Histologische Aufarbeitung

In der Stereologie ist es wichtig, systematische Fehler zu erkennen und bei der späteren Auswertung zu berücksichtigen. Während der Einbettungsphase des Gewebes können Chemikalien das Gewebe alterieren, Gewebeschrumpfung kann quantitative Messungen beeinflussen. Bei der Histologie liegt eine bekannte Problematik in der Schrumpfung des zu untersuchenden Gewebes.

Bei der klassischen Gewebeeinbettung mit Paraffin ist mit einer deutlichen Gewebeschrumpfung von bis zu 50% zu rechnen (Miller et al., 1990; Iwadare et al., 1984). Hingegen bei Proben, die mit Glutaraldehyd fixiert und mit Epoxidharz eingebettet werden, ist nahezu keine Schrumpfung feststellbar (Weibel et al., 1982). Bewährt hat sich eine 3fach Fixierung mit Glutaraldehyd, Osmium- Tetroxid und Uranylacetat für eine möglichst gute Erhaltung des Lungengewebes. In einer weiteren Studie von Schneider et al. (2013) können eine 40%ige Schrumpfung des Gewebes bei der Paraffineinbettung und eine 30%ige Gewebeschrumpfung bei der Glykol-Methacrylat-Einbettung b e o b a c h t e t w e r d e n . E i n e n d e u t l i c h e Ü b e r l e g e n h e i t m i t e i n e r Gewebeschrumpfung von < 3% zeigt sich hier bei einer Vorbehandlung der Gewebeproben vor Dehydratation mit Osmium-Tetroxid und Uranylacetat, danach erfolgt die Einbettung in Methylmetacrylat mit anschließender Glutaraldehydfixation.

3.4.1. Agar-Einbettung und Probengewinnung

Das Sampling für licht- und elektronenmikroskopische Analysen wurde nach standardisierten Prozeduren durchgeführt (Tschanz et al., 2014). Das Lungengewebe wurde in 4%igem Agar eingebettet. Dieser wurde mit destilliertem Wasser in der Mikrowelle aufgekocht und anschließend durch Stehenlassen auf 60°C abgekühlt, um eine Gewebedestruktion durch Hitze zu vermeiden.

Die Lungen wurden in diesen Agar gelegt. Nach Aushärtung des Agars wurden mit einem Gewebeschneider 2 mm dicke Scheiben angefertigt. Die Schnittrichtung erfolgte senkrecht zur Längsachse der Lungen (apiko-basale

Achse). Eine Randomisierung der Schnittebene im Raum z.B. mittels Isector war nicht notwendig, da als primäre Endpunkte die Alveolenzahl und das Volumen des septalen Gewebes gewählt wurden. Diese Parameter sind unabhängig von der Ausrichtung im Raum. Die auszuwertenden Scheiben wurden mit Hilfe einer SURS ermittelt. Ziel war es, eine für das Organ repräsentative Auswahl an Schnitten zu erhalten, wobei jede Region der Lunge die gleiche Wahrscheinlichkeit haben sollte, in die Auswahl und damit in die Auswertung zu kommen. Die erste Scheibe wurde zufällig ausgewählt (Zufallszahl zwischen 1 und 2), dann wurde jede zweite Folgescheibe zu weiteren Verarbeitungsprozessen entnommen. Pro Lunge wurden auf diese Weise 3 bis 4 Scheiben gewonnen. Mit anderen Worten wurden die Lungenscheiben durchnummeriert und entweder jede ungerade oder jede gerade Scheibe für das weitere Prozessieren ausgewählt.

Das Protokoll des weiteren Prozessierens der Lunge hatte zum Ziel, Gewebedeformationen zu minimieren. Gewebedeformation wie zum Beispiel Schrumpfung führt unweigerlich zu Artefakten des Referenzraumes und somit auch der stereologischen Parameter, welche auf diesen Raum bezogen werden (Schneider et al., 2013).

Die weitere Einbettung in Methylmetacrylat (Technovit 8100, Heraeus Kulzer, Wehrheim) nahm einen Zeitraum von 5 Tagen in Anspruch. Methylmetacrylat hat gegenüber Paraffin den Vorteil, dass es mit einer deutlich geringeren HEPES-Puffer gewaschen wurden. Osmium wurde hinzugefügt, um die Zellmembranen für osmotische Diffusion inert zu machen und somit beispielsweise Zellschwellungen zu verhindern. Darüber hinaus reduziert Osmium in Kombination mit Methylmetacrylat zusätzlich die Schrumpfung (Schneider et al., 2013). Nach zweimaligem Spülen mit bidestilliertem Wasser verblieben die Proben über Nacht in halbgesättigter (4%iger), wässriger Uranylacetat Lösung.

Dieses war für den Erhalt der Lipidstruktur der „lamellar bodies“ in den Typ II Pneumozyten notwendig. Am zweiten Tag wurden die Proben mit wechselnden Aceton Lösungen entwässert. Sie befanden sich in den ersten 2 Stunden in 70%igem Aceton, dann für weitere 2 Stunden in 90%igem Aceton und zuletzt für 3 Stunden in 100%igem Aceton. Über Nacht lagerten die Lungenscheiben auf einem Schüttler in einem Gemisch aus 100%igem Aceton und Härter 1 Lösung (Methylmetacrylat, Technovit 8100, Haereaus Kulzer, Wehrheim, Deutschland) in einem Verhältnis von 1:1. Am dritten Tag wurden die Proben in die reine Härter 1 Lösung überführt, wo sie dann 48 Stunden bei 4°C auf dem Schüttler inkubiert wurden. Dies bewirkte, dass das Methylmetacrylat in die einzelnen Gewebeabschnitte eindringen konnte. Nachfolgend schloss sich das Einbringen in Teflonförmchen an. Dieses wurde bei 4°C auf Eis vorgenommen, um eine Hitzeentwicklung zu unterbinden. Die Mulden der Teflonförmchen wurden mit Härter 2 Lösung (Katalysator für die Polymerisation) bedeckt, bevor die Gewebeprobe möglichst mittig und mit der Schnittfläche nach unten platziert wurde. Die Mulden wurden nun mit Härter 2 Lösung aufgefüllt und mit Folie luftdicht abgedeckt. Nach einigen Tagen konnten mittels Microtom (Leica RM2265) von den Proben Schnitte mit 1,5 µm Schnittdicke angefertigt werden, die nun für weitere Färbeverfahren zur Verfügung standen.

3.4.2. Färbung des Lungengewebes 3.4.2.1. Orceinfärbung

Angesetzt wurde eine Lösung aus 0,2%igem Orcein, 70%igem Ethanol und konzentrierter Salzsäure (HCL), welche bei 50°C für eine Stunde auf dem Rührer gelöst und 3mal filtriert wurde. Nun wurde die Färbeflüssigkeit erwärmt und in eine Küvette gefüllt. Die Schnitte wurden in die Färbeflüssigkeit eingetaucht und verblieben so für 90 min. bei 40°C im Wärmeschrank.

Abschließend wurden die Objektträger einzeln mit 70%igem Ethanol gespült und luftgetrocknet. Mit dem Schnelleinschlussmittel Eukitt, welches durch seine kurze Trockenzeit die Färbung haltbar macht, wurden die Präparate eingedeckelt.

3.4.2.2. Toluidinblaufärbung

Es wurde eine Stammlösung aus 100 ml destilliertem Wasser, 1 g Toluidinblau und 2,5 g Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3) angefertigt. Diese wurde im Verhältnis 1:10 mit destilliertem Wasser verdünnt, so dass eine 0,1%ige Toluidinblaulösung entstand. Die Objektträger wurden für 2 min. in diese eingetaucht, anschließend 2mal mit destilliertem Wasser gespült und nun zunächst 3mal für jeweils 1 min. in 80%igem Alkohol und darauffolgend 2mal für 1 min. in 96%igen Alkohol gegeben. Nach Lufttrocknung erfolgte schließlich das Eindeckeln mit Eukitt.