung ist abhängig von der Aktivität unterschiedlicher Zelltypen. Die Septierung in der späten Phase der Alveologenese scheint insbesondere von einer kontrollierten Einwanderung von