Design-basierte Stereologie

Ziel der Strukturanalysen war es, anhand von zweidimensionalen Schnitten Parameter wie Volumen, Oberfläche oder Anzahl dreidimensionaler Strukturen zu ermitteln. Testfelder wurden dabei mittels eines systematischen, uniformen, randomisierten „Flächensamplings“ durch das newCAST-System generiert.

Dabei wurden Testsysteme zufällig auf die mikroskopischen Testfelder

projiziert. Diese Testsysteme interagierten stochastisch mit den jeweiligen Strukturen. So war die Wahrscheinlichkeit, dass ein Testpunkt auf die Schnittfläche einer Struktur fällt, direkt proportional zu dessen Volumenanteil am Organ.

Die Analyse erfolgte nach einem Kaskaden-Sampling-Design (Ochs, 2006).

Somit galt es, initial zwischen Parenchym und Nicht-Parenchym zu unterscheiden. Zum Parenchym zählten sämtliche Lungenanteile, die am Gasaustausch teilnehmen wie alveoläre und duktale Lufträume und interalveoläre Septen. Bronchi, Bronchioli, Gefäße größer als septale Kapillaren und peribroncho-vaskuläres Bindegewebe wurden dem Nicht-Parenchym zugeordnet. Zur Differenzierung wurden bei 5-facher Vergrößerung von oben beschriebenem System Testfelder zufällig ausgewählt, auf denen Testpunkte (insgesamt 24) zur Darstellung kamen. Die Volumenfraktion (Vv) des Lungenparenchyms (Vv(par,lung)) errechnete sich aus der Summe der Punkte, die auf dem Parenchym zu liegen kamen, geteilt durch die Gesamtzahl der Testpunkte im Lungengewebe (P(lung)).

Vv(par,lung) = P(par) / P(lung)

Mit Hilfe des gemessenen Lungenvolumens (V(lung)) konnte in Absolutwerte (V(par,lung)) umgerechnet werden.

V(par,lung) = Vv(par,lung) x V(lung)

Für die Zählung der Parenchym- und Non-Parenchympunkte in der Lunge kam ein Raster, bestehend aus 4 Gruppen, zum Einsatz, wobei jede Gruppe aus 3 x 3 Punkten bestand. In einem weiteren Schritt wurden bei 20ig-facher Vergrößerung nach dem aufgeführten Punktezählverfahren (point counting) die Volumina der azinären Lufträume (Vv(air,par)) sowie des septalen Gewebes (Vv(sep,lung)) ermittelt. Dabei wurden die azinären Lufträume, also Alveolarraum und duktaler Luftraum, funktionell als eine Einheit betrachtet.

Unter Hinzunahme des sogenannten „intersection counting“ konnte des Weiteren die Dichte der Alveolaroberfläche pro Volumeneinheit des

Referenzraumes (= Paremchym) (Sv(alvepi,par)) bestimmt werden. Bei dieser Zählmethode fanden 2 Testlinien definierter Länge Verwendung, wobei die Schnittpunkte zwischen Lufträumen und Gewebe als Zählereignis gewertet wurden.

In dieser Studie kam in dieser Vergrößerung ein Testfeld mit 9 Punkten und 2 Linien mit einer Länge von 45 μm zur Anwendung.

Vv(air,par) = P(air) / P(par)

Vv(sep,lung) = P(sep) / P(par)

Sv(alvepi,par) =2 x I(alvepi) / LT x PL(par)

Die Zahl der Schnittpunkte der Testlinien mit dem Alveolarepithel wurde als I(alvepi) gekennzeichnet, LT stand für die Länge einer Testlinie und PL(par) für die Zahl der Testlinien, die auf den Referenzraum, d.h. das Parenchym, projiziert wurden.

Um den absoluten Wert der Alveolaroberfläche zu erhalten, wurde die bereits berechnete Dichte der Alveolaroberfläche (Sv(alvepi,par)) mit der Volumenfraktion des Lungenparenchyms (Vv(par,lung)) und mit dem Gesamtlungenvolumen (V(lung)), das mittels Flüssigkeitsverdrängung gemessen wurde, multipliziert.

S(alvepi,lung) = Sv(alvepi,par) x Vv(par,lung) x V(lung)

Mit Hilfe des „Physical Disectors“ wurde die Anzahl der Alveolen bestimmt (Sterio, 1984; Ochs et al., 2004). Benötigt wurden Disectorpaare, d.h.

Bildpaare, die dieselbe Lungenregion zeigten und die einen definierten Abstand zueinander aufwiesen. Es wurden Schnitte von je 1,5 µm Dicke angefertigt und dann der erste sowie der vierte Schnitt verwendet. Somit betrug die Disectorhöhe in dieser Studie 4,5 µm. Die Disectorhöhe war somit der Abstand von der Oberfläche des ersten zur Oberfläche des vierten Schnittes (Hyde et

al., 2004). Als Zählereignis wurde ein topologischer Unterschied im Disectorpaar festgelegt. Im Rahmen dieser Studie galten als solches neu gebildete Brücken des Netzwerkes, welches durch die alveolären Eingänge gebildet wurde. Die elastischen Fasern im Bereich der Eingänge der Alveolen ließen sich durch die Orceinfärbung deutlich darstellen, so dass dieses als Entscheidungshilfe bei der Identifikation von alveolären Eingängen diente. Es wurde also das Öffnen oder Schließen einer Alveole zum Ductus alveolaris hin innerhalb des Disectorvolumens gezählt. Um ein definiertes Testvolumen (=

Disectorvolumen) berechnen zu können, wurde ein bestimmter Bereich für das Zählen definiert und ein sogenannter „Counting Frame“ auf das Lungengewebe projiziert. Dieser Rahmen bestand aus 2 roten und 2 grünen Linien, wobei Zählereignisse, die eine grüne Linie überschritten, in die Auswertung mit einflossen, wohingegen eine Brücke, die über eine rote Linie hinaustrat, nicht a l s Z ä h l e r e i g n i s b e t r a c h t e t w e r d e n d u r f t e . G e z ä h l t w u r d e z u r Effektivitätssteigerung in beide Richtungen, so dass jeder Ausschnitt einmal

„sampling section“ und ein anderes Mal „look-up section“ darstellte. Neben den Brücken wurde außerdem die Anzahl der „Counting Frames“ n gezählt, wenn die obere rechte Ecke des Rahmens auf Lungenparenchym bzw. das Referenzvolumen fiel. Die Dichte der Alveolen pro Einheit Referenzvolumen wurde berechnet, indem die Anzahl der Brücken (B) geteilt wurde durch das Testvolumen, in dem die Brücken gezählt wurden, also Rahmengröße multipliziert mit a (Fläche) multipliziert mit der Disectorhöhe (h). Der Faktor 1/2 in der nachstehenden Formel trug der Tatsache Rechnung, dass in beide Richtungen gezählt wurde.

Nv(alv,lung) = B / (2 x n x a x h)

Die tatsächliche Alveolenzahl einer Lunge konnte berechnet werden, indem die Dichte mit dem Referenzvolumen multipliziert wurde.

N(alv,lung) = Nv(alv,lung) x V(par,lung)

Die Bestimmung des mittleren volumen-gewichteten Volumens der Alveolen ṼV(alv) basierte auf einem Punkte-Sampling (Gundersen et al., 1988). Dabei

hatte eine größere Alveole auch eine größere Chance analysiert zu werden.

Der Parameter ṼV(alv) reflektierte somit nicht nur die mittlere Größe der Alveolen, sondern auch deren Heterogenität. Auf die Orcein-gefärbten Gewebeschnitte wurde ein Testfeld projiziert, in welchem sich ein Testpunkt in der Mitte einer Testlinie befand. Fiel eben dieser Testpunkt auf ein Alveolarlumen, so wurde entlang der Testlinie von einer zur anderen Wand der Alveole gemessen (li).

Ṽv(alv) = l / n∑∏ / 3 x li3

Die Ermittlung der Stärke der Alveolarsepten erfolgte, indem die Volumendichte des Septums geteilt durch die Septendichte mit dem Faktor 2 multipliziert wurde.

t(sep) = Vv(sep,par) / Sv(alvepi,par) x 2

(Hsia et al., 2010; Mühlfeld et al., 2013)

Tabelle 2: Zählverfahren